（预防兽医学专业论文）人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及其表达产物活性检测.pdf

罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及其生物活性检测 人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及生物活性检测 研究生：罗冠群 导师：秦爱建教授 摘要 人溶菌酶( 1 l 啪a 1 1l y s o z y m e ，h l y z ) 是一种碱性球蛋白，由l3 0 个氨基酸组成， 分子量为1 4 7 i 。它是一种有效的抗菌剂，全称为1 ，4 b - n 溶菌酶，又称粘肽 n 乙酰基胞壁酰水解酶。它做为一种无残留、无耐药性的新型抗菌药物，代表着 未来抗菌药物应用和发展方向。 本研究扩增携带重组p g e m - h l y z 质粒阳性工程菌，用限制性核酸内切酶励d 1 分别酶切处理p g e m - h l y z 重组质粒和杆状病毒转移载体p f a s t b a c i ，将目的片段进 行电泳、胶回收和连接。将连接子转化d h 5 q 感受态细胞，挑取阳性克隆菌株， 提取质粒，并以勋d i 和声n 酶切鉴定h l y z 插入p f a s t b a c i 的方向，将正向插入的 连接子，命名为p f a s t b a c i h l y z 。 将p f a s t b a c i m ) ，z 重组质粒按b a c - t 0 b a c 表达系统操作步骤转化d h lo b a c 感 受态细胞，纯化培养三代，挑取白色菌落提取基因组d n a ，并l d y z 特异引物和 m 1 3 通用引物对重组质粒进行p c r 鉴定，阳性质粒常规方法转染s f 9 细胞，收取 显著病变的细胞，即p 1 代病毒，命名为r b a c i l l y z ，同时以野生杆状病毒感染s f 9 细胞作为阴性对照。感染9 6 1 2 0 h 后，用免疫荧光技术( i f a ) 方法对p 3 代重组 杆状病毒r b a c 1 1 l y z 感染s f 9 细胞进行检测，观察到特异性的荧光，而阴性对照则 无。用s d s p a g e 及w 色s t e mb l o t 方法对p 3 代重组杆状病毒r b a c h l y z 感染s f 9 细 胞培养上清进行检测，观察发现有符合预测大小的1 4 7 k d 蛋白质条带，阴性对照 则此无特异条带。通过以上两个试验，表明我们获得了重组人溶菌酶蛋白。 用溶壁微球菌制备含有微球菌的琼脂平板，进行琼脂平板扩散试验检测重组 人溶菌酶蛋白的活性。结果显示p 4 代r b a c i l l y z 重组毒感染的s f 9 细胞培养上清孔 内得到了约2 0 衄抑菌圈，细胞裂解上清孔得到了约1 1 咖的抑菌圈，标准蛋清 溶菌酶溶液孔内得到了约1 2 m m 的抑菌圈。阴性对照孔内无抑菌现象。 扬州大学硕士学位论文 2 一 针对临床上常见金黄色葡萄球菌大肠杆菌，我们应用琼脂平板扩散试验检测 r h l y z 对二者的溶菌活性。结果发现，对于金黄色葡萄球菌，p 4 代r b a c 1 l l y z 重组毒 感染的s f 9 细胞培养上清孔内得到了约1 5 m m 的抑菌圈，细胞裂解上清孔得到了 约1 1 m m 的抑菌圈，标准蛋清溶菌酶溶液孔内得到了约8 m m 的抑菌圈。而阴性对 照孔内没有抑菌现象。而对于大肠杆菌，标准蛋清溶菌酶得到了大约9 m m 的抑菌 圈，而p 4 代r b a u c - h l y z 重组毒感染的s f 9 细胞培养上清孔内得到了约只有2 n u n 的 抑菌圈。表明本研究重组表达所获得的人溶菌酶具有很强抑制革兰氏阳性细菌的 生物学活性，而对革兰氏阴性菌效果不理想。这是首次利用杆状病毒表达的具有 活性人溶菌酶，为日后进一步研究及工业化生产人溶菌酶奠定了基础。 关键词：人溶菌酶，杆状病毒，表达，抑菌活性 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用三 e x p r e s s i o no fh u m a nl y s o 巧m e i ni n s e c tc e l l sa n d i t sb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n m s c a n d i d a t e ： g u a n q u nl u o s u p e n ，i s o r ：p r o f a i j i a nq i n a b s t r a c t h 眦a nl y s o z y m e ( h l y z ) i sa na l k a l i n eg l o b u l i n ，w h i c hi sc o i i l _ p o s e do f 1 3 0 a m i n oa c i ds u q u e n c e s ，a n dm o i e c u i a rw e i g h ti s 14 7 0 0k d a i ti sa ne f f e c t i v e a i l t i m i c r o b i a la g e n t ，m uk n o w na s1 ，4 - p nl y s o z y m e ，a l s ow a sn 锄e da sv i s c o 。p e p t i d e n a c e t y l - m l l r 锄叫lh y d r o l a l s e 。