消化实验方法总结.doc

豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究采用胃蛋白酶-胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆粕粉碎力度。平均粒径采用GB 6971-86 方法，体外试验采用Boisen和Fernandez等体外模拟消化方法。胃蛋白酶最适浓度的选择1g豆皮100ml三角瓶+25ml磷酸缓冲液（pH=6.0 0.01M）+10ml盐酸（0.2M）温和搅拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鲜胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌剂（青霉素+链霉素）39恒温水浴中震荡6h,消化后+20%黄基水杨酸5ml室温静置30min抽滤干燥后残渣凯式定氮法测蛋白质含量计算蛋白质和干物质消化率。确定最适胃蛋白酶浓度为75mg/ml.胰酶最适浓度选择在最适（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的产物中加入10ml磷酸缓冲液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氢钾缓冲液配制）pH=6.839恒温水浴中震荡18h消化后+20%磺基水杨酸5ml室温静置30min抽滤，干燥后残渣按照凯式定氮法测其蛋白质含量，计算粗蛋白和干物质消化率，确定最适胰酶浓度为110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶两步法测定过程1分别称取原样和过筛豆粕于三角瓶中，4个重复，使用最适浓度测定不同粒度豆粕蛋白和干物质含量，并通过氨基酸自动分析仪测其氨基酸含量，计算粗蛋白、干物质和氨基酸消化率。燕麦粉添加量对面包营养组分含量和淀粉体外消化性的影响淀粉体外水解动力学测定 1g样品+50ml磷酸缓冲液（pH=6.9）37水浴消化5min取0.2ml消化上清液1min后加入1ml-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）37水浴继续消化每隔15min分别取消化液0.2ml于25ml试管中+0.8ml蒸馏水+1mlDNS沸水浴中煮沸10min取出后+15ml蒸馏水，摇匀空白管调零，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液绘制标准曲表2 ，根据还原糖释放量的变化比较淀粉的体外消化性。苦荞芽粉馒头品质及体外模拟消化研究甲醇提取液的制备参照Bojana(2011)提取样品的方法并稍作修改。准确称取5g待提取的苦荞馒头样品浸没于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均质机搅拌使样品破碎均质。样品液超声波提取15min，将悬浮液转移至离心管中。原样品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重复一次，合并提取液。2500r/min离心，取上清液于45水浴下蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，备用。酚含量测定采用FolinCiocalteu法（FILIPCEV 2011）测定试样的总酚含量，并稍作修改。取500L蒸馏水，加入125L的标准溶液或提取液后，再加入125l FolinCiocalteu试剂，充分混匀后加入1.25ml 7%碳酸钠溶液，漩涡混匀后避光放置90min后于760nm处测定混合液的吸光值。以没食子含量为纵坐标（g/ml），吸光度为横坐标，得回归方程为y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照测定没食子酸标准液吸光度的步骤测定待测液吸光度。黄酮含量测定采用NaNo2-Al(NO)3方法测定。取一定浓度的样品水溶液0.1ml与0.2ml 5%NaNO2溶液，漩涡混匀后室温下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振荡后静止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波长510nm处测定混合液吸光值。以芦丁含量为纵坐标（g/ml），吸光度为横坐标得回归方程为y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照测定芦丁标准液吸光度的步骤测定待测液吸光度。体外模拟消化过程体外模拟消化过程参考Gawlik等人的方法，略作修改。模拟唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91g-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模拟唾液，用磷酸盐缓冲液调节溶液为pH=6.75。模拟胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL调节溶液pH=1.2。模拟肠液：0.05g胰蛋白酶和0.3g胆汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。体外提取过程（S0）：准确称取6.0g荞麦馒头样品浸没于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，静置6h，悬浮液转移至离心管中，2500r/min离心10min，取上清液于45水浴下旋转蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20保存，备用。口腔消化过程（S1）：准确称取6g样品置于100ml的烧杯中并加入30ml模拟唾液，用均质机搅拌使样品充分破碎均质后放入水浴摇床中，37振荡10min。胃肠消化过程（S2）：取出水浴摇床中的样品，用3mol/l的盐酸调节溶液体系至pH=1.5后加入30ml模拟胃液，置于40水浴摇床中振摇60min。反应结束后取5ml的样液，于70的水浴锅中加热灭酶，经过模拟胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3调节使溶液体系的pH=6，加入30ml胆汁胰酶的复合液，再分别加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37水浴震荡120min模拟肠道消化，于70的水浴锅中加热灭酶，-20保存备用。每个样品重复三次。肠道吸收过程（S3）：将20ml剩余消化液转移到透析袋中，并将透析袋置于装有50ml PBS缓冲液的烧杯中，37水浴震荡4h。将PBS缓冲液转移到离心管中，-20保存备用，每个样品重复三次。羊奶婴儿配方奶粉中蛋白质体外模拟消化研究外模拟胃消化体外模拟胃消化参照Johns8的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37水浴中预热10min，用1mol/L的HCl调乳液p H3。在每100m L乳样中添加3106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3106U)，于37恒温摇床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH调节乳液p H值至7灭酶，测定其中蛋白质的胃消化率。体外模拟肠消化体外模拟肠消化参照Johns8的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37水浴中预热10min，用1mol/L的Na OH调乳液p H7。在每100m L乳样中添加1.25105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25105U)，于37恒温摇床上消化水解2h，然后沸水浴5min灭活，测定其中蛋白质的肠消化率。体外模拟总消化体外模拟总消化参照Johns8的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37水浴中预热10min，用1mol/L的HCl调乳液p H3。在每100m L乳样中添加3106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3106U)，于37恒温摇床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH调节乳液p H值至7。再向每100m L乳样中添加1.25105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25105U)，于37恒温摇床上消化水解2h，然后沸水浴5min灭活，测定其中蛋白质的总消化率。燕麦全粉中蛋白质体外消化的测定燕麦蛋白质的体外消化实验采用Wang15报道的体外消化模型进行,略有改动。具体操作如下:准确称取一定质量的样品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,