（分析化学专业论文）n溴代丁二酰亚胺h2o2化学发光体系的研究.pdf

n 溴代丁二酰亚胺一h 2 0 2 化学发光体系的研究 郝亮 摘要：化学发光分析由于灵敏度高，线性范围宽，仪器设备简单，已被人们 用于许多领域中无机物及有机物的分析。当前的化学发光分析研究主要有两个方 向。一个方向是发现新的化学发光反应，以拓宽化学发光分析的应用范围。另一 个方向是将已发现的化学发光体系同其它技术如高效液相色谱、毛细管电泳等相 结合，以增加化学发光分析法的应用价值。化学发光分析的基础是化学发光反应。 化学发光反应大多数是氧化还原反应，许多熟悉的氧化剂，如高锰酸钾、四价铈、 次卤酸盐等都已先后被用作液相化学发光反应的氧化剂。近年来，单线态氧由于 具有较高的反应活性，在许多研究领域引起了人们的关注。在一些化学发光反应 中，单线态氧也被建议为反应中间体，在反应中起着十分重要的作用。但很少有 人有意识地将单线态氧作为化学发光反应的氧化剂。n 溴代丁二酰亚胺h 2 0 2 反 应是一个人们熟知的可以产生单线态氧的反应，该反应产生单线态氧的量子产率 高。本研究以这一反应为基础，探讨了此反应中产生的单线态氧作为化学发光反 应氧化剂的可行性。 本论文分为两部分，第一部分为综述，第二部分为研究报告。 在综述部分，简单介绍了单线态氧的电子结构、特性及其产生方法；总结了 单线态氧的主要检测方法以及单线态氧的应用。 研究报告由四部分组成： 1 流动注射化学发光法测定呋喃西林 发现了碱性溶液中，呋喃西林同n - - 溴代丁二酰亚胺和过氧化氢间的化学发 光反应，建立了测定呋喃西林的流动注射化学发光方法。该方法测定呋喃西林的 线性范围为1 0 x 1 0 7 1 0 x 1 0 4 9 m l ，检出限为2 x 1 0 8 9 m l ，相对标准偏差为4 o ( 6 0 x 1 0 6 9 m l 呋哺西林溶液，n = 1 1 ) 。该方法被用于呋麻滴鼻液，血浆及尿样中 呋喃西林的含量测定。同时，对这一反应可能的化学发光机理也进行了初步地探 讨。 2 流动注射化学发光法测定丙米嗪 丙米嗪与n 一溴代丁二酰亚胺和过氧化氢在碱性溶液中混合时，可以产生强 的化学发光信号。据此，建立了测定丙米嗪的流动注射化学发光法。该方法测定 丙米嗪的检出限为5 x 1 0 9 9 m l ，线性范围为1 0 x 1 0 - 8 1 0 x 1 0 s g m l 。对 4 0 x 1 0 t g m l 的丙米嗪溶液进行1 1 次平行测定的相对标准偏差为1 5 。该方法 被用于药物制剂，血浆及尿样中丙米嗪的含量测定。 3 流动注射化学发光法测定中药中的芦丁 芦丁与n 一溴代丁二酰亚胺和过氧化氢在碱性溶液中混合时，可以检测到弱的 化学发光信号。表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵的存在对这反应的化学发光 信号有增强作用。利用这一现象，建立了测定芦丁的流动注射化学发光法。该方 法测定芦丁的检出限为7 l f f s g m l , 线性范围为1 o x l o 7 一1 o x l o - s g m l ，对 1 ：0 l o 飞，m l 芦丁进行1 1 次平行测定的相对标准偏差为2 2 。该方法被用于四种中 药中芦丁的含量测定。 4 中性介质中流动注射化学发光法测定苯酚 发现了在十六烷基三甲基溴化铵胶束存在条件下，苯酚与n 溴代丁二酰亚胺 ( n b s ) 和过氧化氢在近中性水溶液中的化学发光反应，建立了利用这一反应测定 苯酚的流动注射化学发光法。该方法测定苯酚的线性范围为 1 0 x 1 0 7 1 o x l f f 5 9 m l ，检出限为3 x l o - 8 9 m l ，相对标准偏差为2 o ( 1 o x l o e g m l 苯酚溶液，n = 1 1 ) 该方法被用于苯酚滴耳液中苯酚的含量测定。 关键词；n 溴代丁二酰亚胺过氧化氢单线态氧化学发光分析 i i s t u d yo nt h ec h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mo f n b r o m o s u c c i n i m i d e - h y d r o g e np e r o x i d e h a ol i a n g a b s t r a c t ：c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a n a l y s i sh a sr e c e i v e dm u c ha t t e n t i o nf o rt h e a n a l y s i so fo r g a n i ca n di n o r g a n i cs p e c i e si nav a r i e t yo ff i e l d sf o ri t sh i g hs e n s i t i v i t y , w i d ed y n a m i cr a n g ea n di n e x p e n s i v