（果树学专业论文）缺铁胁迫下小金海棠根特异蛋白的表达鉴定及MxSAMS基因克隆.pdf

缺铁胁迫下小金海棠根特异蛋白的表达鉴定及m x s a m s 基因克隆 郭函子 ( 中国农业大学园艺植物研究所北京1 0 0 0 9 4 ) 墒垂 本试验以苹果属小金海棠( m a l u sx i a o j i n e n s i sc h e n ge tj i a n g ) 为试材，利用蛋白质缀学研 究方法，研究了在缺铁胁迫下小金海棠根部蛋白质表达模式的变化情况，通过质谱测定了5 个 发生变化的蛋白点，根据肽指纹谱鉴定了其中的2 个蛋白，都属于s 腺苷甲硫氨酸( s a m s ) 合成酶家族。利用r a c e 方法克隆了小金海棠的m x s a m s 基因。主要结果如下： 经过0 u m 和4 m 铁水平处理，小金海棠根部蛋白s d s - p a g e 电泳分析，没有发现特异条 带；但o l a m 铁处理第l o 天的叶片中一条大约4 0 k d a 的蛋白加强表达，在4 m 铁处理叶片中， 这个4 0 k d a 的蛋白在2 - 8 天下调，到第l o 天恢复，另外一条4 2 k d a 左右的蛋白在第4 - 8 天加 强表达，到第1 0 天恢复。这些结果表明，低铁和缺铁处理引起了小金海棠叶片蛋白含量和成分 的变化。 通过对双向电泳图谱分析，小金海棠根部蛋白表达模式发生变化，在不同的处理时间，不 同的蛋白表现出上调或下调作用，但没有发现特异蛋白的表达。根据2 - d e 图谱，选取了5 个 蛋白点进行质谱测定，根据得到的肽质量指纹谱( p m f ) 检索，鉴定了其中的2 个蛋白，它们 都属于s 腺苷甲硫氨酸合成酶家族，具有催化a t p 和甲硫氨酸( m e t ) 合成s 一腺苷甲硫氨酸 ( s a m ) 的作用。由于他们的p m f 不同，推测他们是同一个s a m 家族的同源蛋白，行使不同 的功能。另外3 个蛋白没有得到鉴定，可能是未知蛋白。 克隆得到小金海棠s 一腺苷甲硫氨酸合成酶基因( m x s a m s ) ，e d n a 全k1 4 7 9 b p ， o r f l l 7 6 b p ，编码一个3 9 2 个氨基酸残基的蛋白质，具有s a m s 家族的结构特征，分子量约为 4 2 9 9 k d a ，等电点为5 5 8 ，属于酸性蛋白。s o u t h e r n 杂交结果表明，小金海棠基因组中存在 m x s a m s 基因，并且是单拷贝基因；n o r t h e r n 杂交结果显示，缺铁( o m ) 条件下，m x s a m s 基因表达加强，从第2 天可持续到第8 天，到第l o 天恢复到原来水平。 关键词：小金海棠( m a l u s x i a o j i n e n m s c h e n g e tj i a n g ) ，双向电泳，蛋白质组，m x s a m s v i d e n t i f i c a t i o no fi n d u c e dr o o tp r o t e i n su n d e ri r o nd e f i c i e n c ys t r e s s a n dc l o n i n go fm x s a m si nm a l u sx i a o j i n e n s i s g n oh a n z i ( i n s t i t u t ef o rh o r t i c u l t u r a lp l a n t s ，c a u ，1 0 0 0 9 4 ，b e i j i n g ) a b s t r a c t t h ei r o n - d e f i c i e n c ys t r e s s e dp r o t e i ne x p r e s s i o np a t t e mi na p p l e ( m a l u sx i a o j i n e n s i sc h a n ge t j i a n g ) r o o tw a ss t u d i e d t w op r o t e i n so fs a mf a m i l yi n d u c e di n r o o tb yf et r e a t m e n tw e r e c h a r a c t e r i z e da c c o r d i n gt ot h e i rp m em x s a m sg e n ee n c o d i n go n eo ft h et w op r o t e i n sw a sc l o n e d s o u t h e r nb l o ts h o w st h e r ei so n l yo n es i n g l ec o p yo fm x s a m 8g e n ei nt h eg e n o m e n o r t h e r nb l o t p r o v e di ti sf e d e f i c i e n c yi n d u c e d n on e wp r o t e i na p p e a r e di nr o o tu n d e ro g ma n d4 9 