（药物化学专业论文）混旋型萤火虫荧光素的合成.pdf

中文摘要 荧光素是萤火虫生物发光体系的重要组成物质。本文设计了一条新的混 旋型荧光素的合成路线，同时经过实验确定了每步合成最佳的反应条件和操 作方法。新合成方法继续以较为廉价的对甲氧基苯胺作为起始原料，新颖之 处在于：合成路线的简化以及反应条件的优化，从而达到提高目标化合物合 成总产率的目的。 以对甲氧基苯胺和硫氰酸钠作为起始原料，在醋酸水溶液的酸化以及液 态溴的催化下，先后完成加成反应和关环反应，最终以高收率得到中间体2 一 氨基一6 一甲氧基苯并噻唑。 首先，在酸性条件下，通过中间体2 一氨基- 6 - 甲氧基苯并噻唑与试剂亚 硝酸钠进行重氮化反应，得到2 - 重氮基衍生物备用。另一方面，利用氰化亚 铜与氰化钾，制得氰基络合物。然后，在碳酸氢钠的中和作用下，氰基络合 物与预先制备的2 - 重氮基衍生物发生氰化取代反应。最终以比较理想的收率 得到中间体2 - 氰基一6 一甲氧基苯并噻唑。 在氮气保护的条件下，熔融状态的中间体2 一氰基- 6 一甲氧基苯并噻唑与 无水的吡啶盐酸盐，进行脱烷基化反应，并且以较高的收率得到中间体2 一氰 基一6 一羟基苯并噻唑。 用氮气作为保护气体，同时利用不透光的保护膜作为避光保护，在碳酸 钾的引发下，以水和甲醇为混合溶剂，中间体2 - 氰基一6 - 羟基苯并噻唑与一 水合半胱氨酸盐酸盐，进行分子间的加成关环反应，最终以高收率制得目标 化合物一混旋型萤火虫荧光素。 除此以外，本文还在已有手性化合物拆分经验的基础上，设计了三种较 为可行的混旋型目标化合物的拆分方法。 关键词：生物发光体系；萤火虫荧光素；2 氨基6 甲氧基苯并噻唑；2 - 氰 基- 6 - 甲氧基苯并噻唑；2 一氰基一6 一羟基苯并噻唑；手性化合物拆分 a b s t r a c t l u c i f e r i ni so d eo ft h ei m p o r t a n tc o m p o u n d si nt h ef i r e f l yb i o l u m i n e s e n t s y s t e m a n e wm e t h o dt o s y n t h e s i s l u c i f e r i nw a s d e s i g n e d ，a n d a f t e r e x p e r i m e n t a t i o nt h eb e s tc o n d i t i o n sa n do p e r a t i o n si na l lo ft h es t e p sw e r e c o n f i r m e d t h en e ww a ys t i l lu s ep - a n i s i d i n ea ss t a r t i n gm a t e r i a l ，w h i c hi sq u i t e c h e a pc o m p o u n d ，a n dt h er o u t ei su n i q u eb e c a u s eo ft h es i m p l eo p e r a t i o n s ，t h e b e s tc o n d i t i o n sa n dt h eh i 【曲y i e l do f t h ew h o l es y n t h e s i s i nt h ea c e t i ca c i d ，p a n i s i d i n em a ds o d i u mt h i o c y a n a t ew e r eu s e da ss t a r t i n g m a t e r i a l si nt h ep r e s e n c eo fb r o m i n e a f t e ra d d i t i o nr e a c t i o na n dc y c l i z a t i o n ，t h e i n t e r m e d i a t ew a s s y n t h e s i z e d i n h i g hy i e l d ， w h i c h i s 2 - a m i n o 一6 一m e t h o x y b e n z o t h i a z o l e f i r s t l y , 2 - a r n i n o 一6 一m e t h o x y b e n z o t h i a z o l e ，w h i c hw a sp r e p a r e dp r e v i o u s l y , a n dn a n 0 2w e r em i x e dw i t ha c i ds o l u t i o n a f t e rr e a c t i o n ，t h ed i a z o n i u ms o l u t i o n w a sk e p ts t i r r i n ga n dc o o l i n gi na ni c eb a t h o nt h eo t h e rh a n d ，ac y a n oc o m p l e x s o l u t