（水产养殖专业论文）应用elisa方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及，硎 学位论文 老 如需保密，解密时间 7 。扣年7 月；日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：荔知时间：如，7 年二月g 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 始趸君翩鼢彬彬 签名日期：汐刀年莎月g 日 签名日期： 阴7 年乡月g 日 应用e l i s a 方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章文献综述1 1 1 嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌简介l 1 1 1 嗜水气单胞菌1 1 1 2 柱状黄杆菌3 1 2 嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌检测的常片j 检测方法4 1 2 1 选择性培养基4 1 2 2 细菌生化鉴定及其相关用品5 1 2 3 单克隆抗体技术6 1 2 4 凝集试验6 1 2 5 免疫荧光技术7 1 2 6 聚合酶链反应( p c r 技术) 。8 1 2 7 核酸探针技术9 1 3 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 9 1 3 1 原理9 1 3 2e l i s a 的常见种类1o 1 3 3e l i s a 检测技术在微生物检测中的应用1o 1 4 本实验的目的与意义1 1 第二章嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌间接e l i s a 检测方法的研究1 2 2 1 材料与方法1 2 2 1 1 菌株与实验动物1 2 2 1 2 实验试剂1 2 2 1 3 实验试液1 3 2 1 4 实验仪器14 2 1 5 制备抗血清14 2 1 6 间接e l i s a 实验的操作程序1 4 2 1 7 兔抗血清( 一抗) 效价的测定1 5 2 1 8 间接e l i s a 方法最佳反应条件1 5 2 1 9 敏感性试验1 6 2 1 1 0 特异性试验1 7 2 1 11 重复性试验17 2 1 1 2 人工感染草鱼的病原检测17 2 2 结果与分析18 2 2 1 兔抗血清( 一抗) 的效价l8 2 2 2 间接e l i s a 方法最佳反应条件。19 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 2 2 3 兔抗血清敏感性2 4 2 2 4 特异性结果2 5 2 2 5 重复性试验2 7 2 2 6 人工感染草鱼的病原检测2 8 2 3 讨论：；1 2 3 1 兔抗血清的制备及其在间接e l i s a 法中的敏感性和特异性3 1 2 3 2 间接e l i s a 检测方法的影响因素3 2 2 3 3 草鱼人工感染病原菌后的间接e l i s a 检测3 3 2 4d 、结3 3 第三章嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌d o t e l i s a 检测方法的研究3 4 3 1 材料与方法3 4 3 1 1 菌株。3 4 3 1 2 实验试剂3 4 3 1 3 实验试液3 4 3 1 4 实验仪器3 5 3 1 5d o t e l i s a 的操作程序3 5 3 1 6d o t e l i s a 方法最佳反应条件的选择一3 6 3 1 7 敏感性试验3 7 3 1 8 特异性试验3 7 3 1 9 膜片保存期试验3 7 3 1 1 0 玻片凝集法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌。3 7 3 1 1 1 人工感染草鱼的病原检测3 8 3 1 1 2 野外采集样品的病原检测3 8 3 2 结果与分析3 8 3 2 1d o t e l i s a 方法最佳反应条件3 8 3 2 2 敏感性结果4 6 3 2 3 特异性结果4 7 3 2 4 膜片保存期试验4 8 3 2 5 玻片凝集法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌4 9 3 2 6 人工感染草鱼的病原检测4 9 3 2 7 野外采集样品的病原检测5 2 3 ：；讨论! ；：； 3 3 1d o t e l i s a 技术及其在检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌中的应用5 3 3 3 2 嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌不同检测方法的比较5 3 3 4d 、结5 4 参考文献5 6 j l 定谢6 4 硕士期间发表的论文和申请的专利6 5 u 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 摘要 本实验分别提取了嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌外膜蛋白( o m p s ) 作为抗原免 疫健康新西兰白兔，制备了兔抗血清。根据e l i s a 原理，分别设计了常规的间接 e l i s a 和d o t e l i s a 法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌。实验确定了两种e l i s a 方法的最佳优化条件、检测灵敏度、检测特异性、重复性和稳定性，并利用两种 e l i s a 法和玻片凝集法检测了人工感染嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的草鱼样品和 野外采集的草鱼样品。研究结果如下： 1 利用间接e l i s a 法对所制备的嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌兔抗血清进行效 价分析，其效价均为1 ：3 2 0 0 0 ，可用于后面的e l i s a 实验工作。 实验所确定的间接e l i s a 最佳反应条件为：针对两种细菌的兔抗血清最佳稀释 度均为l ：5 0 0 0 ，抗原的最佳浓度为分别为1 1 07 c f u m l ( 嗜水气单胞菌) 和 1 1 0 6 c f u m l ( 柱状黄杆菌) ；c b s ( o 0 5m o l l ，p h9 6 ) 为理想的包被液；最佳酶 标二抗( 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔i g g ) 稀释倍数为1 ：1 0 0 0 0 ：抗原抗体最适反 应时间、酶标二抗最适反应时间、底物最适反应时间分别为l h 、1 5 h 和1 5 m i r a 最 佳包被条件为3 7 湿盒包被2 h 。在最佳优化条件下，利用间接e l i s a 检测嗜水气 单胞菌和柱状黄杆菌的最低检测限分别达到1 o 1 0 s c f u m l 和5 0 x 1 0 4 c f u m l ，且该 方法与水产常见致病菌副溶血弧菌、哈维氏弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌 无交叉反应，具有较好的敏感性和特异性，同时，阻断实验也表明两种抗血清分别 对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌具有良好的特异性，且重复性较好。 2 实验所确定的d o t e l i s a 最佳反应条件为：最佳包被液为c b s ( o 0 5m o l l ， p h9 6 ) ；针对两种细菌的兔抗血清和酶标二抗的最佳稀释度均为l ：5 0 0 、l ：1 0 0 0 ； 抗原抗体最适反应时间、酶标二抗最适反应时间、底物最适反应时间分别为6 0 m i n 、 6 0 m i n 和1 5 m i n ；最佳包被条件为常温干燥1 h 或点样后3 7 干燥1 h 。在最佳优化 条件下，利用间接e l i s a 检测嗜水气单胞菌和杜状黄杆菌的最低检测限分别达到 1 o 1 0 4 c f - u m l 和5 o 1 0 3c f u m l ，表明该法的检测灵敏度较常规间接e l i s a 法要高， 且该法具有较好的特异性、重复性和稳定性。 3 间接e l i s a 、d o t e l i s a 和玻片凝集试验同时检测人工染病草鱼和野外采 集的草鱼样品。确认肠道和鳃分别是检测感染嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌后较为理 想的病原检测组织。间接e l i s a 、d o t e l i s a 和玻片凝集试验( 样品增菌后) 对野 外采集样品中嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的检测阳性率均分别为2 0 o 、2 6 7 ， 几种方法的检测符合率为1 0 0 。 以上结果表明，本研究所建立的两种e l i s a 法能对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌 进行准确、快速的检测，具有特异性好、灵敏度高的优点，尤其是d o t e l i s a 法不 应用e l i s a 方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌 需借助其他的实验仪器就能完成整个检测过程，更具实用价值。 关键词：间接e l i s a ；d o t e l i s a ；嗜水气单胞菌；柱状黄杆菌；玻片凝集试 验；快速检测 h 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep r e s e n ts t u d y , a f t e ra c h i e v e ds p e c i f i va n t i b o d yb yi m m u n i n gh e a l t h yn e w z e a l a n dw h i t er a b b i tw i t ho m p s a c q u i r e d f r o ma e r o m o n a s h y d r o p h i l a a n d f l a v o b a c t e r i u mc o l u m n a r i ss e p a r a t e l y , a i m e dt od e t e c ta h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r i s f l e e t l yb ym e a n so ft w ok i n do fe l i s a ( i n d e c te l i s aa n dd o t - e l i s a ) t e s tt h a tb a s e do n e l i s a p r i n c i p