（物理化学专业论文）基于类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究.pdf

秦艳：基丁类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 摘要 一、基于l d h s l a p o n i t e 修饰构筑的酚类生物传感器的研究 研究阴离子交换粘土类水滑石( l d h s ) 与人工合成阳离子粘土( 1 a p o n i t e ) 的杂化。 并以此l d h s l a p o n i t e 阴、阳离子杂化材料固载多酚氧化酶( p p o ) 从而构建新型高灵 敏度的酚类生物传感器。该杂化材料是由l d h s 和l a p o n i t e 两种无机粘土通过静 电作用合成的，具备了两种无机粘土的优越性。分别用x r d 、f t - i r 对此杂化材料 进行了表征，同时还对它的渗透性进行了研究，结果表明：该杂化材料具有更好的 渗透性、较大的比表面积等，可以为多酚氧化酶提供适宜的微环境，保持酶的最大 活性。采用该复合材料构筑酚传感器的最适参数为：l d h 和l a p o n i t e 质量比为3 ： l ，生物膜中酶的量为1 3 3p g 。构筑的l d h s l a p o n i t e p p o 生物传感器呈现了快速的 生物电化学响应特性、很高的检测灵敏度( 4 3 6 0m am 。c m 。2 ) 、宽广的线性检测范 围( 5 x 1 0 9 1 2 x 1 0 。5m ) 。固定化p p o 的表观米氏常数为0 0 9 3m m ，酶催化反应 的表观活化能为2 2k jm o l 。 二、基于l d h s l a p o n i t e - 杂化材料的高选择性的酚类双酶生物传感器 的研究 我们继续用l d h s l a p o n i t e 杂化材料作为酶的固定载体，研究了另一种新型 的l d h s l a p o n i t e h r p 生物传感器，结果发现，当l d h s l a p o n i t e 质量比为3 ： 1 时，该生物传感器表现出了良好的电化学特性。在l d h s l a p o n i t e p p o 生物传 感器的基础上又进一步构建了l d h s l a p o n i t e p p o h r p 双酶生物传感器，在操 作电位为0 1v 时，与l d h s l a p o n i t e p p o 生物传感器相比较，该双酶生物传 感器表现出了更为优异的选择性。其检测的线性范围为：7 1 1 0 - 8 1 0 7 x l o - 4m 。 三、以l d h s s w n t s 杂化材料为载体构筑的酚类生物传感器的研究 研究了由带正电荷的l d h s 和带负电荷的羧基化的s w n t s 组合而成的一类新 型的杂化材料l d h s l a p o n i t e 来固定多酚氧化酶。通过f t - i r 对该杂化材料进行 2 扬州人学硕十学位论文 了表征，以及检测了它的渗透性和电化学阻抗，结果表明，该杂化材料比单独的 l d h s 表现出更优异的特性，如更高的导电性，更大的渗透性等。本文系统地研究 了由l d h s s w n t s 为载体制备的生物传感器的性能：在l d h s 和s w n t s 的质量 比为2 5 7 ：1 时，该生物传感器表现了优异的性能，高的灵敏度( 4 9 4 4m am oc m 之) ， 较低的表观米氏常数( o 0 2 3m m ) ，较宽的线性范围( 4 3 4 1 0 - 8 1 0 7 1 0 巧m ) 等 秦艳：基丁类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 3 a b s t r a c t 1 h y b r i dm a t e r i a lb a s e do nl d h sa n dl a p o n i t e ：c h a r a c t e r i z a t i o na n d a p p l i c a t i o nt ot h ed e s i g no fa m p e r o m e t r i cp h e n o lb i o s e n s o r t h e h y b r i d i z a t i o no ft h ea n i o ne x c h a n g ec l a y ( l d h s ) a n dt h ec a t i o nc l a y ( l a p o n i t e ) w a ss t u d i e d an e wt y p eo fa m p e r o m e t r i cp h e n o lb i o s e n s o rb a s e do nl a p o n i t e l d h s i n o r g a n i c - i n o r g a n i cc o m p o s i t ef i l mw a sd e s c r i b e d t h i sh y b r i dm a t e r i a lw a ss y n t h e t i e d b ys t a t i ce l e c t r i c i t y i t c o m b i n e dt h e a d v a n t a g e so