mf e 缸 e a w f i e n t s o n e4 0 k d al e a fp r o t e i n w a su p r e g u l a t e di n1 0d a y su n d e ro u mf et r e a t m e n t b u ti tw a sd o w n r e g u l a t e di n2 - 8 d a y su n d e r4 p m f et r e a t i i l e n t t h eo t h e r4 2 k d al e a fp r o t e i nt r e a t e db y4 9 mf ew a si n d u c e di n4 - 8d a y s i ti n d i c a t e d t h a tt h el e a f p r o t e i n se x p r e s s i o np a t t e r nc h a n g e du n d e ro g ma n d4 9 mf et r e a t m e n t n on e wp r o t e i na p p e a r e da n dn op r o t e i nd i s a p p e a r e du n d e rf et r e a t m e n t s t w op r o t e i n sw e r e i d e n t i f i e db yp m fb o t ho f t h e mb e l o n gt os a m f a m i l y , b u tt h e i rp m f w e r ed i f f e r e n t t h e yp r o b a b l y p l a yd i f f e r e n tr o l e si np l a n t 1 1 1 eo t h e rt h r e ep r o t e i n si n d u c e db yf et r e a t m e n th a dn o tb e e ni d e n t i f i e d w h i c hm i g h tb eu n k n o w n p r o t e i n s t h em x s a m sg e n ew a sc l o n e d ，w h i c hi s1 4 7 9 b pi nl e n g t ha n dh a sa no r fo f11 7 6 b pe n c o d i n g 3 9 2a m i n oa c i d s t h ep ii s5 5 8a n dt h em o l e c u l ew e i g h ti s4 2 9 9 k d a i ti sa l la c i d i cp r o t e i n t h e s o u t h e r nb l o te x p e r i m e n tw a sp e r f o r m e d ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tm x s a m sh a so n l yo n es i n g l ec o p yi n t h eg e n o m eo fm a l u sx i a o f i n e n s i s t h ee x p r e s s i o np a t t e r nu n d e rf et r e a t m e n tw a sa n a l y z e db y n o r t h e r nb l o t i ts h o w e dt h a tm x s a 肘sg e n ew a si n d u c e df r o m2t o8d a y s k e yw o r d s ：m a l u sx i a o j i n e n s i s ，t w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，p r o t e o m i c s ，m x s a m s 缩略词 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 撕参 时间：协， 7 年石月7 夕兀 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：? 匆 时间：枷- r 年6 月， f 1 导师签名 岛台镌 时间：多一口，年多月7 日 中国农业大学博上学位论文第一部分文献综述 第一部分缺铁胁迫下小金海棠根特异蛋白的表达与鉴定 植物铁营养研究进展 1 1 植物铁营养状况 文献综述 铁是人们发现最早的微量元素，至今已有两千年的历史铁在生物的生命活动中具有不可替 代的功能。在地壳中，铁含量位居第四，是晟丰富的元素之一，主要有f e ( i i ) 和f e ( i l i ) 两 种形态，它主要通过f e ( i i ) 和f e ( 1 1 1 ) 两种形态的转化在土壤和植物体之间的氧化和还原反 应中释放或获取电子起作用，( 吴平等，2 0 0 1 ) 。