i o nw a sp r e p a r e df r o mc u c ns u s p e n s i o na n da q u e o u sk c n f i n a l l yi nt h e s u s p e n s i o no ft h ec y a n oc o m p l e xa n dn a h c 0 3 ，t h ec o l dd i a z o n i u ms o l u t i o nw a s a d d e ds l o w l yw i t hv i g o r o u s s t r r i n g a f t e rs u b s t i m t i o n ，a s t h ei n t e r m e d i a t e 2 - c y a n o - 6 - m e t h o x y b e n z o t h i a z o l ew a so b t a i n e di ni d e a ly i e l d t h em e t h o x yi n t e r m e d i a t ea n dp y r i d i n i u mc h l o r i d ew e r eh e a t e di n t om e l t a g e w i t hs t i r r i n gu n d e ran i t r o g e na t m o s p h e r e i nt h es a m et i m e ，d e a l k y l a t i o nw a s h a p p e n e dt og i v et h ei n t e r m e d i a t e2 - c y a n o - - 6 - - h y d r o x y b e n z o t h i a z o l ei nq u i t eh i g h y i e l d t h en i t r i l e c o m p o u n da n dc y s t e i n eh y d r o c h l o r i d em o n o h y d r a t ew e r e d i s s o l v e di nac o m p o s i t es o l v e n to fm e o ha n dw a t e r t ot h er e s u l t i n gs o l u t i o n u n d e ran i t r o g e na t m o s p h e r ek 2 c 0 3w a sa d d e d ，a n dt h em i x t u r ew a ss t i r r e di n d a r k a f t e rt h ea d d i t i o nr e a c t i o ni nt h em o l e c u l e sw a sc o m p l e t e ，t h er a c e m i c m i x t u r eo ff i r e f l yl u c i f e r i nw a sf o r m e di nh i g hy i e l d i na d d i t i o n ，t h r e en e wm e t h o d so fs t e r e o s e l e c t i v er e a c t i o n sw e r ea l s o d e s i g n e dt or e s o l v et h er a c e m i cm i x t u r eo f f i r e f l yl u c i f e r i ns m o o t h l ya n dd i r e c t l y k e yw o r d s ：f i r e f l yl u c i f e r i n ；2 - a m i n o 一6 - m e t h o x y b e n z o t h i a z o l e b i o l u m i n e s e n ts y s t e m ；2 - c y a n o - - 6 - - h y d r o x y b e n z o t h i a z o l e ； 2 - c y a n o - 6 - m e t h o x y b e n z o t h i a z o l e ：r e s o l v et h er a c e m i cm i x t u r e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得 的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘茔或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：王唳雾签字日期：如口5 一年7 月彦日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤生盘茎有关保留、使用学位论文的规 定。特授权墨鲞盘芏可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。 