（发育生物学专业论文）斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究.pdf

! 生杰曼斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究 硕士学位论文 斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关 分子机制的研究 专业：发育生物学 硕士生：李冬 导师：彭英教授 摘要 研究背景：神经胶质瘤是一种发源于神经外胚层的常见颅内肿瘤，临床上以 浸润性生长和广泛侵袭性为主要特点并伴有转移现象的发生，已成为危害人类生 命健康的主要肿瘤之一。尽管诊断和治疗水平的提高使得神经胶质瘤的局控率有 明显改善，但是目前临床上仍无法找到克服胶质瘤广泛侵袭和转移的好办法。在 基础实验中，以往主要是在体外去研究胶质瘤发病的分子机理，相关的体内分子 机制研究主要是使用传统的啮齿动物大小鼠模型。此类模型周期长，效率低， 也很难动态监测肿瘤的体内发展情况。这些缺点极大的制约了胶质瘤体内分子作 用机制的研究。因此，建立新的胶质瘤模型，全面地解析神经胶质瘤浸润性生长 和转移的分子机制，深入探索神经胶质瘤转移的相关标志物，是有效控制神经胶 质瘤进步恶化，提高患者生存率的关键。 斑马鱼作为脊椎动物模式生物具备了自己很多独特的优点：它易于饲养，经 济方便，产卵量高，斑马俪体外受精，胚胎透明，易于实验观察，其基因组与人 来有着高度的同源性，分子遗传学操作简便易行。在自然界巾，斑马鱼也会自发 产生各利t 组织器官的癌变，并且与人类的肿瘤在器官和组织水平上都有着很大的 相似性，其致癌基冈也与人类的癌症相关基冈有着很大的保守性。斑马负肿瘤模 型在抗肿瘤药物筛选及其分子靶标研究中更是具备了高效性和动态观察的优势， 并逐渐成为国际上肿瘤体内研究q - 的热门工具。 研究口的：我们借助斑马鱼胚胎建立胶质瘤模型可以解决神经胶质瘤体内分 子作用机制研究中周期长和效率低的难点，并可以高效的进行抗肿瘤药物的筛 选。利用此种模式生物，我们可以研究神经胶质瘤体内治疗中新的分子作用靶标 i l 囝! 。之妻浸斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究 硕士学位论文 及其信号通路中靶标分子的作用机制，为神经胶质瘤的治疗寻找新的突破。 研究方法：首先使用细胞生物学方法建立荧光标记的胶质瘤细胞系，接着使 用显微注射法将胶质瘤细胞移植入斑马鱼体内，最后使用原位杂交、荧光定量 r t - p c r 、血管内源性碱性磷酸酶染色及荧光显微镜直接观察转基因鱼等方法检测 胶质瘤细胞和斑马鱼的相关变化情况。 研究结果：我们成功的建立了斑马鱼神经胶质瘤模型，并发现人胶质瘤细胞 可以在斑马鱼胚胎体内存活、增值、迁移并诱导血管增生等现象。最后我们在分 子生物学层面上进一步研究了人胶质瘤细胞诱导斑马鱼肠下血管增牛的分子机 制。 研究结论：斑马鱼是一种新的研究肿瘤体内发展情况的模式生物并具有着自 己很多独特的优点。人胶质瘤细胞在斑马鱼体内与整个系统发生互作，可以在其 体内增值，扩散，并通过诱导分泌斑马鱼血管内皮牛在因子( v e g f ) 而促进斑马 鱼肠下血管增生。 关键词：神经胶质瘤；斑马鱼模型；分子机制 i i l ，：点怂斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究 硕士学位论文 t h ee s t a b l i s h m e n to fz e b r a f i s h g l i o m am o d e la n dt h er e s e a r c ho ni t s r e l a t e dm o l e c u l a rm e c ha n i s m m a j o r ：d e v e l o p m e n tb i o l o g y m a s t e rc a n d i d a t e ：d o n gl i s u p e r v i s o r ：y i n gp e n g a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：g l i o m at h a td e r i v e df r o mn e u r a le c t o d e r mi so n eo ft h em o s t c o m m o nt u m o ri nb r a i na n dh a st h es p e c i f i cc l i n i c a lc h a r a c t e r i s t i c sj u s tl i k e g r e a t i n v a s i o n , s i g n i f i c a n td i s s e m i n a t i o na n dm e t a s t a s i s a sar e s u l t ，i tm a k e sg r e a td a m a g e t oh u m a nb e i n g s h e a l t h a l t h o u g hw eh a v em a d eg r e a tp r o g r e s si nd i a g n o s i sa n d t