ni sak i n do fn o n - r e s i d u a l ， n o n - r e s i s t a i l c eo fn e w a i 】t i b a c t e r i a l d m g s ，w m c hr e p r e s e m sm ed i r e c t i o no f t l l eu t i l i z a t i o na n d d e v e l o p m e n to fa n t i b a c t e r i a ld m g s 1 1 1t h ec u 盯e ms t u d y ，h 啪a nl y s o z y m eg e n e 行a g m e mw a s 锄p l i f i e du s i n gap a j ro f s p e c i f i cp r i m e r s ，a c c o r d i n gt ot h er e g i s t e r e ds e q u e n c eo fh 哪a nl y s o z y m em r l n a i n g e n b 砌( ，w i 廿l 勋d ir e s t r a c t i o ns i t e sb e i n gi n 仃0 d u c e d t h eo b j e c t 仔a g m e n t sw e r e o b t a i n e db yg e le x t r a c t i o nk i t ，t h e nl i g a t e dt op g e m t e a s yv e c t o ra 1 1 ds e q u e n c e d ，t i l e p o s t i v ep l a s m i d s w e r en 锄e da s p g e m - h l y z h l y z 缸i g m e n t sw e r es u b s q u e n t l y i n t r o d u c t e di n t op f a s t b a c iv e c t o ra i l dw e r ei d e n t i f i e db y 砌d ia n d 妒f id i g e s t i o n ，t 1 1 e p o s i t i v er e c o m b i r 姗tp l a s m i d sw e r en a m e da sp f a s t b a c i - m y za 1 1 dw e r e 啪s f o 珊e d m t 0d h 10 b a cc o m p e t e n tc e l l s p c rw a sc a r r i e do u tf o rt 1 1 ei d e n t i f i c a l i o no f r e c o m b i n a n tg e n 伽c o t a i r l i i l gt l l y z 触g m e n t s ，u s i n gm l3a n db l y zs p e c i f i cp d m e r s p o s i t i v er e c o m b i n 锄tg e n o m e sw e r es u b s e q u e n t l yt r a n s f e c t e di n t os f 9c e i l st oo b t a i n l e r e c o m b i n a n tb a c u l o v i m s ，m m e da sr b a c - m y z h l y zp r o t e i n sc a nb ed e t e c t e di nt i l e 扬州大学硕士学位论文 4 一 r b a c l l l y zi n f e c t e ds f 9c e l l sb yi f a ，s d s - p a g ea n dw e s t e mb l o t n l er e s u l t ss h o w e d t l l a tr b a c - h l y zr e c o m b i i l a 皿tb a c u l o v i m s 、v e r es u c c e s s m l l yc o n s t r u c t e d t oe x 锄i nt h ea c t i v 埘o fm y ze x p r e s s e d b yr b l y zi n f e c t e ds f 9c e l l s ， a g a rp l a t e s w e r ep r e p a r e dw i mt 1 1 em咖。如砌f c 螂a u n l da g a rm i x t u r e a f t e ra g a rb e c o m e s 0 1 i d i f i c a t e d ，a 1 1 da d dc u l t u r es u p e m a 伽1 ta n dc e l l l y s a t es u p e m a t a j l to ft h er h l y zd e r i v e d f - r o ms f 9 ，n e g a t i v ec o n t r o l ( u n i n f e c t e dr h l y zs f 9c e l l s ) a n dt h eh e ne g gw h i t e1 y s o z y m e r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt 1 