（海洋生物学专业论文）腹泻性贝毒软海锦酸快速免疫检测技术研究.pdf

1 删嶝燃】 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论义，是奉人在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除义中已经明确注明和引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：柳1 堡侈 e t 期：7 年7 月2 - 。e t 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论义的复印件和电子版，允许论义被查阅或借阅。 本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：辛：呷f 塾秀 ，指导教师签名：彳么砌 日期：j 1 6 年7 月厶日日期：- 9 年7 月2 ，日 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 马家海上海海洋大学教授主席 王全喜上海师范大学教授委员 严兴洪上海海洋大学教授委员 委员 委员 委员 委员 贾睿上海海洋大学副教授秘书 上海海洋大学 2 0 1 0 年 答辩地点水产与生命学院答辩日期 6 月1 2 日 b 4 3 5 腹泻性贝毒软海绵酸快速免疫检测技术研究 摘要 腹泻性贝毒( d i a r r l l e t i cs h e l l f i s h p o i s o n i n g ，d s p ) 是由有毒赤潮藻鳍藻属和原 甲藻属产生的一类脂溶性多环醚类生物活性物质，主要成分是软海绵酸( o k a d a i c a c i d ，o a ) 及其衍生物。腹泻性贝毒可在贝类等滤食性动物体内富集，因而危害 食用者健康。近年来关于腹泻性贝毒的事件在我国均有报道。腹泻性贝毒的主要 检测分析方法有生物毒性法、液相色谱法以及免疫化学法。本研究采用碳二亚胺 方法合成了软海绵酸与蛋白载体的偶联物，分别用作免疫抗原和包被抗原。通过 免疫b a l b c d 、鼠，利用细胞融合技术，制各了抗软海绵酸的单克隆抗体，建立了软 海绵酸的间接竞争酶联免疫检测技术和胶体金标记免疫层析检测技术。结果表明： 用抗o a 单克隆抗体建立的间接竞争酶联免疫检测方法，最低检出限为0 4 5 n g m l ， 灵敏度为2 5 9n g r r a ，平均回收率为9 2 0 4 ，平均变异系数为3 5 2 。用抗o a 单克 隆抗体建立的胶体金标记免疫层析快速检测方法，检测时间为3 5 m i n ，检出限为 2 5 n g m l 。本研究建立的酶联免疫检测方法和胶体金标记免疫层析检测方法完全可 以满足国家规定的检测贝类中软海绵酸2 0 1 t g 1 0 0 9 贝肉的安全阈值，也为我国有毒 赤潮腹泻性贝毒的监测与食品安全检验提供了技术基础和快速检测产品。 层析 关键词：腹泻性贝毒，软海绵酸，单克隆抗体，酶联免疫吸附，胶体金免疫 t h e s t u d yo n e s t a b l i s h m e n to ff a s td e t e c t i o nm e t h o dw i t h m c a b - b a s e dl m m u n o a s s a yt e c h n o l o g yf o rd e t e c t i n g o k a d a i ca c i di nd i a r r l i e t i cs h e l l f i s h a b s t r a c t d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ( d s p ) i sal i p o p h i l i cm a r i n ea l g a lt o x i n , w h i c h w a sl a t e rf o u n dt ob ei d e n t i c a lt ot h et o x i ni s o l a t e df r o mt h ed i n o f l a g e l l a t e sg e n u s p r o r o c e n t r u ma n dd i n o p h y s i s o k a d a i ca c i d( o a )i so n eo ft h em a i nt o x i n s r e s p o n s i b l ef o rd i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ( d s p ) ，at e r mu s e dt od e s c r i b