同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：王垮妖 导师签名： 参牟 签字日期：掣哪f 年7 月孑日签字同期：or 年1 月l1 日 第一章文献综述 第一章文献综述 l - 王生物体发光： 1 1 i 生物体发光的定义： 生物体发光( b i o l u m i n e s c e n c e ) 1 _ 【3 】俗称为有生命的光，是化学发光 ( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 反应中的一种特殊的类型。它的具体概念是指具有 生命的有机体为了防御、攻击、伪装或进行交流等目的，而从自身发射出的、 有别于白光的、特殊的可见光。到目前为止，人类在地球上已经发现了3 0 多种不同的生物体发光体系，虽然每种体系在发光原理上比较类似，但具体 的发光体系都由不同的物质所组成。除此以外，人们还发现具有生物体发光 特性的有机生物的物种范围非常，3 泛，例如在原生动物、微生物、细菌、真 菌类、藻类、腔肠动物、软体动物、被囊动物、无脊椎动物、节肢动物和鱼 类等物种内，都存在生物体发光特性的种群，特别是在深海中，几乎每种生 物都可以发光，而这些不同生物有机体所发出的光也是五彩缤纷的，从深紫 罗兰色光到蓝绿色光、蓝色光、绿色光、橘红色光，再到红色光等，各种颜 色的光都有【4 j 。生物体发光的波长范围为4 5 0 7 0 0 纳米，而生物体发光的 能量转化率几乎接近于1 0 0 。 1 1 2 生物体发光体系： 生物本身是因为具有了发光细胞或由发光细胞构成的发光器才会发光 的，因此在专业上发光细胞或由发光细胞构成的发光器就被统称为生物体发 光体系 2 】【5 】 6 1 。 发光细胞是起源于皮肤而又发生了变异和特征化的腺细胞，它能分泌出 荧光素和荧光素酶。生物体发光体系可以分为两种：如果发光细胞内同时含 有荧光素和荧光素酶，则发光可以直接在细胞内进行，此时该体系被称为细 第一章文献综述 胞内发光体系；如果发光细胞内仅含有荧光素或荧光素酶，那么含有荧光素 和荧光素酶的不同发光细胞的各自分泌物相遇反应后，发光过程就能完成， 此类发光体系被称为细胞外发光体系。细胞内发光的生物类群有细菌、单细 胞动物、低等无脊椎动物、萤火虫和某些鱼类；细胞外发光的生物类群有水 母、介形类、高等无脊椎动物和某些鱼类 5 】 6 1 。 还有些发光动物自身不仅具有发光细胞，同时还具有由发光细胞、色素 层、反光层和晶状体所构成的发光器，这种发光器的结构与光感受器( 眼睛) 的结构是相反的。某些樱虾、磷虾、头足类和鱼类等发光类群都具有这种相 当复杂的发光器。 一般情况下，根据生物体发光反应过程中，各种物质所起作用的不同， 我们将参与反应的物质概括为三种类型： 1 、荧光素( 1 u c i f e r i n ) 即反应物( 又称为底物) ：这种物质是指在 发光反应中被氧化为过氧化中问体的小分子物质。 2 、氧即氧化剂：是指在发光反应中起到氧化作用的物质，包括过氧 化氨、氧气以及单线态氧等。 3 、荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 催化剂：它虽不直接参与发光反应，但 在反应过程中却起到媒介和桥梁的作用，这种物质多数是可以起到促进、催 化氧化反应发生的特殊蛋白质。 对于一个发光细胞来说，有机生物在反应时，氧气是从环境中获取再由 细胞连接的气管送入细胞的。而荧光素和荧光素酶就成为构成整个生物体发 光体系的根本物质。对于不同的有机生物体，荧光素和荧光素酶所代表的具 体化学物质是不同的。 1 1 3 常见的生物体发光的底物： 到目前为止，科学家已经从自然界中找到了3 0 多个具有生物体发光能力 的不同有机生物种群 6 1 ，并对它们的发光原理有了一定程度的认识和了解， 但是实际上只有为数不多的几个物种，人类才真正完成了从生物体发光的体 系中分离出有效活性物质，并且确定其分子结构的研究。对于有些物种的发 第章立献综述 胞内发光体系；如果发光细胞内仅含有荧光素或荧光素酶，那么含有荧光素 和荧光素酶的不同发光细胞的各自分泌物相遇反应后，发光过程就能完成， 此类发光体系被称为细胞外发光体系。细胞内发光的牛物类群有细菌、单细 胞动物、低等无脊椎动物、萤火虫和某些鱼类；细胞外发光的生物类群有水 母、介形类、高等无脊椎动物和某些鱼类 5 】【”。 还有些发光动物自身不仅具自发光细胞，同时还具有由发光细胞、色素 层、反光层和晶状体所构成的发光器，这种发光器的结构与光感受器( 眼睛) 的结构是相反的。某些樱虾、磷虫卜、头足类和自类等发光类群都具有这种相 当复杂的发光器。 一般情况f ，根据生物体发光反应过程中，各种物质所起作用的不同， 找们将参与反应的物质概括为三种类型： 1 、荧此囊( 1 u c i f e r i n ) 即反应物( 又称为底物) ：这种物质是指在 发光反应巾被氧化为过氧化中问体的小分子物质。 2 、氧即氧化剂：是指在发光反应巾起到氧化作用的物质包括过氧 化氢、氧气以及单线态氧等。