r e a t m e n tt oi m p r o v et h et h e r a p e u t i ce f f e c t s ，t h ep r o b l e m so fg r e a ti n v a s i o na n d m e t a s t a s i ss e e mu n s e t t l e d m o s to ft h ef u n d a m e n t a lr e s e a r c h e so nm o l e c u l a r m e c h a n i s m sa r er e s t r i c t e di nv i t r oa n dt h ei nv i v or e s e a r c h e sh a v ea l w a y sb e e nd o n e i nt h er o d e n tm o d e 一r a to rm o u s ec a n c e rm o d e l t h i sk i n do fm o d e lh a v em a n y d i s a d v a n t a g e ss u c ha sl o n gp e r i o d ，l o we f f i c i e n c ya n dw ec a nn o ti n s p e c tt h es t a t eo f t u n l o rc o n t i n u a l l y t h e nal o to fd i f f i c u l t i e sw h i c hl e a dt ot h el i m i to fr e s e a r c hc o m e t ou s s ot h ek e yp o i n tt oi m p r o v et h es u r v i v a lr a t eo fh u m a nb e i n g si st oe s t a b l i s ha n e wc a n c e rm o d e lt o t h o r o u g h l yk n o wt h eg l i o m am o l e c u l a rm e c h a n i s ma b o u tg r e a t i n v a s i o na n dm e t a s t a s i s t h en e wp r o m i s i n gv e r t e b r a t em o d e ls y s t e mz e b r a f i s hh a sp l e n t yo f a d v a n t a g e s j u s tl i k ee a s ym a n a g e m e n t ，c o s t e f f e c t i v e ，f e c u n d i t ya n di t st r a n s p a r e n tf e r t i l i z e de g g s d e v e l o po u t s i d et h eb o d yw h i c hm a k e st h er e s e a r c hi n s p e c t i o nv e r yc o n v e n i e n t ，a tl a s t i t sg e n o m es h o wg r e a tc o n s e r v a t i o nc o m p a r i n gw i t hh u m a n t h ef i s h i nt h ew i l di s c o m m o n l yt oh a v ec a n c e rb e c a u s eo fw a t e r - b o r n ec a r c i n o g e na n ds o m em u t a t i o n so n i v 囝! 生怂斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 r e l a t e do n c o g e n e so rt u m o rs u p p r e s s o r s i tc a nd e v e l o paw i d ev a r i e t yo ft u m o r si n m o s ta l lo ft h eo r g a n sw i t hah i s t o l o g yc l o s e l yr e s e m b l i n gt h a to fh u m a nt u m o r s z e b r a f i s hc a n c e rm o d e li sm o r ee f f e c t i v ei n s e a r c h i n g t h er e l a t e dm o l e c u l a r m e c h a n i s m sa n ds c r e e n i n ga n t i c a n c e ra g e n t s i ti sb e c o m i n gam o r ea n dm o r ep o p u l a r c a n c e rr e s e a r c h i n gt o o li nt h ew o r l d o b j e