（动物学专业论文）rapd分析江西赣州（贡江）水系鲤鱼（cyprinus+carpio）种群遗传多样性.pdf

a b s t r a c t ab s t r a c t g e n e t i c d i v e r s i ty a n al y s i s o f d i ff e r e n t p o p u l a t i o n s o f c o m m o n c a r p o f g a n z h o u w a s a n al y z e d 妙 r a n d o m a m p l i fi e d p o l y m o r p h i c d n a ( r a p 功 a s s a y . t h e c o m m o n c a r p w e re fr o m r ij m c o u n ty p o p u l a t i o n (u), x i n g g u o c o u n ty p o p u l a t i o n ( x g ) , g a n x i a n c o u n ty p o p u l a t i o n ( g x ) , y u d u c o u n ty p o p u l a t i o n ( y d ) a n d h u i c h a n g c o u n ty p o p u l a t i o n ( h c ) . 1 1 p r i m e r s t h a t c a n g e t t h e c l e a r a n d p o l y m o r p h i c b a n d s w e r e s e l e c t e d i n 2 5 p r i m e r s . a c c o r d i n g t o t h e s i m i l a r i d e n t i ty ( s i ) a n d s i m i l a r d i s t a n c e ( s d ) , t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e fi v e p o p u l a t i o n s i n g a n z h o u r e g i o n w a s m a d e . 1 1 p r i m e r s c a n g e t 1 7 7 2 c l e a r a n d p o l y m o r p h i c b a n d s . t h e a v e r a g e p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i c l o c i t o t o t a l d n a o f t h e fi v e p o p u l a t i o n s w a s 8 5 . 0 4 % . a re l a t i v e l y h i g h l e v e l o f i n t r a s p e c i f i c g e n e t i c d i v e r s i ty w a s r e v e al e d : h e = 0 .2 7 0 8 8 , i =0 . 3 9 5 6 2 a n d p p b = 6 6 .2 0 % a t p o p u l a t i o n l e v e l ; h e = 0 . 3 2 3 2 , i = 0 .4 7 8 9 a n d p p b = 8 5 .0 1 % a t s p e c i e s l e v e l . t h i s s t u d y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e l e v e l o f g e n e t i c v a r i a t i o n o f t h e r i j i n p o p u l a t i o n ( 1 j ) ( h -0.2 9 1 9 ; i = 0 .4 2 4 1 ; p p b = 7 0 .3 % ) w a s h i g h e r t h a n t h a t o f t h e o t h e r p o p u l a t i o n s .g e n e t i c d i s t a n c e u p g ma s y s t e m o c c u r r e n c e t r e e c l u s t e r i n g r e s u l t d i s p l a y , g e n e t i c d i s t a n c e ( s d ) r a n g e d fr o m 0 . 1 3 7 1 t o 0 .2 1 9 2 , w i t h a v e r a g e o f 0 . 1 7 6 3 6 , a n d g e n e t i c i d e n t i ty ( s i ) r a n g e d fr o m 0 .8 0 3 2 t o 0 . 8 7 1 9 , w i t h a v e r a g e o f 0 . 