植物中铁的研究可追溯到一个半世纪以前，1 8 4 3 年g r i s 发现生长在石灰性土壤上的葡萄叶片失绿症与缺铁有关。植物学家s a c h s 和m o l i s o h 将 铁确定为植物生长的必需微量元素。 铁是植物生长发育所必需的1 6 种营养元素之一，虽然铁在地壳中的含量很丰富，但由于受 p h 值和氧的影响，铁在士壤中经常是以比较稳定的氧化物形态f e ( i i i ) 存在，在水中的溶解 度非常低，故能为植物吸收利用的铁只占很小的比例，植物生长所需的最适铁浓度在 1 0 9 1 0 4 m o l l ( g u e r i n o t 等， 1 9 9 4 ) ，但在石灰质土壤( p h7 4 8 4 ) 中，可溶性铁的浓度达 不到1 0 1 0 m o l l ( l i n d s a y 1 9 7 4 ) ，在中性p n 值条件下，铁在通气条件良好的土壤状况下的平 均浓度也只有1 0 1 7 m o l l ，远远不能满足植物的需求。绝大多数的植物由于缺乏从土壤中吸收 铁的活性机制，因而表现出缺铁胁追症状，轻度缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低， 叶绿素合成减少，新生叶变黄。严重缺铁时，叶绿素会有毒害作用，铁通过和氧的还原形式反 应催化氧自由基的形成，这些高活性分子会损伤所有生物合成，导致新叶变黄，产量大幅度 降低。相反地，在酸性、水浸的土壤中，过量的铁导致细胞丧失完整性，并有可能导致细胞死 亡( b r i a r 等，1 9 9 5 ) ，所以，植物对铁元素的吸收和代谢必须被严格的控制，以保持细胞内铁 元素含量在允许的范围之内，保证植物正常的生理功能。 1 2 植物对缺铁胁迫的适应机制 作物为了适应缺铁胁迫，更有效的从土壤中吸收铁，在长期的进化过程中逐渐形成了适应 机制( s t a i g e r ，2 0 0 2 ) 。1 9 8 6 年，德国h o h e n h e i m 大学的r o m h e l d 和m a r s c h n e r 教授在总结前 人研究上作的基础上，首先提山高等植物在适应缺铁胁迫过程中逐渐形成的两种适应性机理一 机理i 和机理i i ( r o m h e l d 等，1 9 8 6 ) ，机理i 植物包括双子叶植物和非禾本科单子叶植物； 机理i i 植物仅指单子叶禾本科植物。但现在也有研究发现与禾本科植物分类相近的帚灯草目， 谷精草日，鸭趾草目，灯心草目和莎草目植物只具备机理l 而不具备机理l l 的特征。随着对缺 铁反应机制的深入研究，机理i 和机理i i 机制不能够充分的解释铁吸收转运的过程。已经有人 提出了另外的一个机理一吞噬机理。苹果属植物属丁二机理i 植物，对苹果属植物的铁利用机制 还有待研究。 中国农业大学博上学位论文第一部分 文献综述 1 2 1 机理i 植物对缺铁胁迫的适廊机制 机理i 主要有三部分组成：一个f e ( i l i ) 还原酶系统，一个强有力的质子外泌泵和有机物 质分泌系统。这三部分都位于形态上特化的根尖表皮细胞的细胞质膜上，并有效的对缺铁胁迫 发生反戍( 吴平等，2 0 0 1 ) 。b r o w n 等( 1 9 6 1 ) 人首次注意到缺铁胁迫下，双子叶植物根部表现出 的“缺铁胁迫反应特性”特征( b r o w n 等， 1 9 6 1 ) 。根系f e ”还原酶活性增加、净质子分泌量 增加、有机酸及酚类物质增加、及产生根尖膨大、根系增多、根表产生转移细胞等，机理i 植 物必须先将f 一+ 还原为f e ”才能被吸收利用( r o m h e d ，1 9 8 7 ；c h a n c y 等，1 9 7 2 ) ，在供铁充足 的条件下，所有植物的根部将f e ( i i i ) 螯合物还原并将还原所得的f e ( i i ) 转运通过细胞质 膜( b i e n f a i t ，1 9 8 5 ) 。在缺铁胁迫的条件下，机理1 植物通过激活一种特异的 r a t p a s e 而使十 壤酸化，从而增加铁的可溶性，并通过一种特异的根部还原酶将f e ( i ) 一螯台物还原，这种 还原酶催化电子从胞质中还原态的吡啶核苷酸( n a d p ) 跨膜传递给胞外作为电子受体的f e ( 1 1 1 ) 一螫合物，这是机理i 植物吸收铁的一个专性前提条件，根系中f e ”被还原为f e ”后，f e ”通 过它的转运蛋白跨越根部的细胞质膜而被转运( g u e r i n o t 等，1 9 9 4 ) 。对于机理i i 植物而言，根系 对缺铁的反应为植物铁载体释放量的增加。这种高铁载体不仅能螯合三价铁成为可溶性蝥合物， 而且还能通过原生质膜上的特殊通道进入到根细胞内( m a r s c h n e r 等，1 9 8 7 ) 。b i e n f a i t ( 1 9 8 5 ) 提出，根包含两类铁还原酶，一种是对螯和三价铁和铁氰化物进行还暇，而另一类仅还原铁氰 化物。f e ( 1 1 1 ) - - 螫合物还原酶在缺铁生长的幼嫩侧根表皮细胞中商度表达，称为“t u r b os y s t e m ”。 而铁氰化物还原酶是在所有根细胞中进行组成型表达，称为“s t a n d a r ds y s t e m ”。 