ei n s t r u m e n t a t i o n c u r r e n tr e s e a r c hi nc l a n a l y s i si s f o c u s e do nt w og e n e r a ld i r e c t i o n s o n ed i r e c t i o ni st od i s c o v e rn e wc lr e a c t i o n sa n d b r o a d e nt h ea n a l y t i c a ls c o p eo fc la n a l y s i s t h eo t h e rd i r e c t i o ni st oc o m b i n et h e e s t a b l i s h e dc ls y s t e m sw i t hn e w l yd e v e l o p i n gt e c h n i q u e s s u c ha sh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p ha n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，t oi n e a s et h ea p p l i e dv a l u eo fc l m e t h o d t h ef o r m e ri sm o r ei m p o r t a n ts i n c ei ti st h ef o u n d a t i o no ft h ec la n a l y s i s u s u a l l y ，c li s e m i t t e dd u r i n ga no x i d a t i o n - r e d u c t i o nr e a c t i o na n dm a n yf a m i l i a r o x i d i z i n ga g e n t s ，s u c ha sp o t a s s i u mp e r m a n g a n a t e ，c e r i u m ( ) ，h y p o h a l i t e sa n dr e l a t e d o x i d a n t s ，a n ds oo n , h a v eb e e ne x p l o r e da st h eu s e f u lo x i d a n tf o rl i q u i dp h a s ec l a n a l y s i s d u et oi t sh i g h tr e a c t i v i t y ，r e c e n t l yy e a r , s i n g l e to x y g e nh a sa t t r a c t e dm u c h a t t e n t i o ni nm a n yf i e l d s i nm a n yc lr e a c t i o n s ，s i n g l e to x y g e nh a sb e e n 矗e q u e n f l y s u g g e s t e da st h er e a c t i o ni n t e r m e d i a t ea n dp l a y e di m p o r t a n tr o l ei nt h e s er e a c t i o n s h o w e v e r ，t h e r eh a v eb e e nf e wp a p e r sw i t ht h ei n t e n t i o no fu s i n gt h e s es p e c i e sa st h e o x i d a n ti nt h ec l a n a l y s i s i t sw e l lk n o w nt h a ts i n g l e to x y g e nf 1 0 2 ) c a l lb ep r o d u c c di n t h er e a c t i o nb e t w e e nn - b r o m o s u c c i n i m i d ea n dh y d r o g e np e r o x i d ew i t hh i g hq u a n t u m y i e l d b a s e do nt h i sr e a c t i o n , w ee x p l o r e dt h ep o s s i b i l i t yo fu s i n gs i n g l c to x y g e na s o x i d a n ti nt h ec la n a l y s i s t h i st h e s i sc o n s i s t so fr e v i e wa n dr e s e a r c hs e c t i o n i nt h ef w s tp a r