（营养与食品卫生学专业论文）产γ谷氨酰基转肽酶菌株的选育.pdf

s p ， - 能透过细胞膜和细胞壁到发酵液中，这就大大简化了实验的操作。 本论文从实验室保藏的菌株枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 出发，通过对其进行诱 变的实验，选育出了高产丫谷氨酰转肽酶的菌株，并且遗传稳定性良好。通过紫外诱 变和微波诱变所获得的稳定高产丫g g t 菌株的酶活分别为3 5 6 u m l 和3 5 2 u m l 。 同时，本实验对所选育出来的高产7 - g t p 菌株进行了发酵培养基的优化，在3 5 培养时得到其最适发酵培养基组成是碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母膏，最适初始p h 值7 5 ，最适装液量6 0 m l 2 5 0 m l 。通过正交试验设计及优化实验，得到各因素及水平 的最佳组合，即碳源为葡萄糖，氮源为玉米粉，初始p h 值为8 ，装液量为6 0 m l 。 本实验还对丫谷氨酰基转肽酶的酶促反应进行了研究。酶促反应最适温度为 3 5 ，最适p h 值7 5 ，以及金属离子c a 2 + 和m 9 2 + 对g g t 活性有激活作用，而c u 2 + ， m n 2 + 和z n 2 + 对酶活性有抑制作用。 关键词t 谷氨酰转肽酶诱变培养基优化酶促反应 ” ， a bs t r a c t t h e a n i n ei st h ec h a r a c t e r i s t i c sa m i n oa c i d ，a n da l s oo n eo ft a s t ec o m p o u n d s t h e a n i n e h a sav e r yi m p o r t a n tr o l ei no u r d a y l i f e h o w e v e r , c o n v e n t i o n a le x t r a c t i o nm e t h o d s ， p r o c e s s e sa n dp r o c e d u r e si sv e r yc o m p l i c a t e da n dd i f f i c u l tt oc o n t r o l ，a n de x t r a c t i o ny i e l d i sv e r yl o w w h i l et h em i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o nh a sb e e nw i d e l ya p p l i e d ，t h em e t h o do f s y n t h e s i s i n gt h e a n i n eb w g l u t a m y lp e p t i d ei sm o r es i m p l ea n de f f e c t i v e c u r r e n t l yt h e m i c r o o r g a n i s m ss e c r e t i n g ? - g l u t a m y lp e p t i d a s em a i r d yi n c l u d ee s c h e r i c h i ac o l i ，b a c i l l u s s u b t i l i sa n db a c i l l u sl i c h e n i f o r m i ss t r a i n sa n ds oo n b u ta m o n gt h ev a s tm a j o r i t yo f s t r a i n s ， 7 - g l u t a m y lp e p t i d ei si n t r a c e l l u l a le n z y m e s d a m ss h o wt h a t 3 , - g l u t a m y lp e p t i d a s ew h i c h b a c i l l u ss u b t i l i ss e c r e t e sc a l lg ot h r o u g ht h ec e l lm e m b r a n ea n dc e uw a l lt ot h eb r o t h , s oi t g r e a t l ys i m p l i f i e st h eo p e r a t i o no f t h ee x p e r i m e n t i nt h i sp a p e r , h i g h7 - g l u t a r n y lp e p t i d a s es t r