（无机化学专业论文）双检测电流型适体传感器的研究.pdf

、 气 萨r 两南大学硕十学伊论文摘要 双检测电流型适体传感器的研究 无机化学专业硕士研究生钱孝清 指导教师柴雅琴教授 向云教授 摘要 适体是通过指数富集配体系统进化技术( s e l e x ) 从单链寡核苷酸片段库筛选出来的单 链寡核苷酸，它可以和氨基酸、蛋白质、无机离子或者药物等许多种目标分析物特异性结合， 被广泛用于医学诊断、药物检测、生物传感器等方面。电化学适体传感器是一种把适体固定 在电极上做为分子识别元件，然后根据适体和目标分析物结合前后电化学信号的变化，进而 检测出目标分析物的含量。近些年，电化学适体传感器倍受关注，本文从以下几个方面开展 具体工作： 1 基于适体电化学编码纳米粒子灵敏的多检测蛋白质和小分子的适体传感器研究 我们报道了一种利用适配体量子点，基于回填法在同一传感器表面可同时检测蛋白质和 生物小分子的新型检测方法，并用溶菌酶和三磷酸腺苷( a t p ) 做为目标分析物进行检测。首 先加入目标分析物，诱导传感器表面的双链d n a 解旋，释放其中的一条适体链，留下另一条 互补链；接着回填上用于杂化的合成适体链，适体链上连有电化学性的编码量子点；然后用 硝酸溶解量子点( p b s 和c d s ) ，这两种量子点在不同的电势位置上有独特的电化学( e c ) 信 号，根据峰的大小能定量检测出溶菌酶和a t p 的含量。与先前报道的多检测相比，这种方法 主要有三个优点：( 1 ) 第一次用电化学编码的量子点同时测定分子量相差很大的生物分子( 溶 菌酶，1 4 3k d a & a t p ，5 0 7 2d a ) ：( 2 ) 检测溶菌酶和a t p 普通的“信号降低”型检测方法是 目标物诱导置换或者相应的适体链发生构象变化，与之相比，我们这种“信号增加”的多检测方 法，大大提高了灵敏度；( 3 ) 做标记的量子点里含有大量的金属离子，在伏安法检测中有高 灵敏性，这样就能检测出低浓度目标物。综合以上优点，此方法能灵敏地同时检测大小不同 的生物分子。 2 一次性无试剂运行分子逻辑门的多检测生物传感器研究 我们报道了一种无试剂、多检测、高灵敏的电流型传感器，它能同时检测分子量相差很 大的生物分子( 蛋白质和小分子) 。这种多检测传感器的主要原理是，在一次性的印刷碳电极 ( s p c e ) 上，目标分子结合标记有氧化还原探针( 亚甲基蓝，m b 和二茂铁，f c ) 的适体链， l 、 n 两南大学硕十学伊论文摘要 使其从电极表面释放出来，然后用电化学方法检测表面剩余的氧化还原探针。而氧化还原探 针亚甲基监和二茂铁的峰电流位置不同，从峰的大小能分别计算出两种目标检测物凝血酶和 三磷酸腺苷( a 1 1 p ) 的含量。另一方面，拓展研究了分子逻辑门，它在分子计算和“自动调控” 化学体系中有重要作用。我们这种新的多检测传感方法，分别通过目标检测物凝血酶和a t p 输入信号，氧化还原探针被抑制的电流密度输出信号，来表示 a n d ”型分子逻辑门。另外因 为适体具有高选择性、稳定性、和通用的目标分析物( 蛋白质、药物、氨基酸等等) 结合能 力强、使用寿命比抗体长等显著优点，它在生物分子检测中被用做识别元素。而且s p c e 是构 建电化学生物传感器很好的材料，因为它用完即可丢、容易批量生产、成本低，并且用电化 学方法识别分子时快速、灵敏、小型化。结合电化学传导、s p c e s 、不同电化学探针标记的适 体这些优点，构建了一种能同时进行多检测的传感器，并且设计运行分子逻辑门。 3 一次性无试剂的电化学基因传感器运用于多检测和分子逻辑门的研究 我们报道了一种无试剂、一次性、灵敏的、能在同一位点同时检测多种目标物的基因传 感器，它能同时分别检测来自鼠伤寒沙门氏杆菌病原体( g y r b 基因) 和直肠肿瘤( k 1 - a s 基因) 的基因生物标记物。这种多检测基因传感器的原理是，在一次性的印刷碳电极( s p c e ) 上， 分别固定上用两种不同氧化还原探针( 亚甲基蓝：m b ，二茂铁：f e ) 标记的d n a 链，它们 在电极表面形成一个环型的发夹结构，使得氧化还原探针靠近电极表面，当加入的目标d n a 链与之杂交形成双链直立起来时，氧化还原探针远离电极表面，它们的电流强度发生变化。 氧化还原探针m b 和f c 的峰电流位置不一样( m b ：一0 2 8v 和f c ：+ 0 2 5v ) ，它们峰电流 的大小变化能分别反映出两种目标序列的浓度。此外，分子逻辑门的研究越来越热门，因为 它在计算和“自动调控”化学体系中有重要作用。迄今为止，大多数分子逻辑门是光学信号输出， 但是它有局限性，因为没有运用分子技术，光输出有复杂的分界面。然而我们这种多检测d n a 的传感器也可以用来表示 a n d ”型分子逻辑门，g y r b 和k 豫s 基因作为输入，对应的各种氧 化还原探针的峰电流值的变化作为电子输出。 