t , t h ee l e c t r o n i cs t r u c t u r e ，p r o p e r t i e sa n dg e n e r a t em e t h o d so fs i n g l e t o x y g e nw a sb r i e f l yi n t r o d u c e d t h e nt h em a i nd e t e c t i o nm e t h o d sa n dt h eu t i l i z a t i o no f s i n g l e to x y g e nw e r es u m m a r i e d t h er e s e a r c hs e c t i o nc o n s i s t so ff o u rp a r t s p a r to n e ，w ep r o p o s e da s i m p l ef l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fn i t r o f u r a z o n e t h i sm e t h o dw a sw a sb a s e do nt i l er e a c t i o no f n i t r o f u r a z o u ew i t hh 2 0 2a n dn - b r o m o s u c c i n i m i d ei na l k a l i n ec o n d i t i o n t h ec ls i g n a l w a s p r o p o a i o n a lt o t h en i t r o f l l r a z o n ec o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e1 0 x t 0 7 1 0 x 1 0 5 9 m l1 1 i cd e t e c t i o nl i m i tw a s2 x 1 0 3 9 m ln i t r o f u r a z o n ea n dt h er e l a t i v e l s t a n d a r dd e v i a t i o nw a sl e s st h a n4 ( 6 0 x l o b g m ln i t r o f u r a z o n e ，n = 1 1 ) t h ep r o p o s e d m e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fn i t r o f u r a z o n ei nc o m p o u n d f u r a c i l l i nn a s a ld r o p s ，h u m a np l a s m aa n du r i n es a m p l e s t h ec lr e a c t i o nm e c h a n i s m w a sa l s od i s c u s s e db r i e f l y p a r tt w o ，s i n g l e to x y g e ng e n e r a t e di nt h er e a c t i o nb e t w e e nn - b r o m o s u e e i n i m i d e a n dh y d r o g e np e r o x i d ew a gu s e df o rt h ec h e m i l u m i n e s c e n c eo x i d a t i o no fi m i p r a m i n e s t r o n gc h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a lw a so b s e r v e dw h e ni m i p r a m i n ew a sm i x e dw i t h n - b r o m o s u c c i n i m i d ea n dh y d r o g e np e r o x i d ei na l k a l i n ec o n d i t i o n t h ec h e m i l u m i n - c s o s n c es i g n a lw a sl i n e a r l yd e p e n d e n to nt h ec o n c e n t r a t i o no fi m i p r a m i n ei nt h er a n g e o f1 0 x l o 8 1 0 x 1 0 t g m lt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s5 x l o 9 9 m li m i p r a m i n ea n dt h