a i n , a n dg o o dg e n e t i cs t a b i l i t yi ss e l e c t e d o u t ，t h r o u g ht h e i re x p e r i m e n t sb yu vm u t a g e n e s i sa n dm i c r o w a v ei r r a d i a t i o no nb a c i l l u s s u b t i l i sw h i c hs t o r e di nt h el a b o r a t o r y t h es t r a i n so b t a i n e db yu v m u t a g e n e s i sa n d m i c r o w a v ei r r a d i a t i o nh a v eh i g hs t a b i l i t ya n dy i e l d ，a n dt h ea c t i v i t yo f t g g ta l e 3 5 6 u 玎：l la n d3 5 2 u m l t h ee x p e r i m e n to p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mf o rb a c i l l u ss u b t i l i s a c c o r d i n gt o t h er e s u l t s ，w h e nt h ec u l t u r em e d i u mc o n t a i n i n gg l u c o s e ，y e a s te x t r a c t ，p h 7 5 ，a n d6 0 m l p e r2 5 0 m l ，t h ea c t i v i t yo f7 - g g ti sh i g e r b yt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g na n d o p t i m i z a t i o n ，w eg e tt h eb e s tc o m b i n a t i o no ff a c t o r sa n dl e v e l s ，a n dt h ec a r b o ns o u r c ei s g l u c o s e ，n i t r o g e ns o u r c ef o rt h ec o r nf l o u r , p h8 ，w i t hv o l u m eo f6 0 m 1 a tt h es a m et i m e ，7 - g l u t a m y lg l u t a m i ce n z y m a t i cr e a c t i o nh a sb e e ns t u d i e di nt h i s e x p e r i m e n t t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 5 ，p hv a l u eo f7 5 ，a n dt h em e t a li o n sc a 十 a n dm 9 2 + h a v ea c t i v a t i o nw h i l ec u + 、m n 2 + a n dz n 2 + h a v ei n h i b i t i o no nt h ea c t i v i t yo f t g g t k e yw o r d s ：7 - g g t ；m u t a t i o n ；m e d i u mo p t i m i z a t i o n ；e n z y m a t i cr e a c t i o n - l r i i i 1 1 性1 1 2 响因素3 3 3 1 5 3 影响酶活的因素3 1 6 】，- 谷氨酰转肽酶的应用5 1 6 1 ) ，谷氨酰转肽酶在临床上的应用5 1 6 2 合成谷胱甘肽和茶氨酸5 1 6 3 ) ，谷氨酰转肽酶在食品中的应用6 1 7 ) ，谷氨酰转肽酶产生菌的介绍一6 1 7 1 枯草芽孢杆菌概况6 1 7 2 其他产) ，谷氨酰转肽酶的菌株9 2 引言10 3 材料11 3 1 菌种11 3 2 仪器1l 3 3 培养基1l 4 方法12 4 1 菌种活化12 4 2 菌体生长曲线的绘制12 4 3 酶活检测12 4 4 蛋白质含量测定12 4 4 1 标准曲线制作13 4 4 2 样品测定13 4 5 菌悬液制备13 4 6 菌株紫外诱变14 4 6 1 诱变及筛选流程14 i 4 6 2 照射时间的确定14 4 6 3 照射距离的确定14 4 6 4 初筛15 4 6 5 复筛15 4 6 6 