c t i v e ：w ec a nm a k eu s eo ft h i sn e wg l i o m am o d e lt oo v e r c o m et h e d i s a d v a n t a g e si nr e s e a r c hj u s tl i k el o n gp e r i o da n dl o we f f i c i e n c y t h e nh i g h e f f i c i e n c yo fa n t i c a n c e ra g e n t ss c r e e n i n ga n dt h ed i s c o v e r yo fn e wm o l e c u l a rt a r g e t a m o n gg l i o m ar e l a t e ds i g n a l i n gp a t h y w a y sw i l lm a k eag r e a ts i g n i f i c a n c e a n do f c o u r s ei ti san e wb r e a k t h r o u g hi nt r e a t i n gg l i o m a m e t h o d s ：w eu s e dc e l lc u l t u r ea n di t st r a n s f o r m a t i o nm e t h o d st oe s t a b l i s har e d f l u o r e s c e n tm a r k e rc e l ll i n e t h e nz e b r a f i s h g l i o m am o d e lw a s s e t u p b y m i c m i n j e c t i o n a n da tl a s t ，w eu s e di ns i t uh y b r i d i z a t i o n , q u a n t i t i v er t - p c r , t h e s t a i n i n go f e n d o g e n o u sa l k a l i n ep h o s p h a t a s ea n df l u o r e s c e n tm i c r o s c o p yi n s p e c t i o nt o i n v e s t i g a t et h er e l a t e dc h a n g e so fg l i o m aa n dz e b r a f i s h r e s u l t s ：w eh a v es u c c e e d e di ne s t a b l i s h i n gt h ez e b r a f i s hg l i o m am o d e la n df i n d t h a tt h eh u m a ng l i o m ac e l l sc a ns u r v i v e ，p r o l i f e r a t ea n di n d u c ea n g i o g e n e s i si n z e b r a f i s h i nt h ee n d ，w eh a v ei n v e s t i g a t e dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m so ft h e s e p h e n o m e n o n c o n c l u s i o n ：z e b r a f i s hi san e wg o o de f f e c t i v ec a n c e rm o d e la n dh a sal o to fi t s a d v a n t a g e s h u m a ng l i o m ac e l l sc a ni n d u c et h ei n c r e a s eo fz e b r a f i s hs u b i n t e s t i n a l v e s s e l st h r o u g hs e c r e t i n gz e b r a f i s hv e g fa n dt h e s eg l i o m ac e l l sc a na l s op r o l i f e r a t e a n dt r a n s f e rt ot h ed i s t a n ts i t et h r o u g hi n t r a v a s a t i o na n de x t r a v a s a t i o n k e yw o r d s ：g l i o m a ；z e b r a f i s hm o d e l ；m o l e c u l a rm e c h a n i s m v 囝妻，上! 懑斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 论文原创性声明内容 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：孪冬 日期：驯。