e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s1 5 f o r4 0 x 1 0 + 7 9 m li m i p r a m i n es o l u t i o ni ne l e v e n r e p e a t e dm e a s u r e m e n t s t h ep r o p o s e d m e t h o dw a ss u c c e s s f u l l y a p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no fi m i p r a m i n e 抽t a b l e t s i nh u m a np l a s m aa n di nh u m a nu r i n e p a r tt h r e e ，m t i nw a sd e t e r m i n e db yan e wf l o wi n j e e t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e m e t h o d ，b a s e du p o ni t sr e a c t i o nw i t hn - b r o m o s u c c i n i m i d ea n dh y d r o g e np e r o x i d ei nt h e p r e s e n c eo fc e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d es u f f a c t a n tm i c e l l e s t h ee h e m i l u m i n e s c e n c os i g n a lw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fm t i ni nt h er a n g eo f1 0 x 1 0 1 1 0 x 1 0 s g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f7 x 1 0 a g m lr u t i n t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n f o r1 0 x l o 6 9 m lm t i ns o l u t i o nw a s2 2 ( n - 1 1 ) t h ep r o p o s e d m e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fr u t i ni nf o u rc h i n e s e m e d i c i n a l p a r tf o n t , t h ec h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o no fp h e n o ln - b r o m o s u c c i n i m i d ea n d h y d r o g e np e r o x i d ei n n e u t r a la q u e o u sm e d i u mi nt h ep r e s e n c eo fc e t y l t f i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d es u r f a c t a n tm i c e l l e sw a sd i s c o v e r e d b a s e do nt h i sr e a c t i o n ，an e w f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp h e n o lw a sp r o p o s e d t h ec h e m i l u m i n e s c e n c es i g n a lw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp h e n o li nt h e r a n g eo f1 o 1 0 。7 1 0 x 1 0 5 9 m l w i t had e t e c t i o nl i m i to f 3 x 1 0 。