， 3 、荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 催化剂：它虽不直接参与发光反应，但 在反应过程中却起到媒介和桥梁的作用，这种物质多数是可以起到促进、催 化氧化反应发生的特殊蚩白质。 对于一个发光细胞来说，有机牛物在反应时，氧气是从环境中获取再由 细胞连接的气管送入细胞的。而荧光素和荧光素酶就成为构成整个生物体发 光体系的根本物质。对于不同的有机生物体，荧光素和荧光素酶所代表的具 体化学物质是不同的。 1 1 3 常见的生物体发光的底物： 到目前为i ，科学家已经从自然界中找到了3 0 多个具有生物体发光能力 的不同有机生物种群【b j ，井对它们的发光原理有了一定程度的认识和了解， 但是实际上只有为数不多的几个物种，人类才真正完成了从生物体发光的体 系中分离出有效活性物质，并目确定其分子结构的研究。对于有些物种的发 系中分离山有效活性物质，并且确定其分子结构的研究。对于有些物种的发 2 第一章文献综述 光体系，人类仅仅只能够分离出可能的有效成分，但目前的技术还没有办法 确定活性物质的确切分子结构；还有些发光体系，研究人员还是停留在对有 效活性成分分离的工作阶段。近几年来研究最彻底、得到最广泛实际应用的 生物发光体系有五种，基于荧光素酶属于功能蛋白质，结构十分复杂，所以 在本文中，只简要的列举出了这五种常见生物发光体的荧光素的分子结构及 其特征【6 】： l 、腰鞭毛虫荧光素( d i n o f l a g e l l a t el u c i f e r i n ) ：此种荧光素( 结构 见图1 1 ) 在g o n y a u l a x 类物种的发光体系中较为常见。特征：这种荧光素 是叶绿素的一种衍生物，它具有与叶绿素非常相似的化学结构。在对发光机 理进行研究时发现：当细胞为碱性( p h = 8 ) 时，荧光素分子与荧光素酶结 合形成了一种“荧光素一捆绑蛋白”，形成了荧光素分子保护体，导致发光细 胞失去活性；当细胞为酸性( p h 值小于6 ) 时，荧光素就会转化为游离态， 开始进行生物化学反应，最终产生生物体光。 2 、细菌荧光素( b a c t e r i a ll u c i f e r i n ) ：这种荧光素( 结构见图1 1 ) 存在于可发光的细菌以及一些短尾乌贼、鱼类的生物发光体系中。特征：这 种荧光素是一种被还原了的磷酸核黄素衍生物，它可以经过氧化反应，完成 与乙醛、氧气和荧光素酶等物质的结合，生成长链型化合物。 3 、腔肠动物荧光素( c o e l e n t e r a z i n e ) ：这种荧光素( 结构见图1 1 ) 是一种常见的海洋生物荧光素，除此以外在放射虫、栉水母、桡脚类动物以 及毛颚类动物的发光系统中也可以找到。特征：荧光素分子构成的荧光素一 荧光素酶体系可以构成发光蛋白质( a e q u o r i n ) 的发光器。 4 、介形亚纲动物荧光素( v a r g u l i n ) ：这种荧光素( 结构见图1 1 ) 存 在于介形亚纲动物、m i d s h i p m a n 鱼类以及p o r i c t h y 类生物的发光体系中。 特征：这种荧光素可以在一条已明确食物生态链的各发光物种间传递。给该 食物生态链中，某一本已失去生物体发光能力的动物喂食这种荧光素相关食 物，可以使这种动物重新恢复发光能力。 5 、萤火虫荧光素( f i r e f l yl u c i f e r i n ) ：这种荧光素( 结构见图1 1 ) 存在于萤火虫的发光细胞中。特征：萤火虫荧光素荧光素酶生物体发光体 系发光反应的启动，依赖于一种不可缺少的影响因子一三磷酸腺苷( a t p ) 。 第一章文献综述 即a t p 萤火虫体系发光反应的直接能量来源。 n a 0 2 c o d i n o f l a g e l l a t el u c i f e r i n b a c t e r i a ll u c i f e r i n c o e l e n t e r a z i n e v a r g u l i n m 取心一 f i r e f l yl u e i f e r i n 图1 1 五种常见生物发光体的荧光素分子结构 1 2 萤火虫的生物体发光体系： 衬v n h ： n h 1 2 1 萤火虫的发光机制： 在萤火虫腹部的第六节和第七节之间，生长着发光器官，里边有着成千 上万个发光细胞，在这些发光细胞的周围密布着许多的小气管以及密密麻麻 的纤细神经分支。发光细胞内部含有的主要物质就是荧光素和荧光素酶【j 一j 1 4 】。荧光素酶是一种功能性的蛋白质，它可以将一分子三磷酸腺苷与一个镁 离子形成的络合物a t p m g “分解，生成一分子的一磷酸腺苷( a m p ) 和一 分子的二磷酸镁盐( p p i ) 。与此同时，由于发光系统的底物一荧光素自身含 有羧基( c o o h ) ，在荧光素酶的催化作用下，促进分解产物a m p 和底物荧 第一章文献综述 光素的羧基完成结合，生成荧光素的羧酸酯衍生物。