产酶活力稳定性试验l5 4 7 微波诱变15 4 7 1辐照时间的确定15 4 7 2 初筛15 4 7 3 复筛15 4 7 4 产酶活力稳定性试验15 4 8 发酵条件对产酶的影响15 4 8 1 菌种活化15 4 8 2 种子液的制备l5 4 8 3 粗酶液的制备15 4 8 4 酶活测定l6 4 8 5 单一碳源对产酶的影响16 4 8 6 单一氮源对产酶的影响16 4 8 7 初始ph 值对酶活的影响16 4 8 8 摇瓶装液量对发酵产酶的影响16 4 8 9 正交试验设计16 4 91 ，ggt 粗酶的制备16 4 10y ggt 的酶学性质l7 4 1o 1 酶的最适反应温度的确定17 4 10 2 酶的ph 值稳定性试验17 4 10 3 酶促反应的最适ph 值试验17 4 10 4 金属离子对酶活性的影响17 5 结果与分析18 5 1 生长曲线的绘制18 5 2 紫外诱变结果分析18 5 2 1 致死率曲线的绘制18 5 2 2 照射距离的确定19 5 2 3 初筛19 5 2 4 复筛19 5 2 5 遗传稳定性试验20 5 3 微波诱变结果分析二20 5 3 1 照射时间的确定20 5 3 2 初筛20 5 3 3 复筛2l 5 3 4 遗传稳定性试验21 5 4 发酵培养基优化分析21 5 4 1 单一碳源对菌体发酵产酶的影响21 5 4 2 单一氮源对发酵所产y gtp 酶活的影响22 5 4 3 发酵液初始ph 值对酶活的影响：22 5 4 4 摇瓶装液量对菌体发酵产酶的影响23 5 4 5 正交试验统计结果23 5 4 6 正交试验评价结果24 5 5 酶的粗提24 5 6 酶学性质分析25 5 6 1 酶的最适温度的确定25 5 6 2 酶的ph 值稳定性试验2 5 5 6 3 酶促反应的最适ph 的确定26 5 6 4 金属离子对酶活性的影响26 6 结论28 参考文献29 致谢35 作者简介36 硕士在读期间发表的学术论文36 i i i 1 文献综述 1 1 丫- 谷氨酰基转肽酶简述 t 谷氨酰基转肽酶( 7 一g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e ，简写为g g t 或者g t p ) 又名丫谷氨 酰基转移酶( 丫g l u t a m y l t r a n s f e r a s e ) ，是转氨酶的一种。它广泛存在于各级生物体内， 并分布在于各种组织中【l j 。7 - g g t 是谷胱甘肽( g s h ) 代谢的关键酶之一，也是催化 转移三y 谷氨酰基的特异性酶。人们通过对丫- 谷氨酰基转肽酶分子结构的研究，证 实了它是一个不对称的二聚体酶，一般由大小两个亚基组成，大亚基( 重链) 1 主1 3 5 1 个 氨基酸残基组成，小亚基( 轻链) 由1 8 9 个氨基酸残基组成。根据不同的来源，其分子 量是不相同的，一般小亚基的相对分子质量是2 1 2 5 k d a 【2 】，大亚基的相对分子质量 一般是在4 6 - - 6 5 k d a 范围内【3 】。但是也有例外，比如家蚕肠中的丫谷氨酰基转肽酶的 分子的小亚基相对分子质量是3 1 7 k u 【4 】，而洋葱的y 谷氨酰转肽酶分子的大亚基相对 分子质量为3 6 - - 一3 9 k u t 5 1 。 1 2p 谷氨酰基转肽酶的分布及其多样性 丫谷氨酰基转肽酶广泛存在于从微生物到哺乳动物的各级生物体内，并分布在各 种组织中。7 - g g t 在不同的生物体内，其分布也有一定的特异性。主要表现为存在位 置、存在形式以及水溶性的不同。在真核生物中，主要存在于膜的组织中，并且以结 合酶的形式存在【4 们】，比如在人体或者其他一些高等哺乳动物体内，它主要是结合在 肾、胰、肝、脾和小肠等组织的微绒毛膜上，而在昆虫中，则主要结合在微立体的膜 上f 4 】。而在原核生物中，7 - g g t 在不同菌属中分布的位置有所不同，但主要分布在细 胞浆液中或者分泌到细胞外。比如在大肠杆菌中，丫g g t 就主要存在于周质空间1 4 j ， 而在枯草芽孢杆菌中，大部分酶则可以分泌到细胞外面【1 0 1 。不同来源的 r g g t 的水溶 性也是不相同的。真核生物中，7 - g g t 是不溶于水的，但经过有机溶剂或者酶处理后 会就变成水溶性的：可在原核生物中，t g g t 本身就能溶于水i l 。 1 3 y 谷氨酰基转肽酶的催化作用 弘谷氨酰转肽酶，尽管其来源多样，催化特性和专一性极其相似。在酶学研究领域 中，a l t o nm e i s t e 等人对y - 谷氨酰转肽酶的催化特性进行了概括的总结p 】，并且指出， 卜谷氨酰转肽酶只对含) ，谷氨酰的化合物( 如谷胱甘肽及其巯基衍生物、三一) ，- 谷氨酰- 对硝基苯胺等) 具有光学以及立体专一性的催化作用。 