关键词：多检测纳米材料电化学适体传感器 i l 、 - “ 开 啦 两南人学硕+ 学伊论文 a b s t r a c t s t u d y o na m p e r o m e t r i ca n d m u l t i p l e x e d a p t a s e n s o r i n o r g a n i cc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：x i a o q i n gq i a n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ry a q i nc h a i p r o f e s s o ry u nx i a n g a bs t r a c t a p t a m e r sa r eo l i g o n u c l e o t i d e ss e l e c t e d f r o mr a n d o ms e q u e n c en u c l e i ca c i dl i b r a r i e su s i n g s y s t e m i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ( s e l e x ) b e c a u s eo ft h e i rh i g ha f f i n i t i e sa n d s p e c i f i c i t i e si nb i n g d i n gt oa m i n oa c i d s ，p r o t e i n ，i n o r g a n i ci o n so rm e d i c i n e ，a p t a m e r sh a v eb e e n w i d e l yu s e df o rm e d i c a ld i a g n o s i s ，d r u gt e s t i n g ，b i o l o g i c a ls e n s o r sa n ds oo n e l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r w h i c ha reb a s e do nt h es p e c i f i c i t yo fa p t a m e r - t a r g e tr e c o g n i t i o nw i t he l e c t r o c h e m i c a l t r a n s d u c t i o nf o ra n a l y t i c a lp u r p o s e s ，h a v er e c e i v e dp a r t i c u l a ra t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s t h i sr e s e a r c h f o c u s e so nt h ed e t a i l sa sf o l l o w ： p a r t1 a p t a m e r n a n o p a r t i c l e - b a s e ds e n s i t i v e ，m u l t i p l e x e de l e c t r o n i cc o d i n g o fp r o t e i n sa n d s m a l lb i o m o l e e u l e st h r o u g hab a c k f i l l i n gs t r a t e g y w er e p o r tan o v e la p t a m e r n a n o p a r t i c l e - - b a s e db a c k f i l l i n gs t r a t e g yf o ro n e - s p o ts i m u l t a n e o u s d e t e c t i o no fp r o t e i n sa n ds m a l lb i o m o l e c u l e s ，e m p l o y i n gl y s o z y m ea n da d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( a t p ) a st h em o d e lt a r g e ta n a l y t e s o u ra p p r o a c hr e l i e so nt a r g e t - i n - d u c e dr e l e a s eo fa p t a m e r sf r o mt h ed n a d u p l e x e so nas e n s i n gs u r f a c e ，f o l l o w e db yb a c k f i l l i n gh y b r i d i z a t i o no f t h er e s u l t i n gs i n g l e s t r a n d e d d n am o l e c u l e sw i t ha p t a m e r sc o n j u g a t e dt ot h ee l e c t r o c h e m i c a l l ye n c o d e dn a n o p a r t i c l e s s u b s e q u e n t u n i q u