（光学专业论文）比率荧光光谱仪测量细胞内游离钙离子浓度的研究.pdf

摘要 钙离子律荛蠡胞表第二信使据外源信号( 激索、光、溢壤等环境利激) 转交 成胞内信号，导致一系列胞内事件的发生。大量的研究表明，c a 2 + 的信使功能 是通过调控细戆蠹游离留+ 浓疫寒实巍懿。e 堆号装产生和终止是缎脆袁 c a 2 + 增减、振荡的结果。因此测量细胞内的c a 2 + 浓度是十分蘸要的。 赫的荧光絷料的开发和戏像技术越发晨，极大豹促避了对懿戆内钙傣号传 导途径的研究。本文前半部分简要回顾了c a 2 + 荧光测量方法的历史与发展，介 绍了c a 2 + 作为细胞内第二信使的作用机理及对细胞内c a 2 + 浓度进行荧光测量 的原理并对我们的实验系统做了简洁的说唆。本文后半部分主要围绕蔫比率荧 光光谱仪测量如胞内游离c a 2 + 的研究进行了以下工作： ( i ) 建立了跑率荧毙党谱仪测量细施内游离钙离子浓度瓣实验系统； ( 2 ) 建立了乳鼠心肌细胞原代培养的模型，并对培养细胞进行了细胞内 c a 2 + 浓度翡测萋。在心甄纲旎鳋液串如入粒( 去耱瞥上艨素) 君测缮蕊耀砖 荧光强度明显升高，该现象符合n e 的生理作用特点，因而表明我们所建立 的测量麴匏内c 矿浓度莉态变靶昀心魅缬戆实验系统是可行妁，该系统琵i ；乏 用于测量加入不阊药物后心肌细胞内c a 2 + 浓度的变化状况，从生物医学的角 度进行分析可以研究药物对细旎的作耀规理。 ( 3 ) 通过用f u r a 2 ，a m 对b 1 6 细胞内c a 2 + 浓度的测量，确定了b 1 6 细胞 的制备及荧光染料的载入方法；建立了用随机软件l m a g e m a 8 t e r 获取被测细 胞的凿象及进行比率分析的穷法，月醚祝较件& l i x 获取被测细胞酶荧光滏 谱及进行比率分析的方法 关链词：c a 2 + 、f 瓣a 2 琏m 、心6 2 絮胞、b 1 6 絮胞、莪羲心麓缎戆 a b s t r a c t c a l c i u ma sas e c o n dm e s s e n g e r 仃a n s f e r se x t e m a ls i g n a l ( h o 肌o n e 、 l i g h t 、t e m p e r a t u r ea 芏1 do m e r e n v i r o n a ls t i m u l a t e s ) t oi 船a c e l l u l a rs i g n a l ，a n d i n d u c e sas e r i e so fi n t r a c e l l u l a ra 脑i r s a b u n d 锄tr e s e a “：h e si n d i c a t e dt l l a tt h e m e s s e n g e r 如n c t i o n o fc a 2 + i sr e a l i 勰d b y a 棚u s t i n g 孤dc o 矗n l l i n g t | l e i n t r a c e i l u l a rc a 2 + c o n c e n t r a t i o n t h ep r o d u c e 锄de n do f c a 2 + s i g n a l r e s u l t e d i n a d d a n d s u b t r a c ta n d s u 略e o fi n t r a c e l l u l a rc a 2 + s on l em e a s u r e m e n to f i n t r a c e l l u l a rc a 2 + c o n c e n t r a t i o ni sv e r yi m p o r t a n t t h ed e v e l o p m e n to fn e wn u o r e s c e n c ed y ea n di m a g i n gt e c h n i q u eh a v e g r e a t l yp r o m o t e d m er e s e a r c h mm ef i e l do fc e l l u l a rc a l c i u m s i g n a lt r a n s d u c t i o n p a m i nt i l e f i r s t p a r to f t t l i st 1 1 e s i s ，也eh i s t o r y 肌dd e v e l o p m e n to f 也ec a 2 + n u o r e s c e n c em e a s u r e m e n tw e r ei n t m d l l c e d ，t t l e铀c t i o no fc a 2 + a s i n 的c e l l u l a rs e c 叻d m e s s e