产谷氨酰转肽酶可以催化利用谷胱甘肽系列反应的第一步，这也是最为关键的一 步，即将三肽上的谷氨酰基转移给受体。谷氨酰基的受体可以是氨基酸，二肽或者谷 胱甘肽。这些反应对产谷氨酰基循环很重要，是谷胱甘肽合成或者降解的代谢途径， 具有非常重要的生理意义。产谷氨酰转肽酶相关的反应式为【1 2 j ： g l u t a t h l o n o + a l n i a c i d 宰兰璺里坠弘g l u “n 。a c i d + c y 和 g i y ( 1 ) g l u t a t h i o n e 垒呈鎏堇1 k g l u 一翻u t a t i l i 。n e + c y 毫( l y( 2 ) g l u t a t h i o r 比+ 飓oo 丝坠g l u 蛐+ c ”g 1 y ( 3 ) l - g l u t a t h l o n e + 啦g i y 毒罾塞坠g l 山t l l i o n e ( 4 ) l , - g l u t a n t i n e + t a u 驾弘g l u ( 5 ) 产谷氨酰转肽酶的催化作用形式有以上三个反应，但是在不同的具体条件下，某 一反应会起主导作用，主要由受体性质，受体浓度和p h 值三个因素共同决定。当受 体是氨基酸，二肽或者三肽时，发生转肽反应，形成相应的少谷氨酰氨基酸或- y - 谷氨酰二肽和三肽( 反应式1 ) ；当丫谷氨酰供体同时又是受体时，则发生自身转肽反 应( a u t o t r a n s p e p t i d a t i o n ) ( 反应式2 ) ，需要指出的是，当丫- 谷氨酰的供体浓度很低时，此 反应可以忽略；而当受体分子为水时，会发生水解反应，也就是反应式3 。 不同来源的丫一谷氨酰转肽酶发生不同催化反应的p h 值也是不一样的。一般情况 下，丫谷氨酰转肽酶罪最适的转肽反应p h 值为8 - 9 ，而水解反应的最适p h 值是6 8 。 来源于细菌的y 谷氨酰转肽酶转肽反应的p h 值范围是6 0 - 一1 0 5 ，相对来说比较宽【1 3 】。 此外，丫谷氨酰转肽酶的活性还受温度，金属离子等因素的影响。温度对其影响 不是很大，一般比较稳定；金属离子中的二价离子钙离子和镁离子对其活性有激活作 用，这可能与该酶的活性中心的结构有关。 1 4 产谷氨酰转肽酶提取纯化 弘谷氨酰转肽酶广泛存在于从微生物到高等哺乳动物的各级组织中，因此其提取 的方法也不尽相同。目前) ，g g t 的提取主要有以下两个途径【1 0 1 ： 从动植物组织中提取y - g g t 的流程： 组织匀浆破碎硫酸铵沉淀脱盐预柱处理d e a e 纤维素柱 层析收集酶蛋白浓缩保存： 赵飞，乔旭光等【1 4 l 依次采用了硫酸铵沉淀法、p h e n y l s e p h a r o s e c l - 4 b 疏水层析 法、c o n a s c p h a r o s e 亲和层析法从大蒜中提取并纯化了丫谷氨酰转肽酶，并对其部分 酶学性质进行了研究。陶黎明等人【1 5 】采用硫酸铵沉淀，葡聚糖g 7 5 柱层析，d e a e 纤维素d e - - ( 3 2 ) 柱层析和羟基磷灰石柱层析等步骤第一次从家蚕蛹体脂肪组织及真 皮细胞分离并提取出纯化了丫谷氨酰转肽酶。 微生物发酵生产y - g o t 的主要流程： 微生物培养发酵离心收集菌泥细胞破碎( g o t 为胞内酶时) 硫酸铵 沉淀脱盐预柱处理d e a e 纤维素柱层析收集酶蛋白铱缩保存。 1 9 8 6 年日本京都大学的h i d e y u l ds u z u k i 分离纯化了大肠杆菌k 1 2 中的】，一谷氨酞 基转肤酶，并对它的性质进行了深入的研究【1 6 】；张新民等从枯草芽孢杆菌中分离并纯 化t y - g g t ，并对其培养条件进行了研究；有些学者对其它微生物中的) ，一谷氨酞基 转肤酶也进行了一些研究【1 7 1 9 1 。日本k y o t o 大学的r e i k on 2 0 - 2 1 1 等人首次从p r o t e u s m i r a b i l i s 的细胞中提取和纯化t y - g g t ，h i d e y k is t 2 2 。2 3 1 等从e e o l i k 1 2 细胞提取和纯化 t y - g g t ，y o s h i h i r o0 【2 4 】等从b a c i l l u ss u b t i l l s ( n a t t o ) 培养基中提取和纯化出y - g g t ， k e n j it t 2 5 】等从a s p e 玛i l l u so r y z a e 培养基中提取和纯化出t t - g g t 。 研究表明，生物体内的y - 谷氨酰转肽酶的含量非常少，提取工艺复杂，故不适 合工业化生产的需要，而生物发酵法生产弘g g t 则比较简单，产量较高，适合工业化 生产的需要。 