1 2 2 机理i 植物缺铁胁迫诱导相关基因的研究 f e ( i i i ) - 螫合物还原酶已经从番茄根细胞质膜中得到部分纯化，一种3 5 k d 的多肽( h o l d e n 等，1 9 9 4 ) 和一种7 0 k d 的蛋白( v a l e n t i 等，1 9 9 1 ) 已被证实具有f e ( ) 一螫合物还原酶 活性。但是至今尚未纯化到足量的蛋白以测定其部分氨基酸序列。研究发现多种植物细胞均有 此还原酶同工型的表达，也许这种表达上的差异可以解释铁缺乏和铁充足条件下f e ( 1 i d 还原 酶活性的不同( g u e r i n o t 等，1 9 9 4 ) 。这种诱导型的f e ( h i ) 还原酶在幼嫩侧根的表皮细胞扩 展的细胞质膜中有独特的活性。p a o l a o 等( 1 9 9 5 ) 从玉米根中分离到一个n a d h f e ( 1 1 1 ) - e d t a 还原酶，该酶为2 1 0 k d 蛋白，易分解为4 6 k d 和2 6 k d 亚基，这两个亚基对f e c n 和f e ( 1 1 1 ) e d t a 还原能力不同。该酶降解时f e ( i i i ) - e d t a 还原活性f 降为2 5 ，故认为该酶属于含 有f a d 的n a d h c y t b 5 还原酶家族。随着酵母的f e ( 1 i i ) 还原酶以及低亲和型和高亲和型的 f e ( i i ) - t r a n s p o r t e r 基因的克隆，这些基因缺失的突变株也都得到。利用酵母的双突变体f e t 3 l e t 4 一低亲和型和高亲和型的f e ( i i ) t r a n s p o r t e r 都被破坏，从拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 中 克隆到第一个高等植物的f e ( i i ) - t r a n s p o r t e r 基因- i r t i ( i r o nr e g u l a i e dt r a n s p o r t e r ) 。1 r t i 在 酵母中的表达能使缺乏铁吸收功能的酵母般重突变体受缺铁限制的生长恢复。i r t l 的长度是 1 3 4 8 b p ，具有一个l o l 7 b p 的开放阅读框，编码一个3 3 9 个氨基酸的多肽。蛋白预测表明i r t l 2 中国农业大学博十学位论文第一部分义献练述 i l l 蛋白是一个整和膜蛋白，超过6 0 的氨基酸为非极性氨基酸，形成8 个疏水的跨膜结构域。在 跨膜结构域3 和4 之问的第1 5 4 1 6 l 氩基酸之间，具有4 个 h i s c y s 重复，这个富含h i s 的区 域对于底物结合或t r a n s p o r t e r 的调节可能育重要作用。因为已知几种结合金属的蛋白是利用h i s 的咪唑环上的n 作为螯和金属离子的配基。i r t l 的氮基酸序列和f e t 3 、f e t 4 和c o p l ( 拟南 芥c u 的t r a n s p o r t e r ) 都没有相似性。虽然i r t l 和ec o l i 中f e o b 基因编码的f e ( i i ) 4 r a n s p o r t e r 的跨膜结构域的数目相同，但他们也没有相似性。表明i r t l 属于一个新的基因家族。另外，i r t i 在拟南芥中的表达是在转录水平被调控，而且其表达是被缺铁胁迫的生长条件所诱导。c o h e n 等( 1 9 9 8 ) 证明，在豌豆( p i s u r ns a t i v u ml c vs p a r k l e ) 根缺铁胁迫诱导的i r t i ，除了转运f e ( i i ) 外，还可以促进一些其他重金属二价阳离子如钴和锌的转运，故认为，f e ( i i ) t r a n s p o r t e r 可能是一个非特异性的二价金属阳离子转运体。以i r t i c d n a 为探针在缺铁诱导的番茄 ( l y c o p e r s i c oe s c u l e n t u m ) 根c d n a 文库中分离了两个c d n a - l e l r t i 和l e l r t 2 ，n o r t h e r n 杂 交分析表明，这两个基因在根中的表达量显著提高，推断的氨基酸序列与i r t l 蛋白的同源性 分别是6 4 和6 2 。用l e l r t l 和l e l r t 2 转化酵母铁吸收缺陷型，可以恢复其吸铁功能。这 种吸收过程是温度依赖型和饱和型的，f e ( i i ) 是优先底物，其他二价金属离子过量可抑制f e ( i f ) 的吸收。酵母的镁、锌和钴吸收突变株可以被这两个基因的表达恢复，说明他们和毅南 芥i r t i 一样也是非特异性的二价金属阳离子转运体( e c k h a r d t 等，2 0 0 1 ； w a n g 等，2 0 0 2 ) 。 v e r t 等( 2 0 0 2 ) 对i r t l 功能研究结果表明，1 r t i 对于拟南芥缺铁胁迫下对铁的吸收是必需的， 利用t - d n a 插入的方法，他们筛选到一个i r t i 基因敲除的突变株i r t l 1 ，表现出严重的失绿 症和生长缺陷，在重新供铁后可以恢复。