l e t h e n ，w eh a dc h o s e dt h eb e s tr e a c t i n gc o n d i t i o no fi n d e c te l i s aa n d d o t - e l i s aa n dd e s i g n e dt e s tt od e t e r m i n et h es p e c i f i c i t y , s e n s i t i v i t y , r e p r o d u c i b i i t ya n d s t a b i l i t yo ft h i st w ok i n de l i s ar e a c t i o n f u r t h e r m o r e ，i tw a sc a r r i e do u ta p p l i c a t i o nt e s t ， w h i c hd e t e c t e da h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r i si nt h eg r a s sc a r pi n f e c t e dp a t h o g e n i c b a c t e r i ab ym a n u a lw o r ka n dt h eg r a s sc a r pc a p t u r e df r o mf i e l d t h em a i nr e s u l t sw e r e s u m m a r i z e da sf o l l o w ： i d e t e r m i n e db yt h ei n d e c te l i s at e s t ，t h es e r u mt i t e ro ft h ep r e p a r e dr a b b i t a n t i - a h y d r o p h i l aa n dr a b b i ta n t i - f , c o l u m n a r i sw e r eb o t h1 ：3 2 0 0 0 i ti ss h o w e dt h a t p r e p a r e di m m u n es e r u mh a dh i g ht i t e rs oa st ob ev a l i df o rf o l l o we l i s a t e s t t oo p t i m i z er e a c t i o nc o n d i t i o n sf o ri n d e c te l i s af o rd e t e c t i o no f a h y d r o p h i l aa n d f c o l u m n a r i sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sw e r e ：d e n s i t yo fa n t i - r a b b i ts e r u ma n dg o a t a n t i - r a b b i t i g g - - h r pw a s 1 ：5 0 0 0a n d1 ：10 0 0 0 ；o p t i m a ld i l u t i o n so fa n t i g e nw a s 1 1 07 c f u m l ( a h y d r o p h i l a ) a n d 1 x l o o c f u m l ( f c o l u m n a r i s ) ；c o a t i n g b u f f e rw a s c b s ( 0 0 5m o l l ，p h9 6 ) ；t i m eo fa n t i g e n - a n t i b o d yr e a c t i o n ，g o a ta n t i - r a b b i ti g g - h r p a f f i n i t yp u r i f i e dr e a c t i o na n ds u b s t r a t ea c t i o nw a slh ，1 5 ha n d15 m i n ；c o a t i n gs i t u a t i o n w a sa c t i n g2 hu n d e rw e tc o n d i t o ni n3 7 c i nt h e s e o p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h e i n d i r e c - e l i s at e s t sd e t e c t i o nl i m i to f a h y d r o p h i l a a n df c o l u m n a r i sw a s a p p r o x i m a t e l y1 0 x10 c f u m la n d5 0 xl0 耳c f u m ls e p a r a t e l y b e s i d e s ，n oc r o s s - r e a c t i o n w a so b s e r v e dw h e no t h e rc o m m o na q u a t i ca n i m a l p a t h o g e n i cb a c t e r i a ,i n c l u d i n g e d w a r s i e l l at a r d a ，h b r i o p a r a h a e m o l y t i c u ，h b r i oh a r