n g e r i nn l es i 驴a l 衄1 s d u c t i o n p a t ha i l dt 1 1 et 1 1 e o 拶o f c e l l u l a rc a l c i u mn u o r e s c e n c em e a s u r e m e n tw e r ep r e s t e d 狮do u re x p e r i m e n t s y s t e mw a sr e p o r t e d r e s e a r c ho nm e r a t i om e m o do f m e a s u r i i l gi m r a c e l l u l a r c a 2 + c o n c e n t r a t i o nw i t l lr a t i on u o r e s c e n c ei m a g e m 船t e rw a s r e p o r t e di n 协e l a s t c h 印t e r s ，w h i c h i n c l u d et h ef o l l o w i n g s ： ( i ) t h er a t i o e x p e r i m e n t s y s t c m o f m e a 跗i n g i 嘶a c e l l u l a rc a 2 + c o n c e n t r a t i o n 、 ，i t hr a t i on u o r e s c 明c e i m a g e m a s t 钉、】l ，勰e s t a b l i s h e d ； ( 2 ) t h ep r i m a r yc u l t u r em o d e o f s u c k l i i l gm o u s e c a r d i a cm u s c l ec e l lw a s e s t a b l i s h e da n dt l l ec a 2 + c o n c e f i 仃a t i o ni ns u c h i n gm o u s ec a r d i a cm u s c l ec e l l w a sm e a s u r e d a r e ra d d i n gn e ( n d r e p i n e p h r i n e ) t oc a r d i a cm u s c l ec e l l ，t 1 1 e 辖i a 毫i v e 羲u o f e s c e 魏c ei n 豫l s i 锣w a s 蠡懋搬l i ei 搀e a s e d 。襄l ep 魏e n o 辙e 珏o na 孚藤 w i m p h y s i o l o g i c a la c t i o n 庇a t u r eo f n e s oo l l re x p e r i m e n ts y s t e mw a sp m v e d t h ec h a n g eo fi n t r & l k l a rc a 2 + c 锄c e 聃极越。ne a l lb e 越e a s u 揩da f 塘f 囊趱n g d i f r e r e n tm e d i c i n ew 浊o u r e x p e r i m e n ts y s _ t e m a n dt h em e c h a n i s mo fa c t i o no f m e d i c m et oc e l lc a nb er e 8 e 棚? c h e df - 0 咖b i o m e d i c i n e ： ( 3 ) t h e c a 2 + c o n c e 瓣a t i o ni nb 1 6c e l lw 黼m e a s u r e dw i t h f a t i o n u o r e s c e n c ei m a g e m a s t e r 驰l ep r e p a r a t i o no fc e l l 甜mt h ec a r r ym e m o do f 蠡u o r e s c e n c ei 聃撒c 栅、转糟c o n 蠡趟l 嚣d ；毛h ea 哪i s i 畦嬲lo fe e l li 搬a g ea n d 饿e r a t i o a n a l y s l s m e m o d b ys o f t w a r e d m a 耋；e m 船t e r w e r e e s t a b l i s h e d ； m e 粒唾滚s i 垃。鞋o fc e l l o 耋e s c 镛e el 撵a g 嚣8 l 游氇e 豫i o 躲蠢y s i s 搬e 盎o d 姆 s o f 、) i r a r e - f e l i xw e e s 协b l i s h e d k 哕聃羽s ：e 鑫2 + 、f 氍a 。