在低铁条件f ，该突变株不能吸收铁，同时不能富集 其他二价金属阳离子。1 r t i 启动子控制下的g u s 基因的表达活性分析和原位杂交表明，缺铁 诱导的i r t i 在根外细胞层特异表达，说明i r t i 基因的启动子区具有感受缺铁信号的顺式元件。 h e n r i q u e 等( 2 0 0 2 ) 研究发现敲除i r t i 基因后的拟南芥不但铁吸收受阻，而且还出现了发育缺 陷症。拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 是一种铁高效的机理i 植物，但是其铁高效的遗传基础尚不清楚。 当缺铁胁迫时，拟南芥根部表皮细胞质膜上的f e ( u i ) e d t a 还原活性增强。r o b i n s o n 等( 1 9 9 9 ) 首次从拟南芥中分离到f e ( i i i ) e d t a 还原酶的基因f r 0 2 基因。并且利用拟南芥的f e d l 突变体进行了功能互补验证，证明功能型f r 0 2 在转基因植物中互补了f r d l 的表型，确定了拟 南芥根部的f r 0 2 具有f e ( i i i ) 鳌合物还原酶活性。f r 0 2 由7 2 5 个氨基酸组成。预测p i 值 为9 ，3 7 ，相对分子量为8j 5 0 k d a ，但糖基化基序的存在表明天然蛋白的分子量会更大。f r 0 2 含 有f a d 结合位点序列( h p f t ) 和与f r e i 的n a d p h 结合位点相邻的保守区( g p y g ) 。二级 结构预测表明f r 0 2 的n 端区内有6 个疏水区，c 一端区有2 个疏水区，这些疏水区都会形成跨 膜的a 螺旋。4 个保守的组氨酸残基定位于两个跨膜的d 一螺旋和上，认为f r 0 2 参与从胞 质供体至f a d 的电子传递，然后电子通过两个连续的血红素基团传递至位于胞外的电子受体 - f e ( 1 1 1 ) 鳌台物还原酶。f r 0 2 基因在缺铁胁迫的根部表达，属于一个跨膜转运电子的b 型细 胞色素大家族。在缺铁胁追卜，机理i 植物除了f e ( i i i ) e d t a 还原活性增强外，h + 的释放 也增加，h + 能够降低根际p h 值，因而增强了f e ( i i i ) 的可溶性。拟南芥有一个h * - a t p a s e 基 因的大家族，其中的一个a h a 2 基因，在缺铁胁迫下受到正调节( f o x 等，1 9 9 8 ) 。 中国农业大学博士学位论文 第一部分文献综述 2 3 植物缺铁胁迫诱导的特异蛋白研究 植物在k 期的进化中形成了一罄套比较完善的基冈表达调控体系，植物体在不同的发展阶 段和不同的环境条件r 都会有不同的基因表达，这就意味着植物体在不同的时间和空间合成不 同的基因。植物在逆境条件下，基因表达发生变化，一些正常的基因被迫关闭，而一些与逆境 相关的基因则开始表达，诱导一些特异蛋白的产生，有人将之称为逆境蛋白( 钱永常等，1 9 8 9 ) 。 因此，近年来有关胁迫条件卜- “逆境蛋白”的研究己成为植物抗性研究的热点之一。 h e r b i c k 等( 1 9 9 6 ) 用双向电泳研究胁迫下番茄根和叶的蛋白表达情况，发现在用f e 和 c u 的营养液培养时，其蛋自质的表达会发生改变，在缺铁条件下，番茄的根尖积累三种多肽， 测序表明，三种多肽分别是3 磷酸甘油醛脱氢酶( g a p d h ) ，分子量约为3 9 k d a ；甲酸脱氢酶 ( f d h ) ，分子量约为4 2 k d a ；和抗坏血酸过氧化物酶( a p ) ，分子量约为2 7 5 k d a 。他们是原 有蛋白合成量增加造成的。a r u l a n m a t h a m 和t e r r y ( 1 9 8 8 ) 通过对甜菜根细胞膜蛋白的电泳发现 了与缺铁胁迫有关的两条蛋白带，分别是2 5 k d a 和3 4 k d a ，这两种蛋白都不是新合成的蛋白， 而是原来蛋白合成含量增加的结果，进一步的研究表明，其中一条可能与f e ”还原酶有关，而 另一条与f e ”转运蛋白有关。t h o i r o n 等( 1 9 9 7 ) 对缺铁和加铁培养的玉米幼茸的根和叶的可 溶性蛋白和膜蛋白进行2 d s d s p a g e 电泳，结果表明，根中两种膜外多肽( 2 2 k d a ，2 7 k d a ) 在缺铁条件下表达增强。s c h m i d t 和b u c k h o u t ( 1 9 9 7 ) 研究发现番茄在缺铁胁迫8 天后，其根系中 有7 条多肽的表达发生了变化，其中仅有一条多肽是在缺铁胁迫下新合成的，另外6 条只是合 成含量的增加，7 条多肽中有3 条多肽与h e r b i k 等( 1 9 9 6 ) 观察到的3 条多肽( g a p d h 、f d h 、 a p ) 的分子量一致。有实验表明，不仅在缺铁条件下g a p d h 和f d h 活性增加，而且在热激、 厌氧胁迫下他们的活性也可以提高，说明g a p d h 和f d h 活性增加并不是缺铁胁迫的专一特 异性反应( c o l a sd e s 和f r a n e s - s m a l lc 等，1 9 9 3 ) 。 