年月7 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 文作一鸯冬新虢吲六 日期：力l 。年6 月7 日 日期：厉伽年6 月 日 = | ! 点撼斑马鱼神经胶质瘤模犁的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关 分子机制的研究 硕士研究生：李冬 导 师：彭英教授 中山大学生命科学学院 引言 1 神经胶质瘤的特点治疗方法及研究现状 神经胶质瘤是一种发源于神经外胚层的常见颅内肿瘤，故亦称神经外胚层肿 瘤或者神经上皮肿瘤，简称胶质瘤。恶性神经胶质瘤的发牛率大概是o 0 0 5 一 0 0 1 。根据组织病理学分析的结果，主要可以把神经胶质瘤分为星形细胞瘤， 少突胶质细胞瘤，室鼓膜瘤和混合性少突星形细胞瘤四类。其中星形细胞瘤又 占了所有初级脑部肿瘤的6 0 ，并按照世界卫生组织的规定细分为四个等级。纤 维状星形细胞瘤( w i - i oi ) ，生长缓慢，主要在儿童和青少年中发生。这类肿瘤是 可以治愈的，在遗传背景和临床行为上都与广泛渗透的星形细胞瘤有着不同。弥 漫类星形细胞瘤( w h oi i ) ，生长缓慢，细胞高度分化。退行性发育的星形细胞瘤 ( w h oi i i ) 来自于低一级的星形细胞瘤，但是有着增强的细胞性和核分裂活性。 恶性程度最高的胶质母细胞瘤( w h oi v ) 也是所有脑部肿瘤中最普遍的一类。 其特点是核非典型性，有丝分裂性，内皮细胞增牛或坏疽。胶质母细胞瘤也可以 分为初级和次级两种。初级的是那种未有低级特征直接转变为胶质母细胞瘤，次 级的是由低级星形细胞瘤发展而来的。相比较而言，初级的胶质母细胞瘤更为普 遍，它相对于次级胶质母细胞瘤而言主要发生于老年人中。这些脑部肿瘤丰要位 于中枢神经系统，起源细胞手要是神经问质，临床上以浸润性生长和广泛侵袭性 为主要特点并伴有转移现象的发生，已成为危害人类牛命健康的丰要肿瘤之一。 目前，胶质瘤的治疗方法以手术为主，结合放疗、化疗和免疫治疗。尽管诊 妻，生，! 潺斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 疗水平的提高和放疗技术的改进，使得神经胶质瘤的局控率有明显提高，但是日 前临床上仍无法找到克服胶质瘤广泛侵袭和转移的好方法。其平均存活期仪为 9 - 1 2 个月。在过去的2 5 年内恶性胶质瘤病人的生存巾值的增加微乎其微1 2 】，在 目前的治疗条件下，胶质瘤病人自诊断后生存时间超过5 年的不到5 0 ，研究新 的治疗方法和开发新药物已显得非常迫切。最近也涌现出了很多传统手术切除， 放疗化疗之外的新型基因和药物治疗方法。比如病毒或纳米载体介导的基冈治疗 法【3 - 5 1 ，新型药物及其机制的研究【6 7 】。 新型基冈治疗方法的基础是神经胶质瘤发病机制的研究，其l 包括相关分子 靶标的发现以及相关分子信号通路的研究。全面解析神经胶质瘤浸润性生长和转 移的分子机制，深入探索神经胶质瘤转移的相关标志物，是有效控制神经胶质瘤 入侵和转移提高患者生存率的关键。而日前的实验研究t t 的很多作用机制及分子 信号通路的探索主要局限于体外，相关的体内分子机制研究主要是使用大小鼠模 型，实验周期长，耗费大且很难动态监测肿瘤的体内发展情况，针对这些基冈靶 标设计的新型药物更是需要合适的高通量的药物筛选模型。因此，建立合适的动 物神经胶质瘤模型对研究其发病的分子机理和新型药物的初步评估，具有重要 的意义。 2 斑马鱼胶质瘤模型的特点及其建立方法 2 1 斑马鱼胶质瘤模型的特点 斑马鱼是日前国际上一种热门的脊椎动物模式生物，与大小鼠模型相比有着 自己很多独特的优剧8 】( 图1 ) 。斑马鱼易于饲养，经济方便；体积小，可以大规 模养殖，适合于高通量实验；它产卵量高，一般一对斑马鱼一周至少能产卵卜2 0 0 枚；在分子生物学水平上，它的基冈组与人类的保守性很高，易于进行分子遗传 学实验操作；自然界巾斑马鱼的各利- 组织器官都会发生癌变，这些组织器官的癌 变与人类极为相似。这为在斑马鱼体内研究人类肿瘤发展提供了很好的基础。斑 马鱼体外受精，胚胎透明，易于观察各组织的癌细胞扩散、转移、渗透和血管生 成；加上内源性血管染色法的应用和血管特异性发光的转基因角v e g f r 2 g f p 的出现使得与血管发生相关的研究显得更加直观和简单易行【9 】。这使得斑马鱼成 为研究神经胶质瘤体内发展情况及其诱导血管增生机制的最好工具。有效的建立 斑马鱼神经胶质瘤模型，深入探索神经胶质瘤在斑马龟体内的发展情况和诱导血 2 ! 生墨! 斑马鱼种经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究 磺士学位论文 管增牛情况，为进一步揭示人胶质瘤细胞增生、经袭扩散和诱导血管牛成的分子 机制提供了很好的工具，也为胶质瘤的分子靶向治疗提供了更全面清晰的基因靶 标。最后，在药物筛选中斑马鱼可以有效的吸收周围水环境中的小分子化合物， 使抗癌药物的太规模筛选简便易行。 簧两普 1 2 4h 佴 0 e “ i 鞭 o o - 2 ； q ， z 一。舞嚣= ：。、 0 翟黜 窘一町，。 罨黜篙 图1 斑马鱼模型的优点 2 2 建立斑马鱼肿瘤模型的方法 建立斑马鱼肿瘤模型的疗法丰要分为化学诱变法、异体移植法和分子水平上 的基因突变法。 