v e y ia e r o m o n a ss o b i l aw e r e a p p l i e d m e a n w h i l e ，t h es p e c i f i c - b l o c k i n gt e s ts h o wn i c es p e c i f i c i t ya n dr e p r o d u c i b i i t yo f t w ok i n d so fa n t i r a b b i ts e r u m 2 t h eo p t i m i z er e a c t i o nc o n d i t i o n so fd o t e l i s af o rd e t e c t i o no f a h y d r o p h i l aa n d f c o l u m n a r i sw e r e ：c o a t i n gb u f f e rw a sc b s ( 0 0 5m o l l ，p h9 6 ) ；d e n s i t yo fa n t i - r a b b i t s e r u ma n dg o a ta n t i r a b b i ti g g - h r pw a s1 ：5 0 0a n d1 ：10 0 0 ；t i m eo fa n t i g e n - a n t i b o d y r e a c t i o n ，g o a ta n t i - r a b b i ti g g - h r pa f f i n i t yp u r i f i e dr e a c t i o na n ds u b s t r a t ea c t i o nw a slh ， 1 5 ha n d15 m i n ；c o a t i n gs i t u a t i o nw a sd r y i n glhi nr o o mt e m p e r a t u r ea f t e ra d d i n g s a m p l e so rd r y i n glhi n37 i nt h e s eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h ed o t e l i s at e s t sd e t e c t i o n l i m i to fa h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r i sw a s a p p r o x i m a t e l y 1 0 x10 4 c f u m la n d 5 0 x10 3 c f u m ls e p a r a t e l y , w h i c hs h o w e dt h es e n s i t i v i t yo fd o t e l i s aw a sb e t t e rt h a n i i i 应用e l i s a 方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌 i n d e c te l i s a b e s i d e s ，t h ed o t - e l i s ah a dn i c es p e c i f i c i t y , r e p r o d u c i b i i t ya n ds t a b i l i t y 3 i tw a sd e t e c t e da h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r & i nt h eg r a s sc a r ps a m p l e si n f e c t e d b ym a n u a la n dc a p t u r e df r o mt h ef i e l db yi n d e c te l i s a ，d o t - e l i s aa n ds l i d e a g g l u t i n a t i o n t h er e s u l t sm a n i f e s t e di n t e s t i n e sa n dg i l lt i s s u ew e r et h eo p t i m a ls p o tt h a t d e t e c t e da h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r i si nt h ei n f e c t e dg r a s sc a r p i ti si n d i c a t e dt h a tb y i n d e c te l i s a ，d o t - e l i s aa n ds l i d ea g g l u t i n a t i o n ( a f t e rb a c t e r i a lc u l t i v a t e d ) ，t h ep o s i t i v e r e a c t i o no fa h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r i si nt h ew i l dg r a s sc a r pi s2 0 o a n d2 6 7 s e p a r a t e l y , a n dt h ec o i n c i d e n c er a t eo ft h e mi s10 0 t h i ss t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tt