p a o l a o 等( 1 9 9 5 ) 从玉米根的微粒体中发现一条2 1 0 k d a 是寡聚物可能是玉米根质膜的 一个天然组分，此寡聚物易分解为2 6 k d a 和4 6 k d a 两个距基，其中2 6 k d a 弧基具有较高的 n a d h f e 3 + - e d t a 还原酶活性，并且认为2 6 k d a 孤基为n a d h f e ”- e d t a 还原酶，认为该酶 属于含有f a d 的n a d h c y t b 5 还原酶家族；而4 6 k d a 亚基有较高的f e c n 还原酶活性。s u z u k i 等( 1 9 9 7 ) 对缺铁胁迫下的大麦根进行的研究表明，的确有一种3 6 k d a 的特异蛋自产生。在他 随后的研究中发现，缺铁条件下，大麦根中有7 种多肽表达量增加，其中有四条( c ，d ，g ， v ) 多肽与以前的研究相一致，而其它三条( w ，x ，y ) 为新发现的多肽，其中d 蛋白可能是 3 6 k d 的多肽，并且还发现他在缺铁胁迫的第三天被诱导出现，此时在根洗液中还检测不到m a s 的分泌，到第七天的时候3 6 k d a 多肽的表达孱和i v a s 的分泌量都达到最大值，但当进行复铁 处理的第二天3 6 k d a 多肽的合成就开始下降，到第七天时下降到正常水平，这是m a s 的分泌 已经停止，m 州研究小组猜测这个蛋白可能是v l m s 合成基因的铁反应元件的调节蛋白( 反式 作用因子) 或者是n a s 本身。序列分析表明c 蛋白为腺嘌呤转磷酸核糖基酶，y 蛋白是i d s 3 基因表达的产物，w 蛋白可能是甲酸脱氢酶( f d h ) ( s u z u k i 等，1 9 9 8 ) 。 4 中国农业大学博士学位论文 第一部分文献综述 2 。植物蛋白质组学研究进展 1 9 9 4 年澳大利证科学家m a r c w i l k i n s 在意人利的s i e n a 的一次2 - d e 电泳会议上首次提出了 蛋白质组( p r o t e o m e ) 的概念。蛋白质组的名称由w a s i n g e r 等1 9 9 5 年第一次在出版物中使用， 发表在1 9 9 5 年7 月的e l e c t r o p h o r e s i s 杂志上( w a s i n g e r1 9 9 5 ：w i l k i n s1 9 9 6 ) 。指由一个细胞或 个组织的基因纽( g e n o m e ) 所表达的全部相应的蛋白质( p r o t e i n ) 。蛋白质组与基因组相 对应，是基因组表达的全部蛋白。基因组在几乎所有的细胞中都是完整的，但蛋白质组具有很 高的细胞特异性：一个有机体的不同细胞表达他的全蛋白的不同亚基。基因组贮存了稳定的信 息，不会随时问发生改变，而蛋白质组是高度动态的，根据细胞的发育和生理状态蛋白表达的 亚基在时刻的发生变化。蛋白质组研究可以分为两个方面：一方面是对蛋白质表达模式( 或蛋 白质组成) 的研究：另一方面是对蛋白质组功能模式( 主要是蛋白质相互作用网络关系) 的研 究( k l a a s ，2 0 0 1 ) 。研究内容包括鉴定蛋白质的表达、结构( b e n n e a 等，2 0 0 0 ) 、修饰、功能以 及相互作用等，从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示利阐明生命活动的基本 规律。 蛋白质组研究的三大核心技术包括双向凝胶电泳( t w o ，d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s 简称 2 - d e ) 技术、计算机图像数据处理技术和蛋白质数据库、及质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ，简称 m s ) 鉴定技术( 成海平，2 0 0 0 ；钱小红，1 9 9 8 ) 。 2 1 植物蛋白质组学在植物研究中的应用 植物蛋白质组学在植物研究中有着广泛的应用，主要表现在以下方面：( 1 ) 植物群体遗传 蛋白质组学，主耍研究植物的遗传多样性和突变，遗传多样性蛋白质研究基于基因组学的些 遗传标记，如r a p d 、r f l p 、s s r 、i s s r 等，已经广泛地应用于植物遗传研究中。与基因组学 的遗传标记相比，由于蛋白质组学的研究对象是基因表达的产物，是介于基因型和表型之间的 特性，因而蛋白质组学标记是联系基因多样性和表塑多样性的纽带，具有独特的意义。通过蛋 白质组比较来检测遗传多样性的变化已有许多成功的尝试。p i e a r d 等0 9 9 7 ) 利用2 1 3 p a g e 分析 了亲缘关系很近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性，发现品系问的多态性很低，并且有7 个蛋 白可以用丁基因型的鉴定。d a v i d 等( 1 9 9 7 ) 也利用2 d - p a g e 技术比较了栽培于不同环境f ，但 起源于同一种群的小麦，结果所有的种群都与原种群有差别，d a v i d 等认为，这不是由随机漂移 引起，而是由适应其各自的气候条件而形成的。