1 a tr e c o m b i n a n th u m a nl y s o z y m ea c t i v i t ) rw a sc l e a r i y d e t e c t e di nm ec u l n l r es u p e m 砷m t sd e r i v e d 舶ms f 9c e l l sa j l dc l e a r e daz o n ea g a i n s tm 1 y s o d e i l ( t i c u sm a tm e a u s u r e d2 0m mi nd i a n t e r ，c o m p a r e d 、i t h12m mo b t a i n e dw i t h m es 切n d a r d ( i l e ne g gw h i t ec - t y p el y s o z y m e ) ，t h e r e b ys u g g e s t i n gs t r o n gl y t i ca c t i v i t y k e y w o r d ：h u m a l ll y s o 巧m e ；r e c o m b i m n tb a c u l o v i m s ；e x p r e s s i o n ；l 如ca c t i v i t i e s 扬州大学硕士学位论文 a m p + a m p i c i l l i n 符号说明 氨苄青霉素 b e v sb a c u l o v i l l l se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m杆状病毒表达系统 c l y d a b c h i c k e n e g gw h i t e l y s o z y m e c 型溶菌酶 3 。3 一d i a m i n o b e n3 ，3 二氨基联苯胺 d m e md u i b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m基础培养基 f i t c g i y h r p f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y n a t e 异硫氰酸荧光素 g o o s e - l y s o 巧m e分型溶菌酶 h o r s e c i m d i s hp e r o x i d 硒e 辣根过氧化物酶 h l y z h u m 趴l y s o z y m e i f a i g g i p t g l b n c o d o p d 人溶菌酶 i m m u n o f l u o r e c e n ta s s a y 免疫荧光试验 i m m u n o g l o b u i i ng 免疫球蛋白质g i s o p r o p y l t h i o - p d - g a l a c t o d i s e异丙基硫代- p - d - 半乳糖苷 l u r i a b e r t a 【n im e d i u m l b 培养基 n i t r o c e i l u i o s e o p t i c a ld e n s i t ) ， 0 - p h e n y l e n e d i 踟i n e 硝酸纤维素 光密度 邻苯二胺 e a g e p o l y a c 巧l a m i d eg e le i e c 仃o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p c r p e g s d s p h o s p h a t e b u 仃e rs o d i u m 磷酸盐缓冲液 p 0 1 y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o i 聚乙二醇 s o d i 哪d o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 t e m e dn ，n ，n ，n - t e r a le t h y l e n ed i a m i n en ，n ，n n 一四甲基乙二j 按 1 r s w b t r i sh y d r o c h i o r d e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 w e s t e mb 1 0 t 蛋白质免疫印迹试验 6 一 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用 7 计量单位计夏阜1 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体己经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 罗匠钧 婵醐咿r 吖日 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许 论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收 录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服 务。 