et h er a p i d o n s e to fg a s t r o i n t e s t i n a ls y m p t o m ss u c ha sv o m i t i n ga n dd i a r r h e ai np e o p l ew h oh a v e c o n s u m e dt o x i cs h e l l f i s h a d d i t i o n a l l y ，o ac o u l dp o t e n t i a l l ya i di nt u m o u rp r o m o t i o n d s pa r em a i n l ya n a l y z e db ym o u s eb i o a s s a y ，h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n ds o m ei m m u n o l o g i c a lm e t h o d s ， i nt h i sp a p e r ，am c a b - b a s e di n d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( i d c e l i s a ) a n d a ni m m u n o g o l da s s a ym e t h o dw e r ee s t a b l i s h e df o rd e t e c t i o n o fo a o aw a sc o n j u g a t e dt ob o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) f o ru s ea sa ni m m u n o g e n , a n dt h em o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s to aw a sr a i s e dw i t hb a l b cf e m a l em i c e t h e ， h y b r i d o m ac e l l sf u s e db e t w e e ns p l e e nc e l l sf r o mi m m u n i z e dm o u s ea n dm y e l o m ac e l l s ( s p 2 0 ) w e r ep r e p a r e da n di n j e c t e dm i c ei n t r a p e r i t o n e a l l yt op r o d u c em o n o c l o n a l a n t i b o d yi nt h ea s c i t e sf l u i d w i t ht h em o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s to a t h ei d c _ e l i s a f o rd e t e c t i n go aw a se s t a b l i s h e d ，n l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec a l i b r a t i o nc u r v ef o ro a h a dg o o dl i n e a r i t yo v e rt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f0 312 5 5 0 n g r r a a n dt h ed e t e c t i o n a s s a yl i m i tf o ro aw a s0 4 5 n g m 1 t h ea v e r a g er e c o v e r yo fs a m p l eb e 崦a d d e do a w a s9 2 0 4 w i t ham e a nc o e f f i c i e n to f v a r i a t i o no f 3 5 2 o na b o v eb a s i s ，t h em e t h o df o rf a s td e t e c t i n go aw i t hg o l d l a b e l e di m m u n o l o g y t e s t i n gt e c h n o l o g yw a se s t a b l i s h e d ，a n dt h et e s ts t r i pf o rd e t e c t i n go aw a sp