化学诱变法可以快速高效的建立很多的斑马鱼肿瘤模型但是它的非特异性 表型比较多，肿瘤的类型和定位很难控制。比如用7 ，1 2 二甲基苯蒽( d m b a ) 来处理鱼胚或者幼鱼便可以诱导出肝脏、血管、内脏等多处肿瘤的发生嘶，而 用n 甲基_ n 一硝基n 监硝基眦( m n n g ) 米处理鱼胚和幼鱼也可以诱发肝脏组 织和许多问叶细胞样肿瘤，比如血管瘟、软骨瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤的产 生i 。 异件移植法叉可以分为同种异体移植和异种异体移植两种，由于斑马鱼幼鱼 免疫系统未发育完善，一般在2 5 天注射的幼鱼都可以不用作“何免疫抑制处理， 并可以持续观察肿瘤细胞发展情况十天左右。一个月左右的斑马鱼幼鱼在进 行肿痛细胞的移植时则需要进行免疫抑制处理m l ，但处理过程相对于免疫抑制 的小鼠要简单得多。这种异体移植细胞的方法可以帮助快速建立所需的斑马鱼肿 瘤模型。在哺乳动物肿瘤细胞移植诱导斑马鱼胚胎新血管的生成的研究中，表达 纤维源牛长因子( f g f ) 和血管内皮生长因子( v e g f ) 的哺乳动物肿瘤细胞系移 ! 皇怂斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 植入受精后4 8 小时的斑马鱼胚胎的肠下血管附近可以诱导斑马鱼肠下血管的增 生，当使用转基因斑马鱼v e g f r 2 ：g r c f p 时，可以看到绿色荧光新血管的形成。 使用f g f 受体络氨酸激酶抑制剂s u 5 4 0 2 和v e g f r 2 l r 抑制剂可以抑制肿瘤 细胞诱导的血管生成且不影响正常血管的发生，当使用v e c a d h e r i n 的吗啉代寡 聚核糖核酸( m o r p h o l i n o ) 时也可以抑制肿瘤新血管生成且不会对节问和肠下血管 有任何影h 向【1 4 】。移植到斑马鱼体内的人类黑色素瘤细胞可以进一步增殖、迁移、 形成肿块及诱导血管生成采用抗体染色及荧光追踪染料试剂标记细胞的方法可 以追踪到黑色素细胞的发展并观察到诱导的血管生成情测1 2 1 。而在人u 2 5 1 细胞 移植斑马鱼胚胎的实验中，研究者也观察到了胶质瘤细胞的增殖、迁移、扩散、 形成肿块及诱导血管生成等现象的发生【l5 1 。这利，模型的缺点是它们一般都是不 稳定不可以遗传的，存在时间不够长，每次研究都需重新建立。 在m y c 诱导的斑马鱼白血病模型巾，主要是通过启用特异性启动子在淋巴 样特异性细胞t - 来过表达m y c ，同时构建的转基冈复合物。i | 连接了g f p 报告基 因，便可以进一步清楚的看到白血病的动态发展状况【m 】。利用基因突变方法构 建的斑马鱼肿瘤模型是特异性的往往比较稳定且可以遗传下去。它是对肿瘤发病 分子原理进一步阐述和证明，通常这种模型也较难建立。因为一般肿瘤的发生都 涉及到多个信号通路基冈的变化，所以要考虑到多个网素的综合作用。例如斑马 鱼的b m y b 的突变可以引起基冈组的不稳定，从而增加了致癌的可能性【1 7 】，在这 个基因突变的基础上可以结合其它因素的改变来构建新的肿瘤模型。人们已经熟 知或研究完全的神经胶质瘤发展信号通路可以概括为下刚1 8 1 ( 图2 ) 。在实际的 应用过程l l l 主要是通过图示i i - 相关原癌基冈的激活，抑癌基冈功能的缺失或者两 者的组合作用来构建出所需要的动物神经胶质瘤模型。例如，抑癌基因p e t e n 杂合型突变加快星型细胞瘤成瘤速率和提高其恶性程度的实验i i i ，p r b 通路的阻 断也包括了原癌基冈c d k 4 或者c y c l i nd 的激活和过表达【l9 1 。另如血小板衍化 生长因子的激活产生星形细胞瘤的过程1 ，如果伴随着抑癌基因i n k 4 a a r f 的缺失 或突变会导致更高级的恶性神经胶质瘤的产生 2 0 1 。再如r a s 在特异的星形胶质 细胞中过表达产生小鼠星形细胞瘤的实验巾也伴随着抑癌基冈p 1 6 ，p 1 9 和 p e t e n 的下调、缺失或者e g f r ，m d m 2 和c d k 4 这些原癌基因的过表达【2 1 1 。 基因突变法建立的动物胶质瘤模型有时也会引起动物早期的死亡，这样便不能观 4 囝l 蔓皇苎量斑马鱼神经腔质癯模型的建立厦其相关分子机制的研究焉士学位论文 察到成年动物中胶质瘤的发展状况，也不会进一步发展成为高级肿瘤。所以可以 采取对相关基因的条件性修饰，来降低致死率，提高生存能力和发展成为高级肿 瘤的可艟性刨。 细胞震中与腔赝瘤发生的 相关基因 红色标记的为抻癌基因 绿色标记的为原癌基园 丁丁 甲甲 细胞拔中与胶质窟发生的 相关基因 缸色标记的为抑癌基因 绿色标记的为原癌基因 图2 神经胶质瘤发生分子信号通路圈 2 3 采用异源移植法建立斑马鱼胶质瘤模型 本课题中，我们是使用异源移植法来建立斑马鱼胶质瘤模型的，建立方法如 下： 第一步；收集受糟卵 使用普通的a b 系或特定的转基因系斑马鱼一罐两雌配于一缸再根据实验需要 选择不同的时期和不同位置显徽注射胶质癌细胞。如注射时期在受精4 8 小时以 5 留 ! 生，态曼斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 后，还需进行麻醉处理。如需观察血管发生情况或者有其它需求可以选择转基因 鱼，也可以在注射后用免疫染色观察等方法。 