萤火虫活动时，随着呼 吸频率的加快，体内从环境吸入了大量的氧气，部分氧气通过小气管直接进 入发光细胞内部，与荧光素的羧酸酯衍生物的接触，使a m p 一荧光素羧酸酯 发生氧化分解反应，在释放出a m p 的同时，一并生成荧光素的羧基过氧化物； 这种羧基过氧化物很不稳定，可以自发地发生分解反应，生成二氧化碳和荧 光素的羰基( c o ) 衍生物；该衍生物羰基的氧原予上有处于激发态的电子， 随着激发态电子跃迁回基态，多余的能量以光量子的形式释放到细胞中，从 而最终导致萤火虫的腹下发出碧莹莹的亮光。同时由于萤火虫不同的呼吸节 律，便形成时明时暗的”闪光信号”。萤火虫的发光机制可以用反应图1 2 表 述出来： 啪众1 3 hc o o h 筹 血d 矽l u c i f e r i n o o a m p l u c i f e r y l - a m p 书带已一爷辑单 对弋斗 图1 2 萤火虫发光机理 l i g h t 除了上面所讲述的萤火虫发光机理以外，还有两点需要特别说明： 1 萤火虫的荧光素酶是具有一个多肽链的单节显性蛋白质，但它由两个 轮廓清晰可见的域组成，并且在两个域中间有一道裂缝。研究表明，在这两 个域上，都存在发光反应的残余物，因此荧光素酶的两个域都参与了发光反 第一章文献综述 应。研究同时发现，在常态下，两个域之问的距离过大，很难同时催化反应 的发生，但是当荧光素和a t p m 9 2 + 的络合物进入两个域中间的裂缝，成为 发光体系的底物时，荧光素酶的两个域会同时发生相互靠近的移动，并且合 拢在一起。由此可见，a t p 在萤火虫生物体发光的过程中起者重要的作用。 2 最近研究发现，分布在萤火虫呼吸道上的细胞能够合成一氧化氮气 体，而来自大脑的信号可以控制细胞进行一氧化氮的合成与释放。一氧化氮 的释放能够导致线粒体细胞结构出现短暂地关闭，在关闭的同时产生一个氧 脉冲，这种氧脉冲将会引发另外一个发光细胞中的荧光素酶，从而打开萤火 虫生物体发光反应的进程。最使人惊讶的是，整个闵光过程全部是在干分之 一秒内完成。而一氧化氮气体的释放就成为了“萤火虫生物灯”的开关。 1 2 2 萤火虫的生物体发光体系的研究发展历史【1 0 】_ 1 5 ： 夺1 6 4 7 年，t h o m a sb a r t h o l i n 首次在书中提出了生物体发光的概念。 冷1 8 8 5 年，r a p h a e ld u b o i s 首先证明整个生物体发光体系是由三种物 质所构成，它们分别为：荧光素、荧光素酶和氧分子。 夺1 9 3 6 年d e s t r i a n s 通过对萤火虫进行的一系列研究实验，最早发现了电 激发光现象。 夺1 9 6 0 年，m c e i r o 和s e l i g e r 首先从一种美国萤火虫( p h o t i n u sp y r a l i s ) 体内，分离得到了荧光素和荧光素酶的纯物质，并确定了它们各自的晶体 结构。 夺同时，e d w i na c h a n d r o s s 正在试图解释生物体发光的反应机制，而 萤火虫生物体发光的真正反应机制由l l o y d 在同年发现。 夺2 0 0 1 年6 月p a | t r i m e 等人证实一氧化氮是萤火虫控制自身生物体发 光的关键物质。 夺2 0 0 2 年7 月吴若萍等人发现荧光素酶基因可以用来”点亮”活老鼠体内的 前列腺癌细胞。通过该技术锁定癌细胞，再通过p l r 技术将含有细胞毒 性的治疗基因附在荧光素酶基因上，这样可直接杀死癌细胞，而不会伤及 到其它的健康细胞。 6 第一章文献综述 夺2 0 0 4 年1 1 月我国已经拥有了在萤火虫荧光素酶技术方面的自主知识产 权。由这项技术生产的萤火虫荧光素酶制剂，质量和使用效果与国际同类 产品相当，并且可以用于批量生产。 1 2 3 萤火虫的生物体发光体系的应用 1 5 】_ 2 9 】： 在初步认识与了解萤火虫的发光机制后，生物体发光体系的冷光特性成 为研究重点，并且很快研究成果转化成了产品：a 、萤火虫的生物体发光是一 种非常高能效的发光体系，它可以将反应中产生的能量9 8 转化为光，而仅 有少许能量以热量形式放出，对比白炽灯( 1 0 的能量用于发光，其它9 0 则以热的形式浪费) 的发光效率，使得利用冷光原理研发的新型节能灯很快 得到普及应用；a 、人们利用生物体发冷光，但不会产生明火的特点，在矿井 和易爆危险品仓库中，普遍都使用了冷光照明灯，这样可以避免由于瓦斯、 甲烷等易燃危险气体遇火燃烧，发生爆炸：c 、军事人员还利用生物体发冷光， 但不会产生磁场效应的特点，在水下扫雷中采用冷光照明，这样可以避免电 灯产生的电磁干扰对检测的影响；同时在军事侦察时，也可以把产生冷光的 物质涂抹在手掌中，这样在黑暗中，侦察兵可以利用“手灯”查地图、看文 件，而不会轻易被敌人发现。 利用分离器将荧光素和荧光酶从发光生物体中分离提取出来，再根据人 工方法对生物光加以控制，培养出可以发光的细菌，荧光闪闪的“细菌灯”就 由此制造成功。 随着研究的不断深入，科学家发现，萤火虫生物体发光体系对a t p 十分 敏感，而且生物体中a t p 浓度与光的亮度成正比关系。人们利用这个新发现 设计出一种可以用来进行a t p 含量检测的分析工具。在临床医疗、生命科学 研究以及食品卫生检测和环境监测分析等方面得到了广泛的应用： 临床医疗方面：由于正常细胞与癌细胞对荧光物质产生的反应效果不同， 利用生物发光技术可以有效地检测出癌细胞的具体位置和范围；通过放大这 种差异，现在荧光检测技术已经可以应用于心脏疾病、肌肉营养失调等疾病 的研究。 