突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一， 应片i 蛋白质组学的方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行研究，可以揭示一些植物生理生 态过程的机制。具体做法通常是对在相同条件下栽培的突变体及野生型植物的2 d p a g e 图谱 进行比较，受到影响的蛋白质通过质谱法或e d m a n 测序法进行鉴定，为研究表型突变背后的生 化过程提供有价值的信息。h e r b i k 等( 1 9 0 6 ) 分析了野生型和缺铁突变体番茄的蛋向质2 d - p a g e 图谱，鉴定了参与无氧代谢和胁迫防御的几种酶，如甘油醛- 3 一磷酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、抗坏 血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶、质体蓝素等，并分析了这些酶在获得铁的过程中的功能。 中国农业大学博十学位论文 第一部分文献综述 v o nw i r e n 等( 1 9 9 7 ) l l 较了野生型和铁摄取缺陷型突变体玉米的蛋白质2 d - p a g e 图谱，确定了4 个与铁离子跨膜运输有关的多肽。k o m a t s u 等( 1 9 9 9a ) 比较了水稻绿苗和白化苗的蛋向质 2 d p a g e 图谱，发现了在绿苗中参与光合作用的蛋白质，而白化苗中仅有此蛋向质前体。而抗 坏血酸过氧化物酶只在白化苗中存在，说明抗氧化酶在白化苗中起细胞保护功能。( 2 ) 植物环 境信号应答和适应机制蛋向质组学，包括非生物环境因子蛋白质组学研究和生物环境闻子蛋白 质组研究。在植物的生存环境中，会受到非生物因子胁迫，如干旱、盐渍、冻害、臭氧、缺氧、 机械损伤等，以及生物因子如动物、植物、微生物等的极大影响。对植物的生艮发育和生存都 会产生严重影响。这些胁迫可以引起大量的蛋白质在种类和表达量上的变化，而蛋白质组学研 究可以使我们更好地了解胁迫的伤害机制以及植物对非生物环境的适应机制。c o s t a 等( 1 9 9 9 ) 发现海岸松中3 8 个受干旱影响的蛋白质，其中2 4 个由干旱诱导，并且不同基闵型对干旱胁迫的 反应差别很大。c h a n g 等( 2 0 0 0 ) 对玉米进行缺氧和低氧胁迫研究，发现低氧处理的效应不仅仅是 缺氧胁迫诱导的糖酵解酶的增加。通过质谱法共鉴定了4 6 个蛋白质，均为在植物中首次得到鉴 定。s a l e k d e h 等( 2 0 0 2 ) 研究两个水稻晶种( o r y z a s a t i v a 三cvc t 9 9 9 3 和e vir 6 2 2 6 6 ) 干旱胁迫下 以及恢复灌溉后的蛋白质组。分析叶提取物电泳胶上的t 0 0 0 多个蛋白点，发现有4 2 个蛋白点 的丰度在干旱胁迫状态下变化明显，其中2 7 个点在两个品种中显示了不同的反应方式。恢复正 常灌溉1 0 天以后，所有蛋白的丰度完全或是在很大程度上恢复成与对照一样。目前关于非生物 因子对植物影响的蛋白质组学研究主要集中在植物与根瘤菌以及植物与菌根真菌的共生关系 上。( 3 ) 植物激素蛋白质组学研究，激索在植物一生中起着重要的调控作用，研究植物激素的信 号传导和作用机理是蛋白质组学的重要组成部分之一。s h e n 和k o m a t s u ( 2 0 0 3 ) 将水稻叶鞘用5 umo1 l 1 赤霉素处理不同时间后的蛋白经2 d ，p a g e 分离和计算机图像分析，看到3 3 个 蛋白发生变化，其中2 1 个蛋白点表达增强，1 2 个蛋白表达减弱，说明赤霉素处理水稻叶鞘起码 有3 0 多个基因的产物与之相关。对其中的钙网蛋白( c a l r e t i c u l i n ) 进行了深入分析，发现有2 个 不同等电点( p 1 ) 蛋白点，随赤霉素处理时间增加，p 1 4 0 的蛋白点逐渐消失，而p 1 4 1 蛋白点 浓度则逐渐增加。由此说明钙网蛋白在赤霉素信号传递调节叶鞘伸长中是一个重要组分( s h e n 等，2 0 0 3 ) 。( 4 ) 植物组织器官蛋白质组学，对于植物来说，蛋白质组学上的差异不但存在于不 同基因型以及同一基因型的不同植株之间，也存在于同一植株的不同组织和器官之间。在植物 的发育过程中，不同组织和器官在功能上的分化，也表现在不同器官蛋白质的组成和数量的差 异上。蛋白质组学的研究有助于我们对植物发育过程机制的理解。关于植物组织和器官的蛋白 质组学研究已经有很多报道。t s u g i t a 等( 1 9 9 4 ) j 钼2 d p a g e 分离了水稻根、茎、叶、种子、芽、 种皮及愈伤组织等部位的蛋白质，总共得到4 8 9 2 个蛋白点，其中3 的蛋白质得到了鉴定。对 水稻胚、胚乳、叶鞘和悬浮细胞蛋白质组学的研究也取得了进展，并且水稻的蛋白质数据库已 经建立( k o m a t s u 等，1 9 9 3 ；1 9 9 9a ：1 9 9 9b ：z h o n g 等，1 9 9 7 ；s h e n 等，2 0 0 3 ) 。