r o d u c e d i t w a st h ef i r s tt i m et oe s t a b l i s ht h eg o l d - l a b e l e di m m u n o l o g yt e s t i n gm e t h o d ，a n dt h e m e t h o dw a se a s ya n df a s t ( 3 - 5m i n u t e s ) t h el i m i td e t e c t i o nr e a c h e da t2 5n g r r l l t h ef o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n ( f d a ) o ft h eu n i t e ds t a t e sh a sp r o p o s e da m a x i m u ml i m i tf o ro ai ns h e l l f i s hm e a to f0 2m g l i ne u r o p e a nu n i o nc o u n t r i e s ，a n i d e a la s s a ys h o u l di n d i c a t eap o s i t i v er e s u l ta to ra b o v ear e g u l a t o r yl i m i to fa r o u n d 0 2 0 6m go ap e rko ft i s s u ea n dac l e a rn e g a t i v eb e l o wt h i sc o n c e n t r a t i o n i nc h i n a , t h em a x i m u ml i m i t sf o ro ai ns h e l l f i s hm e a ti s2 0 i t g 10 0 9 t h e r e f o r et h et w od e t e c t i o n m e t h o d sh a v eg r e a ta p p l i e dv a l u ei no ad e t e c t i o ne s p e c i a l l yi nf o o ds a f e t yf i e l d k e yw o r d s ：d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n ( d s p ) ，o k a d m ca c i d ( o a ) ；a n t i b o d y , e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，c o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h y i l 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i 弓l 言l 第一章抗软海绵酸单克隆抗体的制备与鉴定6 1 材料与方法6 1 1 试剂及仪器设备6 1 2 抗原制备与免疫抗原鉴定一7 1 3 免疫小鼠7 1 4 多抗特异性鉴定7 1 5 细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选8 1 6 单抗的生产与纯化8 2 结果9 2 1 免疫抗原偶联效果9 2 2 免疫鼠抗体产生与效价检测9 2 3 多抗特异性鉴定1 0 2 4 单抗制备、筛选与鉴定1 0 ，3 讨论1l 4d 、结1 1 第二章软海绵酸间接竞争酶联免疫学检测方法的建立1 3 1 材料与方法1 3 1 1 试剂及仪器设备1 3 1 2 棋盘法确定抗原、抗体最适工作浓度1 3 1 3o a 稀释液中甲醇浓度对i d c - e l i s a 的影响1 4 1 3 1 阴性对照实验( 即不加0 a ) 1 4 1 3 2 阳性对照实验( 即加0 a ) 1 4 1 4 一抗、二抗反应时间对o a 间接竞争抑制i d c e l i s a 的影响1 4 u i 1 4 1 不加o a 时，初步确定一抗、二抗反应时间 1 4 1 4 2 加o a 时，选择最佳一抗、二抗反应时间1 4 1 50 a 间接竞争i d c - e l i s a 标准曲线的获得1 4 1 6o a 间接竞争i c d - e l i s a 的特异性分析1 4 1 7 样品模拟提取与加标回收1 5 1 8 精密度测定1 5 1 9 贝类染毒提取及检测1 5 1 9 1 前期处理1 5 1 9 2 蛤蜊样品的处理1 5 1 1 0 十算o o qo l 二1 6 2 结果1 6 2 1 