第一章文献综述 生命科学研究方面：十亿分之一克的a t p 在荧光素酶的作用下就可以使 荧光素发出荧光。因此，利用这种高灵敏性的荧光素酶一荧光素等物质制成 ”生物探测器”已经飞入太空，通过它，科学家可以轻松的了解到未知区域中 是否有生命的存在。因为只要存在生命，无论是大体型还是小体型，甚至是 微生物，体内必然含有a 丁p 物质。只要利用”生物探测器”进行检测，如果它 可以发射出荧光，就能够快速准确地发现生命的痕迹，科学家甚至还可以根 据荧光的强弱得到更多的生命信息，因此利用”生物探测器”是一个巧妙的方 法。将萤火虫的荧光素酶基因转录到植物的基因中，这种新颖的尝试使得这 些实验植物的根茎和叶枝都可以在黑暗中c ；j 着神奇的荧光。将来的某一天， 在照明系统中，也许我们可以使用这些新一代“生物灯”。 食品卫生检测和环境监测分析方面：利用a t p 浓度与细菌浓度的相对关 系，运用荧光探测技术，检测人员可在几秒内检测出食品中导致污染的微生 物数量，从而可以实现食品卫生微生物的现场检测监督。 从2 0 世纪9 0 年代中期开始，生物体发光体系的研究有了更新的进展。 许多研究团体都证实：他们利用生物体发光体系可以产生光量子的原理，尝 试将荧光索酶一荧光素一氧气导入溶液中，从而产生活性氧原子。人们希望 可以利用这种活性氧杀灭病毒，并由此研制出安全经济的杀灭病毒新装置。 最近几年，萤火虫生物体发光原理在医药学领域中的使用得到了长足的 发展： 眼底荧光血管造影法( f l u o r e s c e n c ef u n d u sa n g j o g r a p h y ) ：是 将能产生荧光效应的染料快速注入血管，应用加有滤色片的眼底镜或眼底照 相机进行观察或照像的一种检查法。由于染料随血流运行时可动态地勾划出 血管的形态，加上荧光现象，可以有效的提高血管结构的对比度以及可见性， 更可以帮助医生辨认出眼睛组织中某部分血管的细微变化，以及脉络膜和 视网膜的供血途径和血管形态的差异；利用荧光眼底照相机的连续拍照，使 眼底检查结果更客观、更准确和更动态，从而为临床诊断、治疗、疗效观察、 愈后评价以及探讨发病机理等提供有价值的依据。 报告基因( r e p o r t e rg e n e ) ：是指将荧光素酶的基因直接植入某些特 定的基因内部，形成种在生物体内可以“报告”状态和位置的基因。报告 第一章文献综述 基因进入生物体内后，报告基因首先会以某种蛋白质的形式表达出来，因此 荧光素酶的基因自然也会随之得以表达，研究人员可以确认出报告基因中特 定基因的表达形态和作用位点，因此这种发光的”报告基因”可以帮助人们揭 开遗传密码的奥秘、治疗药物的作用靶向以及大分子基因药物的分布、表达 等情况。 1 3 已有合成方法： 目前，已经报导的萤火虫荧光素的合成方法主要有以下四种： 1 3 1w h i t e 合成路线 8 1 9 】= 1 9 6 3 年，w h i l e 等人经过8 步反应完成萤火虫荧光素的合成( 见图 1 3 ) 。反应的总产率为5 8 。 m 。m + h h h d 葑r 。 m e o m abc d m 气。 f 9 e n 厂c 、n , oh g g 第一章文献综述 n n 芦- c n s 厂、 一= ，h c l h ho f 仃v 孓s c n m n 一一c o o h h j j 图1 3 萤火虫荧光素的合成路线一 原料对甲氧基苯胺a 首先与草酸二乙酯b 反应生成产物c ，在五硫化二 磷的作用下得到化合物d ，随后赤血盐氧化羧酸衍生物d 进行关环脱水反应 得到产物e ，接着脱水产物e 依次进行酯化、氨化、脱水等反应得到产物h ， h 在吡啶氯化氢盐中加热发生脱烷基化反应得到中间体i ，i 再与半胱氨酸发 生反应得到目标产物j 。 同年，s e t o 等人经过5 步反应合成了萤火虫荧光素( 见图1 4 ) 。反应 的总产率为6 5 。 p m + 一c 孓c 气丫h 一2 絮戳。0 n v 、sr n h ：气。胁c n d 1 0 e 叫哪 一 o 一 c 一 一 h 、 ，一 、 ， 一 n 雕一 2 j 1 一h 翌 第一章文献综述 h o f 叫了篇咀。 y 0 0 h g 图1 4 萤火虫荧光素的合成路线二 原料对甲氧基苯胺a 首先与氨甲酰硫代羰基硫代乙酸b 反应生成氨甲酰 硫代羰基对甲氧基苯胺c ，产物c 在赤血盐的作用下得到化合物d ，随后三氯 氧磷使氧化羧酸衍生物d 进行关环脱水反应得到2 - 氰基一6 甲氧基苯并噻唑 e ，接着脱水产物e 在吡啶盐酸盐的作用下得到衍生物f ，化合物f 与半胱氨 酸发生反应得到目标产物g 。 1 3 3w h i t e 合成路线改进 3 1 ： 1 9 6 5 年，w h i t e 等人经过对原有方法的改进，利用4 步反应完成了萤 火虫荧光素的合成( 见图1 5 ) 。反应的总产率为2 1 。 m e 0 a 吗黑崴。