8 4 1 8 . n e i s g e n e t ic d i v e r s i ty a n al y s i s s h o w e d a l o w fr e q u e n c y o f g e n e fl o w ( g s t = 0 . 3 2 1 7 ; n m = 1 . 0 5 4 1 ) e x i s t e d . a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e re w a s a c e r ta i n g e n e t i c d i ff e r e n t i a t i o n b e t w e e n t h e s e p o p u l a t i o n s . t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r i j i n c o u n ty p o p u l a t i o n ( r j ) a n d x in g g u o c o u n ty p o p u l a t i o n ( x g ) i s c l o s e s t . t h e re l a t i o n s h i p b e t w e e n r ij i n c o u n ty p o p u l a t i o n ( r j ) a n d h u i c h a n g c o u n ty p o p u l a t i o n ( h c ) i s f a r th e s t . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s h o w s t h a t , t h e g e o gr a p h i c al i s o l a t i o n i s t h e m a i n i n fl u e n c e t o g e n e t i c d i ff e r e n t i a t i o n . k e y wo r d s : c a r p ; g e n e t i c d i v e r s i ty; r a p d ; g o n g j ia n g r e g i o n ; j i a n g x i p r o v i n c e 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论 文是本人在导师指导下进行的 研究工作及取得的 研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他 人己 经 发 表 或 撰 写 过的 研究 成 果 ， 也 不 包 含为 获 得 丛达兰一 或 其 他 教 育 机 构的 学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 (手 、 :郁 坷 签 字 日 期 :x 07 年 了 月 抖 日 学位论文版权使用授权书 本 学 位 论 文 作者 完 全了 解i 团 鲤 ( 塘鲤、 荷包 鲤) ， 产于广东、 江西; 祀麓鲤， 产于云南: 沉 江鲤( 红尾鲤) ， 产于湖南沉江: 三角鲤， 产于广西: 大眼鲤， 产于云南的洱海等。 此外， 我国各地还有不少鲤鱼的地方品种， 如湖南的呆鲤、 江西的红鲤、 河南的 黄河鲤、辽宁的淞花湖鲤以 及从国外引进的鳞鲤、镜鲤等。 在中国， 鲤具有悠久的养殖历史和重要的经济价值， 无论是天然种群还是养 殖品种， 年产量远超过其它鱼类。 近几十年来， 养殖新品种的开发获得成功， 大 大提高了产量， 改善了品质。 但是由于盲目的开发利用， 许多重要的鲤养殖种类 的种质资源遭到破坏。 因此， 开展鲤鱼， 特别是地方品种鲤鱼的遗传多样性调查 有重要的意义。 1 .鱼类遗传多样性研究的主要方法 在自 然界中， 遗传变异在个体、 群体以及物种间广泛存在。 遗传变异的广泛 存在导致生物在不同水平上体现出遗传多样性。 包括群体水平、 个体水平、 组织 和细胞水 平以 及分 子水 平o 1 。 遗传多样性研究的 基本原理就是从群体、 个体、 组 织和细胞以及分子水平来研究物种的遗传结构， 度量物种的遗传变异， 为物种的 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 遗传资源开发、 利用和保护提供资料。 因而， 对遗传多样性研究的主要方法也主 要体现这几个不同 水平( 层次) 上。 1 . 1形态水平 从形态水平或表型水平来检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法 11 .2 1 。 通常 利 用的 表型 性 状 有两 类: 一 类是 质量 性 状( 如体 色、 鳞被 和鳞 式、 脊 椎 数、 鳃耙 数等) ， 另一 类是数量性状 ( 如大多 数形态性状、 生活 方式性状等 ) 。 对于 质量性状通常采用较为简单的文字描述和简单的生物统计方法， 对于数量性状可 通过方差、 相关、 回归 及多元统计分析等方法。 随 着数量遗传学的不断发展， 对 表型水平的研究将更为科学和严密， 因为数量遗传学方法估算的许多重要的遗传 参数， 不仅用来度量群体间或群体内遗传变异的大小， 而且能推断群体中已发生 过的 进 化事件以 及未 来因素 将如何影响群体 1 ， 这对珍稀濒危物种保护措施的制 定和实施具有重要价值。 