1 5 】，谷氨酰转肽酶的活性检测及其影响因素 1 5 1 酶活单位定义 在相应条件下，l m i n 催化转移l m o l y 谷氨酞基所需要的酶量，即为1 个酶活力单 位，以u 表示。 1 5 2 检测方法 目前对于弘谷氨酰转肽酶的酶活检测主要是应用分光光度计法和液相色谱法进 行检测。 1 5 3 影响酶活的因素 由不同来源1 约7 - g g t 的提取纯化方法可知，生物发酵法生产y - g g t ，方法简单， 产量较高，但并不是目前所有发现的菌种都能发酵生产) ，g g t ，而且酶活力也不高。 目前只有日本在此方面的研究相对多一些，已知的能产生产g g t 的菌种有如表1 1 1 2 6 ： 表1 1 产谷氨酰转肽酶生产菌 t a b l e l 1t h em i c r o b ew h i c hc a np r o d u c ey - g g t 菌种 7 - g g t 生成量( u m d 地衣芽孢杆菌a 3 5 地衣芽孢杆菌a t o c 9 9 4 5 a 枯草芽孢杆菌a s a h i k a w a 枯草芽孢杆菌s a w a 枯草芽孢杆菌i f 0 3 3 3 5 3 0 2 0 1 3 2 0 o 0 6 1 5 3 1 0 0 0 9 从表1 1 中的数据可以看出，酶的活力是比较低的，因此，采取相应的措施提高 酶促反应中酶活力具有很重要的现实意义。酶活受多种因素的影响，比如温度，p h 值，金属离子等。 3 首先，温度影响酶促反应表在体现两个方面：第一，温度的升高会加剧底物分子 的热能，增加了酶与底物分子的接触机会，从而提高酶促反应的速率；第二，温度升 高的同时也增加了构成酶本身蛋白质结构分子的热能，当温度升高到一定程度时，使 得分子间相互作用力( 氢键，范德华力等) 破裂，当维系着整个酶的三维结构的相互 作用破裂时，就导致了酶的变性。而在温度逐渐升高的过程中，酶的三维构象正是逐 渐发生变化而改变酶活性的部位，从而导致酶的催化能力的降低。升高温度用以提高 反应速率的总效应是这两个相反效应之间的平衡【2 7 1 。 其次，酶的催化活力受p h 值的影响比较大，多数情况下，酶催化反应在一定p h 值下具有最大的反应速度，高于或者低于这个p h 值，反应速度都会有所降低，这个 p h 值就是酶的最：i 置p h 值。p h 值可以多方面影响酶促反应，通过影响酶的构象和底物 的荷电性质，从而影响酶的活性中心与底物的接近和结合程度，因为酶是一种两性化 合物，在不同的p h 下会以不同的解离状态存在，其中有一种解离状态最适合酶对反 应的催化作用，此时p h 环境为最适于酶促反应的p h 值。 再次，金属离子对酶活的影响 研究发现，金属离子对y g g t 活性的影响可能与其活性中心的结构有关。 此外，不同来源的丫g g t 对温度，p h 值等因素的敏感性是不同的。 1 6 产谷氨酰转肽酶的应用 1 6 1y 谷氨酰转肽酶在临床上的应用 弘谷氨酰转肽酶主要存在于人体及一些哺乳动物的具有吸收和排泄功能的细胞 的特定的组织中，如肝，肾等，并且在特定的条件下会大量的释放到血液当中。临床 上应用这个性质来检测组织细胞是否发生了病变。一直以来，人们常常通过血清学检 测y 谷氨酰转肽酶特异性同工酶从而来鉴别诊断肝癌【2 引。随后，又在多种组织疾病中 发现了该酶的异常表达，如胰头癌、胆管癌、结肠癌、胃癌以及大肠癌组织等，甚至 还通过检测尿液中y g t p 的活性来判断肾脏的疾病 2 9 1 。我国对丫g t p 的研究多局限于 一些脏器的诊断以及愈后判断，如肝脏和肾脏等。而国外在临床上对y - g t p 的研究则 有新的进展和突破。w a n n a m e t h e e 等通过对6 9 9 7 个4 0 5 9 岁的无c v d ( 冠心病或中风) 或糖尿病中年男子的随访中，发现并证明了谷氨酰转肽酶显著增加是冠心病、严重中 风、心血管病等引起猝死的主要原因，因此监测丫g t p 的量也可以做为防范心血管疾 病的一个标志【3 0 】；h a y e ta b e r k a n e 等 3 1 】在体外实验中发现 r g t p 抑制剂可以阻断肿瘤 细胞的营养供应，这为临床治疗癌症提供了新的思路。8 j o r nv e r g a u w e n 等1 3 2 】以丫g t p 的水解作用为靶点制备出新型的丫g t p 抑制剂，从而使得丫g t p 抑制剂在应用于临床 上治疗疾病的方面又前进了一步。 1 6 2 合成谷胱甘肽和茶氨酸 4 谷胱甘肽是由三谷氨酸、三半胱氨酸和甘氨酸三者组成的三肽，是一种氨基 酸衍生物，在生物体中具有极其重要的生理作用和非常广阔的应用前景。临床上主要 用于肝病的辅助治疗，有机物及重金属的解毒作用，癌症辐射和化疗的保护，白内障、 h i v 的抵制，细胞膜的保护等等。谷胱甘肽的合成开始的工业生产主要是化学合成 或者从富含谷胱甘肽的酵母细胞中提取，但是这两种方法都有其不可避免的缺点。