2 ， m 、1 9 6 2 c e l l 、s 璐醢矗塔m o 獬ee 喇i a c m h s c l e c e i l 、b 1 6 c e l l 独创性说明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研 究工作及取得研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得西北大学或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我工作过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：郝穆 签字日期2 。鸣年5 月弓。日 两北大学硕士学位论文第一章引言 第一章引言 上世纪7 0 年代初，c a 2 + 受体蛋白一一钙调素( c a m ) 的发现及其 功能研究使r a s m u s s e n 在1 9 7 8 年提出c a 2 + 第二信使学说。钙是人体 重要的活性物质，细胞内c a 2 + 浓度虽然比细胞外c a 2 + 浓度约低1 万倍， 但它却是细胞内重要的第二信使，参与和调控了细胞内外许多重要的 生命过程，例如，受精时钙离子激发生命，并控制细胞的生长分化； 钙离子信号调控细胞的运动，并能触发细胞损伤和死亡等病理过程。 因此近年来，钙作为第二信使在细胞信号转导中的作用直是生物光 学、细胞分子生物学及临床医学等学科重要的前沿热点课题【卜”】。 细胞内的钙离子信号具有时间、空间和振幅特异性，不同种类的 细胞具有与其生物功能相适应的钙离子信号。因而，准确测定细胞内 钙离子浓度在空间和时间上的变化具有非常重要的生物学意义。1 9 6 7 年，r i d g w a n g 和a s h l e y 通过向藤壶肌纤维中微注射水母发光蛋白，第 一次准确测定了细胞内的钙离子浓度1 1 6 j 。上世纪八十年代，i n d o l 和 f u f a 2 等c a “荧光指示剂的发现，使用光学方法准确定量分析细胞内 c a 2 + 浓度成为可能。这些c a 2 + 荧光指示剂和新发展的光学显微技术使 我们在亚细胞水平实时、原位、无损伤的研究细胞内c a 2 + 浓度成为可 能。 1 1 研究目的和意义 钙是人体内极其重要的金属元素，广泛分布于有机体的细胞及体 液中。c a 2 + 除了作为骨骼、牙齿的主要结构材料外，还作为细胞信号 转导的第二信使，参与和调控细胞内外许多重要的生命过程。测定其 含量及变化具有多方面意义：无论是细胞外信号或是细胞内调节物， 无论是电的、机械的或是化学的刺激，凡能引起细胞内c a 2 + 浓度的变 化，则由c a ”介导的或依赖于钙的酶、蛋白质和有关的生理生化反应 也会发生相应的改变。因此，细胞内游离c a 2 + 浓度的变化，代表着各 两北人学硕士学位论文第一章引言 种特定细胞功能的启动、加强或抑制。通过提高或抑制细胞内游离c a ” 浓度来观察相应生理应答反应的变化，有助于了解c a ”对正常生理反 i 应的调节过程；某些疾病的发生、发展往往是由于细胞内c a ”浓度过 高所致。通过测量细胞内游离c a ”的浓度，可以提供它与疾病问相关 联的直接证据，并有助于疾病的诊断、治疗和愈后判断；现已证明许 多药物的治疗作用是通过影响细胞内c a 2 + 而实现的，借助不同的药物 和不同的测试手段，可以了解到该药是阻断细胞外c a “内流还是抑制 细胞内钙库的内钙释放，是作用于c a 2 + 通道本身，还是加强或抑制了 钙依赖性酶，进而从生物医学的角度进行分析就可以研究药物对细胞 的作用机理。因此研究c a 2 + 浓度与细胞功能的关系具有十分重要的意 义。 现阶段国内测量细胞内钙离子浓度的研究已有不少，例如河北师 范大学孙大业、上海植物生理所、北京大学生命科学院等几个课题组 都从生物学的角度通过测量细胞内钙离子浓度在细胞信号转导方面做 了很多的工作。但这些都是从生物学的角度进行的研究，且多使用的 是激光扫描共聚焦显微镜等仪器，相比较我们的测试手段一一比率荧 光成像光谱仪更为先进，且从物理学的角度入手可以通过测量在各种 情况下的细胞内钙离子浓度变化，建立数据库，分析变化规律，建立 相应物理模型，研究细胞信号转导的物理机制，进而带动一系列新的 研究领域。但由于本课题属于交叉学科，涉及光学、细胞生物学及分 子生物学等多种学科，对于我们物理系学生来说生物方面的工作有很 大的困难，且建立细胞内液与细胞外液钙离子变化的数据库，分析其 变化规律，建立相应物理模型需要做大量的工作，硕士期间时间有限， 所以本论文的目的是希望通过使用比率荧光光谱仪测量细胞内游离钙 离子的浓度，建立起比率荧光测量方法的实验系统，从而能够确定细 胞内游离c a 2 + 的位置，测量细胞内c a 2 + 浓度、监控细胞内c a 2 + 的改变。 为今后的研究工作提供可行的测试方法。