学位论文作者躲粤丘睁导师躲 毒进， 撕期：y 7 年6 月1 f 日撕期：1 年彳月久日 扬州大学顾十学位论文 第一部分文献综述 溶菌酶研究进展 溶菌酶是由弗莱明在1 9 2 2 年发现的【l 】，全称为1 ，4 b n 溶菌酶，又称粘肽 n 一乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断肽聚糖中n 乙酰葡萄糖胺和n 乙酰胞壁酸之间 的b 1 ，4 糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂 开，引起细菌裂解【2 】。它能直接水解革兰氏阳性菌。在分泌型免疫球蛋白a 和补 体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。并能够增强抗生素和其他药 物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎和修复组织的目的。溶菌 酶还具抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等多种药理作用【3 1 。人和动物细胞无细胞壁 结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。溶菌酶是一种小分子碱性蛋 白，长期以来一直被作为一种“模型 体系，用于研究蛋白质的空间构象、酶动 力学及其与分子进化、分子免疫间的关系【4 】。 1 溶茵酶的分布及其生物学活性 1 9 6 3 年由乔利斯和坎菲尔德研究了溶菌酶的一级结构。1 9 6 5 年英国菲利普及 同事用x 衍射法解析了溶菌酶，溶菌酶是全世界第一个完全弄清了立体结构的酶， 是近代酶化学研究的最大成果之一【5 l 。溶菌酶广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中和哺 乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞及其他体液和组织( 如肝、肾) 细胞 内。从大麦、芜青、无花果、木瓜和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶， 其中以蛋清中含量为最高( 约含o 3 ) 【5 1 。而人乳、眼泪、唾液中的溶菌酶活性远 高于蛋清中( 约为3 倍) 1 6 】或其他来源的溶菌酶的活性。鸟蛋清中的溶菌酶已从如鹤 鹊、珍珠鸡、火鸡等的蛋清中分离纯化出来，它们与鸡蛋清的溶菌酶活性非常相 似，也由1 3 0 个氨基酸组成，虽排列顺序有所不同，但活性部位的氨基酸排列则大 体相同。鸡蛋清中约含有0 3 的溶菌酶，可分解溶壁小球菌，黄色八迭球菌和巨 大芽孢杆菌等革兰氏阳性茵，但对革兰氏阴性菌无效。当有e d t a 存在时，某些革 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用 9 兰氏阴性菌也可为该酶分解。鸡蛋清中的溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表， 是溶菌酶群中重要研究对象，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。在碱性环境中 对热稳定性较差，其一级结构由1 3 0 个氨基酸组成，维持其结构的主要作用力为二 硫键、氢键和疏水键。目前发现含溶菌酶的植物有近1 7 0 种。植物中的溶菌酶，已 从木瓜、芜菁、大麦、无花果和卷心菜等植物体中分离出该酶。溶菌酶c 型的活性 中心为g l u 3 5 、a s p 5 2 、t r p 6 2 和t r p l 0 8 ，此结果已被x 线衍射所证型6 1 。对于溶菌 酶的活性来说，最理想的条件是p h 6 o 7 0 、2 5 【7 1 。碱和氧化剂对它起阻遏作用， 而食盐则相反能起活化作用【8 l 。粉状溶菌酶若采用低温干燥贮存，则几乎可永不变 质。即使在p h 值为中性的水溶液中，该酶也可维持数天而不损失其活性。1 9 7 2 年， j o l l e s 【9 】等注意到，四边形晶体在温度高于2 5 时，则变得不稳定，特别是在3 7 4 0 时，它们转变成斜方体状晶体。目前研究比较清楚的是，该存在形式在低温能 够转变成稳定的斜方体形式。无论怎样，它们晶体的最初条件都是一样的，仅仅 不同的是过渡点，因而在高温似乎是稳定的。其实高范围的温度，直到5 5 也能 获得。认为这种可能性是酶经历了构象转换，这种转换能说明有两种晶体形式存 在。 2 溶菌酶的分类 根据溶菌酶的一级结构、分子量和生物来源，可以将溶菌酶分为6 种类型【9 j ， 即：噬菌体t 4 溶茵酶嗍( p h a g e t y p e ) 、植物溶菌酶( p l 眦一锣p e ) 、微生物溶菌酶 ( b a c t e r i a t y p e ) 和3 种动物型溶菌酶，即溶菌酶c 型( c k e k e n - l y s o z ) r m et ) ，p e ) 、g 型( g o o s e t y p e ) 和i 型( i n v e r t e b r a t e - t y p e ) 。其中溶菌酶g 主要存在于脊椎动物 中；溶菌酶1 只存在于无脊椎动物中；而溶菌酶c 型【1 0 1 则是唯一同时存在于脊椎 动物、原索动物( 文昌鱼) 和无脊椎动物中的类型，也是目前研究得最广泛、最透 彻的类型。大部分溶菌酶都属于c 型，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属 c 型。g l 矿】最早是由j o l l e s 和c a n f i e l d 发现的，约含有1 8 5 个氨基酸残基，相对 分子质量为2 1 0 0 0 。j o l l e s 等报道c 型与g 型溶菌酶轻度同源。