日 本人h i d e h i k o 利用砷谷氨酰转肽酶以三谷氨酰胺为供体，以人工合成的二肽衍生物 s 苄基也半胱氨酰甘氨酸甲酯为受体，先合成谷胱甘肽的衍生物，然后再经处理得 到谷胱甘肽，最终对二肽衍生物的转化率达7 6 。k y o w a 采用固定化细菌( 酶) 并且在 生产过程中添加a ，r p 的方法生产谷胱甘肽，这种方法使得生产的成本大大增加。张鲁 嘉利用从土壤中分离出的b s u b t i l i sn x 2 生产谷胱甘肽，其中t g t p 分离简单，不需添 加a t p ，既简化了过程又节约了成本，此方法具有一定的突破性。 茶氨酸是茶叶中的特征氨基酸，同时也是茶叶中的呈昧物质之一。茶氨酸具有非 常重要的作用。茶氨酸能对抗咖啡碱从而对人体起到提高兴奋的作用，起到镇静的作 用等【3 3 3 4 】。茶氨酸具有促进脑波中c t 波产生的功能，从而引起舒畅和愉快的感觉，同 时还能使注意力相对集中【3 5 1 。动物和人体试验均表明，茶氨酸可以作用于大脑，快速 缓解各种精神压力，放松情绪，对容易不安以及烦躁的人会更有效果【3 6 】。茶氨酸能通 过干扰谷氨酰胺的代谢从而来抑制肿瘤细胞的生长【3 7 】。另外茶氨酸可通过降低谷胱甘 肽过氧化物酶的活性，从而使脂质过氧化的过程正常化【3 引，茶氨酸具有降血压【3 9 1 ， 改善经期综合症等【4 0 】的作用。茶氨酸在食品上也具有食品风味的添加剂【4 ，茶饮料 品质的改良剃4 2 1 ，功能食品的添加剂等的作用【4 3 】。此外，茶氨酸还有抗疲劳，提高 免疫力和防御病毒的作用等。k a m a t ha 等研究发现，茶氨酸在人体肝脏分解为乙胺 和谷氨酸以后，前者能调动人体血液免疫细胞作出抵御外界侵害的反应，并成为抵御 细菌、病毒因子的第一道防线。从而t 型细胞促进干扰素的分泌量会激增5 倍，对细菌 的歼灭反应提高了1 0 倍。茶氨酸的提取目前主要有提取法，植物细胞组织培养法，微 生物发酵转化法以及化学合成法。化学合成法制备茶氨酸成本低，但是操作复杂，反 应条件苛刻。植物细胞组织培养法具有产量非常低，产品的分离纯化过程复杂以及生 产工艺的过程难以控制等缺点。提取法工序复杂。而微生物转化法的应用越来越广泛， 其中以产谷氨酰转肽酶合成茶氨酸的方法更为简便有效。h i d e y u k is u z u k i 等报道了利 用从细菌中得到的谷氨酰胺转肽酶作催化剂，将2 0 0 m m 谷氨酰胺和1 5 m z , 胺在p h 为 1 0 ，温度为3 7 的条件下，保持5 小时，获得1 2 0 m m 茶氨酸，转化率为6 0 。 1 6 3y 谷氨酰转肽酶在食品中的应用 y 谷氨酰转肽酶能够催化多种谷氨酰化合物，可将谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨， 这一性质与谷氨酰胺酶的性质相类似。例如，h i r o m i c h im i n a m i t 4 4 等发现天然的b 1 s u b t i l i s 中的g t p 具有耐盐的活性，于是他们利用基因操控技术对b1s u b t i l i s l 6 8 的1 5 个衍生株进行分析，发现它能大量生产g t p ，而且这种耐盐型的g t p 酶能够在大豆发 酵过程中稳定存在，即使在n a c i 质量分数1 8 时仍能发挥其水解性能将谷氨酰胺水解 成谷氨酸，这有助于减少谷氨酰胺向焦酸的转化，能够抑制酱油不良口感的出现。2 0 0 2 年，b l e l ( 4 5 j 等检测发现了牛乳中的y - 谷氨酰转肽酶可以作为巴氏杀菌的一个新标志， 其酶在检测过程中活性比较稳定；c a r l o p i g a 等人采用r p h p l c 方法对巴氏杀菌后的 羊乳以及其转化产品中丫- 谷氨酰转肽酶的活性进行了分析，其酶活性值比较稳定，并 且在一定的范围之内。这就为乳制品工业寻找新型的热处理标志物提供了一个全新的 思路【4 6 1 。 1 7 产谷氨酰转肽酶产生菌的介绍 1 7 1 枯草芽孢杆菌概况 枯草芽孢杆菌，属于革兰氏阳性或染色不定，严格好氧或兼性厌氧菌，化能异养 菌，能利用各种基质，氧化型或者发酵型代谢。枯草芽孢杆菌是一种嗜温性的好氧产 芽孢的革兰式阳性杆状细菌，分布广泛，且易分离培养。由于能够产生对热、紫外线 和电磁辐射以及某些化学药品有很强抗性的芽抱，并且可忍受各种不良环境，如可以 在p h 为2 3 的地方生存，也可以在温度高达8 0 甚至以上的地方生长，南极寒冷的冰 雪中也能见到它们的踪迹，因此其在自然界分布较为广泛刀。对人畜无毒无害，产生 多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力。同时，枯草芽孢杆菌还是常 见的植物内生细菌，尤其存在于植物的根部和茎部。