我所要做的工作主要有以下 几点：( 1 ) 确定被测细胞的制备及荧光染料的载入方法；( 2 ) 建立用 随机软件i m a g e m a s t e r 获取被测细胞的图像及进行比率分析的方法； ( 3 ) 建立用随机软件f e l i x 获取被测细胞的荧光图谱及进行比率分析 2 西北大学硕士学位论文 第章引言 的方法。 1 2 目前常用的钙离子浓度的荧光测量方法 快速准确的测量静息态和激发态细胞内c a 2 + 的浓度、时空分布及 其与细胞功能的关系，是当今生物光学研究的热点之一。细胞经特定 c a 2 + 荧光探针标记，测量其荧光信号，即可获得胞内第二信使c a 2 + 受 神经递质、化学因子、生长因子及各种激素等作用后的含量和分布时 空依赖性变化的信息，从而为揭示生命现象的本质提供理论依据。 细胞内发生在毫秒时间内分子间相互作用的活动是用钙来调节的 f ，墙】。要了解细胞内钙的功能，就要确定体内游离钙浓度在何时何处 发生改变。 测量c a 2 + 在何处发生变化，通常意味着测量样品在二维光化学方 面的改变，或三维重构方面的改变。这常常需要光子传感仪和二维光 子检测仪。这些仪器对活细胞或组织切片内产生的入射光的振幅量很 敏感。摄像机( 模拟的或晶体管的) 和位置敏感的光子检测仪( 主要 是二维位置敏感的光电倍增管) 是最常见的仪器。样品可以在直立或 倒置的显微镜下观察。数据可以以模拟形式或数字形式纪录，并进行 获取后的分析和处理。 测量c a 2 + 何时发生变化，常常涉及确立某种生理状态与相应的 c a 2 + 变化的时间关系。例如受精时，卵细胞突然定位的将c a “释放到 胞浆中。跟踪和检测这种变化包括在特定的分子机理发生变化的时间 段进行监控。 显然，在活细胞中c a 2 + 是不能直接观察到的。因此必须与一种分 子相互作用才能反应出来，而这种分子的光学特性以一种特殊的方式 发生改变。这种相互作用能引起光吸收的改变，即荧光发射的改变， 或单光子发射的改变。 理论上对细胞内c a 2 + 测量方法有如下要求： 在使用c a 2 + 特异性指示剂时，指示剂对c a 2 + 专一结合性强、 亲和力高，可以测量低浓度c a ”； 应能获得c a 2 + 浓度绝对值； 3 曲北人学硕士学位论文 第一章引言 对c a 2 + 水平改变的反应必须比细胞内c a 2 + 信号引起相关生 理反应要快： 指示剂与c a 2 + 结合不损伤细胞内正常生理生化过程： 容易进入细胞并在细胞溶质内扩散，但为了测量细胞溶质 部分c a 2 + 浓度，指示剂不应跨内膜系统而进入细胞器； 有可能显示胞内c a 2 + 分布。 实际上，完全符合上诉要求并适合各种实验要求的方法是很困难 的。人们常常要根据各种方法的优点和局限性，根据具体的实验要求 选择不同的方法。细胞内c a 2 + 荧光检测方法主要包括荧光分光光度计 法、流式细胞仪法、荧光显微镜法、激光扫描共聚焦显微镜法、多光 子激光扫描共聚焦显微镜法、比率荧光光谱仪法等。 1 2 1 荧光分光光度计法 利用比色法测量悬浮液中细胞群体的平均荧光强度，其结果受细胞 密度、大小、状态，钙离子指示剂装载量，着色细胞所占比例等因子影 响，很难得到准确数值，现在已很少使用。 1 2 2 流式细胞仪法 流式细胞仪法用于测量流动溶液中悬浮细胞的荧光和散射光【l9 1 ，其 原理是利用压力使细胞悬浮液通过一根极细的小管，使之成为单细胞液 流，利用激光作为激发光源使细胞产生荧光，利用灵敏的光电管以对单 个细胞的荧光进行检测，还可以设置2 3 个光路系统同时获得多个信息， 可以用于钙离子浓度测量，特异蛋白含量测量以及在细胞多参数定量分 析的基础上将群体中特定的细胞亚群单独分选出来，例如，t a r n o k 利用 流式细胞仪法无菌分离药物刺激后细胞内c a 2 + 浓度升高的细胞，然后扩 大培养【2 们。流式细胞仪法分析药物对细胞内 c a 2 + 】的影响的一个局限性 在于药物加入点和【c a 2 + 】测量点之间存在延时。因为必须先对样品管减 压加入药物，然后重新加压才能获得原来的细胞流，因而细胞在到达激 光束区域前已走过了几十厘米，导致l o 2 0 秒的时间延迟，无法精确 4 两j e 人学硕士学位论文第一章引言 测量药物加入瞬间细胞内部的c a 2 + 响应。流式细胞仪法的另一个局限性 在于只适于测量整体细胞的c a 2 + 响应。 1 2 3 荧光显微镜法 荧光显微镜显然能进行单细胞荧光图像分析，但由于一般传统的 荧光显微镜使用的是大面积场光源，在所观察的视野范围内，样品标 本某一焦平面上的所有点被同时照射和成像，每一点的图像都会受到 邻近点的衍射光或散射光的干扰，从而降低了信噪比，影响了图像的 清晰度和分辨率。并且，入射光辐射到整个细胞的一定厚度，位于焦 平面外的发射光也能在检测器上形成模糊的图像，即与所要观察点相 邻各点也被同时成像。所以一般光学显微镜不仅横向分辨率差，纵向 分辨率差，不具有光学切片功能，只能对局部厚度作平面成像。