ft h ei n o r g a n i cl a y e r e dd o u b l e h y d r o x i d e s ：l d h sa n dl a p o n i t e t h i sh y b r i d m a t e r i a lh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e db y f o u r i e rt r a n s f r o mi n f r a r e d ( f t - i r ) a n dx r d a l s ot h ep e r m e a b i l i t yo ft h i sh y b r i dw a s e v a l u a t e d s ot h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h i sh y b r i dm a t e r i a lh a v eg o o dp e r m e a b i l i t y , p r e f e r a b l ec o n d u c t i v i t ya n ds p e c i f i cs u r f a c e ，a n d s oo n p p or e t a i n e dt h ee s s e n t i a l f e a t u r eo fi t sn a t i v es t r u c t u r ei nt h ec o m p o s i t ef i l m t h eo p t i m a lp a r a m e t e ro ft h e b i o s e n s o r ：t h em a s sr a t i oo fl d h s l a p o n i t ei s3 , t h ee n z y m a t i cm a s si s13 3p g t h e e n z y m ee l e c t r o d ep r o v i d e dal i n e a rr e s p o n s et oc a t e c h o lo v e rac o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 5 x10 一一1 2 x10 。5mw i t has e n s i t i v i t yo f4 3 6 0m am 。lc r n 2 t h e a p p a r e n t m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( k m 8 叩f o rt h es e n s o rw a sf o u n dt ob e0 0 9 3m m t h e a c t i v a t i o ne n e r g yf o re n z y m a t i cr e a c t i o nw a sc a l c u l a t e dt ob e2 2 k jm o l 一 2 s e l e c t i v ep h e n o lb i e n z y m e a m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r sb a s e do nl d h s a n d l a p o n i t e w ec o n t i n u eu s i n gt h eh y b r i dm a t e r i a la se n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm a t r i x t h e d e v e l o p m e n to fh r p - b a s e db i o s e n s o rw e r ea c h i e v e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h i s b i o s e n s o rh a v ea p p r o v e de l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r a tt h es a m et i m e ，t w ob i e n z y m e b i o s e n s o r ( p p oa n dh r p ) w e r ec o n s t r u c t e du s i n gl d h sa n dl a p o n i t ea se n z y m e i m m o b i l i z a t i o nm a t r i x t h eb i o s e n s o r sr e s p o n s e sw e r er e c o r d e da t 一0 1vv e r s u ss a t u r a t e d 4 扬州大学硕十学位论文 c a l o m e le l e c t r o d e ( s c e ) ，s u c ha st h e h i g hs e l e c t i v i t y , al a r g e d e t e r m i n a t i o nr a n g e ( 7 1 x l o - 8 1 0 7 x