第二步：荧光标记胶质瘤细胞的制备 胶质瘤细胞复苏后培养于含1 0 胎牛血清、1 双抗( 青霉素和链霉素) 的d m e m 培养基中，经过两至三代的传代后便可以进行荧光质粒转染实验。此步骤是对胶 质瘤细胞进行荧光标记，也可以用绿色或红色荧光质粒，一般需要线性化处理以 获得长期较稳定的转染细胞。转染后可以对荧光细胞进行流式细胞仪筛选，以获 得高比率的荧光标记细胞。也可以用相应的荧光染料如c m - d i i l l 2 】来标记细胞。 第三步：斑马鱼胶质瘤模型的建立 根据实验的不同要求选择消化后不同浓度的人胶质瘤细胞，通过显微注射的方法 将其移植到不同时期斑马鱼胚胎或者幼鱼的不同位置，一般包括颅内原位注射和 肠下异位注射，每次注射的细胞量在几十至几千不等。通常细胞应充分消化离心 后重悬于p b s 或m a t r i g e l 中，再将这些荧光标记的细胞注射到斑马鱼胚胎或者 幼鱼的相应位置【1 4 】。 第四步：对移植了胶质瘤细胞的斑马鱼进行培养和观察 这种异源移植胶质瘤的斑马鱼的培养温度需特别的注意。由于胶质瘤细胞和斑马 鱼生活的最适温度有一定的差异，所以得选择一个两者最优的培养温度。一般肿 瘤细胞的最适生长温度为3 7 ，而斑马鱼为2 8 ，提高温度会对斑马鱼的生长 产生一些影响，而降低温度又不利于肿瘤细胞的生长，在前人的一些探索性实验 中也是进行了不同时期的温度调节和变化以寻找出一个适合两者的最适温度，如 3 3 c 1 2 , 2 3 1 。由于斑马鱼胚胎是透明的，对于这些移植了胶质瘤细胞的斑马鱼胚胎， 我们可以直接在荧光显微镜下观察胶质瘤细胞的发展动态。一般可以直接观察这 些荧光标记的胶质瘤细胞的发展情况，但如果超过三天最好要进行黑色素脱色处 理。还可以将不同时期的斑马鱼进行多聚甲醛固定处理，以进行后续分子生物学 实验操作，包括原位杂交、免疫组化、荧光定量r t - p c r 等，然后可以在体式镜 或荧光显微镜下观察，如需要可以进行切片和共聚焦等更加精细的观察。 下面对上述的实验思路进行汇总，得出技术路线图( 图3 ) 6 ! 土! 心斑马鱼神经腔质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 圈3 研究技术路线图 3 斑马鱼胶质瘤模型建立的意义及应用前景 斑马鱼是现在应用的非常成熟的一种实验室模式生物，具有很多优点。在环 境学、毒理学及生命科学中都有着很大的应用价值。它可以作为环境监测工具， 分子遗传学模式生物及多种人类相关疾病的动物模型。在研究斑马鱼中某个基因 的功能时，使用吗啉代寡聚核糖核酸( r r 哪h o l i n o ) 抑制和敲降日的基因的方法相 对于小鼠中目的基因的敲降更加迅速和方便】。 众所周知，肿瘤细胞在体外的活动和研究对真正揭示它的生物学原理还有着 一定的差距，建立合适的神经胶质瘸动物模型，研究神经胶质瘤在体内的活动机 理有着重要的实用价值。构建的斑马鱼神经胶质瘤模型不仅可以方便我们观察 固! ，生! 潺斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 它体内的肿瘤发展情况和血管的发生和变化而且在对药物筛选方面也有着其它 动物模型不可比拟的优点。斑马鱼可以批量繁殖培养和研究，而且它生活在一个 水性环境中，对周围环境中小分子物质具有透过性，这样更方便大批量药物的高 通量筛选。在斑马负药物筛选模型中，主要是使用4 8 孔板和9 6 孔板进行药物的 批量筛选，这样我们便能以最快最有效的方式得出药物的有效性和最适作用浓 度，最后我们可以直接通过显微镜观察斑马鱼表型的变化或者通过原位杂交、免 疫组化、荧光报告基冈等分子生物学技术进步精密准确的去检测相关基因的改 变【2 4 l 。在异源移植的斑马鱼胶质瘤模型中，我们还可以对整个动物模型进行消 化处理，从而达到对这些胶质瘤细胞进行定性定量研究的要求，使得研究更精细 更精确。由于鱼胚在十天之内一般都不具有免疫能力，相对于小鼠模型来说，要 进行异源移植的斑马鱼可以不进行小鼠的那种免疫缺陷处理。即使要进行长时期 的研究或针对成鱼所建立的肿瘤模型，需要进行免疫抑制处理时，它相对与裸鼠 模型也会更加简单和经济【2 5 1 。在斑马负胶质瘤模型i l ，一项应用的比较多的技 术就是荧光标记，这利- 实时追踪的动态研究方法也是大小鼠模型无法达到的，一 般在大小鼠模型中都要选择处死不同时期的动物，来研究其肿瘤组织的发展和变 化，而这种实时追踪的动态研究方法不仅不用处死动物而且还更加精确更利于研 究的连续进行，在荧光追踪实验f f j 我们可以结合荧光标记细胞和荧光标记转基冈 鱼的优点通过共聚焦显微镜和三维重建作图法更清晰更精细的反应出肿瘤细胞 和斑马鱼微环境的变化2 6 】。 综上所述，我们建立的斑马鱼胶质瘤模型有着以往传统动物模型所没有的很 多优点，对进一步研究胶质瘤的分子机制有着重要的意义，它的构建可以帮助人 们更好的研究神经胶质瘤的发病机理、筛选新药物和探索新的治疗方法。 ! 患! 瓣斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 第一章带有红色荧光标记的人胶质瘤细胞系的制备 荧光标记技术是在斑马鱼肿瘤模型中研究细胞定位时最常使用的一项标记 追踪技术【2 6 1 。通过荧光细胞的标记，注射至斑马鱼体内的细胞便能够被实时动 态的监测，且此种荧光标记技术副作用少，不影响细胞功能的发挥。