所以 普通的荧光光谱仪及荧光显微镜只能对细胞群体的荧光强度动态变化 进行测量，而不能获得单细胞的荧光图像，也不能提供有关c a 2 + 在单 个细胞中的分布变化等信息。 1 2 4c l s m ( 激光扫描共聚焦显微镜) 法 c l s m ( c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e ) 【2 1 ，2 2 】基本结构比光学 孵t 敲党f l 括辨摹能量獭z 作髓 显微镜复杂，它除了包括光学显 微镜部分之外，主要由激光光 源、扫描装置、检测器、计算机 系统( 包括数据采集，处理，转 换、应用软件) 、图像输出设备、 光学装置和共聚焦系统( 如光学 滤片，分光器，共聚焦针孔及相 应的控制系统) 等部分组成( 见 图1 ) 。扫描和检测装置是c l s m 的重要组成部分，台阶扫描和光 束扫描( 或镜扫描) 是目前广泛 曲北人学硕士学位论文 第一章引言 应用的两类扫描装置，而检测器主要有光电倍增管和电感偶合器。c l s m 是一种新的三维成象设备，可获得普通光学显微镜无法达到的分辨率a 同时具有深度识别能力及纵向分辨率，可对2 0 0 一4 0 0 p m 的切片进行扫 描，因而能看到较厚生物标本中的细节。它是以激光束经光源照明孔形 成的点光源辐射于样品的微点上，避免了非照射区域产生光散射，并在 发射光检测光路上放置一个检测针孔，发射光通过此针孔到达检测器。 入射光源针孔和检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，这样，来 自焦平面的光可以通过检测针孔被检测，而来自焦平面上、下的光被阻 挡在针孔的两边。当选择合适的针孔大小，便可得到高清晰度的图像。 由于共聚焦系统中样品是被一个点光源照射成像。实际应用中，为了得 到完整的样品结构信息，必须使入射光点在垂直于显微镜光轴的焦平面 ( x y 轴) 上，沿样品逐点或逐线扫描。将每点扫描的图像信息经计算 机采集、储存、处理、转换后合成一定大小的二维图像。所得的二维图 像实际上是样品在微小厚度内的平面“切片”图像。如果沿显微镜光轴 ( z 轴) 方向以一定的间距扫描出不同z 轴位置的多幅x y 平面图像， 就能由计算机处理“堆积”出此扫描区域内样品的三维立体结构图像， 从而能十分灵活、直观的进行细胞或组织形态的观察，并揭示亚细胞结 构的空间关系。此外，激光扫描共聚焦显微镜借助荧光标记的方法，运 用激光扫描、共聚焦显微镜、计算机技术相结合的手段，可进行重复性 极佳的荧光定量分析，从而对单个细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内 质网、细胞骨架、结构性蛋白质、d n a 、r n a 、酶、受体分子及胞内 c a 2 + 、m 9 2 + 、k + 、n a + 等的含量及分布进行定量、定时及定位测量，同 时还可以将荧光图像和相差图像重叠以显示荧光在形态结构上的精确 定位。其主要优点可总结为：成像清晰，可以对单细胞进行测量，可进 行活体实验，三维重组功能【2 ”。但是由于c l s m 结构精密、工艺先进、 价格昂贵，使其普及应用受到一定的限制；其次，使用成本消耗较大， 如激光管的消耗；第三，激发波长有限( 常用光源为氩离子或氩氪激光 器) ，而荧光染料的种类很多，其激发光波长各不相同，这样在使用某种 型号的激光器时，只有少数几种荧光染料可以使用，而其他大多数的染 6 曲北人学硕十学位论文第一章引言 料不能使用，目前同时配备数个不同激光器或多光子脉冲激光器的激光 共聚焦系统的出现，虽然可以解决这一难题，但是设备结构复杂、价格 昂贵，维护保养要求较高；第四，时间分辨率不高，成像质量与扫描速 度始终是相互矛盾的。 1 2 5 多光子激光扫描共聚焦显微镜法 分子的多光子激发需要的光子能量比单光子低，倒如，双光子激发 需要的光子能量大约是单光子激发所需能量的一半，因此在c l s m 基础 上发展起来的多光子激光扫描共聚焦显微镜使c l s m 的清晰度又上升 了一个水平，所发挥功用的领域得到了更大地扩展。经典的c l s m 的激 光光路是直线的，常因样品曝光过久而使样本遭到光漂白作用，而多光 子激光显微镜的使用恰好可减轻这种光漂白作用，因为多光子激发的是 一个非线性过程，具有准确的定位特征，也就是只有在焦点处的光子才 能激发荧光分子，光漂白和光损伤仅局限于焦点附近，且有利于减少测 试样品的自发荧光，这样可以对活细胞进行更长时间的观察。c l s m 中， 被照射的样品区域均被激发，散射光或焦平面周围的荧光会降低图像的 反差，所以需要一个共焦针孔作为一个空间滤光片来选择焦平面发射的 荧光。多光子激光显微镜的荧光只来自于焦点，这就不需要共焦针孔来 选择荧光，所以测量光路更加简单、可靠，有效地提高了光子的收集效 率，且高准确度的定位又保证了更高的三维分辨率，使背景的干扰相对 减少，进一步提高了图像清晰度。多光予显微镜除了可用可见光外还可 用用红外或者近红外光代替紫外光【2 2 1 。