l o - 4m ) 3 h y b r i dm a t e r i a lb a s e do nl d h sa n ds w n t s ：c h a r a c t e r i z a t i o na n d a p p l i c a t i o nt ot h ed e s i g no fa m p e r o m e t r i cp h e n o lb i o s e n s o r w eh a v es t u d i e dat y p eo fn e wh y b r i dm a t e r i a l sw h i c hi sc o m p o s e do fl d h sw i t h p o s i t i v ec h a r g ea n db a r b o x y l a t e ds w n t sw i t hn e g a t i v ec h a r g e ，a san e wm a t e r i a lt of i x t h ed a u p h i no x i d a s e c h a r a c t e r i z a t i o no ft h es a m p l e sw a sc a r r i e do u tu s i n gf t - i r s p e c t r o p h o t o m e t e r , p e r m e a b i l i t y d e t e r m i n a t i o na n de l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c e t h e p e r m e a b i l i t yd e t e r m i n a t i o na n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c ei n d i c a t et h en e wm a t e r i a l h a v eh i g h e rc o n d u c t i v i t y 、l a r g e rp e r m e a b i l i t y , a n db e t t e rb i o - c o m p a t i b i l i t y s ot h i sn e w m a t e r i a lc a no f f e ram o r es u i t a b l em i c r o e n v i r o n m e n tf o rt h es u r v i v a lo f 。e n z y m e i ti s f o u n dt h a ta tt h ep r o p o r t i o no f2 5 7 ：1 ( l d h s s w n t s ) ，t h eb i o s e n s o rs h o w sh i g h e r s e n s i t y ! ，l o w e ra p p a r e n t m i c h a e l i s c o n s t a n t ( o 0 2 3 m m ) a n d w i d e r l i n e a l r a n g e ( 4 3 4 x 1 0 - s - 1 0 7 x 1 0 。5 m ) ，a n ds oo i l 扬州大学硕十学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究 成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研 究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 奏痧 签字同期：咖f ，少年6 月厂口同 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本 人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。 学位论文作者签名：泰孝白 导师签名： 签字日期：州汐年b 月f 佣 签字日期： f 同 秦艳：基丁类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 第一章绪论 生物传感器技术在研究和工程技术领域受到非常大的重视，生物传感器是通 过生物、物理、仿生学、医学、化学、电子技术等多种学科相互渗透而成长起来的 高新技术，且处在生命科学和信息科学的交叉区域，能够对所需要检测的物质进行 快速分析和追踪。它们的共同特征是：探索和揭示出生命系统中信息的产生、储存、 传输、加工、转换和控制等基本的规律，探索应用于人类经济活动中的基本方法【卜4 】。 所以，生物传感器技术探究的主要内容是：在研究和生产具有识别功能的换能 器的同时，将种类繁多的生物活性材料与传感器相结合，逐渐发展成为生产新型的 分析仪器和分析方法的原创技术。其中在生物传感器中应用的生物活性材料包括生 物大分子、细胞、细胞器、组织、器官等，以及人工合成的分子印迹聚合物。而且 随着生物传感器的迅猛发展，它比起常规的化学分析及离线分析技术( 高效液相色 谱或质谱) 优越性越来越明显，如：不需要经过特殊处理可对样品直接测定( 如对 发酵液、血液之类非透明物质可进行直接检测分析) ，具有较高的专一性，选择性 好、灵敏度高，测定速度快，操作简单，固定化的催化材料可以反复使用，检测电 信号易于自动化控制，而且减少了污染，可以进行在线甚至活体检测【3 羽。 