h e s et w oe l i s ac a nb ec o n s i d e r e da su s e f u lm e t h o d f o rd i a g n o s i so f a h y d r o p h i l aa n df c o l u m n a r i s ，w h i l et l l e ys h o wn i c ea c c u r a c y , r a p i d i t y , s p e c i f i c i t y , s e n s i t i v ea n dr e p r o d u c i b i i t y , e s p e c i a l l yd o t - e l i s a ，w h i c hc a ng u i d e st h e w h o l e d e t e c t i n gp r o c e d u r ew i t h o u ta n yo t h e re x p e r i m e n te q u i p m e n t m o r e o v e r , d o t - e l i s ah a sab e t t e rs e n s i t i v ea n df a s t e rp r o c e s ss oa st oh a st h ev a l u eo fp r a c t i c a la n d u s i n ge x t e n s i v e l y k e yw o r d s ：i n d e c te l i s a ；d o t - e l i s a ；a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ；f l a v o b a c t e r i u m c o l u m n a r i s ；s l i d ea g g l u t i n a t i o n ；r a p i dd e t e c t i o n i v 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 第一章文献综述 嗜水气单胞菌( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) 和柱状黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m c o l u m n a r i s ) 是水产养殖中常见的两种水产动物致病菌，其分布广泛、危害巨大， 每年水产养殖者因其造成的损失十分惨重。随着研究的深入，人们已经认识到其引 发的问题和后果，并随着生化技术、生物技术的发展，研究者也不断寻求各种检测 技术对这两种致病菌进行研究。酶联免疫吸附技术( e l i s a ) 是近3 0 年研究者发明 的一种检测新技术，并已成功运用到诸多领域的检测。本文就嗜水气单胞菌和柱状 黄杆菌的研究概况及其危害、病原的常见检测技术和e l i s a 实验的应用现状进行综 述。 1 1 嗜水气单胞茵和柱状黄杆菌简介 1 1 1 嗜水气单胞菌 1 1 1 1 嗜水气单胞菌的分类地位、生物学性状及其血清型 嗜水气单胞菌属于弧菌科( v i b r i o n a c e a e ) 气单胞菌属( a e r o m o n a s ) ( 张翠娟等， 2 0 0 8 ) 。根据有无运动力可将气单胞菌属分为嗜冷性、无运动力的嗜冷群 ( p s y c h r o p h i l i cg r o u p ) 和有运动力的嗜温性( m e s o p h i l i cg r o u p ) 。前者主要指引起 鲑鳟等冷水性鱼类的疗疮病( f u r u n c u l o s i s ) 的杀鲑气单胞菌( a e r o m o n a s s a l m o n i c i d a ) ，并分为无色亚种( a c h r o m o g e n e s ) 、日本鲑亚种( m a s o u c i d a ) 、杀鲑 亚种( s a l m o n i d a ) 和史氏亚种( s m i t h ) 等4 个亚种；后者则种类繁多，种间分类极 为细致繁杂。嗜水气单胞菌属于第二类，是气单胞菌中最重要的一种，也是气单胞 菌属的模式种。 嗜水气单胞菌是兼性厌氧的革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，直或略弯，单个或 成对排列，长约o 5 1 o 岬。无荚膜，不产生芽孢。电子显微镜下可见极端单鞭毛， 部分侧鞭毛，有运动力，生长适宜p h 为8 0 ，最适生长温度为2 5 ( c a n a l sr ，2 0 0 6 ； 李联泰，安贤惠，2 0 0 7 ) 。嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，形 成圆形、边缘整齐、中央隆起、表面湿润、光滑、半透明、颜色由灰白色至浅 黄色的菌落，并有特殊气味。多数菌落可在普通营养琼脂培养基上产生浅黄色 色素，少数菌落经4 c 进一步培养表现为淡红色。血琼脂平板上生长旺盛，部 分菌株在1 0 以下培养可产生清晰的b 溶血环。 鉴于运动性气单胞菌细胞表面成分复杂，因此其血清学分型比较复杂，血 清型呈多样性。