枯草芽孢杆菌最突出的特点是营 养简单，生长快，能产生耐热抗逆的芽孢。它的这一特点有利于作为生防菌剂，并且 批量生产工艺简单，成本低，使用方便，储存期长。 1 7 1 1 枯草芽孢杆菌的研究现状 芽孢杆菌的发现已经有很长的历史了，但是到目前为止人们对它的研究却并不是 很透彻，主要集中在特定功能的基因的寻找并克隆到需要的物种中或者是通过诱变、 基因工程等手段对属于芽袍杆菌属的生产菌株进行改造1 4 s 5 0 李荣森等1 9 8 7 - - 1 9 8 9 年 对云南、贵州、四川、陕西等2 6 个县土样中的苏芸金芽抱杆菌和球形芽抱杆菌资源进 行了调查，并初步探讨了不同土壤条件下的检出率，戴顺英等于1 9 9 2 1 9 9 4 年开展了 1 2 个省土壤中苏芸金芽孢杆菌的资源研究，并且分析了土壤p h 值、土壤植被对苏芸 金芽抱杆菌的分布的影响【5 m 3 1 。近年来，我国利用枯草芽孢杆菌的防治植物病害的研 究已经达到了世界的先进水平，目前已经开发成功并且应用于生产的有亚宝、百抗、 麦丰宁、纹曲宁等。谢栋等( 1 9 9 8 ) 分离到了枯草芽抱杆菌b s 一9 8 ，它是一种能强烈抑 制苹果轮纹病菌等植物病原真菌的拮抗菌。范青等( 2 0 0 0 ) 从苹果园的土壤中分离了枯 草芽抱杆菌b 一9 1 2 ，防治柑桔青霉病、绿霉病均取得较好的抑制效果。林东等( 2 0 0 1 ) 发现枯草芽抱杆菌s 0 11 3 对水稻白叶枯病菌具有极强的抑菌作用。何红等( 2 0 0 2 ) 发现 6 了来自于辣椒体内的枯草芽抱杆菌b s 一1 和b s 一2 ，菌株对香蕉炭疽病菌德茵丝生长、 分生抱子的形成以及萌发等有强烈的抑制作用。 国际上美国目前已有枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局( e p a ) 商品化或有限商品 化生产应用许可，例如c b 0 3 、m b l 6 0 0 、q s t 7 1 3 和解淀粉枯草芽抱杆菌变种( b s u b t i l i s v r r a m y l o l i q u e f a c i e n sf z b 2 4 ) 。澳大利亚开发的b s u b t i l i sa 一1 3 对麦类以及胡萝卜立枯 病和其他土传病害具有良好的防治和增产的作用( b k a e r ，1 9 8 7 ) 。日本东京技术研究所 的b s u b t i l i sr b14 和b s u b t i l i sn b 2 2 分别对r h i z o c t o n i as o l a n i , f u s a r i u l t io x y s p o r u m 和 p s e u d o m o n a ss o l a n a c e a r u m 弓i 起的番茄病有较好的防效( a s i a ，1 9 9 6 ) 作用。 1 7 1 2 枯草芽孢杆菌在生物学上9 0 应用【6 9 】 目前国内外将枯草芽孢杆菌试用于防治的植物病害主要有蔬菜病害有：番茄刚、 菜豆【5 5 1 、茄子【5 6 】苗期的病害，菠菜的枯萎病【5 7 1 、辣椒的炭疽病【5 8 1 ；作物病害：大豆 的根腐病、小麦的根腐病5 9 1 、棉花的炭疽病【5 7 】、小麦的纹枯病卿、水稻的纹枯病【6 l 】、 水稻的瘟病【6 l 】、豆类的锈病【6 3 1 、小麦的白粉病【6 4 1 、小麦的赤霉病【6 5 】；树木果实病害： 苹果轮纹病、叶的斑病【5 7 1 、金花梨的灰霉病【嘲、采后柑桔果实青、绿的霉病【6 7 1 、桃、 油桃和甜樱桃的褐腐病【6 引。有的己开发成了商品【7 0 扔】。 1 7 1 3 枯草芽孢杆菌在养殖上的应用 枯草芽孢杆菌等微生态制剂是以内生孢子的形式存在的，当其进入消化道后内生 孢子迅速复活并且分泌活性很强的活性酶，如胞外酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、 淀粉酶等，它们可以提高饲料中营养成分的消化率，降低料肉比；或者也可以间接刺 激机体本身酶的活性，从而提高动物的生产性能。由于芽孢杆菌为好氧菌，可以通过 生物夺氧，扶持瘤胃内厌氧菌的生长，维持瘤胃内的微生态平衡，减少腹泻以及预防 疾病等。目前在实际生产的过程中常常根据有益菌的生物学作用及微生态的特性，将 芽孢杆菌与其他有益菌进行合理的搭配，优化组合进行混合发酵制成复合的菌种制剂 并对不同种类的反刍动物、不同的生长阶段、不同的日粮水平应用不同的微生态制剂， 从而达到良好的效果。 1 7 1 4 枯草芽孢杆菌在医药卫生方面的应用 活菌制剂在国外3 0 年前就己经进入了实际应用阶段，我国的活菌制剂的研究起步 较晚，基本上是近十几年才发展起来的【7 4 7 5 1 。枯草芽抱杆菌活菌剂作为口服液可用于 治疗肠炎、支气管炎等多种疾病，也可用来预防和治疗烧伤创面的感染等【7 6 1 。 