包被抗原和单抗最适工作浓度的确定0 oo o00 1 6 2 2o a 稀释液中甲醇浓度对i d c e l i s a 的影响1 6 2 3 抗体反应时间对i d c e l i s a 的影响1 7 2 4o a 间接竞争i d c - e l i s a 方法的检测步骤1 8 2 5o a 间接竞争i d c - e l i s a 标准曲线1 9 2 6i d c - e l i s h 的特异性( 交叉反应) 分析2 0 2 7o a 加标回收率与样品精密度测定结果2 1 2 8 染毒贝类检测2 l 3 寸论2 2 4 小结2 3 第三章软海绵酸胶体金免疫快速检测技术与产品制备2 4 1 材料与方法2 4 1 1 试剂及仪器设备o oog 2 4 1 2 胶体金的制备9 4 1 3 单克隆抗o a 抗体的纯化2 5 1 4 盐析抗体的定量2 5 1 5 胶体金对单抗的标记o o oo oo o 1 o i 2 5 i v 1 6 金标记单抗浓度的确定2 5 1 7 金标鼠抗o a 单克隆抗体包被量的确定2 5 1 8 检测线( t ) 工作液浓度的确定2 5 1 9 控制线( c ) 工作液浓度的确定2 5 1 10 反应时间的确定2 6 1 1 1 灵敏度的检测2 6 1 1 2 胶体金试纸条的实际应用2 6 2结果2 6 2 1 胶体金颗粒大小确定2 6 2 2 金标单抗浓度的确定：2 7 2 3 金标鼠抗o a 单克隆抗体包被量的确定2 7 2 4 检测线( t ) 和控制线( c ) 的工作液浓度2 8 2 5 反应时间2 9 2 6 灵敏度2 9 2 7 加标贝肉的胶体金试纸条检测3 0 2 8 染毒贝类的胶体金检测3 1 2 9o a 胶体金免疫层析快速检测卡的3 l 2 9 1 工艺流程3 2 2 9 2 使用方法3 2 2 9 3 保存和有效期3 3 3i 寸论3 3 4d 、结3 4 结论3 5 参考文献3 6 论文发表4 3 致谢4 4 v 己l喜 jl 口 1 赤潮及其危害 赤潮( r e d t i d e ) 是指海洋中一些藻类或微型生物在一定环境下暴发性增殖或 聚集达到某一水甲，引起海水颜色变化或其它海洋环境异常，并对海洋中其他生 物产生危害，如引起鱼虾贝的死亡或在海洋生物体内蓄积毒素，最终对摄食这些 有毒种类的其他生物包括人类产生毒害作用的一种生态异常现象。赤潮生物包括 浮游生物、原生动物和细菌等，其中有毒赤潮生物以甲藻居多，其次为硅藻、绿 色鞭毛藻、定鞭藻和原生动物等。近年来我国河口、内湾和沿岸水域污染不断加 剧，水体富营养化程度日趋严重，导致赤潮发生的频率和危害程度明显上升。赤 潮对海洋生态环境、水产养殖业和人类健康安全具有严重危害作用，可引起水产 养殖业、旅游等行业的经济损失并直接影响到生态环境和人类健康【1 1 ，赤潮已成为 我国沿海地区重要的环境问题。 海洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物，在4 0 0 0 多种浮游微藻中有2 6 0 多种能形 成赤潮。我国沿海的赤潮生物有1 4 8 种，其中4 3 种曾引发过赤潮1 2 1 。而合成毒素是 有毒赤潮藻的一个常见特征，目前已知能够产生毒素的微藻有7 0 多种，我国就有 2 8 种 3 1 。赤潮对海洋生物和人类健康造成的危害大致可分为如下三类 4 1 ： 一、赤潮生物死亡后分解会使海水缺氧，或者赤潮生物使鱼类等呼吸器官堵 塞，从而使鱼类等生物死亡。 二、某些藻类本身含有毒素，其中有的直接释放毒素，使鱼、虾、贝死亡； 有的赤潮生物死亡后分解而产生毒素；有的藻类的毒素能在海产动物体内的水管 或消化管内富集【5 西1 ，其他动物或人类通过食物链发生中毒事件。而鱼类由于体内 氧化酶的作用，往往转化产物的毒性会更大r 7 1 。 三、赤潮能改变海域生物多样性，破坏海洋生态系统。 2 藻毒素的分类 因为海洋藻毒素的发现多起源于贝类或鱼类，所以又称为贝毒或鱼毒。有毒藻 毒素的结构差别很大，既有复杂的多( 聚) 醚类化合物也有简单的氨基酸。到目 前为止对藻毒素的分类通常采用p s o a m e sm r a c i l 8 1 的方法，该方法是根据毒素对人 类引发的中毒症状和藻源进行分类的。常见的藻毒素分为：麻痹性贝毒( p a r a l y t i c s h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) ，腹泻性贝毒( d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) ， 记忆缺失性贝毒( a m n e s i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，a s p ) ，神经性贝毒( n e u r o t o x i c f s h e l l f i s hp o i s o n i n g ，n s p ) 及西加鱼毒( c i g u a t e r af i s hp o i s o n i n g ，c f p ) 。 