形态学水平往往建立在个体性状描述和宏观观测的水平上。 这种方法可利用 的形态性状标记较少， 无法随机代表生物群体的 遗传组成。 同时表型和基因型之 间存在基因表达、 调控、 个体发育等一系列复杂的中间环节， 加上环境条件的影 响等因素。 因此， 表型差异不一定反映基因型上的差异， 基因型上的差异也不一 定在表型上体现出来。 如何根据表型性状的差异来反映基因型的差异就成为形态 学方法研究遗传变异的关键。 尽管如此， 用形态性状来估测遗传变异是一种较为 现实的 方法， 尤其是当需要在短期内 对变异有所了 解或其它方法无法开展时， 形 态学研究不失为一种有价值的 选择 t 从形态水平来研究鱼类的遗传多样性是一项长期而基本的方法， 国内外在此 方 面 作 了 大量 的 工 作 3 ,4 1 。 鱼 类 分 类 学 上 通 常以 形 态 差 异 ( 体 型、 鳞 被、 鳍 式 及 脊 椎骨数 等) 来进行鱼类群体鉴别和分 类。 随 着统计方法的 不断发展， 形态水平的 研究逐渐从性状的直观描述和宏观观测发展到形态性状的多元统计分析， 从鱼类 的 传 统 可 数、 可 量 性 状发 展 到 现 代的 框 架结 构 数据3 ,5 -6 1 。 近年来， 图 像处 理 技 术 也开 始 用 于 鱼 类形 态学的 研究中 闭 。 这 使 鱼类的 形 态水 平 研究 进 入 更 科 学、 更 精 确的研究水平。 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 1 . 2细胞( 染色体) 水平研究 随着解剖学和细胞生物学的发展， 生物的遗传多样性研究也从宏观的形态水 平向微观的染色体水平深入。 由于生物的遗传信息均包含在染色体上， 染色体的 变异必将导致遗传变异的发生。 所以染色体变异是生物变异的重要来源。 鱼类核 型的研究， 不仅对鱼类分类学和系统演化的探讨将显示出不可忽视的作用， 而且 对于鱼类的遗传、 变异和杂交育种等方面的研究， 无论在理论上还是应用上都具 有重要的意义。 每种生物的染色体数目 是相对恒定的， 通常为一套父本和一套母本遗传物质 的二倍体。 但在不少物种中， 染色体水平的变异广泛存在。 染色体变异包括染色 体数目 变异和结构变异。鱼类染色体多态性也包括了数目多态性和结构多态性。 染色体数目 变异主要是表现在染色体整倍性( 单倍体、 三倍体及多倍体等) 和非整 倍性变异。 染色体非整倍性变异常导致生物个体败育或发育不正常， 它在进化中 的 意义不大。 染 色体结构的 变 异( 缺失、 重复、 易 位和倒位) 在群体内 最为常见。 据估计， 大约5 0 0 个个体中就有一个发生染色体结构变异。 在某些群体中， 变异 频 率 可 能 会 大 大超 过 此数， 只是 结构 变 异 不像 数目 变 异那 样 容易 观 察 和 分 析$ 1 除染色体数目 和结构变异外， 染色体在着丝点位置, 绕痕和随体以 及超染色体( b 染色体) 等特征上体现出 多样性。 染色体变异在生物进化中具有十分重要的作用 1 1 ， 同时也是生物进化的档案 库9 1 。 染色体水平上的遗传多 样性研究主要在细胞的 特定分裂时 相( 通常是有丝 分裂中 期 ) 的 染色体的 数目 和形态( 着丝点 位置、 相 对长 度、 臂长、 臂比 等参数 ) ， 以 及 通 过 染 色体 显 带 ( 如c , g , r , t , q带等 ) 技 术和 染色 体原 位杂 交 ( f i s h ) 技 术检测染色体的多样性。 但染色体水平的 研究只有当染色体内部结构的微小变异 积累到一定程度， 导致染色体表型结构发生变化时， 才能检测出 表型变化来。 再 加上技术问题， 重复性和稳定性差以及检测数量的有限性， 其结果往往不尽人意， 难以 获得令人信服的 证据 io- u l 世界上对鱼类染色体水平上的研究较多，但主要集中在常规的核型分析上， 在显带 技术方面的 研究还 较不 足 u 1 。 据不完 全统 计， 全世界己 对 近2 0 0 0 种鱼类 进 行过 核 型 研究， 约占 鱼 类 种 数的1 0 % ， 遍 及3 0 个目 1 3 1 。 我国 于2 0 世纪7 0 年 代初开始鱼类染色体研究，1 9 7 5年长江水产研究所等首次报道了我国 鱼类的染 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 色体研究。至今我国已 报道3 0 7 种鱼类的染色体研究，其中海水鱼类5 0 种，淡 水 鱼类2 5 7 种12 ,14 1 5 1 。 目 前正 开 始实 行的 染 色体原 位杂 交( f i s h ) 技 术为 染色 体 水 平的遗传多样性研究开辟了更广阔的前景。 1 . 3酶( 蛋白 ) 水平研究 蛋白质遗传多样性的研究主要集中在同工酶、 血清蛋白、 血红蛋白、 肌肉蛋 白 等方面。 同工酶是存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织， 甚至同一组 织或同一细胞中， 催化同一种化学反应， 但酶分子结构有所不同的一组酶。 同工 酶已 广泛应用于鱼类的物种及杂种鉴定、种质资源保护和遗传多样性研究等。 鱼 类的 同 工酶 研究始于1 9 6 0 年， k a p l a n 首先研究了 蝶科鱼类的l d h同 工 酶。