o n l 2 - 孓s c n 卜c 1 s b 私 c n d 第一章文献综述 hy 0 0 h e 图i 5 萤火虫荧光素的合成路线三 2 一氨基- 6 一甲氧基苯并噻唑a 与亚硝酸生成重氮盐后，进行氯取代反应， 生成2 - 氯代一6 一甲氧基苯并噻唑b ，氯代衍生物b 在吡啶氯化氢盐作用下反 应得到产物c ，f i ，f q 体c 与氰化钾发生氰基取代反应得到中间体d ，化合物d 与半胱氨酸发生反应得到荧光素e 。 1 3 4y o s h i a k i 合成路线 3 2 】： 1 9 6 5 年，y o s h i a k i 等人利用3 步反应完成了萤火虫荧光素的合成( 见 图1 6 ) 。反应的总产率为3 4 7 。 m 。胁茂。旺 c n a 鱼之。旺 c h 2 n - - , - c o o h n h r j h c l h 2 0 - - - c n 堕! ： 一h 。删丁佣 图1 6 萤火虫荧光素的合成路线四 第一章文献综述 2 - 氨基一6 一甲氧基苯并噻唑a 与亚硝酸在酸性条件下反应，生成重氮盐后 直接进行氰化取代反应生成2 一氰基一6 一甲氧基苯并噻唑b ，氰基衍生物b 与 吡啶氯化氢盐发生反应得到中问体c ，化合物c 与半胱氨酸发生反应得到荧光 素d 。 1 4 文献总结： 通过文献的查阅总结，发现萤火虫的生物体发光体系具有十分广阔的应 用前景，同时荧光素酶的“克隆”生成技术已经受到了世界各国科技工作者 们相当程度的重视。特别是在我国，作为8 6 3 国家基金项目，荧光素酶的“克 隆”生成制剂技术的研究已经取得了相当程度的进步，未来国家自主生产荧 光素酶的前景乐观。但同样是萤火虫发光体系要素之一的荧光紊却极不容易 获得，如果依靠生物提取，提取质量仅仅相当于一张普通邮票那么重的荧光 素，就需杀死3 3 万只萤火虫，这迫使我们寻找荧光素的人工合成路线，但 是到目前为止，人们合成荧光紊所使用的方法大多数是都是通过生物化学法， 这种合成方法的造价很高，而且很难进行工业大批量生产，现在荧光素的生 产技术还无法满足大面积普及使用的要求。只有找到适合于工业化生产的荧 光素合成技术，降低生产成本，才会使萤火虫的生物体发光体系的相关技术 得到全面利用。因此，本文在已有合成基础上，探索了一条适合于工业生产 的荧光素的新合成方法。 第二章目标化合物的合成策略 第二章目标化合物的合成策略 2 1 目标化合物的确定： 本文的最终目标为：在对已有的萤火虫荧光素的合成方法进行查阅、研 究、总结的基础上，设计一条新的合成方法，并且通过实验，对设计路线中 各步反应的合成技术、反应条件进行优化，使它适合于现有技术水平下的工 业化生产。因此本文最终的目标化合物应该为萤火虫的荧光素。 文献的检索结果显示 8 】【9 】 3 0 _ 【3 2 】：在这种萤火虫荧光素的结构中，含有 一个手性碳( c 术) ( 见图2 1 ) ，而使得该荧光素具有一定的光学活性。从自 然界中分离提取得到的萤火虫荧光素纯物质，经过测定其旋光性，可以确定 其立体构型为d 一荧光素。因此在对合成方法进行研究的过程中，根据有机合 成路线设计的基本原理，在常规的情况下：一般都需要依靠原料d - 半胱氨酸 盐酸盐，在最后一步的合成反应中，将立体构型引入最终产物。 队八v - n s s j o o h 州筛叫 i h c l * h 2 0 h s j f i r e f l yd - l u c i f e r i n d - c y s t e i n e 图2 id 一萤火虫荧光素手性碳的引入 另一方面，经过对目前国内化学原料试剂供应市场的反复调研，我们发 现：因为混旋型的半胱氨酸盐酸盐的分子量小、结构共轭弱，不利于手性拆 分和检验工作的完成；又因为一般的生物提取物都为l _ 构型，所以d - 半胱氨 酸盐酸盐没有找到供应渠道，但是混旋型的半胱氨酸盐酸盐供应渠道多、易 得而且价格便宜。 由于上述情况，我们只能一边利用可以得到的混旋型的半胱氨酸盐酸盐， 第二章目标化合物的合成策略 进行合成路线的研究与实验；一边考虑混旋型的拆分方法。因此，我们决定 暂时将混旋型的萤火虫荧光素( 即f i r e f l yd l - l u c i f e r i n ) ，设定为本文研究的 目标化合物( 见图3 2 ) 。 h 2 n , , , 丫c o o h lh c i h 2 0 h s c o o h c y s t e i n en r e n yd l - l u c i f e r i n 图2 2 目标化合物混旋型荧光素的没定 2 2 目标化合物的合成路线确定： 文献报道的四种途径在理论上都有一定的可行性，但在实际上哪种方法 最好，产率最高，以及最适合工业生产，都需要进行探索与比较。 合成路线一( 见图1 3 ) ：由于其原料氨甲酰硫代羰基硫代乙酸在国内没 有生产；原料的稳定性差，无法进行保存，必须随用随制备，而且它的工业 化生产具有一定的危险性。该原料为整个合成路线的起始原料，对于整个合 成工艺影响极大，所以暂时不予以考虑。 合成路线二( 见图1 4 ) 有以下几个不利因素：1 、第一步反应容易产生 副产物，导致实际产率只有6 6 7 5 ( 具体操作方法见3 3 5 ) ；2 、反应 原料草酸二乙酯含水量大，又因为水会对反应结果产生影响，所以草酸二乙 酯必须先通过干燥、纯化后才可以加以使用。