2 1 麻痹性贝毒 麻痹性贝毒( p s p ) 是目前世界上分布最广、危害最大的一种藻毒素。它的主 要活性成分为石房蛤毒素( s t x ) 、新石房蛤毒素( n e o s t x ) 和膝沟藻毒素 ( g t x l 4 ) 。其中s t x 就占p s p 的8 5 以上。能够产生p s p 毒素的主要是亚历山大 藻属a l e x a n d r i u m 。p s p 是一类神经性毒素，无紫外吸收，p k a 值在8 2 至j 1 1 5 间，旋 光度大概是+ 1 3 0 0 ，分子式是c l o h l 7 n 7 0 4 ，分子量是2 9 9 。p s p 的稳定性为； s t x n e o s t x g t x 2 3 g t x l 4 。稳定性的差异和互变现象的存在引起毒素分析的 差异。n e o s t x 多样性的减小导致了s t x 的形成，有证据表明生物体系有类似的转 换发生。p s p 的中毒症状为全身麻木，短暂失明，出现瘫痪，甚至死亡。 2 2 腹泻性贝毒 腹泻性贝毒( d s p ) 起源于倒卵形鳍藻( d i n o p h y s i s f o r t i i ) ，因此曾被命名为 鳍藻毒素( d i n o p h y s i s t o x i n ，d t x ) 【9 】。后来，人们从一种海绵( h a l i c h o n d r i ao k a d a i ) 体中分离出一种具有相似毒性的酸性物质，将其称为软海绵酸( o k a d a i ca c i d ，o a ) 1 0 1 。由于它们相似性很大，分子结构很快就得到确定【l i 】。后来人们也相继分离出 鳍藻毒素的衍生物d t x 2 ，d t x 3 ，d t x 4 ，d t x 5 a 和d t x 5 b ，以及软海绵酸的二醇 酯衍生物o a - 1 ，o a - 2 和o a - 3 ，o a - 4 ，o a - 5 ，o a 6 t 1 3 - 1 4 。能够产生d s p 毒素的 甲藻主要有鳍藻属( d i n o p h y s i s ) 和底栖甲藻利玛原甲藻( p r o r o c e n t r u ml i m a ) 等 1 5 - 1 6 】。d s p 的中毒症状为腹泻，呕吐，同时o a 导致体内蛋白质的磷酸化，且能促 进肿瘤的形成【1 7 - 1 引。如果贝肝脏内d s p 的含量分别超j 立2 p go a g 和1 1 8 p gd t x l g ， 对人来讲就不宜食用【1 9 1 。 2 3 记忆缺失性贝毒 1 9 8 9 年，人们从拟菱形藻( p s e u d o n i t z s c h i a 卿) 中分离出软骨藻酸( d o m o i c a c i d ，d a ) 2 0 - 2j 】。随后人们相继发现了d a 的八种异构体d a a 、d a - b 、d a - c 2 2 l 、 d a - d 、d a - e 、d a - f 和d a - g 、d a - h 2 3 1 ，它们具有和d a 类似的毒性作用，即 通过与控制细胞膜n a + 通道的神经递质谷氨酸受体紧密结合，提高c a 2 + 的渗透性， 使神经细胞长时问处于去极化的兴奋状态，最终导致细胞死亡【2 4 】。由于d a 的存 在可能对中枢神经系统海马区和丘脑区造成损伤，从而导致记忆力丧失。 2 2 4 神经性贝毒 神经性贝毒分布范围较小，它的活性物质主要为b r e v e t o x i n a ( b t x a ) ， b r e v e t o x i n b ( b t x b ) 、b r e v e t o x i n c ( b t x c ) 2 5 1 、h e m i b r e v e t o x i n b ( h e b t x b ) 年1 d e h y d r o b r e v e t o x i n b ( d e b t x b ) 2 6 l ，这类毒素是由短凯伦藻( k a r e n i ab r e v i s ) 产生的。n s p 是一种脂溶性的环状聚醚毒素，能够与n a + 通道的位点5 牢固结合，增 强n a + 流向细胞内，外用河豚毒素可以阻断这种n a + 内流【2 7 1 。n s p 的中毒症状主要 是血压过低、支气管收缩、瘫痪等，但一般不出现死亡1 2 妣9 1 。 2 5 西加鱼毒素 西加鱼毒( c f p ) 是在海洋珊瑚礁系统中积累的一种毒素，主要来源于有毒岗 比亚藻( g a m b i e r d i s c u st o x i c u s ) 。