（生物化学与分子生物学专业论文）rgd葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化.pdf

r g d - 葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化 摘要：我室构建的溶栓和抗栓双重功能的r g d 氆激酶突变体( r g d s a k ) 在大肠 杆菌中高表达，目的蛋白质以包涵体形式存在。为获得有活性的缀白质，需要对 包涵钵送行交复性。剥躅凝薮屡聿厅方法怼包溺髂中r g d s a k 进行复性，：蒡与猿 释复性法进行比较，发现凝胶楗复性方法具有操作周期短，简便，成本低而高效 等优点。复毪盖虽囱震稻q s e p h r o s ef f 离予交换避一步缝佑，筑度这9 5 ，赘 蛋白凝胶板活性测定表明两种复性法得到的蛋白质比活性相当。比活性5 x 1 0 4 h u m g 。隧二色谱测定显示两稀复往法褥戮的蛋白质的二级络构成份和谱澎 一致，说明在两手申复性过程中竞成了r g d s a k 分予鸵正确辑叠。 关键询：r g d 葡激酶，包涵体，复饿，圆二色谱( c d 谱1 t h er e n a t u r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f r g d - s t a p h y l o k i n a s eb y g e lf i l t r a t i o n a b s t r a c t ：ar e c o m b i n a n tr g d * s t a p h y l o k i n a s e ( r g d s a k ) w i t ht h r o m b o l y t i ca n d a n t i t h r o m b o l y t i cb i f u n c t i o nw a se x p r e s s e dw i t he c o l i ，t h ee x p r e s s i o np r o d u c t i o n w a sf o r m e di n c l u s i o n b o d y i no r d e r t oo b t a i na c t i v em o l e c u l e t h er g d s a ki nt h e i n c l u s i o nb o d ys h o u l db ed e n a t u r e da n dt h e l lr e n a t u r e d + 善h er e n a t u r a t i o no f r g d s a k w a sp e r f o r m e db y g e lf i l t r a t i o n c o m p a r i n g w i t hat r a d i t i o n a l w a yo fd i l u t i o n r e n a t u r a t i o n ，g e lf i l t r a t i o nw a y i sb e t t e rt h a r lt h et r a d i t i o n a lw a y , s i n c et h e r ea r es o m e a d v a n t a g e s ，s u c ha ss i m p l ep r o c e s s i n g ，h i 灿r e c o v e r y , l o wc o s ta n dh i g h e rp u r i t ya f t e r r e n a t u r a t i o n ，a f t e rr e n a t u r a t i o n ，r g d s a kw a s p u r i f i e db yq s e p h a r o s ef f a n dt h e p u f f t yw a sm o r e t h a n9 5 a n a l y s i so f c d s p e c t r as h o w e d t h a tt h ef i n a l p r o d u c tf r o m t h et w or e n a t u r a t i o nw a y sh a v es i m i l a rc d s p c t r a i tw a sd e m o s t r a t e dt h a tr g d s a k m o t e c u l 嚣w e r e c o m p l e t e d c o r r e c t r e f o l d i n gt h r o u g hg e t f i l t r a t i o no rd i l u t i o n r e n a t u r a t i o n p r o c e s s ， k e yw o r d s ：r g d s t a p h y l o k i n a s e ，i n c l u s i o nb o d i e s ，r e n a t u m t i o n ，c ds p e c t r a 2 稀言 舭栓栓滤疾病是心脑舡管瘸致死和数残的主要原因之，大约3 0 的心血瞥 痫恿者死予惫性心肌梗死( a m i ) 。溶裣药怒能将已经形成的血梭溶解的药物。 这类药物溶解血栓主要是通过调动体内纤维蛋白溶勰系统( 纤溶系统) 生效。 目前i 临床常用和有可能近期用于临床的溶栓蓟有：锻激酶( s t r e p t o k i n a s e ， s k ) ，蓉香酝基纤滚酶嚣s k 活纯裁复会物( a p s a c ) ，尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) ， 单链尿激酶( s c u p a ) ，组织型纤溶酶原激活剂( h u m a nt i s s u e t y p ep l a s m i n o g e n a c t i v a t o r , t - p a ) ，蘩激酶( s t a p h y l o k i n a s e ，s a k ) ，蔽斑鞴蝠睡液纾溶酶蘸激活裁 ( d e s r n o s d u s s a l i v a r y p l a s m i n o g e na c t i v a t o r , d s p a ) 。 现有溶栓药物疗效显著，嘲显降低了a v i i 患者的死亡率和致残率，但还存 在许多缺陷，如初贻再灌注延迟和失败，出血等不良反应，以及露栓塞等闻题【”。 理想的溶栓药物应具备以下的要求f 2 】：( ) 高度的溶栓性，能迅遴而彻底 逮溶解耨鹫以及豫| 霉粒盘栓，撼莲再逶率，减少霉捡塞率，降低死亡率。( 二) 高度的选择性，即能选择性地溶解纤维蛋白，而对血液中的纤维蛋白原和其它凝 盘霞予不产生影响，不荔萼l 起蹬盘往著发瘥。( 三) 光免疫漂往，朝用蔚不产生 过敏反应，不中和药物的作用，不影响反复应用时的药效。( 四) 半衰期t ，2 长， 能较长时间的维持药效，减少用药次数。( 五) 性质稳定，便于保存和疵用，最 好是鞠服生效。 葡激酶( s t a p h y l o k i n a s e ，s a k ) 是一种由金黄色葡萄球菌中几种溶源性噬菌体 分泌瓣蛋壹缓，箕残熬蛋自矮囊1 3 6 令氮基羧缝或+ 相对分子羹隽1 5 0 0 0 。s a k 是一种纤溶酶原( p l a s m i n o g e n ，p l g ) 的辅助激活因予，在血浆中与p l g 形成1 ：1 复台魏，该袈合耪被盎块袭面痰錾纤溶酶( p l a s m i n ，p l m ) 激潘为s a k p l m ，s a k p i m 是高教纤溶酶原激活剂，特异切割p 培形成裔活性的p l m ，溶解斑栓。s a k 作为 一种纤溶酶原辅助激活园子，溶解血梭特异谶强，对富含窳小板的血栓溶解效聚 较其他溶检翁好。 葡激酶在人血浆中与人纤溶酶原形成1 ：l 的复合物是，如果没有纤维蛋白存 在醛，该复会物的活性迅速被a2 挠绎溶酶搀镧，鸯纤维爨自存程嚣，终维蛋窭 与a2 - 抗纤溶酶竞争纤溶酶原分子上的赖氨酸结合位点，使a2 抗纤溶酶难以发 挥捧索俸稻，复合物中酶纤溶酶藤激添成纤溶酶，因忿s a k 能商效激活斑栓周黼 的纾溶酶原，特异地溶解舡栓面不诱发系统蚀纾溶状态，即其纤游活性舆有纤维 蛋自专一性。此外由于s a k 分予量小，穿透性能好，对富禽血小掇的血栓，尤篡 是齄劫融盘检翻黢搭静默斑捡匏溶解毖其它溶捡蘩基鸯更强的疗效1 3 4 ，5 1 。我们安 验室已实现了s a k 在大肠杆菌中的高效表达，并完成了中试研究f6 1 。但烧s a k 是 异傣瀑自，耀予久体奏较强豹撬豢往，器室试鬻在保持麓激簿溶羧活淫靛蓊据下 改造葡激酶分子，设计小分子量，低抗原性的衍生物，以期开发新型口服溶栓药 物。 我室构建的r g