这使得斑马 鱼模型真正实现了体外研究的体内转换。 目前实验研究中通常使用的荧光报告基因主要有绿色荧光蛋白( g f p ) 及其 衍生物，或红色荧光蛋白( d s r e d 或m r f p l ) 。g f p 是一种来自发光水母( a e q u o r e a v i c t o r i a ) 的蛋白，在蓝色激光激发下将发出绿色荧光【2 7 1 。由于近期转基因鱼技术 的成熟，及很多绿色荧光蛋白转基因鱼的成功构建，使得单一的绿色荧光蛋白标 记技术已经不能满足研究者的需要，而来自于香菇珊瑚属( d c o s o m a ) 的d s r e d 这类长波长的荧光蛋白，则是绿色荧光蛋白一种很好的代替和补充，可以实现斑 马鱼体内细胞的多荧光标记【2 8 1 。这些荧光蛋白基因的大量表达对细胞没有毒性， 细胞仍可以连续传代培养，在活细胞实时定位观察中，对活细胞的基因表达变化 和蛋白功能研究更接近自然真实状态。 由于斑马鱼肿瘤模型研究的持续性，我们需要建立可以连续长期发出荧光标 记的细胞系。本实验使用了线性化的红色荧光质粒p c d n a 3 0 + d s r e d 转染人胶 质瘤细胞u 8 7 ，获得稳定转染的红色荧光标记的人胶质瘤细胞。再通过流式细胞 技术和抗牛素g 4 1 8 的筛选，进一步获得高比例稳定转染的红色荧光标记人胶质 瘤细胞系u 8 7 ，从而完成了斑马鱼胶质瘤模型构建中第一步重要的- t 作带有 红色荧光标记的人胶质瘤细胞系u 8 7 的制备。 1 1 实验材料 1 1 。1 质粒、细菌和细胞的来源 p c d n a 3 0 + d s r e d 质粒由本实验室保存。 大肠杆菌d h 5q 由本实验室保存。 u 8 7 人胶质瘤细胞购买于a t c c ( a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ) 。 1 1 2 实验试剂 9 ! 。生芝遗斑马鱼神经胶质瘤模犁的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 实验试剂名称公司名称 d l l 5 0 0 0 ，b g li i 限制性内切酶 日本t a k a r a 公司 胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂糖 美国s i g m a 公司 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 美国i n v i t r o g e n 公司 d m e m 培养基，胎牛血清，胰酶，美国g i b c o 公司 双抗( 青霉素，链霉素) ，2 4 孔细 胞培养板 氯化钠， i r i s 碱，冰醋酸，e d t a ，北京鼎国公司 氢氧化钠，氨苄青霉素，溴化乙锭 去内毒素质粒小提试剂盒美国o m e g a 公司 p c r 清洁试剂盒美国a x y g e n 公司 1 1 3 实验仪器 实验仪器名称 公司名称 液氮罐美国t h e r m o 公司 二氧化碳培养箱美国t h e r m o 公司 电子天平德国s a r t o r i u s 公司 超低温冰箱美国n u a i r e 公司 液氮罐美国t h e r m o 公司 烤箱长沙医疗仪器厂 压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂 磁力加热搅拌器深圳国华仪器公司 针头式过滤器 美国m i l l i p o r e 公司 细胞计数板德国c a r lr o t hg m b h & c o k g 公 司 电动微量加样器 英国g e n c o n s 公司 微量加样器 德国e p p e n d o r f 公司 光学倒置显微镜日本n i k o n 公司 荧光倒置显微镜日本n i k o n 公司 l o ! 。皇! 漂斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 h w y 21l 大容量恒温落地式摇床 西安z h c h e n g 公司 c e n t r i f u g e5 4 15 d 小型台式高速离德国e p p e n d o r f 公司 心机 m i k r o2 0 0 0 r 低温离心机 德国h e t t i c hz e n t r i f u g e n 公司 s i m f 1 2 4 制冰机日本s a n y o 公司 台式离心机德国h e r i n 公司 超净工作台 苏净集团安泰公司 电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司 纯水装置 法国m i l l i p o r e 公司 n a n o d r o p 微量浓度测定仪 美国t h e r m o 公司 1 1 4 主要溶液配制 0 5 m o l le d t a ( p h 8 ，o ) ： 1 8 6 1 9e d t a 溶于8 0 0 m l 双蒸水，磁力搅拌器混匀，加2 0 9 n a o h 颗粒，调 p h 值至8 0 ，定容至1 0 0 0 m e ，高压火菌，备用。 