ee l e c t r o c h e m i c a l ( e c ) s i g n a t u r e so ft h ea c i d d i s s o l v e dn a n o p a r t i c l e sa td i s t i n c tp o t e n t i a l p o s i t i o n sw i t hw e l l - r e s o l v e dp e a k st h u sr e f l e c tt h ei d e n t i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o n so fl y s o z y m ea n da t e c o m p a r e dw i t hp r e v i o u s l yr e p o r t e dm u l t i p l e x e dd e t e c t i o ns c h e m e s ，o u rn e wa n a l y s i sr o u t ef o rp r o t e i n s a n ds m a l lb i o m o l e c u l e so f f e r st h r e ec l e a ra d v a n t a g e s f i r s t , s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f b i o m o l e c u l e sw i t hd i s t i n c tm o l e c u l a rw e i g h t s ( 1 y s o z y m e ，14 3k d av e r s u sa t e5 0 7 2d a ) i sa c h i e v e d f o rt h ef i r s tt i m e w i t he l e c t r o c h e m i c a l l ye n c o d e dn a n o p a r t i c l et a g s s e c o n d ，i nc o n t r a s tt oo t h e r c o m m o n “s i g n a lo f f a s s a yf o r m a t sf o rl y s o z y m ea n da t pb a s e do nt a r g e t - i n d u c e dd i s p l a c e m e n to r c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so ft h ec o r r e s p o n d i n ga p t a m e r s ，o u rm u l t i p l e x e dm e t h o di sa “s i g n a lo n ” c o n f i g u r a t i o n , w h i c he x h i b i t si m p r o v e ds e n s i t i v i t y t h i r d t h ea n a l y t i c a ls i g n a la m p l i f i c a t i o nb yt h e 、 r 两南大学硕+ 学伊论文 a b s t r a c t n a n o p a r t i c l e l a b e l sc o m p o s e do fal a r g en u m b e ro fm e t a li o n sa n dt h eh i g hs e n s i t i v i t yo ft h e v o l i a m m e t r i cs t r i p p i n gd e t e c t i o nl e a dt ol o w - c o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n a t i o no ft h et a r g e ta n a l y t e s t h e c o m b i n a t i o no ft h e s ea d v a n t a g e sf a c i l i t a t e st h ed e t e c t i o no fb i o m o l e c u l e sw i t hd i s t i n c ts i z e si na m u l t i p l e x e da n ds e n s i t i v em a n n e r p a r t2a r e a g e n t l e s s ，d i s p o s a b l ea n dm u l t i p l e x e de l e c t r o n i cb i o s e n s i n gp l a t f o r m ：a p p l i c a t i o nt o m o l e c u l a r l o g i cg a t e s w ed e m o n s t r a t ear e a g e n t l e s s ，m u