c 型溶菌酶【1 3 】活性 中心的g l u - 3 5 和a s p 一5 2 可能和g 型的和g l u - 7 3 和a s p 8 6 同源，此结果已被x 线 衍射所证实。噬菌体溶菌酶【1 2 】位于各种噬菌体内，对溶解宿主菌起重要作用。它 扬州人学坝i j 学位论文 i o 含有1 6 4 个氨基酸残基，相对分子质量为1 8 7 0 0 。噬菌体溶菌酶在序列上与c 型溶 菌酶同源性较差，但它们组成的主干、结合底物的定位及催化的特异性方面有很 多相似之处等。噬菌体溶菌酶的g l u 1 1 和a s p 2 0 与c 型溶菌酶的g l u 3 5 和 a s p 5 2 相对应，都参与组成酶的活性中心。植物源溶菌酶【1 3 】分子量较大，约为 2 4 0 0 0 2 9 0 0 单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1 3 ，但其 对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的1 0 倍。微生物产生的溶菌酶【1 4 】 可分为7 类：1 ) 蛋白酶与内肽酶；2 ) 酰胺酶( 主要作用于细菌细胞壁肽聚糖中n 一 乙酰胞壁酸( n a m ) 与肽“尾 之间的n 乙酰胞壁酸l 丙氨酸键) ：3 ) n 乙酰已糖 胺酶( 类似于鸡蛋清溶菌酶，主要破坏细菌细胞壁肽聚糖中的b 1 ，4 糖苷键) ；4 ) b 1 ，3 、b 1 ，6 葡聚糖酶、甘露糖酶( 主要用于分解酵母细胞的细胞壁) ；5 ) 壳聚 糖酶( 分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶) ；6 ) 磷酸甘露糖酶；7 ) 脱乙酰壳多糖酶。噬菌 体产生的溶菌酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿 主细胞上不存在该酶。 3 溶菌酶的基因与结构 溶菌酶基因的外显子及其内含子序列已被确定【1 4 1 ，含有4 个外显子和3 个内含 子。成熟溶菌酶的基因编码1 3 0 个氨基酸残基。在前体溶菌酶基因中外显子1 之 前还含有一段编码信号肽的前导序列。外显子l 编码氨基酸l 2 8 ；外显子2 编码 氨基酸2 9 8 2 ：外显子3 编码氨基酸8 3 1 0 8 。外显子4 编码氨基酸1 0 9 1 3 0 ， 相邻的外显子之间共含有3 个内含子。3 个内含子分别位于第2 8 位、8 2 位1 0 8 位 氨基酸之间。溶菌酶基因序列长度为相应的m r n a 序列的7 倍【1 5 】。外显子与结构 单位之间存在密切的对应关系。蛋白化学家将溶菌酶序列分为4 段：a 段l - 3 9 ，b 段4 0 8 5 ，c 段8 6 1 0 0 ，d 段1 0 l 1 2 9 。结构上的a 段与外显子1 编码区域不相 符。内含子l 的插入点是2 8 位，而不是4 0 位，它存在于由2 4 3 4 位氨基酸形成 的一个a 螺旋内。除a 段外，其它外显子产物都构成一个主要结构成分，独自折叠， 很少插入其它外显子单位【1 6 】。溶菌酶c 蛋白结构研究表明【1 7 】，一个含酶活性位点 的深裂隙将酶分子分为两半。裂隙的一半是由a 段( $ 片层结构) 形成，它含有酶 的活性中心。裂隙的另一半是由2 个链末端的a 螺旋( 即a 段d 段) 组成。最后， 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用 l l 由含有a 螺旋的c 段将两半分子连接起来。外显子2 编码邯2 8 到a l a 一8 2 通过 g l u 一3 5 和a s p 5 2 及其周围裂隙两侧的重要功能成分将酶的催化活性中心合在一 起。这部分催化中心含有底物结合位点，可与糖环c 、d 、e 和f 结合，位于d 环 和e 环之间的b 1 ，4 糖苷键是酶的作用位点。外显子3 编码的片段与外显子2 编 码的片段相连，含有a 、b 糖环及部分c 环的结合位点，使活性中心结构完整。 外显子2 产物决定了糖苷酶的活性，外显子3 决定了酶与特异性底物的结合，外 显子2 与3 相连，使酶结合底物的特异性与催化效率提高。外显子1 和4 编码m r n a 上的翻译信号序列，这种序列位于前体溶菌酶的信号肽和溶菌酶的n 和c 末端。 这2 个外显子的编码产物在空间结构上以二硫键紧密相连，它们不直接参与酶反 应，但可以稳定酶活性或起其它一些未知的生物学作用。 4 影响溶菌酶活性的因素 溶菌酶遇热很稳定，p h 值4 7 、1 0 0 处理1 m i n 仍保持原酶活性；p h 值5 5 、 5 0 加热4h 后，酶活性不受影响：在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较差，易 变性。研究者发现在6 0 以上牛乳中的溶菌酶活性下掣1 8 l 。溶菌酶通过二硫键聚 合，1 8 0 时聚合和降解同时进行。当温度大于2 0 0 时肽键的断裂和重组发生， 聚合和降解变得更为剧烈。溶菌酶化学性质非常稳定，当p h 值在1 2 11 3 范围 内剧烈变化时，其结构几乎不变。溶菌酶在酸性下是稳定的，此时1 0 0 的加热对 溶菌酶仅有很小的活性损失。曾报道，p h 4 5 ( 1 0 0 、3m i n ) 、p h 5 2 9 ( 1 0 0 ，3 0 r n i n ) 的加热溶菌酶是稳定的。溶菌酶在p h 5 5 时最为稳定，在碱性时不稳定。糖 和聚烯烃类能增加溶菌酶的热稳定牲。