1 7 1 5 枯草芽孢杆菌的诱变育种 枯草芽孢杆菌的诱变原理主要是通过一定的手段改变菌体的基因组成，即使其基 因突变。诱变育种技术是通过物理、化学因素作用于抗生菌，通过人为手段使其遗传 物质发生变异，并从中选育高产菌株。由于它操作简便，速度快、收效大而且诱变手 段多样，因此是实验室和生产上最为常用的高产菌株的育种方式之一( f u a l l ，1 9 9 4 ) 。 7 1 7 1 6 诱变育种的方法 菌株的诱变方法多种多样，主要分为物理诱变剂和化学因子诱变剂。其中物理诱 变剂指的是使用物理辐射中的各种射线，包括紫外线、x 射线、y 射线、a 射线、p 射 线、快中子、微波、超声波、激光射线和宇宙射线等等。 一物理诱变 紫外线是常用的物理诱变因子，也是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。君 主的d n a 和r n a 的嘌呤和嘧啶的最大吸收峰在2 6 0 r i m ，具有很强的紫外吸收能力，当 紫外光在2 6 0 n m 辐射d n a 时，菌株的致死作用是非常有效的。紫外辐射通过引起d n a 的转换，颠换，移码突变或缺失等来达到基因突变的作用。齐秀兰等( 1 9 9 5 ) 以妥布霉 素产生菌黑暗链霉菌a t c c l 7 9 2 0 为出发菌株，经紫外线处理后，获得了一株产量较 高而且性能稳定的菌株u v 2 5 9 ，其效价比原菌株提高了9 2 3 。王筱虹等( 2 0 0 0 ) 等利 用u v 照射红霉素产生菌红色链霉菌的原生质体，得到乐比对照菌株效价提高了 2 2 5 8 的高产菌株。 由于u v 的能量比x 射线和y 射线低，因此在核酸中能造成比较单一的损伤，所以 在d n a 的损伤与修复的研究中具有深远的意义( w a n g e ta l ，2 0 0 2 ) 。 离子注入是2 0 世纪8 0 年代时期兴起的一种表面的处理技术。余增亮等首先把离子 注入这一高新技术应用于农作物品种改良，并获得成功( 唐伟等，2 0 0 4 ) 。由此，注入 离子与生物体系相互作用过程的也就探索开始了。这种相互的作用过程大致可以分为 能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换等一共4 个原初反应的过程。离子注入诱 变育种是一种物理和化学效应，是集化学和物理诱变为一体的综合的诱变方法。它能 够引起染色体的畸变，导致d n a 链碱基的损伤和断裂，从而使遗传物质在基因水平 或者分子水平上发生改变或者缺失，即大幅度提高变异的频率( 宫春波等，2 0 0 3 ) 。龚 加顺等( 2 0 0 0 ) 等用圹离子注入单宁酸酶产生了菌黑曲霉9 7 0 1 ，获得了一株产酶活力为 4 5 0 m o l s 的高产菌株，比原始菌株的酶活力提高了2 6 8 倍，而且酶活性非常稳定。赵 洪英等( 2 0 0 1 ) 用n 十处理庆大霉素生产菌株，使该菌株的发酵能力提高t 2 7 3 9 。 激光是一种光量子流，又称为光微粒。激光辐射是一种产生光、热、压力和电磁 场效应的综合应用，直接或者间接地影响有机体，从而引起细胞d n a 或r n a 、质粒、 染色体畸变的效应，酶的激活或钝化，以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变。赵炎 生等( 1 9 9 7 ) 用激光诱变赤霉菌，其产生的赤霉素中活性最高的g a 3 的效价比出发菌株 提高了11 3 7 。李红民等( 2 0 0 1 ) 用h e n e 激光诱变面包酵母菌，筛选到了3 株低糖面 团起发活力大幅度提高的菌株x d l 9 8 、x d l 9 3 和x d l 7 4 ，低糖面团起发的活力比出发 菌株分别提高了3 1 1 、3 2 7 和3 5 3 ，并且筛选到了高活力菌株的遗传性能非常稳 定。彭益强等( 2 0 0 2 ) 用1 0 6 | lm ，1 5 k h z 高重复率声光调q n d ：y a g 激光诱变黑曲霉， 筛选到了一株酶活提高达3 7 5 倍的单个变异菌株。滕利荣等( 2 0 0 4 ) 用h e n e 激光辐照 g 诱变兽疫链球菌的原生质体，筛选出了一株能够高产透明质酸的菌株，其产量达到原 始菌株的4 5 倍之多。 二化学诱变方法 化学诱变是用化学诱变剂处理植物材料，从而诱发遗传物质的突变，引起形态特 征的变异，然后根据育种的目标，对这些变异进行鉴定、培育和选择，最终培育成新 品种的一种方法。 其诱变机制不同于辐射育种，化学药剂与遗传物质发生生化反应，结果多是基因 的点突变，而辐射诱变中诱变因高能射线造成，染色体结构变异广泛，且染色体或 d n a 是在辐射时发生的，化学诱变剂作用则是在较晚时发生，即”迟发突变”。此外， 化学诱变