s g m l m t i n t h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o nf o r1 0 x l o 6 9 m lp h e n o ls o l u t i o nw a s2 0 ( n = 1 1 ) t h ep r o p o s e d m e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp h e n o li np h e n o l e a rd r o p s k e yw o r d s ：n - b r o m o s u c c i n i m i d e ；h y d r o g e np e r o x i d e ；s i n g , l e t o x y g e n ； c h e m i l u m i l l e s e e r e ea n a y s i s l v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：煎, 4 - c 鱼 日期： 1 击 d 7 2 ， 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：日期：竺2 ：! 第一部分综述 单线态氧的检测和应用 尽管在1 9 2 4 年，单线态氧已被首次报道，但在很长一段时间内，单线态氧并 不为人所熟知。自从1 9 “年f o o t e 等人【1 l 提出有枫化合物的光催化氧化反应的活 性中间体是单线态氧以来，单线态氧才引起了人们的注意。单线态氧在生物氧化、 高聚物的降解、污染物的光转化、化学发光、肿瘤的诊断和治疗等过程中都会不 断的生成和猝灭。本文对单线态氧的电子结构、特性及其产生方法进行了简单介 绍；总结了单线态氧的主要检测方法以及单线态氧的应用。 l 单线态氧简介 1 1 单线态氧的电子结构及特性 在量子力学中，电子能态的多重性m 可用2 s + 1 表示，s 为电子自旋量子数的代 数和，如果分子中有两个不成对电子，平行自旋且分占两个轨道，即两个电子的 自旋量子数都为1 2 ，总自旋量子数为s = 1 ( s = 1 2 + 1 2 ) ，其自旋多重性m = 3 ，称为 三线态。如果分子中两个电子自旋方向相反，则s = 1 2 + f i l 2 ) l = o ，其自旋多重性 m = 2 s + i = i ，称为单线态1 2 】。 氧分子的电子排列可表示为： ( 0 9 1 s ) 2 ( 瓯。1 s ) 2 ( c f 9 2 s ) 2 ( i 2 s ) 2 ( o 瘩2 p ) 2 2 p ) 40 i 2 p ) 2 ，堍2 p 可容纳4 个电子。但 氧分子中只有两个电子进驻此分子轨道。这两个电子可采取反自旋方式排列s = o ， 也可分占两个轨道并采取平行自旋的方式排列s = 1 ，前者属单重( s i n g , l e t ) 状态，后 者则为三重( m p l c t ) 态。三重态的能量较低。故氧分子的基态属于三重状态，具有 顺磁( p a r a m a g n e t i e ) 性质，符号为3 ；( 3 0 2 ) 1 3 , 4 4 1 。而单线态氧是能量较高的激发态氧 分子，当氧分子被激发后，最高能量的自旋相反的2 个电子有2 种排列方式：其 中之一，自旋相反的2 个电子同占1 个唯轨道，有1 个空轨道，这就是氧分子的 第一激发态，符号为1 0 2 _ ( 1 k ) 。而另一种则为自旋相反的2 个电子分占2 个如 反键轨道，符号是1 0 2 ( 1 ：) ，是氧分子的第二激发态。氧分子的这3 种形式，称 为自旋异构体1 5 1 这三种自旋异构体的电子轨道分布如图1 所示。它们的键长分 别为3 三；( 基态) 1 2 0 7 4 a 、1 ( 第一激发态) 1 2 1 5 5 a 和1 z ；( 第二激发态) 1 2 2 6 8 a i q 在1 z ：态，氧的两个价电子是自旋相反和共平面的，排斥能最大，分子的能量 最高，容易发生两个电子同时进攻反应底物的协同加成氧化反应。在3 z ；态，氧的 两个自旋平行的价电子位于相互垂直的平面内，能够像自由基一样，以单电子进 攻反应底物。氧的1 ：态和；态均有双自由基的特点，而1 0 2 ( 1 钆) 贝f j g 示有两性 离子的特征。在1 。态，包含两个组分。一个组分是两个自旋相反的价电子在同一 平面内，另一组分是两个价电子在相互垂直的平面内。故1 态的氧可显示双电子 进攻与单电子进攻两种反应性能。 1 ： q l g q 3 ； 能态 电子分布 图1 氧分子石反键轨道电子分布图 1 0 2 ( 1 ) 的能量是9 4k j t o o l ，1 0 2 ( 1 ；) 的能量是1 5 7k j t o o l 。由于1 0 2 ( 1 ；) 的 京2 量高、稳定性差，且由第一电子激发态1 0 2 ( 1 & ) 跃迁到第二电子激发态1 0 2 ( 1 ；) 是自旋禁阻的，因此，1 0 2 ( 1 ；) 的寿命比1 0 2 ( 1 越) 要短的多。在气相中，1 0 2 ( 1 ) 和1 0 2 ( t z ：) 的寿命分别是4 5m i n 和7 1 2s l q ；在水溶液中寿命分别是1 0 r 6 1 0 - 3s 和 1 0 - n _ 1 0 r 9s 旧。 1 2 单线态氧的熄灭 单线态氧是氧气分子的激发态，很容易释放出能量返回到基态，这一过程也 即单线态氧的熄灭。单线态氧的熄灭主要有两种方式： ( 1 ) 物理熄灭：1 0 2 + a 一3 0 z + a ，在此反应中仅有单线态氧的熄灭而没有氧的消 耗和新物质生成。 ( 2 ) 化学熄灭：1 0 z + a - - * p ，在此反应中，熄灭剂同单线态氧反应生成了新物质。 1 3 单线态氧的发射光谱 1 9 6 3 1 9 6 4 年，k a s h a 和k h a n 检测到n a o a h 2 0 2 溶液中1 0 2 红色的化学发光，并 推测这种红色的光来自于单线激发态氧分子的发射f 1 1 0 j 。o g r y z l o 和他的同事通过 分子氧的电子放电反应( 气相) 证明了单线态氧分子复合物【21 0 2 ( 1 趣) 】的存在 n a 3 l 。这些研究成果极大推动了这一领域的发展。人们逐渐掌握了单线态氧在气 相和液相中发光的知识。单线态氧发光的光谱特征通过研究c i o ( 或a 2 ) 同h 2 0 2 的反应而记录下来。其发射光谱的主要发射谱带处于可见和红外光谱区，总结如 表11 2 4 1 所示：在表1 所记录的所有谱带中，仅可见区中位于6 3 3 n m 和7 0 3 m 处的谱带 以及红外区位于1 2 7 0 r i m 处的谱带可在所有产生单线态氧的化学反应中观察到。 表1 单线态氧的发射光谱 1 0 2 ： ( 1 0 2 h ： 1 5 8 0 r i m ：( 0 , 1 ) 1 a 。- 3 ； 1 2 7 0 n m ：( o ，o ) 1 a l 一3 嚣 1 0 7 0 n m ：0 ，o ) 1 | 一z ； 8 6 5 n m ：( 0 ，1 ) 1 ；一3 z ； 7 7 0 r i m ：( 1 ，1 ) 1 ：一3 三- 7 6 2 n m ：( 0 ，o ) 1 蜀- 3 ； 7 8 6 n m ：( 1 a j x o ( 1 a j x - o ( 3 ；x 。2 ( 3 三；x - o 7 0 3 r i m ：( 1 a j ) v - o ( 1 厶x - o - ( 3 z ；x 1 ( 3 z ；) ，o 6 3 3 n m ：( 1 f x o ( 1 j x o + ( 3 x d , - o ( 3 ；) ，- o 5 7 8 n m ：( 1 a ；x 一( 1 a # x - o ，( 3 ；) ，o ( 3 ；) 。o 4 7 7 n m ：( 1 鬈) ，一( 1 5 ) ，- 0 + ( 3 ；x o ( 3 z ；) ，- o 3 8 1 n m ：( 1 ；) ( 1 ；x o 一( 3 z ；) ( 3 ；) 1 4 单线态氧的产生 产生单线态氧的方法有物理方法和化学方法。 1 4 1 物理方法 物理方法主要有氧气中放电的方法和光敏化方法。其中光敏化方法以其简单， 可控性强而最为常用。这种方法需要氧气、适当波长的光以及光敏化剂。光敏化 剂在光的照射下，吸收能量丙成为激发单重态( s 1 ) 。寿命很短的s - 态很快经过系问 跨越回到寿命较长的三线态t l 。处于激发三线态的光敏剂通过同基态氧的碰撞将 能量转移给氧分子，产生激发单线态的氧分子。其过程可表述如下： p ( s 。) 一p ( 墨) - 。一p 瓴) p ( ，) + d l p ( s o ) + 1 0 ； 光敏化剂应具有以下特征【1 5 1 ：( 1 ) 在激发光的光谱区具有高的吸收系数：( 2 ) 具有适当的三线态能( e r = 9 5 k jm 0 1 - 1 ) ，以便可以有效的将能量传递给基态氧；( 3 ) 具有较高的三线态量子产率( 唾，o 4 ) 和长的三线态寿命( f t ，1 缈) ；( 4 ) 光稳定性较 高。常用的光敏化荆有以下类型：( 1 ) 有机染料和芳香烃【t 6 , 1 7 1 ；( 2 ) 卟啉、酞箐染 料及相关的四毗咯化合物1 1 & 硼；( 3 ) 过渡金属络合物1 2 1 捌；( 4 ) , 导体t z 3 1 。 1 4 2 化学方法 化学方法是通过化学反应来产生单线态氧，能用来产生单线态氧的化学反应 主要为过氧化反应，其中以基于过氧化氢氧化分解的方法最为常用，如h 2 0 2 c i o - 反应，这一体系已被详细研究【嬲l 并被作为有效产生单线态氧的模型体系( 在一 定条件下几乎定量生成1 2 4 w 1 ) 虽然产生单线态氧的化学反应很多，但探寻对环 3 境友好，单线态氧量子产率高，能加以利用的反应仍具有重要意义。如j m a u b r y 等最近合成了一种新的能产生单线态氧的试剂c a 0 2 2 h 2 0 2 ，这种试剂对环境没有 污染，在多种溶剂中都可以产生单线态氧，且可以再生利用i 勰】，并被应用于有机 合成中。一些典型的产生单线态氧的过氧化反应及其量子产率列于表2 1 1 4 j 。 表2 典型的产生单线态氧的过氧化反应及其量子产率 注：c h e mt r a p 为化学捕获法。见2 | 3 ；碾c l 为近红外化学发光光谱检测法，见2 1 。 2 单线态氧的检测 检测单线态氧的方法很多，本文主要介绍以下三种方法： 2 1 发射光谱法 单线态氧的单分子和双分子发射现象的发现为化学和生物过程中检测和定量 单线态氧提供了可靠的光谱学方法。