n a c l 对溶菌酶也有抗热变性作用，盐溶液 的存在对溶菌酶的活性是十分必要的，溶菌酶的活性在低盐浓度时和离子强度密 切相关的，在高盐浓度时溶茵酶的活性受到抑制，阳离子的价态愈高则其抑制作 用愈强。曾发现具有c o o h 和s h 、o h 的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。 s c h a i c h i 悖l 发现溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养。导致蛋白质溶解度 下降和增加溶解部分的分子量。s c h a i c h 【1 9 等( 1 9 9 9 ) 后来发现是由于在溶菌酶中产 生了游离基。而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用。研究表明溶菌酶中游离基浓 度随水活性的上升而下降，其原因可能是因为基团的重构和交换。f u n e s 【2 0 】等继 扬州火学硕i ：学位论文 续进行溶菌酶和过氧化甲基亚油酸的作用研究，发现铁在一个冷冻干燥的模拟体 系中，溶菌酶在空气中和过氧化甲基亚油酸作用，有聚合、生物活性损失和其它 化学变化的反应。溶菌酶和过氧亚油酸反应生成二聚和高聚体：多聚是因为随水 活性增加，共价键交联度、蛋白质不溶性和酶活性损失增加引起的。f u j i m a l ( i 【2 0 1 等研究了在1 5 0 3 0 0 焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用。溶菌酶作为一个纯蛋白质 样品，在2 5 0 几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解。含硫氨基酸、碱性氨基酸和b o h 氨基酸较酸性氨基酸脯氨酸、芳香族氨基酸( 除色氨酸外) 、有烷侧链的氨基酸容 易分解。溶菌酶可和许多物质形成络合物导致其活性丧失。曾有报道称【2 0 1 等量蛋清 和蛋黄的混合物其溶菌酶无活性，脱水整蛋仅保留部分溶菌酶活性，蛋黄在p h 6 2 磷酸盐缓冲液中使纯溶菌酶失活，他们观察发现蛋黄污染蛋清仅有两个离子交换 色谱峰，而无污染的样品则出现3 个峰。整蛋的色谱分离时无溶菌酶。研究者认为抑 制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。n 乙酰葡萄 糖胺的b 1 4 键多聚物是溶菌酶的底物，它们之间形成一聚、二聚、三聚、四聚体， 是溶菌酶的抑制剂。 5 溶菌酶的酶活力测定 检测溶菌酶的方法有l o 余种【2 1 。2 2 】，由于方法条件各异，结果差异很大。目前 国内较为常用的测定方法有琼脂板扩散法，比浊法，比色法，高效液相色谱法以 及琼脂糖火箭电泳法。比浊法采用溶菌小球菌为底物。琼脂板扩散法是借鉴抗生 素的琼脂平板扩散法测定生物效价的原理，建立了一种新的简便易行的溶菌酶活 力测定方法，即把酶样定量滴在一定规格的圆形小纸片上，置于混有试验菌的琼 脂平板上，样品在平板上以浓度为推动力的扩散产生相应大小的抑菌圈，通过测 量抑菌圈的直径可以定量溶菌酶活力。比色测定法，是将微球菌加等量艳红染料 搅拌一定时间，让染料渗入到细胞壁内，然后洗除多余的染料，裂解的程度( 颜色 的深浅) 与溶菌酶的含量成正比。采用琼脂糖火箭电泳法测定唾液溶菌酶活性，将 酶学方法和电泳技术结合，使溶菌酶在电场中泳动，在通过含有作用底物的凝胶 时与溶壁微球菌发生水解作用，形成透明的溶菌峰，根据峰值与溶菌酶浓度的对 数成正比的关系，求得样品溶菌酶含量。高效液相色谱法也在测定中应用。比浊 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用 1 3 法对单个样品测定速度快。琼脂平板法测定溶菌酶酶活的新方法与经典的比浊法 的实验结果基本一致，它是切实可行的。而且与比浊法相比具有以下优点：( 1 ) 重 复测定数据离散程度小、变异率低、准确度高。( 2 ) 1 次可检测样品数量大，减少了 样品之间由于批次检测造成的系统误差。( 3 ) 在标准曲线范围内，可测酶浓度跨度 大，从5 0 0 3 0 0 0 0 u m l ，而实验结果表明，采用琼脂平板法测定溶菌酶活力，5 种酶质量浓度的测量值的变异系数均 5 ，且标准差和变异系数都小于比浊法， 说明采用琼脂平板法更稳定、准确，误差更小。这是由于琼脂法是标准品与样品 同时测定，从而排除了比浊法在温度和时间控制方面的微小差别以及仪器本身随 时偏差，而且用比浊法还需将酶液稀释到合适的倍数，不好把握。比色测定法测 定线性关系良好，随反应时间延长，吸收度不断提高；反应温度越高，活性显著 降低。测定结果不准确，易受肉眼的影响。琼脂糖火箭电泳法简便，快速、稳定 性好、灵敏度高，结果准确可靠。且由于电场的存在，溶菌酶以电泳代替了自由 扩散，测定时间大为缩短，扩散法需2 4 小时扩散，而电泳法在本实验条件下只需 9 0 分钟，其操作步骤也较比浊法简便，影响因素更少。溶菌酶是一种低分子碱性 蛋白质，p i l o 5 11 0 ，当它处于p h6 4 的介质中时带正电荷，电泳时借助电场力 的作用，推动溶菌酶泳向负极，使它在通过含有溶壁微球菌的琼脂糖凝胶时，与 相应的微球菌发生水解作用，形成透明的火箭状溶菌峰，溶菌峰长度与溶菌酶浓 度的对数呈直线关系。高效液相色谱法操作简便、快速、重现性好，结果可靠。 比浊法对单个样品测定速度快。但操作复杂，一般人难以掌握：精确度较低，实 验结果产生的偏差度较大，结果的重现性不好。重现性较差，缘该法使用的溶球 菌悬液体系是一个不均匀体系，由菌体颗粒和缓冲液组成的固液相分布体系不稳 定，在自然条件下菌悬浮液也会发生自身解体，终止反应时加入高浓度强碱也会 促使菌体解体，以及菌悬液在反应前预热时间长短，终止反应时间的控制等结果 产生影响的因素有关。