c f p 是一类强烈的神经性毒素，与短裸甲藻毒素 的致毒机理相同【3 们。它的中毒症状主要是神经和心血管的紊乱，心律不齐，瘫痪 甚至死亡。 3 藻毒素的检测分析方法 由于赤潮及其毒素对水产养殖业和人类健康等会造成巨大危害，因此对藻毒 素检测方法的研究就显得至关重要。现有的藻毒素检测方法有小鼠生物法、生物 传感器法、免疫法、酶活性抑制分析法、高效液相色谱法( h p l c ) 、液质联用分 析法( l c m s ) 等。小鼠生物法在概括样品毒性方面相当有效，但存在较多限制， 如不能确定样品中毒素结构；假阳性高( 士2 0 ) ；灵敏度低；不同小鼠品系、批 次、损伤程度和大小对毒素的灵敏度也有很大波动性；浪费较多的毒素和需要使 用活体动物等【3 l 抛l 生物传感器法是目前灵敏度最高的钠通道堵塞物s t x 的检测方 法，且检测装置可持续使用约2 5 0 个h 【3 副；由于o a 币i d t x l 可高效、专一地抑制丝 氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶( p p 2 a ) 的活性，因此酶活性抑制分析法被预测将会成为 一种有效检i 贝i j d s p 毒素的方法【3 5 1 ；h p l c 法的灵敏度是小白鼠生物法的4 4 0 0 倍， 平均灵敏度小于1 a gs t x 10 0 9 ，最低检测限为0 5 2 5 n gs t x 1 0 0 9 【3 引。但h p l c 法需 要其他方法进行广泛的标定，且h p l c 法存在毒素标准品全球缺乏的普遍问题，每 种毒素类似物的毒性种类都是唯一的，但很多类似物很容易相互转化，因此对样 品中的原始或潜在总毒性作出判断是比较困难的，这是影响该法普遍推广的主要 原因。目前一些发达国家如加拿大、荷兰等法定使用该方法【1 5 1 ；l c m s 的高灵敏 度和选择性使得其成为海洋藻毒素分析研究的首选方法，也成为科研工作者关注 的焦点【3 7 1 。有人使用l c m s 3 8 1 或l c m s m s 3 9 1 系统同步分析赤潮藻或贝类样品中 的d s p 毒素，得到了很好的分析结果。但也有人组织了八个实验室使用不同的 l c m s 系统对含有d s p 和a s p 的贝类样品进行分析，大多数实验室都能检测到毒 素，却发现毒素的定量有差异，尤其是缺少标准品的毒素成分【4 0 】。因此，使用l c m s 定量分析d s p 的方法还有待于进一步改进和并进行实验室之间的比较研究；免疫学 检测技术是利用抗原抗体特异性结合的特点，对毒素进行定性定量的检测方法。 1 9 6 4 年j o h n s o n 等首次成功制备了抗s t x 的多克隆抗体，随后a d a c h im 等】用单抗 进行了研究。近年来也相继报道了有关p s p 毒素检测的免疫学方法的重要进展，如 放射免疫技术和酶联免疫技术【4 2 1 。根据k h o l e r 和m i l s t e i n 的方法【4 3 1 ，免疫动物后， 取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞杂交，然后筛选出稳定分泌抗体的单克隆细胞株，从 而产生单克隆抗体( m a b s ) 。利用单抗进行藻毒素研究的如y o s h i v e i k oa s k o 等1 4 4 】 用特异性单抗砒l e x a n d r i u m 进行了研究； j 日t a k a s h i l 4 5 】等建立起来的针对d s p 的单 克隆抗体( d s p h e c k ) 在世界范围内得到了厂泛应用；另外，一种商品化的d s p 试剂命r o u g i a rb i o t e c h 也是利用单克隆抗体进行酶联免疫吸附实验，对藻类和贝 类样品中的d s p 进行检测。下表是几种商品化的毒素试剂盒。 表1 几种酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 毒素检测试剂盒 t a b 1k i n d so f a l g a lt o x i n sa s s a yr e a g e n tb o xb ye l i s a ， 4 藻毒素检测分析的发展方向 随着对毒素性质的进一步了解和分析于段的不断提高，也使毒素的检测和分 析的方法越来越多。