红外激光的深度穿透能力更强， 故多光子显微镜深度识别能力更强。应用两个或三个光子叠加的能量激 发以往观察不到的分子发出的荧光，不仅进一步拓宽了荧光激发的范 围，而且使更长波长光子的应用成为可能，同时还可以使研究者对细胞 的观察时间更长，探测的层次更深，为生物学家研究组织和细胞内特异 分子的动态变化开拓了新的前景。 7 西北大学硕士学位论文第一章引言 1 2 6 比率荧光成像光谱仪法 本论文采用的仪器是比率荧光成像光谱仪( 详见第四章) ，它不同 于一般的显微镜成像法，主要应用于双波长荧光指示剂的动态测量， 可以确定活细胞内游离钙离子的位置，测量细胞内离子浓度【2 “、p h 值，监控细胞内离子的改变。它的实时采集、记录检测信号及强大的 图像处理功能，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离 子生物学变化的新途径，将有助于我们深入研究和了解这些离子在细 胞内的动态变化过程和生物调控机制。 参考文献 川r 邪m u s s e nh c a l c i u m 锄dc a m p 船as y n 眦m 船n g e ln e w y o r k ：j o h n 锄ds o n si n c 1 9 8 l f 2 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9 7 ，2 0 ( 6 ) ：3 3 1 3 3 2 【1 6 】r i d g e w a ye b ，a s h e l e yc c ，b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n 【j 】，1 9 6 7 ，2 9 ：2 2 9 - 2 3 4 1 7 】s u g i m o r i ，m ，e j l a n g ，r b s i l v e la t l dr l l i n 鹤1 9 9 4 h i g hr e s o l u t i o nm e 鹊u r e m e n to f t | l e t i m ec o u r s eo f c a l c i u m - c o n c a m 州m i c r c d o m a i n s 砒s q u i d p 托s ) ，1 1 a p t i ct e r m i n a j s b i 0 1 b u l l 1 8 7 ：3 0 0 一3 0 3 1 8 】s j 】v e r b ，1 9 9 6 c a l c i 啪，b o b s q e d s ，m j c r o d o m a j n s 锄dac e j 】u j a rd e c i s j o n ：c o n t m jo f m i t o t i cc e l ld i v i s i o ni ns 锄dd o i l 甜b l 舢幻m e r e s c e i ic a l c i 哪2 0 ：1 6 l 1 7 9 1 9 】张春阳，陈波，马辉细胞内钙离子的光学分析方法研究进展 分析科学学报2 0 0 0 ， 1 6 ( 6 ) ：5 1 6 5 2 4 【2 0 j t 岫o ka r a r e e v e n ts o r t 如gb yf i 触i m ef i o wc ”o m e t l yb e do nc h 锄g e si ni n t r a c e “u i a r 行e ec a l c i u m ， c y t o m e 奶r 【j 】，1 9 9 7 ，2 7 ：6 5 - 7 0 【2 1 】张旭，徐维奇激光扫描共聚焦显徽镜技术的发展及应用现代科学仪器2 0 叭，2 ：2 1 2 3 【2 2 】霍霞，吕建勋，杨仁东等激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较 受| p 3 、内嫒弱腔e a 2 + 、腿质c 8 2 + 等调节。l p 3 起着分子开关 的作用，i p 3 与i p 3 r 的结合可增强i p 3 r 对c a 2 + 诱导信号的敏感性，以 便萼| 超c a “诱等瓣内锈羲受。缨嚣齄f e a 2 + 】i 交稼受鬟委受反馈篌镧豹耱 细调控，对下游反应进行质量和数量调控，从而对外界刺激做出准确 瓣反应。 s ) 细胞内各条信号通路的棚亘影响、相互协调、相互作用、相亘制约， 才能对各种内外刺激做出完燕、迅速、准确的反戚。c a 2 + 与许多信号谂 绞的组份都有囊接或翘接豹联系，翔c a 2 + 褥| 2 乏看作l p 3 d g 途径懿第三 信使，农各条信号途径问起桥梁、中介作用；c a 2 + 信号谂径与器条信母 途径闲缎魏交联，形簸售惠转递圈终。 2 。2c a 2 + 信擘系统及其细臆功麓 缨戆内叁巍c a 2 + 熬分毒舄转移是形成c a 2 + 傣号戆基璐。