在比浊法中，溶菌小球菌胞壁中的肽聚糖被溶菌酶水解成 可溶性的碎片，虽然可以使溶液对光的吸收度减少，但仍有大量溶菌酶小球菌体 悬浮液在溶液中，由于菌体本身多方面的差异，故悬浮在溶液中的持续时间不同， 导致溶液对光的吸收度变化较大，给测定结果带来一定的误差。琼脂平板扩散法 扬州大学顾士学位论文 1 4 虽简便，但重复性差，扩散法在扩散过程中还受到其它交叉性蛋白的干扰，唾液 中的i g a 在琼脂扩散时可形成透明的溶菌圈，致使结果偏高，这些都影响到结果 的可靠性。菌粉的制备方法对活力测定的结果并无明显的影响，但活菌的溶菌环 最为清晰；随着琼脂环厚度的增加，溶菌环的直径缩小，以2 m m 厚度溶菌环最为 清晰；溶菌环大小随琼脂浓度的增加而逐渐缩小，以1 浓度琼脂溶菌环最大，且 边缘清晰、整齐：随着温度的增加，溶菌环直径逐渐增加，线性范围增宽；反应 时间延长，溶菌环直径增大；加样量在5 2 5 此范围内与溶菌环直径呈线性关系。 比色测定结果不准确，易受肉眼的影响大。用比浊法测定酶活，对于不同浓度的 溶菌酶溶液，使用不同的研具研磨制备的底物悬浮液，对测定结果的影响偏差很 大。溶菌酶浓度取1 0 甥、5 0 “g 测定时，不同研具制成的底物悬浮液对结果有较 大影响，玛瑙研钵制得悬浮液测得结果一般高于其他研具，主要原因由于小球菌 分散度的差异。玛瑙研钵光滑，受力均匀，菌体溶解分散好，用玛瑙研钵制成的 悬浮液在显微镜下观察到基本为单个的小球菌，分散均匀；而用玻璃研钵和匀浆 机制锝的悬浮液，在显微镜下观察，黑色的未溶解分散的球菌团状物较多，影响 菌体在悬浮液中的持续性，造成测定误差。酶液浓度也有影响，不同研具对l o 鹇 的浓度测得结果影响最大。在药典规定的测定方法下，需统一溶解底物的研具。 扩散法测定酶活性也受多种因素的影响。在用高效液相色谱法测定溶菌酶口腔药 膜中维生素b 6 的含量的实验中。在标准b 6 溶液浓度梯度范围内，线性关系良好。 按照处方配制不含维生素b 6 的空白样品，分别按u v 法和h p l c 法配制供试液绘 制，得出结论，采用h p l c 法可以排除其他成份的干扰，测得的维生素b 6 的实际 含量比采用u v 法要低。由于现在所使用的测定方法存在大量问题，特别是较为 常用的比浊法和比色法。科研工作者提出了修改意见，制定出了一些改进后的测 定方法，使其更容易被应用于测定的操作中。微量快速比浊法：对于比浊法所存 在的问题，不少科研工作者也提出了改良措施。苍金荣等采用聚苯乙烯微量反应 板，建立了微量快速比浊检测溶菌酶的方法，具有线性关系好，标本用量少，反 应时间短，准确，灵敏度高的特点。微量快速比浊法，溶菌酶能使肘如d 沈f 胁c 淞 溶解，吸光度降低，其减低的程度与溶菌酶含量成正比。在测定标准曲线测定范 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用 1 5 围宽时，因低浓度酶量不足，高浓度底物不足影响线性的问题。提高了检测的灵 敏度和准确性，保证了标准曲线良好的线性；采用聚苯乙烯反应板，以酶标仪检 测吸光度，使比浊法微量、快速、准确；聚苯乙烯反应板的质量对测定结果有影 响；菌液的浓度应调正至5 0 肛l 于微量孔板中，4 9 0 m ，吸光度在1 9 2 0 之间比 较合适，过高过低都会影响灵敏度，标准液要临用前配制。光电比色法是在原来 比色测定法的基础上形成的一种新的检测方法，其灵敏度高，重现性好，稳定， 方法简便，经常用于临床诊断中。溶菌酶属于低分子蛋白，肾小球滤过后，几乎 全部由肾小管重吸收，尿中含量甚微，测定尿中含量，可用于评价肾小管重吸收 功能。目前常用的光学比浊法和琼脂平板法，后者虽快速和简便，但微球菌混悬 液均匀状态对结果影响大，并反应时间要求甚严，不宜进行批量测定；光电比色 法结果判定受肉眼观察影响，溶菌酶含量低时尤为严重。 6 溶菌酶的生产来源 6 1 天然资源的溶菌酶来源 鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3 5 ，是提取溶菌酶的方便来源【2 5 】。但不同产地 的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。工业上多采用直接结晶法、亲和色谱 法、离子交换法、超滤与亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。郇延军【2 6 】采用 控制温度、调酸和加盐的分离纯化工艺将溶菌酶分离，之后利用超滤和喷雾干燥 方法制成产品，产品活力1 l 0 0 0 咖g 。利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌 酶制备研究的一个热点。s t e r n b e 唱【2 7 】等1 9 7 4 年报道了应用聚丙烯酸( p a a ) 形成 p a a 一溶菌酶聚电解质复合物。c h e m 【2 8 】等于1 9 9 6 年应用p h 敏感的亚微粒丙烯 酸胶浆以及e 咖i tl 1 0 0 作为溶菌酶的沉淀剂。最近v a i d y a 等报道采用n 一异聚 丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到9 0 的收率。他们认 为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用p h 敏感聚合物具有更多的优点，因为 后者通常只有较低的收率。