l t i p l e x e d ，d i s p o s a b l ea n dy e ts e n s i t i v ee l e c t r o n i cs e n s i n g p l a t f o r mf o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fb i o m o l e c u l e sw i t hs i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei ns i z e ( p r o t e i n s a n ds m a l lm o l e c u l e s ) o u rn o v e lm u l t i p l e x e ds e n s i n gp l a t f o r m r e l i e so nas i n g l e s t e p ，t a r g e t - i n d u c e d d i s p l a c e m e n to ft w ot y p e so fr e d o x - t a g s ( m e t h y l e n eb l u e ，m ba n df e r r o c e n e ，f c ) c o n j u g a t e ds i g n a l i n g a p t a m e r s c o n f i n e do nad i s p o s a b l es c r e e n p r i n t e d c a r b o n e l e c t r o d e ( s p c e ) ，f o l l o w e db y e l e c t r o c h e m i c a l ( e c ) m o n i t o r i n go ft h es u r f a c e - r e m a i n e dr e d o x - t a g s t h er e d o x t a g s ，m ba n df c ， e x h i b i tt w ow e l l r e s o l v e dp e a k s ，w h o s ep o s i t i o n sa n ds i z e sr e f l e c tt h ei d e n t i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o n so f t h et a r g e ta n a l y t e s ，t h r o m b i na n da d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( a t p ) ，r e s p e c t i v e l y o nt h eo t h e rh a n d ，t h e r e h a sb e e na l li n c r e a s i n gr e s e a r c hf o c u so nt h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rl o g i cg a t e sb e c a u s eo ft h e i r i m p o r t a n tr o l e si n m o l e c u l a rc o m p u t a t i o na n d “a u t o n o m o u s l yr e g u l a t e d ”c h e m i c a ls y s t e m s b a s e do n o u rn e wm u l t i p l e x e ds e n s i n gp r o t o c o l ，a n “a n d m o l e c u l a rl o g i cg a t eo p e r a t i o ni sf u r t h e rr e a l i z e db y e m p l o y i n gt h et a r g e ta n a l y t e s ，t h r o m b i na n da t ea st h ei n p u t sa n dt h ec u r r e n ti n t e n s i t ys u p p r e s s i o n s f r o mt h er e d o x - t a g sa st h eo u t p u t s ，r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , i n t e n s er e s e a r c he f f o r t sh a v eb e e np u ti n e m p l o y i n ga p t a m e r sa sr e c o g n i t i o ne l e m e n t si nb i o d e t e c t i o n sd u et ot h e i rd i s t i n c ta d v a n t a g e ss u c ha s h i g hs e l