今后藻毒素的检测与分析可向以下几个方向发展：1 、建立和 完善更加快速、灵敏的检测方法，特别是e l i s a 法、蛋白磷酸酶抑制试验和神经受 体结合试验等生化方法，并研制成方便使用的试剂盒；2 、寻找更加简单、精确的 化学检测方法，定量检测各种已知类型的毒素，并对新发现的毒素进行结构、性 质等方面的分析；3 、对饮用水、娱乐用水以及贝类、鱼类等海产品制定合理的安 全标准；4 、将藻类毒素的检测和分析与各种理化环境因子的监测相结合，探索毒 素产生的规律及有效控制方法；5 、运用化学方法大规模提纯毒素，纯毒素不但可 作为检测分析的标准，还可开发为各种工具药和治疗药。 4 综上所述，赤潮灾害日益严重，已成为一种全球性的海洋生态灾害。对海洋 生态和渔业资源造成了巨大损害，特别是有毒赤潮发生次数的逐年增加，对海水 养殖业及人体健康构成了严重威胁。因此研究有毒赤潮生态学、毒素产生机制、 毒素在食物链中的传递及相关的毒理学，进而揭示有毒赤潮形成机制、提出预防 治理的措施，都是有毒赤潮研究的热点领域，而毒素检测技术方法特别是快速简 便的检测技术的研究则是有毒赤潮研究的基础。目前我国腹泻性贝毒研究的空白 点仍很多，迫切需要建立相关的检测方法，以开展更多的赤潮研究和生态环境的 监测。 本研究通过制备抗腹泻性贝毒主要成分软海绵酸的抗体，建立软海绵酸的酶 联免疫和胶体金免疫层析快速检测方法，为研制具有我国自主知识产权的免疫检 测方法提供技术支持，也为我国赤潮研究和生态环境监测以及食品安全检验提供 一简便、快捷的技术产品。 第一章抗软海绵酸单克隆抗体的制备与鉴定 近年来以单( 多) 克隆抗体为探针的免疫学检测方法已用于多种海洋贝毒素 的检测。但腹泻性贝毒软海绵酸o a 的相对分子质量只有8 0 5 ，不能够刺激机体产 生抗o a 的抗体，因此必须将其偶联到载体蛋白上制各成完全抗原才能够使机体 发生免疫反应。目前国外已研制出商品化的o ae l i s a 检测试剂盒，但国内这方 面的产品还未问世。本研究利用活性酯法，用牛血清白蛋白作为载体，偶联软海 绵酸合成制备免疫抗原，利用杂交瘤技术，制备了优质的抗o a 单克隆抗体，为 建立以单克隆抗体为基础的免疫学检测方法及检测试剂盒、试纸条的研制与应用 奠定了基础。 1 材料与方法 1 1 试剂及仪器设备 b a l b c 健康小鼠( 8 周龄和1 2 周龄以上，分别用于免疫和腹水制备) 由中国 科学院实验动物中心研究所提供；小鼠骨髓瘤细胞s p 2 0 由本实验室保存；软海绵 酸o k a d a i ca c i d ( o a ) 标准品购自北京伊普瑞斯科技有限公司；水溶性碳化二亚 胺 1 - e t h y l - 3 - ( 3 一d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o i m i d eh y d r o c h l o r i d e ，e d c 、n 一羟基 琥珀酰亚胺( n h y d r o x y s u c c i n i m i d e ，n h s ) 、m e s 缓冲液、卵清白蛋白( o v a l b u m i n ， o v a ) 、牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 、弗氏完全和不完全佐剂、 二甲基业砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 、h a t 和h t 培养液、聚乙二醇 ( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 、酶标二抗h r g - 羊抗鼠i g g 均购自s i g m a 公司； r p m i 1 6 4 0 培养基、胎牛血清购自g i b c o 公司；3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯二胺( t m b ) 购自f l u k a 公司；p h 9 6 ，0 0 5 m 碳酸盐缓冲液；p h 7 4 ，0 0 1 m 磷酸盐缓冲液p b s t ( 含0 0 5 t w e e n - 2 0 ) ；1 明胶；p h 5 0 磷酸盐柠檬酸缓冲液；h 2 0 2 ；2 mh 2 s 0 4 ； 其他试剂均为国产分析纯。 c 0 2 培养箱；超净工作台；倒置显微镜；7 0 。c 超低温保存箱；液氮罐；高速 冷冻离心机；透析卡；聚苯乙烯9 6 孔酶标板；细胞培养瓶、平底细胞培养板( 2 4 孔和9 6 孔) ；单通道及八通道连续可调移液枪；3 7 恒温箱；b i o r a d 酶标仪。 6 1 2 抗原制备与免疫抗原鉴定 参照文献1 4 6 l 方法制备免疫抗原( o a - b s a ) 和检测抗原( o a - o v a ) 。