一般认为， 细胞对许多外界环境和激素等刺激做出的反应悬通过胞质中自由c a 2 + 浓度交像来蓑遴豹。豢受到蘩l 激霹，蕤舛c a 2 + 逶避c a 2 + 遴遂懿野癌避入 胞内或臌内钙库( 如内质网，液泡等) 向胞浆释放出c a 2 + 【”，使细胞胞 浆中c a 2 + 浓度增秀拜，继而与c a 2 + 能够结合的蛋白旗或酶( 靶分子) 结合， 两北火学硕士学位论文第二章细胞内第二信使- 钙离子的信号转导原理 使后者激活，弓 超细胞反应，从而超到传递胞外信号酶作用。 c a 2 + 信使的靶分予或感受体 s # n s o r ) 是c a 2 + 结合缀自( c a 8 p ) 域 已知生理功能的c a 2 + 结合蛋白一c a 2 + 调节蛋白( c a l c i u mr e g u l a t e d p o t e i 珏，e r p ) 。对c a 2 + 这糕麓擎豹售号分子，蕊要穆信号簧递下去劳 能调节多种生化反应，作为译码机制的下游感受体，即c a 2 + 结合蛋白的 露建是十分重簧豹。c a 2 + 信毽与萁稳蕤内嵇使不鬻懿是，它不暾逶遗僚 使依赖的蛋白激酶起作用，亦可与麓体蛋囱或其他分子作用。其靶分子 稳整穰广，耱类很多，增加了c a 2 + 僚号途径的多样往藕笈杂往。钙谲綮 ( c a m ) 是其中已知的胞内c a 2 + 信号受体巾最重饕的一莘申，它参与多种 生理活动的调节。c a m 是由1 9 种氨基酸缀成的耐热的酸性小分子，为 争争可溶性球爨是。c a 挞与钙豹亲粒零数k d 力o 。5 1 5 l o 石m o l ，l ，由 于细胞受刺激时胞内e c a 2 + 会升高爱o 5 l o 巧m o l l ，这一水平下的袋 稳常数使褥e a m 逶予在缨熬麓激条传下被激活。薅贯一些钙缀合蛋蠢 ( c a b p ) 有很高的亲和力( k d l e x l o 茚m o l ，b 靛c 8 b p 也无法感受到细胞的锊信号【4 1 。经典的c a 2 + c a m 信号系统示意圈如下： nc a 2 + + c a m 争c a n 计c a m ( 1 n 4 ) n c a n 。+ - c 8 m + e 一( c a t 2 + c a i 迭) l n e 式中表示涵性构象，n 代表c a m 活化所需结合的c a 2 + 数，e 代表被 e 8 n e a m 复合椿激溪熬罄薅，c 鑫2 + c 鑫必溪毒i 二态懿孛鬻复会钵。c a m 介导的c a 2 + 信母转导，由于c a m 对c a 2 + 的依赖性不同，因此其与目的 蛋鑫褶互铬瘸辩，致嫠绥魏霹憝震审c & 2 + 鹣舞毒稳够骰惑各耱笺杂静奄 理反应。c a m 的靶酶商很多种类，例如c a 2 + c a m 或c a 2 + 依赖的蛋白激 酶、蛋盘磷酸酶、钙转移酶、其他信号途径缀分( 如p d e 、a c 等) 、缩 飕骨架相芙蛋自、核内转录因子、r n a 结合蛋白、分子伴侣等。c a m 以两种方式调节它们的活性：( 1 ) 畿接与这些靶酶结合，诱导其构象改 变；( 2 ) 先活他菝赣c a 2 + e a m 戆蛋白激黪，霉使靶黪磷酸纯，趣接影 响其活性。c a 2 + 信号系统调节的蜘胞生理功能十分广泛，从卵细胞受精、 耧聚发商剿缍魏分纯；炔绸耱分袭麴维莠鏊斓亡；获蒸霾转蒙鹫伐漆调控； 西北大学硕士学位论文第二章细胞内第二信使钙离子的信号转导原理 从细胞分泌到肌肉收缩、神经传导，可以说无所不在，对生命活动正常 进行有十分重大的意义。 参考文献 f 1 】p i e r s o nes ，m 川e rdd ，c a l l a h 枷da ，、丘ma k e nj ，h a c k e ngh 印l e rpk t j p j o c a j j z e dc a l c j u m e n t r yn u c t u a t e sd u r i n gp 0 1 l e nt u b eg m w t h d e vb i o l ，1 9 9 6 ，1 7 4 ：1 6 0 一1 7 3 【2 】宋秀芬，洪剑明植物细胞中钙信号的时空多阳性与信号转导植物学通报2 0 0 】，1 8 ： 4 3 6 4 4 4 【3 】刘宏涛，李冰，周人纲钙- 钙调素信号系统与环境刺激植物学通报2 0 0 】，1 8 ：5 5 4 5 5 9 【4 】孙大业，郭艳林，马力耕，崔素娟等编著酸亿导入法 离子型指示剂在周围介质呈酸性条件下与飘离子结合成为不带电 豹分子形式，霹疆避入缨藤内部，在缨蕤露近中靛静环境下，义重耨解 离成为可以结合钙离子的离子型指示剂，这种方法特别适用于植物细 胞。 4 )常温孵育法 荧光指示翻被酝亿后，缀容易跨过质膜送入缁耱内。在胞内，酯形 式指示刹被非特意性酾酶水解，重凝与c a 2 + 结合。此法不太适用于植物 细胞，由于其细胞壁中存在酯酶，荧光指泳剂在进入细胞前就被分解了 。 