e c t i v i t y , s t a b i l i t y , v e r s a t i l et a rg e tb i n d i n gc a p a b i l i t y ( p r o t e i n s ，d r u g s ，a m i n oa c i d s ，e t c ) a n d l o n gs h e l fl i f eo v e ra n t i b o d i e s b e s i d e s ，s p c e sa r ep r o m i s i n gm a t e r i a l sf o rt h ef a b r i c a t i o no fa ne c b i o s e n s o rd e v i c ed u et ot h e i rd i s p o s a b l e ，e a s ym a s sp r o d u c t i v ea n dc o s t - e f f e c t i v en a t u r e ，a n de c m e t h o d sc a nt r a n s d u c em o l e c u l a rr e c o g n i t i o ne v e n t si naf a s t , s e n s i t i v ea n dm i n i a t u r i z e df a s h i o na s w e l l c o u p l i n gt h ea d v a n t a g e so fe ct r a n s d u c t i o n , s p c e s ，a n dt h ed i s t i n c te cl a b e l sw i t ht h e s u p e r i o r i t yo fa p t a m e r sw o u l dp o t e n t i a l l yf a c i l i t a t et h ef a b r i c a t i o no f r n u l t i p l e x e dp o i n t - o f - c a r ed e v i c e s a n dt h ed e s i g no fr o b u s tl o g i cg a t eo p e r a t i o n s p a r t3a r e a g e n t l e s sa n dd i s p o s a b l ee l e c t r o n i cg e n o s e n s o r ：f r o mm u l t i p l e x e da n a l y s i st o m o l e c u l a rl o g i cg a t e s w er e p o r th e r e i nar e a g e n t l e s s ，d i s p o s a b l e ，s e n s i t i v ea n dm u l t i p l e x e dg e n o s e n s o rf o ro n e s p o t s i m u l t a n e o u sm o n i t o r i n go ft w og e n eb i o m a r k e r sf r o mt h es a l m o n e l l at y p h i m u r i u mp a t h o g e n ( g y r b g e n e ) a n dt h ec o l o r e c t a lt u m o r ( k r a sg e n e ) ，r e s p e c t i v e l y t h i sm u l t i p l e x e dg e n o s e n s o ri sb a s e do n i v w h o s ep o s i t i o n s ( m b ：- 0 2 8va n df c ：+ 0 2 5v ) a n ds i z e sr e f l e c tt h ei d e n t i t i e sa n dc o n c e n t r a t i o n so f t h et a r g e ts e q u e n c e s m o r e o v e r ，m o l e c u l a rl o g i cg a t e sh a v er e c e i v e di n c r e a s i n ga t t e n t i o no w i n gt oi t s i m p o r t a n tr o l e si nd e v e l o p i n gm o l e c u l a rc o m p u t a t i o n sa n d a u t o n o m o u s l yr e g u l a t e d c h e m i c a l s y s t e m s m o s to ft h em o l e c u l a rl o g i cg a t e sr e p o r t e dt od a t e ，h o w e v e r ，a r em a i n l yb a