国际上较早研究了运动性气单胞菌的血清学分型情况，日本国 立康复研究院( 简称n i h ) 研究组、荷兰国立公共健康和环境卫生研究院( 简 称n i p h e h ) 系统地研究气单胞菌嗜温群的血清学分型( s a k a z a k ie ta 1 ，1 9 8 4 ； 应用e l i s a 方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌 g u i n e ee ta 1 ，1 9 8 7 ) ，n i h 和n i p h e h 研究组分别发现该菌拥有4 4 个和3 0 个 o 血清型。英国学者t h o m a s 在n i h 系统4 4 个。血清型的基础之上将o 血 清型扩大到9 6 个( t h o m a se ta 1 ，1 9 9 0 ) 。国内多数研究者( 钱冬等，1 9 9 5 ；董 传甫等，2 0 0 4 ) 认为引起暴发性鱼病的嗜水气单胞菌菌株按o 抗原不同可分为 o ：5 和o ：9 两个血清型，其中o ：5 的代表菌株j 1 对鲫鱼的l d 5 0 达5 1 0 3 c f u ， 目前已成为疫苗制备菌株。 1 1 1 2 嗜水气单胞茵的致病因子 早在1 8 9 1 年，人们就认识到了嗜水气单胞菌的致病作用，并开展了大量的研 究工作，尤其是近年来，对嗜水气单胞菌的致病因子研究方面，取得了较大的进展。 研究表明，嗜水气单胞菌可产生各种毒力因子，包括外毒素、胞外蛋白酶、各种粘 附因子等( 任燕，2 0 0 5 ) 。人们对其外毒素的研究比较深入，不同研究人员赋予其 不同的名称，如：气溶素( a e r o l y s i n ) 、溶血素( h e m o l y s i n ) 、细胞毒素( c y t o t o x i n ) 和肠毒素( e n t e r o t o x i n ) 等( b u c h f e ya n dh o w e r d ，1 9 9 9 ) 。涂小林和陆承平( 1 9 9 3 ) 将嗜水气单胞菌的外毒素称为h e c 毒素。上述毒素的结构、功能及生物活性都有 着许多相似之处：单一多肽物质；许多菌株具d 或a 溶血；具细胞毒性，可使动物 肠道处形成积水；小剂量纯化外毒素即可引起实验动物在短时间内死亡；与霍乱毒 素存在着一定的交叉反应；5 6 处理1 0 3 0 m i n 活性丢失等( c h o p r a e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 胞外酶是嗜水气单胞菌重要的致病因子之一。就其致病性而言，胞外蛋白酶有 的具有直接致病性，有的不具有直接致病性( c a s c 6 ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ，但可以活化其他 致病因子。这些胞外酶的种类及性质随菌株、生长期、培养条件等差异而有所不同 ( 孟喜龙等，2 0 0 7 ) 。 嗜水气单胞菌的粘附因子包括菌毛、s 层蛋白、外膜蛋白( o u t - m e m b r a n e p r o t e i n ， o m p ) 和脂多糖。其中外膜蛋白被认为是重要的粘附因子和保护性抗原而成为近期 研究的热点，其功能和作用逐步为试验所证实( i d n n a l ac ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 1 1 3 致病范围及病症 嗜水气单胞菌是一类广泛存在于水环境的病原菌，也是危害鱼类、两栖类、爬 行类和哺乳类的致病菌，该菌分布广泛，世界各地各种淡水鱼均有感染。自1 9 8 9 年以来，淡水鱼暴发性传染病在我国广为流行，造成严重的经济损失。特种名贵鱼 类如香鱼( 郑成昌，林恒雄，1 9 8 7 ) 、黄鳝( 陈怀青，陆承平，1 9 9 1 ) 、鳜( 黄文芳 等，1 9 9 9 ) 等也可感染本病。目前，已经确诊曾感染本菌的重要养殖鱼类有鲫、鲢、 鲤、草鱼、虹鳟、尼罗罗非鱼、狼鲈等，而其他水产动物如对虾、蛙类、鳖类( 虞 蕴如等，2 0 0 4 ) 及哺乳动物也都有因感染而患疾病的报道。 溶血性腹水症和细菌性败血症是嗜水气单胞菌引起的常见水产动物病症，该病 的发病率和死亡率均很高，是我国养鱼史上危害鱼的种类最多，年龄范围最大，流 行地区最广，流行季节最长，危害养鱼水域类别最多，造成的损失最严重的一种急 性传染病( 黄琪琰等，1 9 9 3 ) 。中华鳖出血性败血症( 陆宏达，金丽华，1 9 9 6 ) 、腐 皮病( 储卫华，杨金先，2 0 0 1 ) 、穿孔病( 孙佩芳等，1 9 9 6 ) 、红脖子病、红底板病 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 ( 叶巧真等，2 0 0 0 ) 、白底板病、鱼类皮肤溃疡的慢性型及鳃的“红皮炎”的病原也 皆是嗜水气单胞菌( g r a e v e n i t z ，2 0 0 7 ) 。此外，人感染嗜水气单胞菌而发生腹泻、 食物中毒、继发感染的病例也日渐增多( k i r o ve ta 1 ，2 0 0 3 ：杨守明，王民生，2 0 0 6 ) 。 可见，嗜水气单胞菌因其具有宿主范围广，感染力强的特点，已成为淡水鱼类 养殖业病害的主要病原，并受到广大专家和学者的高度重视。 1 1 2 柱状黄杆菌 1 1 2 1 嗜水气单胞菌的分类地位、生物学性状及其血清型 柱状黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u mc o l u m n a r e ) 的学名曾多次被学者更改，曾用名有 鱼害粘球菌( m y x o c o c c u s p i s c i c o l a ) ( 陈月英，1 9 8 1 ) ，柱状软骨球菌柱状粒球粘细 菌( c h o n d r o c o c c u sc o l u m n a r i s ) ( 何君慈，邓国成，1 9 8 7 ) ，柱状嗜纤维菌柱状纤维 粘细菌( c y t o p h a g ac o l u m n a r i s ) ( 陈昌福等，1 9 9 5 ) 和柱状屈挠杆菌( f l e x i b a c t e r c o l u m n a r i s ) ( b e m a r d e te ta 1 ，1 9 9 6 ) ，并最终定名为柱状黄杆菌( d e c o s t e r ee ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。