具体方 法如下：取4 5 m gn h s 和9m ge d c 溶于3 0 m lm e s 缓冲液( o 0 5m ，0 5m n a c l ， p h5 o ) ，充分溶解，取5 0 斗l 力口入到1 0 0 肛l 含l m g o a 的d m s o 溶液中，2 5o c 反应1 5 m i r a 另秤取3m gb s a ，用5 0 0 1 x lp b s 溶液( 0 0 1 mp h 7 4 ) 溶解；将上述活化的o a 和l o l x l 吡啶加入b s a 溶液中，在室温条件下轻速搅拌6 小时，再放置4 0 c 冰箱过夜。第二 天取出，分别用0 0 5 mp h 9 6 的碳酸盐缓冲液和0 0 1 mp h 7 4p b s 透析，分装、- 2 0o c 保存，用作免疫抗原。 用o v a 代替b s a 作载体蛋白，按照以上方法与o a 进行偶联，制备检测抗原 0 a - o v a ，保存备用。 用乙醇精确配$ 1 j o a 标准溶液，用0 0 1 mp h 7 4p b s 配s t b s a 的标准溶液。称取 一定量的o a b s a 溶于p b s 液中，用b r a f o r d 法测其蛋白质的浓度。根据此浓度调整 o a - b s a 溶液中蛋白质的浓度，使其与- p b s 缓冲液一致。取2 m l o a 溶液( 1 0 t g m 1 ) 、 取2 m l b s a 溶液( 1 m g m 1 ) 和2 m l o a b s a 溶液，以p b s 为空白对照，用紫外分光扫 描仪在波长2 0 0 5 0 0 n m 的范围内逐一扫描它们吸收光谱，在最大吸收峰处的波长测 定吸光值，参照文献【4 7 l 估算o a 与- b s a 的偶联比。 1 3 免疫小鼠 以o a - b s a 为免疫原，免疫三只8 1 0 周龄的雌性b a l b c d 、鼠。首免按1 5 0 i t g 只o a - b s a ) b h 完全弗氏佐剂足垫注射，三周后加强免疫一次，改用不完全弗氏佐剂， 皮下注射，剂量为2 0 0 g 只；以后每隔二周继续加强免疫，用不完全弗氏佐剂，肌 肉注射，剂量为2 0 0 肛g 只。从第2 次免疫后开始，每次免疫后l o d 间接e l i s a 法测定 血清效价，效价达到l ：8 0 0 0 以上且抗体特异性鉴定结果好的小鼠继续加强免疫，第 四次腹腔加强免疫，剂量为2 0 0 “g 只，不用佐剂。3 d 后取脾脏，进行细胞融合。 1 4 多抗特异性鉴定 上述免疫的b a l b c d 、鼠，摘除眼球放血致小鼠死亡，收集血液制备多抗血清， 室温放置l h ，8 0 0 0 r m i n 离, l 二, 2 0 m i n ，取上层血清，分装，2 0 0 c 保存待用。用碳酸盐 溶液分别稀释o a - b s a 、o a - o v a 偶联物至浓度1 p , g m l ，用碳酸盐溶液分别稀释载 体蛋白( o v a 、b s a ) 至1 0 1 x g m l ，分别包被9 6 孔酶标板的不同列孔，每孔1 0 0 l ， 4 0 c 过夜，甩干板内的液体，用p b s t 洗液洗三次，再用1 明胶于3 7 0 c 封闭2 小时， 用p b s t 洗涤5 m i n ，共3 次；用p b s t 将一抗( 衄清) 作系列稀释，每一种包被物同 7 一个抗体稀释度作2 个重复，1 0 0 l 孔，3 7 。c 作用2h 。p b s t 洗涤5m i n ，3 次；用含 5 0 m l l 牛血清的p b s t 按1 ：1 0 0 0 稀释二抗( 羊抗小鼠i g g ) ，加入酶标板，每孔l o o “l ， 3 7 0 c 反应1 5 h ，p b s t 洗涤5 m i n ，共洗涤3 次；配置新鲜的t m b 显色液，加入酶标板 中于3 7 。c 显色1 5 m i n ，每孔用5 0 9 l2 mh 2 s 0 4 终止反应。在酶标仪上读数，计算平 均数，比较抗体与不同包被物结合反应情况，判断诱导产生的抗体是否针对o a 。 1 5 细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选 无菌取免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的s p 2 0 骨髓瘤细胞以5 ：1 体积比混 合，按常规方法进行融合，融合剂为5 0 的p e g 6 0 0 0 。 融合细胞和小鼠腹腔巨噬细胞用含h a t 2 0 胎牛血清d m e m 培养液悬浮，加 入9 6 孔细胞培养板中，3 7 0 c ，5 的c 0 2 培养箱中培养，5 d 左右用含h a t 的d m e m 完全培养液换液培养，5 1 0 d 用含h t 的d m e m 完全培养液换液培养，以后改为 d m e m 完全培养液培养。 待细胞生长到培养孔面积的1 3 1 2 时，采用间接e l i s a 方法分步筛选杂交瘤细 胞，首先标记单个克隆或2 个克隆( 细胞克隆相互分开) 的细胞培