s e do no p t i c a l o u t p u t s ，w h i c hs u f f e r t h el i m i t a t i o n so f c u m b e r s o m e l yi n t e r f a c i n gt h eo p t i c a lo u t p u t sw i t h n o n - m o l e c u l a r - b a s e dt e c h n o l o g i e s i nr e s p o n s e ，b a s e do no u rm u l t i p l e x e dd n a s e n s i n gs t r a t e g y , w e s h o wt h a tar o b u s t a n d m o l e c u l a rl o g i cg a t eo p e r a t i o nc a nb ed e s i g n e db ye m p l o y i n gt h eg y r ba n d k - w a sg e n e sa si n p u t sa n dt h ed i s t i n c tc u r r e n ts u p p r e s s i o n sf r o mt h er e d o x - t a g sa st h ee l e c t r o n i c o u t p u t s ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：m u l t i p l e x e dd e t e c t i o nn a n o p a r t i c l e se l e c t r o c h e m i s t r y a p t a s e n s o r v 两南大学硕十学伊论文 第1 章 曼曼曼皇曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼舅曼置曼曼曼曼鼍皇皇量量量喜舅皇皇量量舅曼曼曼曼曼量量量量量量量曼量皇舅曼量量量量曼量量量量曼曼量曼曼量皇置曼曼量 第1 章绪论 1 1 电化学适体生物传感器 1 1 1 适体简介 核酸适体( a p t a m e r ) 也称核酸适配体或核酸适配子，它是利用体外筛选技术一 指数富集的配体系统进化技术( s e l e x ) 从随机单链寡核苷酸文库中筛选出d n a 或r n a 片段，一般由2 5 - - 8 0 个碱基组成。1 9 9 0 年t u e r k 等首次利用s e l e x 技术 成功筛选到噬菌体t 4 d n a 聚合酶的r n a 片段【1 1 ，这种单链r n a 片段被称为 “a p t a m e r ，该词来源于拉丁文“a p t u s ”，意为“适合”。 。器 踹l 器 嗍 蒜? j o r 触州j 、，k 托 v 一_ _ o i 图1 1s e l e x 示意图 指数富集的配体系统进化技术( s e l e x ) 如图1 1 所示，由以下几个基本步骤 组成：( 1 ) 建立一个巨大的单链寡核苷酸片段库；( 2 ) 将这些单链寡核苷酸片段分 别与目标分析物作用，目标物将和有特异性的片段结合起来；( 3 ) 用过滤或色谱等 方法，将特异性寡核苷酸片段与目标物的结合物跟其它的寡核苷酸片段分离开来； ( 4 ) 将片段与目标物分开，释放出特异性的寡核苷酸片段；( 5 ) 用p c r 扩增筛选 出的寡核苷酸片段，进入一级候选库；( 6 ) 对进入一级候选库的片段重复步骤2 5 ， 筛选出亲和性更高，特异性更好的寡核苷酸片段，该步骤重复5 8 次，筛选出的寡 核苷酸片段就能批量生产，并用于目标分析物的检测1 2 j 。 1 1 2 适体的优点 适体代替抗体作为生物传感器的识别分子，主要有以下几个优点【3 ，4 】： ( 1 ) 特异性高，亲和力好：适体与配体之间的解离常数一般为1 0 - 9 - - 1 0 。zm o l l ， 盟 f 嚣 簪 一 丑严 两南大学硕十学伊论文第t 章 所以适体与目标分子结合具有很高的特异性。例如，咖啡因在分子结构上比茶碱多 一个甲基，茶碱单克隆抗体检n - - 者时有交叉反应，而用s e l e x 技术筛选出的核酸 适体只会跟茶碱特异性结合，而且它跟茶碱的结合能力比咖啡因高1 0 0 0 0 倍。 ( 2 ) 制备方便、合成速度快：制备单克隆抗体至少需要3 - - 6 个月且成本昂贵， 而适体的制各是通过s e l e x 技术在体外筛选，不依赖细胞或者动物，筛选出来的适 体还可以通过化学合成，成分确定纯度高，易于批量生产。目前s e l e x 已经实现自 动化，进一步提高了生产效率，降低了成本。 ( 3 ) 可修饰性：一般说来对适体进行简单的修饰，它的生物活性不会受到影响。 比如说，可以修饰氨基、生物素、巯基，也可以修饰酶、光活性和电活性物质。 ( 4 ) 目标分子范围广：酶跟底物结合，抗体跟抗原结合。而适体不但可以和相 应的碱基序列结合，还可以跟酶、抗体、生长因子、细胞粘附分子等较大的蛋白质 分子结合，也可以跟肽、药物、氨基酸、金属离子等小分子结合，甚至可以跟细菌、 细胞、病毒颗粒等结合。