其它组织和器 官，如拟南芥的愈伤组织和花粉，也有研究涉及( p r i m e 等2 0 0 0 ；m a y f i e l d 等，2 0 0 1 ) 。( 5 ) 植 物亚细胞蛋白质组学，植物的蛋白质组学研究目前已经深入到细胞水平即研究在一个细胞 器内表达的蛋白质组。研究比较多的细胞器是叶绿体。据估计高等植物大约共有约2 1 0 0 0 到 2 5 0 0 0 个蛋白质( b o u c h e z 和h o f i e ，1 9 9 8 ) ，叶绿体的蛋白质占其中1 0 2 5 ( v a n w i j k 等， 2 0 0 0 ) 充分证明了叶绿体在植物细胞中的重要性。另外，关于线粒体与细胞壁的研究也有报道。 6 中国农业大学博士学位论文第一部分义献综述 利用b l u e - n a t i v e 凝胶电泳( p e l f i e r 等2 0 0 0 以及m a l d i t o f 和e s i m s m s 分析，鉴定了拟 南芥叶绿体中一个3 5 0 k d 的由1 0 个不同的亚基组成的c l p p 蛋白酶复合体，并发现了一个不属 丁任何已知的叶绿体基因家族的新的n i 绿体蛋白。y a m a g u c h i 和s u b r a m a n i a n ( 2 0 0 0 ) 利用 2 d ，p a g e 、色谱、m s 、e d m a n 测序等多种方法鉴定了菠菜( s p i n a c i a o l e r a c e a ) 叶绿体中的核糖 体3 0 s 和5 0 s 亚基的蛋白质。发现菠菜的质体核糖体是由5 9 个蛋白质组成的，其中5 3 个与大 肠杆菌有同源性，而6 个是非核糖体质体特异性的蛋白质( p s r p 1 到p s r p 6 ) 。许多蛋白质表现 出翻译后的修饰。p s r p 蛋白质可能参与质体中特有的翻译及其调控过程，包括蛋白质通过质 体5 0 s 亚基在类囊体膜上的定位和转移。 2 2 植物蛋白质组学的局限性和解决方法 获得基因组序列和e s t 序列之后，大大加快了利用e d m a n 测序法和质谱分析对蛋白进行 鉴定利定性的工作。拟南芥的基因组是第一种公开的完成测序的植物基因组，因此，从技术前 景来看，很明显拟南芥是蛋白质组研究的最佳材料，但是拟南芥属于双子叶植物，并不是农作 物品种，而且也不是豆科植物或树种。它是我们了解许多基本生物学过程的一个很好的模式系 统，但仍然具有一些局限性，晟重要的问题在于蛋白质组学对于未完成测序的植物来说，其可 行性到底达到何种程度还不清楚。在这一点上可以有两种选择：( 1 ) 如果可以得到e s t 序列 就可以通过e s tm s m s 或m a l d i t o f - p s d 来获取序列标签( s e q u e n c et a g s ) 以进行蛋白鉴 定。但是这种方法对e s t 数据库的规模和质量依赖性很大。e s t 数据库的典型缺点在于许多蛋 白在数据库中没有或很少有数据可查( 短e s t s 只能覆盖部分蛋白e s t 序列的错误率非常显著) 。 多肽分子指纹法很少能单独成功地鉴定来自于e s t 数据库的蛋白，因为e s t 序列很短，不能 覆盖整个蛋白而且酶切后多肽的匹配数不够( r o w l e y 和c h o u d h a r y , 2 0 0 0 ) 。( 2 ) 利用m s m s 、 m a l d i - t o f p s d 或e d m a n 测序法获得的序列进行同源性搜索。在不同的植物种间，有相当 数量的蛋白具有很大的同源性，我们就可以直接利用质谱分析的离子化蛋白进行数据库搜索。 但是晟好先把质谱分析数据转译成氨基酸序列，然后再用f a s t a 或类似的搜索引擎。直接用 多肽分子 多肽分子指纹) 进行搜索效果不好，因为它们需要实验序列与同源序列之间1 0 0 匹 配。当酶切产生许多多肽分子时，m a l d i t o f 质谱分析是唯一可行的方法，能够提高酶切多肽 与同源蛋白匹配的几率。在完整植物数据库中搜索豌豆叶绿体蛋白( p e l t i e r 等，2 0 0 0 ) 和玉米 蛋白( 0 f a n e l l ，1 9 7 5 ) 已经证明了这一点。 尽管蛋白质组学在越来越多的微生物以及人类中广泛研究，并建立了相麻的数据库 ( h u m p h e r y s m i t h 等，1 9 9 7 ；w i l k i n 等，1 9 9 7 ) ，但是植物蛋白质组数据库的发展还是比较缓 慢，目前网上可用的植物蛋白数据库有：双子叶的拟南芥、单子叶的水稻、重要的农作物如玉 米、裸子植物海岸松等这些数据库提供扫描的胶和可点击的图像，特征点有超级链接。单个蛋 白入口通过激活的交叉文献与其他蛋白质数据库如s w i s s p r o t 或t r e m b l 链接。在基因组 表达分析方面，这些数据库都包括在各种植物器官( 根、茎、叶、芽、种子) 或组织( 愈伤组 织、术质部、韧皮部) 或基因型间多态方式的比较。有时候也提供其他的信息如弧细胞定位、 生理学数据和遗传学数据。 由丁取向电泳技术、蛋白质检测、指纹图谱和利用质谱便( m s ) 测定蛋白质序列等技术增 7 中