5 0 t a e ： 2 4 2 9t r i s 碱5 7 1 m l 冰醋酸1 0 0 m l0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，加纯水约 8 0 0 m l ，充分搅拌至完全溶解，定容至l l ，分装，高压灭菌备用。 l 琼脂糖凝胶： 0 3 9 琼脂糖加入1 t a e3 0 m l ，微波炉中加热使其充分溶解。 5 m o l ln a o h ： 量取8 0 m l 单蒸水置于1 0 0 m l 烧杯中，称取2 0 9n a o h 小心逐渐地加入到 烧杯中，边加边搅拌。待n a o h 完全溶解后，将溶液定容至1 0 0 m l 后，转移至 塑料容器中，室温保存。 l b 液体培养基： 胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c i1 0 9 ，加约9 5 0 m l 新鲜单蒸水充分混 匀，用5 m o l ln a o h 约0 2 m l 调p h 值至7 0 ，加新鲜单蒸水定容至1 l ，充分混 匀，分装，高压火菌后备用。 溴化乙锭( e b ) ( 5 m g m 1 ) ： 支点怂斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 称量1 0 0 m g 溴化乙锭溶于2 0 m l 单蒸水| 1 1 ，充分溶解后，置于棕色试剂瓶 中，室温避光保存。 氨苄青霉素( 1 0 0 m g m l ) 称量5 9 氨苄青霉素置于5 0 m l 烧杯中，加入4 0 m l 灭菌双蒸水，充分混合 溶解后，定容至5 0 m l ，用0 2 2pm 滤膜过滤除菌，小份分装( 1 m l 份) 后，2 0 保存。 d m e m 细胞培养基： 在4 4 5 m ld m e m 培养基中加入5 0 m l 胎牛血清和5 m l 双抗( i o o u m l 青 霉素，1 0 0ug l l 链霉素) ，混匀后分装于5 0 m l 离心管中，备用。 细胞冻存液： 按照d m s o ：f b s ：1 6 4 0 = 1 ：3 ：6 的体积比配置细胞冻存液，配置全过程 需无菌操作。 1 2 实验方法 1 2 1 去内毒素红色荧光质粒p c d n a 3 0 + d s r e d 的扩增及其线性化处理 1 2 1 1 按照o m e g a 公司的去内毒素质粒小提试剂盒提取 p c d n a 3 0 + d s r e d 质粒 ( 1 ) 接利- l 滴含有质粒p c d n a 3 0 + d s r e d 的大肠杆菌d h 5q 的菌种置于含 有5 m l a m p 的l b 培养基的1 5 m l 离心管中，2 2 0 r p m ，3 7 4 c 摇菌过夜( 1 2 - 1 6 h ) 。 ( 2 ) 吸取1 5 - 5 m l 菌液置于1 5 m l 离心管( 每次l m l ) ，章温1 0 0 0 0 g 离心l m i n 。 ( 3 ) 轻轻去除培养基，收集菌体，加入含有r n a s e a 的s o l u t i o ni 溶液2 5 0 l ll ，充分重悬菌体至菌体完全分散为止。 ( 4 ) 加入2 5 0 p ls o l u t i o ni i ，轻轻混合，温柔的允分颠倒离心管4 - 6 次，直 至菌液澄清为止，整个过程不超过2 m i n 。 ( 5 ) 加入1 2 5 9 l 冰冷的b u f f e r n 3 溶液，温柔的充分颠倒离心管数次，直 至形成白色絮状沉淀为止。室温1 2 0 0 0 g 离心1 0 m i n 。 ( 6 ) 小心吸取上清并转移至新的1 5 m l 离心管巾。加入总体积1 0 的e t r 溶液，上下颠倒7 1 0 次，冰浴1 0 m i n ( 冰浴期问颠倒离心管数次) 。 ( 7 ) 4 2 。c 孵育5 m i n ，2 5 。c1 2 0 0 0 g 离心3 m i n ( e t r 将在管底形成蓝色沉 ! 。生懋斑马鱼神经胶质瘤模型的建立及其相关分子机制的研究硕士学位论文 淀) 。 ( 8 ) 将上清转移至新的1 5 m l 离心管，室温下加入总体5 0 的无水乙醇， 轻柔的上下颠倒6 7 次，室温孵育1 - 2 m i n 。 ( 9 ) 转移7 0 0l al 的上述混合液至安装于2 m l 收集管的干净的小量d n a 结合柱子中，室温1 0 0 0 0 x g 离心l m i n ，倒掉收集管中的液体，继续把d n a 结 合柱安装于收集管上。 ( 1 0 ) 将剩余的混合液继续转移至d n a 结合柱中，1 0 0 0 0 g 离心l m i n ， 再去除收集管中的液体，并继续使用空的收集管。 ( 1 1 ) 在d n a 结合柱中加入5 0 0 i ll 的b u f f e r h b ，按上述条件离心，洗涤 柱子，倒掉收集管中的液体。 ( 1 2 ) 在d n a 结合柱中加入7 0 0ul 的d n aw a s hb u f f e r ，按上述条件离心， 洗涤柱子，倒掉收集管中的液体。 ( 1 3 ) 重复( 1 2 ) 的操作一次。 ( 1 4 ) 将空柱子1 3 0 0 0 g 离心2 m i n ，去除废液。 ( 1 5 ) 将d n a 结合柱子重新置于一个新的1 5 m l 离心管中，加入3 0 pl 的 e n d o t o x