双分子发射是两分子单线态氧同时返回基态 去活发出的光，波长位于可见光区；单分子发射是一分子单线态氧返回基态时所 发出的光，波长主要位于近红外区【1 4 1 。检测单线态氧在1 2 7 0 n m 处的发射光是一种 对单线态氧专一且对反应或生物体系无干扰的非侵入性的检测方法1 3 ”。近年来， 这种方法已成为研究单线态氧，特别是测定单线态氧的产率，寿命以及去活常数 1 3 8 - 4 0 1 的标准方法1 4 ”。测定单线态氧产率时，将未知单线态氧产率的反应的红外化 学发光强度与一已知单线态氧产率的标准反应的红外化学发光强度相比较，从而 4 可计算出未知反应的单线态氧产率i l ”。常用的可用作定量的标准反应主要有：热 分解臭氧化三苯基磷或萘的1 ，4 内过氧化物的反应、过氧化氢与c i o 或n 氯代丁 二酰弧胺的反应以及钼酸盐催化分解过氧化氢的反应。这些反应都已成功用于单 线态氧1 3 6 删7 1 的定量。值得注意的是，当被测反应与标准反应在同一种溶剂中反应 时，所得的结果才是可靠的。否则，应当校正单线态氧在这些溶剂中衰减时的辐 射与非辐射常数。 在过去3 0 年中，主要使用低温锗二极管检测单线态氧在1 2 7 0 n m 处的发光，由 于低温锗二极管检测单线态氧的灵敏度较低，限制了发射光谱法在生物体系中的 应用削。最近，采用近红外光电倍增管，由于它在1 2 7 0 n m 处的灵敏度比锗二极管 要高一个数量级，提高方法的检测灵敏度，使得发射光谱法可用于生物体系中单 线态氧的检测6 飘。采用近红外光电倍增管，w i l s o n 等检测了光动力疗法过程中 体内细胞和组织中的单线态氧1 5 0 1 。m a j i m a 等使用全内反射荧光显微镜成功地检测 了空气中二氧化钛光催化产生的单分子水平的单线态氧分子【5 1 】。用一横向分辨率 为2 5 p r o 的光学显微镜，通过检测1 一3 ；迁移在1 2 7 0 n m 处弱的磷光，o # i b y 等 检测了用光持续照射溶解予甲苯中的光敏剂5 ，1 0 , 1 5 ，2 0 t e r n i p h e n y l 2 1 h , 2 3 h p o r p h i n ef r p p ) 所产生的单线态氧p 2 1 。建立了甲苯和水的混合相中单线态氧的成像 系统，该系统能将含有单线态氧和不含单线态氧的区域分开。他们还对单线态氧 在c s 2 和d 2 0 两相界面的扩散迁移进行了研究【5 3 i 。将研究结果应用到生物体系中， 建立了单细胞中单线态氧的检测方法刚，对单细胞中单线态氧的寿命和扩散进行 了研究 s s l 。 2 2 探针检测方法 单线态氧的探针检测方法主要是利用探针同单线态氧发生反应前后，探针性 质的变化来检测单线态氧。发展对单线态氧高选择性高灵敏度的探针由于以下两 个方面仍存在一定困难：( 1 ) 单线态氧与其它活性氧的性质相似，很难将它与其它 活性氧分辨开；( 2 ) 单线态氧在水环境中的产率很低且寿命很短( 2 却s ) 。根据所利 用的探针性质的不同可将探针分为荧光探针，化学发光探针等。 2 2 1 荧光探针 荧光探针是利用探针同单线态氧反应前后其荧光性质( 如强度、波长、量子 产率、荧光寿命等) 的改变情况来检测定量单线态氧由于荧光分析法灵敏度高， 光谱资料易于收集，在显微成像技术中空间分辨力高1 5 6 1 。因此荧光探针法是检测 单线态氧的一种较好的方法。目前所报道的用于检测单线态氧的荧光探针主要有 以下几种：( 1 ) 9 ，1 0 - - = 甲基葸( 9 ，1 0 一d i m e t h y l a n t h r a c e n e ，d s t a ) ，d m a 是一种荧 光化合物，能在多种有机溶剂及水中选择性地同单线态氧迅速反应，生成没有荧 光的内过氧化物i s t - 6 , o l 。( 2 ) 基于单线态氧捕捉剂的荧光探针。n a g a n o 等将单线态氧 捕捉剂9 ，1 0 一二苯葸( 9 ，1 0 - d i p h e n y l a n t h r a c e n e ，d p a ) 与荧光素结合合成了一种能 进行荧光检测的化学捕捉单线态氧的荧光探针9 - 2 - ( 3 - c a r b o x y 9 ，1 0 & p h e n y 0 a n t h r y l 6 - h y d r o x y 3 h x a n t h e n 3 - o n e ( o p a x ) ( 7 3 1 这种探针自身荧光很低，它同单 线态氧反应后生成的d p a x 内过氧化物( d p a x e p s ) 具有强的荧光性。通过对 d p a x s 结构上修饰吸电子基团，还能使探针用于自然水溶液中单线态氧的检测1 6 l i 。 为了得到比d p a x s 灵敏度更高，与单线态氧反应生成内过氧化物更快的探针，他 们又设计合成了9 2 - ( 3 - c a e o o x y 9 ，l o - d i m e t h y l ) a n t h q l 6 h y d t o x y - 3 h - x a n t h e n - 3 - - o n e ( d m a x ) 6 2 1 ，这种新探针是基于d m a 与单线态氧反应比d p a 快得多的基础上设计 成功的。