所以适体传感器的目标分子范围很广。 ( 5 ) 结构简单，分子量小：适体分子量小，它是一段由2 5 8 0 个碱基组成的 单链寡核苷酸片段，分子量一般为8 1 5k d a ，这样它与目标分子结合空间位阻小， 有利于构建高密度阵列生物传感器。 ( 6 ) 性质稳定，易于保存、可反复使用：抗体容易变性，不宜长时间保存，温 度、p h 值等外界条件容易影响它的活性。与之相比，适体比较稳定，在冷冻条件下 它以干粉的状态可以保存好几年，即使在某些条件下发生变性，在适当的条件下也 能恢复活性，这有利于适体传感器的反复使用以及提高它的使用寿命。 1 1 3 适体生物传感器的原理及分类 适体传感器是一种可以连续而且可逆识别分子的传感装置【5 】。它主要由接收器、 换能器和电子线路三部分组成，利用电子系统放大处理和显示信号，从而可以定性 和定量地检测目标分析物。当具有识别功能的接收器识别目标分析物时，目标分析 物和固定在接收器上的亲和配基发生反应进而瞬间产生能量转移，这种能量经过换 能器以电或者光等物理信号输出，通过电子系统的放大处理和显示，定性和定量检 测目标分析物。根据不同豹换能器，适体传感器主要可分为光学适体生物传感器( 光 适体生物传感器又可以分为：光纤适体传感器、消失波光纤生物传感器、表面等离 子共振适体传感器、荧光适体传感器) 、压电晶体适体传感器( 压电晶体适体传感器 又可以分为：体波式适体传感器、表面声波适体传感器) 和电化学适体传感器。 1 1 4 电化学适体传感器的发展 电化学适体传感器是把适体和目标分析物结合，从而产生的信号转化为电信号 2 两南人学硕+ 学伊论文第1 章 表达出来的。传感器的识别分子是适体，根据检测信号是否来源于标记物，电化学 适体传感器可分为两类：标记型和非标记型。 法很多，比如说，循环伏安法、交流伏安法、 伏安法、法拉第阻抗法。 l 、标记型电化学适体传感器 适体传感器用于定量检测的电化学方 方波伏安法、差分脉冲伏安法、溶出 标记型电化学适体传感器是指，标记适体并通过检测反应前后标记物的电化学 信号变化来检测目标分析物。标记型传感器的灵敏度很高，但是适体需要标记，操 作繁琐。一般说来有三种物质可以做标记物，一是电化学活性物质，在适体上作为 识别的电活性物质主要有亚甲基蓝( m b ) 和二茂铁( f c ) ；二是酶，例如碱性磷酸 酯酶、辣根过氧化氢酶；三是纳米材料，纳米材料既可以作为适体固定基底，又可 以作为标记物放大信号1 6 。 图1 2 “s i g n a lo f f ”型适体传感器构建图 ( 1 ) 小分子电活性物质标记的电化学适体传感器 在适体上标记亚甲基蓝( m b ) 、二茂铁( f c ) 等小分子电活性物质，一般说来， 适体( 单链d n a 或者单链i 矾a ) 的空间构象不稳定，当目标分析物存在时，适体 与之结合发生构象变化，通过检测反应前后小分子电活性物质的电化学信号，从而 可以达到检测目标分析物的目的。这种“信号开关”型的传感器可以分为两类：信号 增加“s i g n a lo n ”型和信号降低“s i g n a lo f f 型。y a n g 等人设计的“s i g n a lo f f 型电化学适 体传感器1 7 j ，如图1 2 所示，适体固定在沉积纳米金的印刷碳电极上，当没有目标分 析物时，适体形成发央结构，电活性标记物亚甲基蓝靠近电极表面，电流信号增大； 当加入目标分析物( 一段与适体互补的d n a 单链) 后，适体和目标分析物在电极表 面上杂交，适体直立起来，亚甲基蓝远离电极表面，电流信号明显降低。通过检测 亚甲基蓝电流信号的降低值，就可以计算出目标物的含量。关于“s i g n a lo f f 型适体传 感器的研究很多，有些是因为加入目标分析物后，适体的构象发生变化，导致电信 号降低【8 以们，有些是因为加入的目标分析物带走了与之相对应的标记有电活性物质的 o 易，冒r 蛰 两南大学硕十学伊论文第1 章 适体，导致电信号降低l l l 】。 图1 3 “s i g n a lo n ”型适体传感器构建图 与“s i g n a lo f f 型相对应的电化学适体传感器，就是“s i g n a lo n ，型，它随着目标分 析物浓度的增加，电流信号值增加。b r i a n 等人构建的“s i g n a lo i l ”型适体传感器【l 2 1 ， 如图1 3 所示，将一段标记有电化学活性小分子亚甲基蓝的适体固定在金电极表面， 当没有目标分析物可卡因时，亚甲基蓝远离电极表面，电信号较小；当加入可卡因 后，适体链与其特异性结合，形成“y ”型结构，迫使亚甲基蓝靠近电极表面，电信号 大大增加。根据亚甲基蓝电信号的增加值，就能计算出目标分析物可卡因的含量。 “s i g n a lo n ”型适体传感器在加入目标分析物后，既有因为适体构象发生变化，使电信 号增大 1 3 - 1 6 1 ；也有同时加入目标物和另一段标记有电活性物质的适体，这二者和之 前固定在电极表面的适体结合起来，组成特殊的构型，产生电信号【1 7 ，1 8 】。由于“s i g n a l o n ”型适体传感器随着目标物浓度的增加，电信号值增加，所以这种传感器跟“s i g n a l o f f 型相比，更加灵敏。 ( 2 ) 酶标记的电化学适体传感器 现在蛋白质的检测主要运用酶联免疫法，把酶标记在适体上，综合了酶标记和 适体的优点，有利于检测跟疾病相关的蛋白质。凝血酶【1 9 1 和p d g f 2 0 2 1 1 等蛋白质有两 个结合位点，可以建立“三明治结构的适体传感器，如适体一目标分析物一标记酶 的适体，m o n i c a 等人就构建了这样的酶标电化学适体传感器【2 2 1 。如图1 4 所示，首先 在能与凝血酶特异性结合的适体一端标记上巯基，并将其固定在金电极表面上，然 后加入目标物凝血酶，它能和适体结合，接着在凝血酶的另一个结合位点结合上一 端标记有生物素的适体链，最后这条适体链结合上标记有亲核素的辣根过氧化氢酶 ( h r p ) ，这样就构成了一个典型的“三明治”结构适体传感器。通过检测标记的辣 根过氧化氢酶对过氧化氢的催化氧化，就能计算出目标分析物凝血酶的含量。该实 验还在没有辣根过氧化氢酶标记的适体或者没有巯基标记的适体的情况下，做了对 比实验，效果均没有“三明治 构型的好。类似的用酶标记适体产生或者增强电信 4 两南大学硕十学伊论文第1 章 号的传感器还有很多，例女h r e b e c a 等人构建了一种电化学传感器【2 引，在适体上标记 碱性磷酸酯酶( a l p ) ，来检测一段特定的d n a 序列。 乳警二 鼎1 厂珏：q 酗k 图1 4 酶标记的适体传感器的构建图 ( 3 ) 纳米材料标记的电化学适体传感器 纳米材料是指至少有一维方向微观结构尺度在l 1 0 0n n l 之间的超微颗粒及其 致密的聚集体【2 4 1 。因为它具有表面效应【2 6 】，量子尺寸效应【2 5 2 7 】，宏观量子隧道效应， 所以纳米材料具有比表面积大、吸附能力强、电子传输性好、催化能力强等优点， 它已广泛的运用在生物传感器中。纳米材料既可以运用在光学适体传感上【2 8 。3 0 】，又 可以运用在电化学适体传感器上。在电化学适体传感器中，纳米材料既可以固定在， 电极表面增大传感器的灵敏性【3 1 1 ，又可以标记在适体上放大电信号。z h a n g 等人就设 计了一种这样的适体传感器【3 2 ，如图1 5 所示，把纳米金标记在适体上，放大信号， 提高检测目标序列的灵敏性。除了在电极上，在溶液中的磁珠上同样可以构建纳米 材料标记的适体传感器1 3 3 。 a c 一 碧王 ， 5 一 厂 圈延 圈1 5 纳米粒子标记的适体传感器的构建图 2 、无标记型电化学适体传感器 无标记型适体传感器少了一次标记的程序，操作起来更简单。如图1 6 a 所示【3 4 1 ， 将适体固定在金电极表面，结合目标物血小板衍生生长因子( p d g f ) 之后，导致电 极表面传质屏蔽层更厚，电流值减小，阻抗增大，根据电信号的变化就能计算出目 鳖昝 西南大学硕十学伊论文第1 覃 标物的含量。因为电化学阻抗谱有良好的界面表征能力，生物分子不会受到微小振 幅正弦电压或者电流的干扰，所以灵敏度高，是一种优异的生物传感技术。适体链 相对比较小，它的反应特性反映的能量变化也比较弱，所以适体传感器比免疫传感 器更加灵敏【3 5 】。因为检测小分子目标物时，目标物和适体结合之前与结合之后阻抗 的变化很小，所以要放大法拉第阻抗变化，e l b a z 等人就设计了这样的适体传感器【3 引。 如图1 6 b 所示，首先在电极表面固定一条单链d n a ，这条d n a 链既含有可卡因适 体识别片段也含有可卡因5 单磷酸适体识别片段。接着适体识别片段与这条d n a 互补杂交，形成具有两段双链结构的适体传感器。然后加入目标分析物可卡因或者 可卡因5 单磷酸，目标分析物和与之相对应的适体链结合后，另一段双链结构就不 稳定了，最后双链解旋适体被目标分析物带离电极表面，这样目标物和适体结合之 前与结合之后阻抗的变化增大。这种传感器既能检测两种小分子的目标分析物，同 时又放大了检测信号。 一 b 图1 6 无标记型电化学适体传感器的构建图 总而言之，近些年来人们不断研究和拓展电化学适体传感器，使得它的发展很 快。以后电化学适体传感器可能从以下几方面发展：( 1 ) 筛选与目标分析物亲和力 更好的适体，提高特异性结合能力，减少干扰；( 2 ) 探索新的构建方法和检测技术， 构建操作简单、重复性好的传感器；( 3 ) 运用纳米技术扩大信号，提高灵敏度【37 】； ( 4 ) 推广适体传感器在环境检测、临床医学、药物传输等方面的实际运用。 6 两南大学硕十学伊论文 第1 章 1 2 量子点标记d n a 半导体纳米晶体又称为量子点，主要是i v 族元素按照特定的方式组成的纳 米颗粒。量子点的研究内容涉及了化学、物理、材料科学等许多学科，开始量子点 运用在光电材料和微电子方面，后来因为它独特的光学性质，被应用在疾病检测、 临床医学等方面。近些年来，随着量子点的深入研究，在检测离子、有机小分子、 生物分子等方面都有运用【3 8 】。 1 2 1 量子点的性质及制备 量子点具有独特的光学性质，其直径为1 1 2n n l ，由于它的直径和光的波长接 近，所以它能和光产生特殊的相互作用。随着量子点粒径大小的改变，它的颜色也 会改变1 3 9 j 。和传统的染料相比，量子点具有可调的荧光发射波长、对称的荧光发射 光谱、连续的吸收光谱、光学稳定性好等特点【4 0 】。 一般用液相法制备量子点【4 ，液相法设备简单、原料易得、制备纯度高。液相 法又可以分为