o w e n 【2 9 1 等1 9 9 7 年报道使用连续逆流、膨胀床吸附系 统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料 的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。另外最近g h o s h 等报 道采用小型的中空纤维超滤系统( 3 0 l ( d am w c o ，聚砜膜) 从蛋清干粉中分离溶菌 扬州大学硕j ：学位论文 1 6 _ 一 酶。溶菌酶被选择性透过膜，而其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留。改进系统 的流体动力学导致溶菌酶透过的增加，从而获得较好的收率。 目前，溶菌酶的提取方法主要有：亲和层析法、离子交换树脂法、食盐直接 结晶法及聚丙烯酸沉淀法【2 9 川1 。其中亲和层析法分离提纯的倍数较高，质量较好， 可广泛应用于各种来源的溶菌酶，但亲和吸附剂的制作较为复杂，限制了其在工 业中的应用；离子交换树脂法也会得到较好的收率。但树脂用过一段时间后，需 要再生，比较麻烦，此法适合规模化工业生产。食盐直接结晶法比较简单，但缺 点是不能用以分离微量的溶菌。 国内有人在对华南地区5 0 多科1 2 0 多种植物进行普查中，发现十字花科萝卜 叶中溶菌酶含量最高，且发现萝卜溶菌酶的耐热性、耐酸性均优于鸡蛋清溶菌酶 1 3 4 1 。进一步研究发现，该酶的抑菌效果与现在普遍生产和应用的鸡蛋清溶菌酶有 所不同【3 5 】。该酶不但对白色葡萄球菌等3 种革兰氏阳性茵，而且对大肠杆菌等6 种 革兰氏阴性菌及酵母、毛霉等5 种真菌具有不同程度的抑制作用，对另外参试的 白菜软腐病等7 种植物病原细菌、真菌及烟虫和小菜蛾两种昆虫都有抑杀作用。 萝卜溶菌酶抑菌的广谱性和较强的抑菌能力，以及原料成本低廉，都为萝卜溶菌 酶提供了良好的应用前景。卢顺舵等以脱氨几丁质为亲和吸附剂，直接从萝卜叶 的抽提液中制备溶菌酶，产品比活力达4 2 1 6 2 咖g 【3 6 1 。岳克【2 1 1 等将蒙古马奶经过 硫酸铵沉淀，乳清蛋白脱盐，d e a e s e p h a d e xa 2 5 ，s e p h a d e xg 1 0 0 ， c m s e p h a d e xc 2 5 柱层析分离得到马奶溶菌酶，产率为3 8 m g l 马奶。 6 2 利用基因工程技术生产溶菌酶 崔晓江【3 7 】等以噬菌体t 7 d n a 为模板，p c r 扩增t 7 溶菌酶基因，插入 p b l u e s c r i p ts k 载体。d n a 序列分析表明，克隆的t 7 溶菌酶基因和已报道的序列 无氨基酸水平上的差异。将t 7 溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白( p r l b ) 信号肽编码序列的3 末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白( p l r vc p ) 基因靠近3 末端 处，构建成两个融合蛋白基因。将t 7 溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达 载体p b v 2 2 l ，实现t 7 溶菌酶基因在大肠杆菌中的高效表达，其产物的表达量占 菌体可溶性蛋白的2 0 以上。 罗冠群：人溶菌酶基因在昆虫细胞内表达及表达产物活性检测和初步应用旦 钱世均【3 即等构建了人溶菌酶工程菌j p b h l y ，e c o ，f 工程菌得高效表达，经 培养、诱导，所得菌体经破碎，酶蛋白的变性、复性处理，酶活力测定结果为 3 0 0 0 0 u l 培养液。他们通过对含人溶菌酶的包含体的分离、溶解、多肽复性方法 等研究，来提高酶的复性率。结果表明：1 ) 用有机溶剂处理菌体，同样能使含人 溶菌酶的包含体从细胞中释放出来，特别是在丙酮处理后，经变性复性所得酶活 性还高出超声处理后的酶活性1 2 ；( 2 ) 在复性时，加入分子量8 0 0 0 ，2 0 0 0 0 的 p e g 都能提高酶的复性率( 分别提高2 2 和1 7 ) ；( 3 ) 在复性液中，加入氧化型 谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽之比在2 ：1 时，酶的复性效果最好；( 4 ) 一定浓度的 甘油对酶的复性也有帮助，5 和1 0 的甘油能提高酶的复性率的3 1 4 和3 6 5 。 要提高重组蛋白质的复性率，最近的研究是利用分子伴侣促进蛋白质的复性。董 晓燕1 3 3 l 等利用重组大肠杆菌表达制备了分子伴侣g r o e ( 研o e l 和c 的2 e s ) ，研究 了嘶e 以及觚e l 辅助变性溶菌酶复性的作用。结果表明，不仅游离e l 单 独作用可使溶菌酶复性收率达到9 0 以上，而且固定化g r o e l 亦可有效地促进蛋 白质复性，最佳复性温度为3 7 ，最佳p h 值范围为6 8 ，复性酶的活性收率在 8 5 以上。另外，固定化研o e l 可反复回收利用，表明固定化q o e l 有可能应用 于生物下游的蛋白质复性过程。 m u r a k 锄i 【3 9 】等早先报道了在酿酒酵母中表达人溶菌酶基因，但表达产物以不 溶解的包涵体形式存在，没有生物学活性。随后y o s h i m u r a 【3 9 】等通过在人溶菌酶 基因上游连接一段鸡溶菌酶信号肽，从而使酿酒酵母工程菌分泌出了有活性的人 溶菌酶，但表达量仅5 1 5 m g 几。最近贾向志【4 0 1 等将人溶茵酶基因克隆到巴斯德毕 赤酵母( 尸配办幻脚，括) 分泌型表达载体p p i c 9 k