1 9 6 5 年， ma r k e rt同时分析了3 0 种鱼类的乳酸脱氢酶，指出不同个体间以 及同一个体的不同组织具有特定的同工酶谱。 我国在鱼类同工酶方面的研究起步 较晚， 1 9 8 2 年， 朱蓝菲等 1 6 1 对几种鲤科鱼类的l d h同工酶进行了 研究， 并探讨 了 它 们间 的 亲缘 关系， 开 始了 我国 的 鱼 类同 工 酶研究。 李思发 等【2 0 1 对长 江、 珠 江、 黑龙江的鳞、 鲡和草鱼原种种群进行了同工酶分析， 发现三条江中三种鱼的 平均杂合度是草鱼: 长江0 . 1 0 7 6 珠江0 .0 8 3 3 黑龙江0 .0 4 5 4 ; 缩: 长江0 . 1 1 3 3 珠江。 . 1 0 4 2 ; 鳞: 黑 龙江0 . 0 5 1 1 长江。 .0 4 9 3 珠江0 .0 4 8 4 。 赵金良 等1 1 7 1对长江 中下游链、 缩、 草鱼和青鱼种群进行的同工酶分析表明， 发现这四种鱼各属一个 没 有 显著 分 化的 种 群， 均为 “ 长 江 种群 ” 。张四明 等1 8 1 用 聚丙 烯酞 胺梯 度 凝胶电 泳 ( p a g e ) 技 术 对中 华 鲜 ( a c ip e n s e r s i n e n s is g r a y ) 天 然 群体 进行同 工 酶 遗传 多 样 性 分析， 研究表明中华鳃在蛋白质水平上的遗传变异贫乏， 与其他鳃类的情况类似。 徐成等1 9 1 用淀粉胶和聚丙烯酞胺凝胶两种电泳方法对妒鱼( l a t e o l - a b r a x j a p o n i c u s ) 野生 群体进行l d h , m d h , m e p , a d h , s o d等1 7 种同 工 酶进行 遗传分析， 发现8 个基因座位具有多态性。 同工酶虽然是一个检测遗传多样性的有效手段， 但也存在一定的局限性。 一 是同工酶检测的是基因的表达产物， 检测的位点有限， 因为表达产物的基因在生 物体的整个基因组只占 极少部分， 还有大量的遗传变异未能检测出来。 二是由于 密码子存在简并性， 编码基因d n a的无义突变无法检测出来， 还有可能受到哑 基因 ( 不 表 达或表达 很弱的 等位基因 ) 的影响。 三是易受环境条件和生 物不同 发育 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 阶段的影响，无法准确确定d n a水平上的变异。四是谱带分析有时较为困难， 并非所有的带均在电泳图谱上显示出来，相同的带有时不一定是相同的酶。 1 . 4分子水平研究 随着分子生物学发展，分子水平上的遗传多样性出现了多种多样的检测方 法，归纳起来有三大类，第一类是以d n a杂交技术为基础的检测方法;第二类 是以p c r技术为基础的检测方法; 第三类建立在第一类或第二类基础上的d n a 测序技术。 1 . 4 . 1以d n a杂交技术为基础的检测方法 r f l p ( r e s t r ic t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h is m s , 限 制片 段 长 度多 态 ) 技术 是使用时间最长、 应用最为广泛的分子遗传多 样性检测技术。 r f l p 是一种共显 性标记， 遵循孟德尔遗传定律， 不受基因显隐性关系以及生物的发育阶段和环境 条件的影响，可靠性强。 r f l p 技术不但用于群体的遗传多样性研究， 还可用于 构建生物的 遗传连锁图 谱， 进行基因定位和标记辅助选择. 但r f l p 技术相对复 杂、 操作较繁琐、 工作量大、 用放射性标记对人体有危害性等， 在实际应用有一 定的局限性。 在鱼类的遗传多 样性研究中， r f l p 的应用是仅次于同 工酶技术， 是应用最 广泛的分子生物学技术， 尤其是在线粒体d n a的r f l p 分析方面。 进行整个线 粒体d n a的r f l p 分析来研究 不同 鱼类群体的 遗传差异己 有大最报 道(2 1 一国 内 对 鱼 类 线 粒 体d n a的r f l p 的 研究 始 于乏 。 世 纪8 0 年 代中 期， 陈 关 君 (2 4 1 等 首 次报道了 鲤、 卿鱼线粒体d n a的限制性内 切酶分析。 至今我国已 对近2 0 种鱼 类的线粒体d n a进行了r f l p 分析。如乌鳍、方正银螂、白卿、卿、鲤、琏、 鳍、 草鱼、 团 头鱿、 长吻 鱿、 黄颧鱼、 鳗鲡、 黄鳝、 泥鳅、 银姻及彩鲤等(2 3 ,2 5 -0 0 1 一些学者还将p c r技术与r f l p 技术结合来， 对线粒体d n a的某一基因或片段 进行p c r 扩 增， 对 扩 增 产物 进 行r f l p 分 析， 并 取得了 很 好的 结 果 (4 1 4 3 1 1 . 4 . 2以p c r技术为基础的检测方法 p c r ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) 利用d n a复制的原理， 以 合成的 寡核昔酸为 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 引物，在耐热的d n a聚合酶作用下经几十次变性、复性和链延伸的循环，从而 使引物间的d n a片段大量扩增。 p c r技术简便快速， 能在短时间内将不同生物 的d n a呈指数倍数扩增。 