5 ) 低温导入法 1 9 9 8 年z h a n g 和r e n g e l 报道丁这种方法，其原理楚，低瀑条件下 细胞壁中的酯酶活性爱抑制，因而无法水解酯化毅指示剂，但指示剂分 予扩敖送入缨艨内懿遮摇受甄澄豹影穗势不丈，宅毒敷穷过缀骤震貘送 入细胞内部，以低温处理段时间质，细胞内可以积累定量的指示剂 分子，醚銎鬻滋下螽，缨憨逡酪蘸灞性静瑟舞，获蔼将送入慈内的攒添 剂分子水解成离子形式而与钙离子结合，予是在定波长光的激发下便 发蹬荧光弹l 。于低温下将锊离子指示剂f l t l o 一3 a m 导入百合筏粉粒细 胞，结果对花粉的活力并不造成明熙影晌。在蚕驻时片气孔保卫细腿和 蕊维管袋薄壁细胞以及小麦掇毛细胞中也取得良好效果f ”。 2 l 阳北大学硕士学位论文第三章荧光测鬣 3 1 4c a 2 + 浓度的计算公式 1 ) 单波长测定 对于那些与c a 2 + 配位后仅有荧光强度的改交，而荧光激发或发射 波长均露变化的试裁，则只缝利用单一波长下荧光强度的变化进行测 定。 设c a 2 + 与试裁l 以l ：l 嚣蕴，羽可表示舞： c a 2 + + l c a l 平衡常数为：蹦2 背 们# 朋臀 ( 1 ) 由式( 1 ) 可知，在已知离解常数k d 的情况下，从【c a l 】【l 】的眈 後，可求褥f e a 2 + 】。 又【l t = 【l 】+ 【c a l 】( 2 ) 在蘩波长下，毛纛c 8 毛豹荧毙强痍分裂燕；f l ；l ( 【翻，f c 。l = k 【c a l 】 敌爵戳通邋溅羹体系豹炎苑强发分掰袋得【c a l 】和【己】。 如分别配制三种l 总浓度相等而【c a 2 + 】值不同的溶液，即： i ) l c a 2 + 】= o ，试剂l 全部以游离l 的形式存在：i i ) 【c a 2 + 】绝对过量， 试裁l 皱c a 2 + 媳和，以c a l 形式存在；i i i ) 【c a 2 + 】为菜一待测浓度，体 系中既肖游离l ，也有配合物c a l 。然后在同一波长、相同条件下分 剿溅量葵荧悫鞭度，绞次专己为沁擎。粒 。剽； f m i n k 【l h f m a x = k 7 l c a 乙】t ；款f 乙】了 f = k f l + k c a l 国( 2 ) 式可得 f m i n f = k ( 【l h 一【l 】) 一l 【c a l 】 = ( k k7 ) c a l 】( 3 ) 两e 大学硕士学德论文第三章荧光溯艇 f f 。x = k l l 】一款( 【l 】f 一【c a 毛】) 一( k k ) 【l 】 将( 3 ) 、( 4 ) 代久( 1 ) 式，得 喇筹 戏 ( 4 ) ( 5 ) p 【l ：臼2 + 】= p k d + l o g ( f f 。) ( f 。j 。一f ) 】( 6 ) 式( 5 ) 极为单渡彀荧光攒示激发测定【c a 2 + 】的定量关系式。式中； f 为试验测得的待测体系的荧光强度，f 。i 。和f 。，分别为无c a 2 + 和 e a 2 + 饱和时试和的荧光强度。同时，根据( 6 ) 式亦可求得荧泡指示剂 与c a 2 + 瓤位的离鳃鬻数k d 。 2 ) 双波长比率法 单波长测量时，必须严格保诞测定f 、f 。n 、f m 。的测量条件完全相同，因为 试剂的绝对浓度、光程长或仪器的绝对瑟敏度等测量条傣的任何微小交化都将会 g l 起对游离【c a 2 + 】测定的误差。恧采用双波长比率法则可减少这些因素 造成的误差。 当试裁与e a 2 + 结会磊荧毙蜂有链移对，霹采建双波长毙搴法透露 测量。同理 c a 2 + + 己e a l 平缀霉数必：列= 甯 l 】t 【l 】+ f c a l 】 则商 f - 罂：黩 ) 【期r( 【白2 + 】+ z ) 一。 卜p 品= 旒 ， 【剀r( c 矗2 + 】+ z ) 设试帮在测定波长处，秃c a 2 + 和被c a 2 + 饱和辩测量的荧光强度系 西北火学硕士学位论文 第二章荧光测量 数分别为s f 和s b 。 x 处 f l = s f l l 】+ s b l c a l j = s f i ( 1 一f ) 【l 】t + s b l f 【l 】t ：处 f 2 = s f 2 ( 1 一f ) 【l 】t + s b 2 f 【l 】t 结合( 1 ) 、( 2 ) 得 鼻s ，l ( 1 一，) + 既i 厂墨l + s 6 l ( 2 + 】k d )，、 一= 一 lj es ，2 ( 1 一，) + s 6 2 j rs ，2 + s 6 2 ( c 口2 + 】k d ) 令 f l f 2 = r 当【c a 2 + 】_ 0 ，f - o 时，拒( 3 ) 式有： r m i n = s f l ，s f 2 c a 2 + 饱和，f - l 时，拒( 3 ) 式有：r 。“= s b l s b 2 代入式( 3 ) 并整理得 【c 口2 + 】= 麒( s ，2 魏2 ) ( r 一置眦) ( r 蛳一r ) ( 4 ) 令b = s f 2