与d 相似，d m a x 将荧光素与单线态氧捕捉分子d m a 结合在一起。 d m a x 几乎没有荧光，而它的内过氧化物d m a x e p 则有很强的荧光。其量子产 率是d p a x - e p s 的1 5 倍。与d p a x s 相比，d m a x 检测单线态氧的灵敏度更高，更 适合于生物体系中单线态氧的检测嘲；( 3 ) 除了以上介绍的有机荧光探针，基于镧 络合物【叫的荧光探针也有报道。镧络合物的单线态氧荧光探针同有机荧光探针相 比其优点在于：镧络合物具有长的荧光寿命，大的s t o k e s 位移，尖的发射曲线，这 使得它们很适合时间分辨荧光测量，减小了由生物样品，散射光和光学元件带来 的背景噪音引起的干扰。t i a n 等1 6 4 l 设计并合成了可用于水溶液中检测单线态氧的 铽( ) 络合物n ，n , n 1 ，n 1 - 【2 ，6 一b i s 0 a m i n o m e t h y l l - p y r a z o l y l ) - 4 - ( 9 - a n t h r y l ) p y r i d i n e t e t r a k i s ( a c e t a t e ) - t b 3 + ，( p a t a - t b 3 3 , 这种络合物在水中溶解度大，几乎没有荧光， 可以与单线态氧发生特异性反应生成具有强荧光的络合物。p a t a - t b 3 + 内过氧化物 长的荧光寿命( 2 7 6 m s ) 使探针能用于时间分辨荧光检测单线态氧。这种探针对单线 态氧具有高灵敏度和选择性，已被用于定量检测m o o ：- , 0 2 中产生的单线态氧， 以及在弱酸性缓冲溶液中辣根过氧化物酶催化氧化吲哚3 乙酸体系中产生单线态 氧的动力学过程的实时监测中，检出限可达1 0 8 m n o l l 。 2 2 2 化学发光探针 化学发光法仪器设备简单，无需外界光源，与荧光分析法相比，可消除背景 荧光和各种散射光的干扰，改善信噪比。由于化学发光检测灵敏度高，需要的探 针浓度相对较低，降低了可能发生的二次反应的干扰陋j 。因此，采用化学发光探 针研究化学反应及生物体系中的单线态氧也是一种较好的方法。然而，文献所报 道的单线态氧的化学发光探针1 6 甜4 】并不多西普利多荧光素类似物被广泛用作单 线态氧化学发光探针 c 铂, 6 7 1 ，检出限达至l j 9 4 n m m 砒醴l ；但这些探针选择性低，对o f 也有响应【删，且其化学发光背景高，因而不是一种好的单线态氧探针。基于1 ，2 - 二氧烷化合物( 1 ，2 - d i o x e t a n e s ) 的化学性质的单线态氧探针也有报道，m c n e i u 和 他的同事研究了以稳定的二氧化物前体作为苹线态氧探针，具有高灵敏度，可准 确检测5 x l f f l 3 m o l l 的单线态氧1 7 0 , 7 ”。基于光诱导电子转移( p e n 原理，马会 民等将强电子给体四硫富瓦烯f t t f ) 单元连接到对单线态氧有特效捕获 作用的发光体蒽上，设计与合成了一种新的、对单线态氧有很高选择 性和灵敏度的化学发光捕获探针：4 ，5 二甲硫基4 f 2 一( 9 惹氧基) 乙硫 基1 四硫富瓦烯 7 2 , 7 3 】。其响应机理为：受t t f 活化的蒽单元首先捕获单 线态氧。生成了一种不稳定的内过氧化物；它的分解不仅引起葸核的 激发并随后通过辐射失活面发光，而且还导致了t t f 单元的氧化。在这 一反应中，最终形成的探针的阳离子形式促进了化学发光反应的进行， 同时也阻止了t t f 单元和激发态蒽单元之间的p e t 过程，从而增强了化 学发光。但由于这种探针的水溶性很低，需在四氢呋喃与水的混合溶液中进行检 测。为了能往检测在水溶液中进行，他们又对这种探针进行了修饰，得到一种薪 的探针。结果显示，新探针在水中溶解度仍较低，但很易溶于乙醇和甲醇中，这 就允许在相当温和的介质中检测单线态氧 7 4 1 。 基于吸收的探针也有报道，这种方法是利用这些探针同单线态氧发生特异性 反应后吸光度值的改变来检测单线态氧的。如9 ，1 阻二苯葱( d p a ) 是使用最为广泛 的单线态氧捕捉剂r 玲l ，它能选择性地同单线态氧迅速发生反应，生成热稳定性好 的内过氧化物【硼。通过测量内过氧化物在3 5 5 m n 处吸光度的减小值可确定单线态氧 的量。以9 ，1 0 - - - 苯蒽( d p a ) 为探针，s t e i n b e c k 检测了噬菌细胞产生的单线态氧l 稠。 其它物质如许多水溶性的d p a 衍生物p 刀，2 ，5 - 二甲基呋喃 7 8 1 ，糠醇1 7 9 1 也被用于构 建基于吸收的单线态氧探针。 2 3 化学捕捉 化学捕提( c h e m - u a p ) 法是一类曾被广泛使用的单线态氧检测方法1 2 4 2 9 , 3 0 珏3 5 l ，其原理是基于化学捕捉剂诱捕单线态氧后检测捕捉剂的减少量来计算单线态