随着p c r技术的出 现， 派生出了以其为基础的多种分 子水平上的遗传多样性检测方法。目前主要有如下几种: 1 . 4 . 2 . 1 r a p d技术 r a p d ( r a n d o m a m p l i fi e d p o ly m o r p h i c d n a ) 技 术 其原 理 是 利 用一 系列1 0 b p 的随机引物对生物的基因组d n a进行p c r扩增。 扩增产物经琼脂搪或聚丙烯酞 胺电 泳 分 离。 澳化乙 锭 ( e b ) 染 色。 在紫外 灯下观 察 扩 增产 物的 多 态 性。 扩增产 物 的多态性反映了基因组相应区域的多态性。 r a p d技术无需设计特定的扩增引物; 扩增产物具有丰富的多态性， 因为随 着使用引物的增加， 可覆盖整个基因组， 能反映整个基因组的变化. 同时， r a p d 技术具有操作简便快速、 成本低、 无放射性污染等优点。 因 此， 它一出 现就广泛 用 于 群 体 遗传多 样 性 研究 4 4 ,4 5 、 遗 传图 潜构 建 4 6 ) 、 基因 定 位与克 隆 等 4 7 1 。 但r a p d 技术也具有一定的局限性， 如为显性标记、 无法区分纯合子和杂合子、 稳定性和 重复 性 较差、 不同 实 验室间的 研究结 果可比 性差等4 9 1 在鱼类的遗传多样性研究中， r a p d是目 前仅次于r f l p的一项分子水平上 遗传 多 样性 检测 技 术， 有 广泛的 应用， 并 取 得了 一些 成 果。 如邓 怀 等 4 9 】 对 青 鱼、 草鱼、 鳞、 端、 鲤、 团 头鱿等十种常见淡水鱼 类进行了r a p d 分析。 薛国 雄等50 1 对长江、珠江和黑龙江三水系的草鱼种群进行的 r a p d分析表明，三水系草鱼 各有其 特异性的 基因 谱带。 张四明 等5 1 】 用r a p d技 术对7 种 鳃形目 鱼类的亲缘 关系进行了研究， 发现长江白鲜与匙吻鳃为一支，中华1 、 达氏 鳃、史氏 鳃、 意 大利鳃和短吻鲜为另一支。 1 . 4 . 2 . 2卫星d n a ( s a t e l l i t e d n a ) 卫星d n a是一种非编码的重复序列，在真核生物基因组中广泛存在， 大约 每1 0 - 5 0 k b 就 有 一 个 微卫 星序 列5 2 1 ， 其 杂 合 度 可 达1 0 0 % ， 每 代变 异 超过2 % , 多态性极为丰富。同时微卫星具有重复性好、显性遗传、操作简便、所需 d n a 样品少等优点，是进行群体遗传多样性研究5 3 1 、 遗传图谱构建和基因定位的理 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 想分子标记【 5 4 1 目 前微卫星d n a已在鱼类遗传多样性研究、种质鉴定及渔业管理等方面广 泛 应 用 5 3 ,5 5 1 。 如刘 静 霞 等 5 6 1用微卫 星 鉴定 锦 鲤 人 工雌 核发 育 系的 基因 多 样性， 并 证明 锦 鲤 基 因 高 度 杂 合. 常 玉 梅 等 5 7 1 利 用 微 卫 星 标 记 对中 国 鲤 几 个 代 表 种 群 ( 江 西三红， 黄河鲤， 黑龙江野鲤) 基因组d n a遗传多样性分析. 1 . 4 . 2 . 3 a f l p标记 a f l p的原理是将用两种或两种以上的内切酶切割基因组 d n a ， 在切得的 限制性酶切片段两端加上双链人工接头，作为p c r扩增的模板。然后以人工接 头和内切酶位点序列再加上选择性核昔酸序列为引物进行选择性扩增， 扩增产物 经凝胶电 泳而显示出其多态性。 a f l p 与r f l p 和r a p d比较，具有技术简单、 快捷、 无需制备探针和分子杂交、 无放射性污染、 成本较低、结果可靠、 信息量 大、 应 用范围广等 优点 5 s - 5 9 1 。目 前广 泛用于 遗传多 样性和种质鉴定、 基因 定位、 连锁图 谱的构建等。 a f l p 标记出 现较晚， 鱼类上的应用较少，目 前国内仅见利用对中国 沿海真 明群体的 遗传变异和趋势的研究报道 6 0 1 1 . 4 . 2 . 4 s n p标记技术 s n p ( s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ， 单核昔酸多态) 是继第一代分子标记 r f l p 、 第二 代 分 子 标记微卫 星后的 第三 代分 子 标 记后的 最理 想的 分 子标 记6 q s n p 是 指 基因 组 上的 单 个核 昔酸 发生 变异 而引 起的d n a 序列多 态 性6 2 1 。 单 核 昔 酸多态的发生频率极高， 其分布密度比微卫星标记更高。 因此， s n p的遗传稳定 性也高于微卫星标记。但 s n p技术是建立在基因组大量测序或基因芯片等标记 的基础上， 研究成本高， 技术要求较高，目 前主要应用于人类， 其它生物的应用 很 少 6 3 1 ， 还未 见 鱼类的s n p 研究 报道. 1 . 4 . 2 . 5 d n a序列分析 自1 9 7 7 年s a n g e r 创立双脱氧核昔酸( d d n t p ) 链终止测序法以 来， d n a序列 分析技术己成为遗传多样性研究中的一种重要方法， 尤其最近几年应用越来越普 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 遍。 