3 、在第二步反应中需要用至0 试 剂五硫化二磷，它自身可以发生水解反应，释放出硫化氢气体；而且在该步 反应中也会产生乙基硫负离子，这两点都会导致对环境的破坏与污染，致使 合成工艺在工业化不容易采纳使用；4 、因为第二步反应的生产原料与反应产 物的化学性质相似、分子极性相同，使得反应终点不易控制，也不利于工业 化；5 、整个合成路线步骤较多，很难提高总产率。由于验证初期出现的上述 因素，本文将合成路线二定为次选，不再加以考虑。 合成路线三( 见图1 5 ) 和路线四( 见图1 6 ) ，整体反应的实质是相似 第二章目标化合物的合成策略 的，所不同的仅是合成路线四将部分反应进行了合并。考虑到反应合并可以 节省反应与处理中所花费的操作时间，同时还可以在一定的程度上提高反应 的产率，因此选择合成路线四作为优先考虑。 经过上述比较与验证，本文选择合成路线四，作为本次实验研究的首选 合成路线。 2 3中间体2 一氨基- 6 - 甲氧基苯并噻唑合成路线确定： 2 一氨基一6 一甲氧基苯并噻唑可以利用对甲氧基苯胺为起始原料，经过两种 不同的合成路径( 见图2 3 ) 制备出来 3 1 】 3 3 ： 合成路径l ： m e 0 合成路径2 ： m 。d 删2 掣挚m 。胁 图2 32 - 氨基- 6 一甲氧基苯并噻唑的合成路径 考虑到合成工艺的简化和产率的提高，本文以合成路线2 作为首选。 2 4 合成路线总结： 综上所述本文设定：以对甲氧基苯胺作为起始原料，经过4 步反应合成 目标化合物混旋型萤火虫荧光素的新型合成路线，具体合成步骤见图2 - 4 所示： 1 6 第二章目标化合物的合成策略 n h d s c n b r v - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - c h s c o o h 舡 器悯脏c n 佥兰 h o h n n 、f c o o h h j 图2 4 本课题设计的目标化合物合成路线 在随后的探索研究中，将针对目标化合物的整个合成途径，进行每一步 反应的逐个摸索与研究。希望通过实际研究与实验，对包括获得较高的总产 率，以及每步反应所需要的最佳原料配比和最优反应条件等诸多方面的问题 进行综合考虑与验证，从而找到一条较为合理的工业生产工艺。 第三章实验部分 第三章实验部分 3 1 主要的原料与试剂： 实验中所用到的所有无水试剂均用氢化钙加以干燥处理，所用原料与试 剂主要来源及规格见表3 一l 。 表3 1原料与试剂主要来源及规格 1 8 第三章实验部分 3 2 ：主要的分析仪器： 核磁共振仪器：b r u k e ra v 4 0 0 ； 熔点仪：y r t - 3 型药物熔点仪( 天津大学精密仪器厂) t l c 薄层色谱分析：g f 2 5 4 ( 山东烟台源博硅胶厂) ； 硅胶：2 0 0 - 3 0 0 目( 山东烟台源博硅胶厂) 。 第三章实验部分 3 3 实验操作： 3 3 1 2 - 氨基一6 一甲氧基苯并噻唑( 3 - 1 ) 的合成： 反应方程式如下所示： mq m ( 3 - i ) 加入浓度为9 6 的醋酸水溶液( 2 8 8 m l ) ，并用冰水浴冷却至o 。继 续保持冰浴冷却，将对甲氧基苯胺( 1 9 6 8 9 ，0 1 6 m o i ) 分i 0 次缓慢加入 溶液中，每次投入固体必须在前一次加入固体完全溶解后进行。对甲基苯胺 固体全部溶解后，加入硫氰酸钠( 5 2 3 9 ，0 6 4 m o i ) 固体，同时持续搅拌 直至悬浮物全部溶解形成溶液。另一方面，先将液态溴( 8 1 6 m l ，0 1 6 m o i ) 在搅拌下，注入1 0 0 的冰醋酸( 1 2 0m l ) 中。然后滴加到混合溶液中， 注意控制滴加速度，确保反应体系的温度始终低于3 0x 3 ，随着滴加的进行， 有一些白色固体生成。约1 个小时滴加完毕，在持续搅拌的条件下，自然升 温至室温( 约2 5 ) 。然后反应继续大约1 0 小时，用碳酸钠中和后的反应样 液t l c ( 5 0 乙酸乙酯：石油醚) 分析显示原料点全部消失，则反应结束。 将反应混合液过滤，滤渣用水( 5 0m l 3 次) 进行洗涤。合并滤液和洗 液，并在冰水冷浴的冷却下，用氨水进行中和。滴加调节至p h = 7 的过程中， 有大量固体析出。过滤收集固体，并用水( 3 0m l 3 次) 进行洗涤。最 终干燥后，得到产物( 3 - i ) 的固体2 5 8 4 克，熔点为1 5 8 1 6 1 3 4 】，收 率为8 9 7 。 化合物无须经过进一步的纯化，就可以直接参与下一步反应。它的 1 h - n m r 谱图见附图3 。( c d c l 3 ) ：6 = 3 8 0 3 ( 3 h ，s ) ，5 1 1 2 ( 2 h ，b s ) ， 6 8 8 9 ( 1 h ，d d ，j = 9 0 ，2 ，4 h z ) ，7 i i i ( i h ，d ，】= 2 4 h z ) ，7 4 2 6 ( 1 h ，d ，】= 9 0 h z ) 。 第三章实验部分 3 3 22 一氰基一6 一甲氧基苯并噻唑( 3 - 3 ) 的合成： 3 3 2 16 - 甲氧基苯并噻唑- 2 - 重氮盐( 3 - 2 ) 的制备