根据伯杰氏鉴定细菌学手册第九版，柱状黄杆菌被归于第1 5 群( g r o u p 1 5 卜非光合作用、不产子实的滑行细菌群的第l 亚群，是单细胞杆状滑行细菌亚群 的噬纤维菌属中2 3 个种的常见致病种( 张晓君，2 0 0 4 ) 。 柱状黄杆菌为中等大小但偏长些的杆菌，菌体长为2 1 2 i t m ，宽约为0 4 i t m ，两 端不尖，无荚膜及芽孢，大小形态一致，培养后会变形，如：菌体变得细长弯曲、 指状等等，还出现退缩球形，以致无定形。这种细菌具有两种运动方式：一种为一 端附着另一端摆动，另一种为滑动( g r i f f i n ，1 9 9 2 ) 。菌体在噬纤维茵培养基平板上 生长良好，2 5 培养4 8h 出现稀薄的、平铺在培养基表面上呈蔓延生长的菌落，菌 落边缘不整齐、假根状、中央较厚、呈颗粒状、大小不一，菌落最初与培养基的颜 色相近、粗看不易发现，以后逐渐变为淡黄色，茵落随培养时间的延长不断增大、 菌层增厚、颜色也加深( 倪达书，汪建国，1 9 9 9 ) 。 a u s t i n ( 1 9 8 7 ) 在对从美国c o l u m b i a 河的鱼类中分离的3 2 5 株以及从德克萨斯 州分离的1 株该菌进行研究时，发现这些菌株作为种的特征存在一种共同的凝集抗 原及8 种型的特异性抗原，在抗原结构上除2 个菌株不能归型外，其余菌株可分为 4 个血清型。陈昌福( 1 9 9 8 ) 通过对从1 9 7 2 年到1 9 9 2 年分离自不同患病淡水鱼 上的4 0 个菌株进行交叉凝集和琼脂内扩散反应，证明从我国各地收集的柱状黄杆 菌存在三种血清型，即：g r 1 ，g r 2 及g r 3 ，且柱状黄杆菌的血清型与其菌苗 抗原性没有明显相关性。 1 1 2 2 柱状黄杆菌的致病因子 近年来，国内外研究者研究了柱状黄杆菌的致病因子，发现柱状黄杆菌致病力 依菌株的不同而有较大的差异，表现为强毒株与弱毒株在对鳃的粘附力上存在的不 同，而细菌的粘附能力与其表面的多糖成分相关( d e c o s t e r ee ta 1 。1 9 9 9 ) ，从而表明 柱状黄杆菌表面的多糖成分是其致病因子之一。此外，柱状黄杆菌还可释放一种降 3 应用e l i s a 方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌 解酸性多糖的酶类，这些酶可降解透明质酸及硫酸软骨素( n e w t o ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ， s t r i n g e r - r o t h 等( 2 0 0 2 ) 据此认为该酶可能与柱状黄杆菌的毒力相关。 还有研究发现柱状黄杆菌的致病因子还包括其外膜蛋白。刘国勇等( 2 0 0 7 ) 为 了鉴定柱状黄杆菌的毒力相关因子，利用蛋白质组学方法分析了强毒株g 4 r 3 和弱 毒株g 1 8 的外膜蛋白。双向电泳结合图像分析，共发现了8 个差异表达的蛋白点。 经过胶内酶解和质谱分析，其中的1 个蛋白点被鉴定为l c m a 蛋白，它可能是柱状 黄杆菌的一种毒力因子。 1 1 2 3 致病范围及病症 柱状黄杆菌分布面极广，世界范围内皆有( a n d e r s o na n dc o n r o y , 1 9 6 9 ) 。宿主 分布于鲑科( s a l m o n i d a e ) 、鲤科( c y p r i n i d a e ) 、鲶科( s i l u r i d a e ) 、脂科( s e r r a n i d a e ) 、 太阳鱼科( c e n t r a r c h i d a e ) 、鲈科( s e r r a n i d a e ) 等鱼类。淡水鱼均对柱状黄杆菌比 较敏感。自然和养殖条件下淡水、海水鱼以及观赏鱼都是其感染对象。 由该菌引起的鱼类疾病基本上表现为鱼类的细菌性烂鳃病，此病范围极广。在 我国，草鱼、青鱼、鳙、鲢等四大家鱼均有染病报道，但主要危害草鱼，尤其是夏 花鱼种。此外，鲑科、鲤科、鲶科、脂科、太阳鱼科、鲈科等鱼类均能患上细菌性 烂鳃病，特别是斑点叉尾鲴( 刘礼辉等，2 0 0 8 ：b a d e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 、鳜( 陈昌福等， 1 9 9 5 ) 、加州鲈( 邓国成等，1 9 9 6 ) 等名贵鱼种和一些观赏鱼类。患病鱼的鳃丝腐烂 并带污泥，黏液很多，有时在鳃瓣上也可见到淤血斑点，严重时鳃丝软骨外露，鳃 盖内表皮被腐蚀，形成一个透明“小窗”，所以有“开天窗”之称，每年由该病造成的 损失极大。 除能造成诸多鱼类的细菌性烂鳃病外，柱状黄杆菌还可中继感染造成其他病 变，如鳗鲡的腐鳍病，鲤或虹鳟幼鱼的口腐病、鳞片脱落及其他一些鱼类的皮肤溃 烂和白头白嘴病等( 谢海侠，2 0 0 5 ) 。 1 2 嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌检测的常用检测方法 1 2 1 选择性培养基 选择性培养基是用不同培养基成分和培养条件，达到抑制多数细菌生长，而有 利于某一种或某一类细菌生长为目