遗 传变异在分子 水平上的 直 接表现形 式是d n a序列( 或r n a序列 ) 。 通过 d n a序 列分析， 可获 得有关生物遗传 变异的 最确切的、 最深层次的 信息 16 4 1 目 前对鱼类的d n a序列分析主要是线粒体d n a序列。全世界己对十七种 鱼 类的 线 粒体d n a进 行了 全 序 列 测定， 即 台 湾缨口 鳅 ( c r o s s o s t o m a l a c u s t r e ) , 鲤 ( c y p r in u s c a r p i o ) 、 多 鳍鱼 ( p o ly p ie r u s o r n a l ip i n n i s ) 、 大西洋婚( g a d u s m o r h u a ) 、 虹 鲜( o n c o 海n c h u s m y k i s s ) 、 细鳞非洲肺 鱼( c r o s s o s t o m a l a c u s t r e ) 、 矛尾鱼( l a t i m e r i a c h a l u m n a e ) , ( c a r a s s i u s a u r a t u s ) 、日本仙女鱼(a u l o p u s j a p o n ic a s ) 、香鱼 ( p l e c o g lo s s u s a l l iv e l is ) 、日 本辫鱼(a le le o p u s j a p o n ic u ) 、大眼大辫鱼(ij im a ia d o f l e i m ) 、 纤钻光鱼( g o n o s to m a g r a c i l e ) , n( s c y l io r h in u s c a n ic u la ) 、 海七鳃鳗 ( p e t r o m y a o n m a r in a s ) 、 花氏 溪w (a u lo p u s j a p o n ic a s ) 、 斑 马 鱼( d a n io r e r io ) ( 引自 g e n b a n k ) . 对 线粒体d n a部分基因 或区域( 片段 ) 的 序列分 析是 遗传多 样性研究的主要 方向 ， 研究 较多的 序 列 是d - l o o p 区 ( 控制区 ) 、 细胞 色素b 基因 、 1 2 s 和1 6 s r n a 基因 -6 6 1 . m e v e i t h l6 1 对 大 西洋 继的1 1 个欧 洲 群体和8 个北 美 群 体的 细 胞 色素b 基因的2 5 9 b p 片 段的 进行 分 析， 发现 种内 和 群体 的 遗传 变异 均 较小。 o k a z a k i 6 6 1 对来自 中国、日 本、 韩国 和德国 的2 7 种螃皱 鱼的1 2 s r n a的7 0 9 b p 片段进行了 分析，结果表明2 7 种鱼的种间遗传变异极小，它们起源于共同祖先。 2 . r a p d技术的应用 2 . 1品种鉴定和分类及群体遗传特性分析 以 往动物品种的鉴定主要采用形态观察和同 工酶分析的方法。 但由于形态观 察受到环境条件和观察者主观性的影响， 而同工酶分析又受到可使用的酶种的限 制， 从而使以 往的品 种鉴定效率较低、 误差较大、 一些性状相近的品 种难以鉴定。 r a p d分析可以 在d n a水平提供大量的遗传标记，而且取样量小，因此可以对 品种进行快速、 准确的鉴定。 r a p d在鱼类品种鉴定等方面已有一些成果的实践。 例如， 张辉等6 8 i对 螂鱼的3 个亚 种共7 个品 系进行了 线粒体d n a物理图 谱的比 较。 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 2 . 2在遗传多样性研究中的应用 采用r a p d技 术分 析种群 遗传多样性己 有很多 报道。 宋平等(69 1 采用了3 8 7 个引物对普通娜鱼进行了r a p d分析，筛选出了3 1 个重复性好、 可用于普通卿 鱼r a p d标记的引 物。 另 用8 个引物对普通螂鱼( 2 0 尾) 进行了 遗传多样性分析。 这8 个引物共检出4 5 个位点， 其中多态性位点数2 4 个，占 总位点数的5 3 .3 3 . 据个体间共有带数和n e i s 遗传相似率计算公式， 计算出 普通卿鱼平均遗传相似 率为 8 8 . 6 8 %。上述两项指标的初步分析表明，普通卿鱼具有较为丰富的遗传多 样性。 孙景春等 7 0 1 利用2 5 个随机引 物对产于江西省的 荷包红鲤、 玻璃红鲤和兴国 红鲤及野鲤进行了r a p d检测及聚类分析。结果表明:荷包红鲤的遗传距离最 小 ( 0 .8 0 9 ) 。 对 于品 种间 ， 则 是 玻璃 红鲤与 兴国 红 鲤较为 相 似 ( 0 .7 4 5 ) ， 江 西三红 之 间的遗传差异较小。根据聚类分析可知兴国红鲤与玻璃红鲤之间的亲缘关系最 近，荷包红鲤次之.王成辉4 0 1 发现群体内，兴国红鲤、玻璃红鲤、荷包红鲤和 欧江彩鲤的遗传相似度分别为0 .8 5 7 , 0 . 8 4 9 , 0 . 7 8 6 和0 .7 7 1 。 群体间， 兴国红鲤 与玻璃红鲤的 遗传相似度最大( 0 . 7 5 4 ) ， 荷包红鲤与we 江彩鲤的 遗传相似度最低 ( 0 .6 5 7 ) ， 相 互间 的 遗 传 距 离 最 大。 玛 建 新等 7 1】利 用4 0 条随 机 引 物 对 淇 河 0 种 群 进行了r a p d扫描。并与彭泽螂、普通野螂鱼进行了比 较， 其平均遗传相似率 为0 . 7 8 2 。 张春霖等n 】用1 3 个引 物在 三个青海湖裸鲤 群体中 共检测出8 5 个位点， 其中 多 态 性位点6 8 个， 总的d n a多 态 位点百 分 率为8 0 .0 % . 贾 海波等 7 3 并从 3 0 个随机引物的 扩增谱带中找到了7 个引物的扩增谱带可以 作为两个不同雌核 发育群体间的遗传标记，由u p g m a聚类法构建的分支系统树清晰地反映了两 个雌核发育群体及其个体间的相互关系。 2 . 3亲缘关系的鉴定 通过指纹图谱的构建能够了解d n a的同源程度，从而确定亲缘关系和进化 地位. 在法医学和人类遗传学上， 指纹图谱已广泛用于鉴别个体， 确定亲缘关系。 s e m e n o v a ( 7 4 运用r a p d标记 技术分析和检测了欧 产 猎犬的 基因多 态性， 并对其 与俄产 猎犬的 亲 缘关系 进行了 鉴定， 确定了 二者的 亲缘 关系。 王晓 梅 等7 5 1采用 r a p d技术对野生螂鱼和四个金鱼品种进行了亲缘关系探讨。 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 2 . 4基因图谱的 构建 遗传图谱是遗传研究的重要内容。 r a p d等分子标记的出现和发展极大地推 动了动植物的遗传图谱的构建。 r a p d技术应用于遗传作图， 不需要预先克隆标 记或进行序列分析， 而是直接完成多态性d n a标记的寻找，并同时完成对这些 标记的 遗传作图。 这使得遗传作图 变得 容易且又快速方便。 吴常信、 李宁 f7 61 利 用r a p d标记和以 北京红鸡f 2 代设计构建的参考群为基础， 经过2 年工作， 鸡 参考群的规模达到3 8 0 只的遗传图谱上r a p d标记达到5 2 个， 覆盖了8 7 0 c m ( 厘 摩) 的 遗传长度，是当 时国际第1 张， 也是最大的鸡r a p d遗传图谱. 2 . 5遗传变异的检测 突 变体是 基因 组 ( 达2 . 0 x 1 0 9 b p ) 少数位点 发生突变的结果。 由 于已 知的 探针 数量有限， 限制了r f i p 和s o u t h e rn杂交等技术的应用. 一个r a p d引物只能检 测基因组的极小部分，因此， 突变位点的检测相对比 较困难。 然而只要增加引物 数量， 选择合适的引 物也可以 将突变体检测出 来。 p o n s u k s i l i h 7 1 等用r a p d技术 对小鸡种内和种间遗传变异进行了测定， 该技术极大地提高了突变位点的检测机 率。 3 . 遗传多样性的研究意义 3 . 1评价群体的遗传结构 遗传结构是遗传变异在群体内的存在格局或特征， 它反映了遗传多样性的组 成形式和变化特征. 评价群体的遗传结构， 即研究群体的基因频率和基因型频率、 交配与 繁 殖模式 、 群体分 化 模式、 群体间 的 基因 流动模式等 64 1 。了 解突 变、 选 择压力( 包括自 然选择与人工选择) 、 迁移扩散、 交配基因流等因素对群体遗传多 样性的影响，是对群体遗传资源进行开发、利用和保护的基础。 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 3 . 2揭示物种的起源与进化历史 物种或群体的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存和进化的前提 i 。 一 个 群体 的 遗 传 变 异 越高 或 遗传 多 样性 越丰富， 对环境 变化 的 适 应能力 就 越 强， 越易扩散其分布范围和开拓新的环境。 一个物种的进化潜力和抵御不良 环境 的能 力既 取决 于群体 的 遗传变异大小， 也依赖于群体的 遗传结构 川 . 群体的遗传 变异大小与其进化速率成正比。 因而， 对群体的遗传多样性研究可揭示群体的进 化历史 ( 起源的 时间、 地点 和 方式等 ) ， 也可为进一 步分析其进化 潜力和未来的 命 运提供重要的资料. 同时， 对不同 群体间的遗传多样性的比 较研究可探讨群体间 的遗传分化与系统进化关系。 3 . 3珍稀濒危物种保护 由于过度捕捞、 生境恶化以 及外来物种入侵等因素的影响， 一些物种正步入 濒危、 灭绝的境地。 对于濒危物种， 往往存在有效繁殖群体太小、 性别失衡、 遗 传漂变导致的遗传衰退和近交衰退等现象， 遗传多样性极为贫乏。 因为种群太小， 易发生近交现象， 导致遗传多样性的丢失， 并降低了群体适应环境、 抵抗病害的 能力， 同时近交会导致遗传杂合度降低， 从而导致物种灭绝的概率增加。 不进行 物种的遗传多样性研究， 不了解其遗传变异大小、 时空分布及其与环境条件的关 系， 就无 法采取 科学 有效的 措 施来保护人类赖以 生存的 遗传资 源 ( 基因 ) ， 来挽救 濒于绝灭的物种， 保护受到威胁的物种。 对珍稀濒危物种保护方针和措施的制定， 如迁 地 或就 地保 护的 选择 等， 都 有 赖于 对 物种 遗传 多样 性的 认 识 【7 8 1 3 . 4有利于生物遗传改良 或育种 遗传多样性的 理论研究始于达尔文时代， 起步较晚。 但自 远古时代起， 人们 却在有意或无意地运用遗传多样性的原理， 即生物的遗传变异， 如野生生物的驯 化、 品种选育等， 来为人类的社会生产和生活服务。 养殖对象的遗传改良 与育种， 就是利用生物的有益遗传变异， 使其优良 性状充分表现出来为人类服务。因而， 对生物的遗传多样性研究， 是对其进行遗传改良 或育种的基础。 特别是近期随着 分子生物学技术的飞速发展，分子标记辅助育种技术( m o l e c u l a r m a r k e r - a s s i s t e d s e l e c t i o n , ma s ) 的出 现，需要对物种的遗传多样性进行广泛而深入的 研究。 第一章 鱼类遗传多样性及其研究方法 3 . 5不同水平研究方法的综合应用 因 为 生 物的 遗传 多 样 性 可 体 现 在形 态 ( 表 型 ) 水 平、 细胞 ( 染 色体 ) 水 平、 酶 ( 蛋 白 ) 水平及分子水平等层次上，因而对遗传多样性的研究是建立在以上几个层次 上的。 但目 前任何研究遗传多 性的方法都是从特定的角度或特定层次进行研究， 在理论上或实际应用中都有各自的优点和局限， 还找不到一种能全方位检测遗传 多样性的研究方法与技术. 因而在遗传多样性的研究过程中可根据具体情况选择 适合的方法与技术。 通常形态学和细胞学方法能快速地对遗传变异大小有一个大 致的了 解。 同工酶分析在技术上比 较成熟， 能从分子水平上对基因组遗传变异的 大小进行较为客观的度量。d n a分析是目 前及将来的发展方向， 值得进行深入 研究。 每种研究方法与技术并不互相排斥， 都能提供许多有价值的信息。 因而在 进行遗传多样性研究时， 最好是多种方法与技术共同 使用， 从形态到分子水平等 进行多方位研究，以得出一个客观、 系统而深入的认识。目前应用多种方法与技 术对鱼类遗传多 样性的 研究己 有一些 报道【7 9 -8 1 4 . 课题研究目的、意义 鲤鱼具有悠久的养殖历史和重要的经济价值，无论是天然种群还是养殖品 种， 年产量远超过其它鱼类。 近几十年来， 养殖新品种的开发获得成功， 大大提 高了产量， 改善了品质。 但是由 于盲目 的开发利用， 许多重要的鲤养殖种类的种 质资源遭到破坏。 因此， 开展鲤鱼， 特别是地方品种鲤鱼的遗传多样性调查有重 要的意义。 兴国红鲤、 荷包红鲤、 玻璃红鲤、 黄河鲤、 黑龙江野鲤是中国鲤鱼几个具有 代表性的养殖品种和野生种，在我国鲤鱼遗传育种研究中均占有非常重要的地 位。 其中， “ 江西三红” 是经长期人工选育而培育成的形态特征显著和遗传性状稳 定的 3个养殖品种。赣州地区贡江水系由于其水系发达，且相对封闭，鱼类种 质资源相当丰富， 素有“ 鱼米之乡” 的美名， 其中有名的“ 兴国红鲤” 就是出自 这里。 一般认为 赣江水系上游是我省鲤鱼的发源地之一。本论文采用 r a p d标记对赣 州水系野鲤分析，以期研究鲤鱼种群的遗传多样性。 第二章 赣州地区水系鲤鱼的r a p d 扩增 第二章 赣州地区水系鲤鱼的r a p d扩增 1材料与方法 1 . 1 材料 实验鲤鱼采自 赣州市的章江段、 赣县的贡江段、 于都的贡江段、 会昌的湘水、 兴国的兴江河和瑞金的绵水。 采样方式分为多点多次进行， 具体方式是每个县域 水域， 分3 次每隔约1 公里撒一次网 ， 选取其中鲤鱼 ， 每个县域采样1 0 - 2 0 尾， 即每 个县域采样 3个点。剪下活鱼的胸鳍或尾鳍，用 9 5 %乙醇保存并提取其基因组 d n a 。多方考虑，本实验材料取用除赣州市以外的5 个地方。 、 泰和 江 赣 遂夕 . 干万安 iu e7k i i-1 ft i a fir 章、 江 宁都 长冈水库_石城 梅江 . 瑞金市 昌 会 . 乙烟磷 卜岁水 质桃江 巷县 南康市 安远 龙南 图i鞍州地区贡江水系示意图 f ig . 1 t h e r i v e r mo d e l o f g a n z h o u 1 . 2 主要药品与试剂 实 验室 所用试剂和引 物( 表1 ) 购自 上海生 工生物工 程技术服务有限公司。 t a q 酶、 d n t p , d n a m a r k e r 均购自 大连宝生生物有限公司。 第二章 赣州地区水系鲤鱼的r a p d 扩增 表1 r a p d引物序列 t a b . l r a n d o m p ri m e r s e q u e n c e s 编号序列序列 5 2 2 1 s 2 2 3 s 2 2 4 5 2 2 5 s 2 2 9 5 2 3 2 s 2 3 3 s 2 3 4 s 2 3 5 s 2 3 6 s 2 3 7 :y 2 3 8 t gac gc a t gg ct c cc t gc aa c c c ct c ac ga t c cgagaggg t gt ac c c gt c acc cc ccac t accccc t gaa aga t c c c gcc cag t gc c ggt ac acc c c ac a ac cggctt gt t ggtggcggt 编号 s 4 0 1 5 4 0 2 5 4 0 3 s 4 0 4 s 4 0 5 5 4 0 7 s 4 0 8 s 4 1 3 s 41 4 5 41 5 5 4 1 6 s 4 1 8 s 4 2 0 g tt g gt g g c g a c a ac gc