1 1 生物传感器的简介 1 1 1 生物传感器的发展历史 生物传感器的研究开始于2 0 世纪6 0 年代。在1 9 6 2 年，由c l a r k 矛l l y o n s 最先 提出了生物传感器( 酶传感器) 的原理，即用葡萄糖氧化酶与氧电极进行组合检测 葡萄糖【7 1 。至- u 1 9 6 7 年，经过u p d i k e 等人【8 】的探索，酶的固定化技术有所突破，从而 成功研制了酶电极【9 】，世界上第一个生物传感器由此诞生。 在最初的1 5 年里，生物传感器主要是以酶电极为主，可是由于酶的价格昂贵 且性质不够稳定，所以以酶作为敏感材料的传感器，其应用受到一定的限制。至1 1 2 0 世纪7 0 年代中期以后，生物传感器技术才达到最终成功，主要是探索和研究可以 用于制备生物传感器的生物活性材料，研究和开发对活性物质的固定化技术，研究 6 扬州人学硕十学位论文 生物信号电信号的转换问题等，并获得了较快的进展，例女f l d i v i e s 首先提出 了用于检测醇类的电极，此电极是由固定化细胞与氧电极相组合而成，即所谓“微 生物电极”。1 9 7 7 年钤木周一等研制了快速测定生化需氧量( b o d ) 的微生物传感器 0 0 ，发表一百多篇论文，并详细阐述了使用微生物传感器对发酵过程的控制等方面 的应用，因而生物传感器的命名被正式提出。自此以后生物传感器技术逐渐成熟， 并确立了自己独立的体系，从而确立了它在生物工程和传感技术研究领域罩无法取 代的地位。尤其是近1 0 年，随着生物技术的不断完善、微电子学技术的迅猛发展及 实际应用领域的迫切需要，一系列生物传感器已经被研制成功，在临床检验、生化 分析和环境监测等方向都具有一定的实用价值，可以用来对糖类、有机酸、氨基酸、 抗原、抗体、激素、蛋白质、d n a 、生化耗氧量、微生物和某些抗癌物质等进行有 效分析检测l 。 1 1 2 生物传感器的概念、原理 g r o n o w 将生物传感器定义为“将一种含有固定化生物物质( 如酶、抗体、全细 胞、细胞器或其联合体) 与一种合适的换能器( 如电极、热敏电阻、离子敏场效应管 等) 紧密结合而形成的分析工具或系统，它可以将生化信号转换为数量化的电信号” 0 2 1 o 一般，主要由两个部分组成了生物传感器都：一是具有分子识别能力的生物活 性物质( 如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、核酸、有机物分子等) 组 成的生物分子识别元件( 感受器) ；二是信号换能器( 转换器) ，主要有电化学电极、 光学检测元件、热敏电阻、压电石英晶体、场效应晶体管及表面等离子共振器件等。 当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物通过信号转换器将生化信 号即非电信号转换成能够输出的可测量的电信号、光信号等，从而达到分析检测的 目的。因此，生物分子识别部件和信息转换部件可以组成一个典型的生物传感器【1 3 】。 生物传感器的工作原理就是：转换器可将体系内由于物理化学反应而产生的产 物( 如化学物质、光、音、热等) 的数量变化经传递与变换后，以电极测定其电流 值或电位值，以此换算出被测物的量或浓度【l 引。根据信号转换器的类型，生物传感 器的工作原理主要有将化学能转变为电信号；将热能转变为电信号；将光能效应转 秦艳：基于类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 7 变为电信号；直接产生电信号等【1 5 舶j 。如图1 1 所示。 物理或 竺今 电极 热敏 电信号 检 元件 测 光学检 装 测元件 置 场效应 晶体管 识别元件 信号转换器 - - - - - - r - - 一 生物传感器 输出 f i g u r e l 1c o m p o n e n t so fag e n e r i cb i o s e n s o r 1 1 3 生物传感器的分类 生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传 感器等，这是根据分子识别元件的不同进行分类的，这归因于生物传感器的分子识 别元件是具有分子识别能力的生物活性物质【1 4 】【19 1 。同时可以按照生物传感器的信号 转换器不同，将生物传感器分为电化学生物传感器、测热型生物传感器、半导体生 物传感器、测声型生物传感器、测光型生物传感器等。上述两种分类方法还可相互 交叉。 酶生物传感器一般固定化活性酶和电化学装置( 电极) 组成了酶生物传感器， 故又称为酶电极。它的分子识别部件是固定化的活性酶，利用活性酶在生化反应中 的特殊催化作用，反应过程中消耗的底物或产生的化学物质即可用转换器转变为 电信号记录下。酶生物传感器既是最早出现的生物传感器，也是传感器领域中研究 最多的一种类型。它包括葡萄糖生物传感器、酚类生物传感器、胆固醇生物传感器、 乳酸生物传感器、氨基酸生物传感器等。酶生物传感器的应用范围及其广泛，包括： 临床检验、食品分析、环境监测、发酵工业控制：防卫安全检测等领域。生物传感 器检测技术是生物加工类企业改造的重要途径之一，在线生物传感器分析是建立生 产模拟系统和实时检测的新工具【2 0 】。 免疫传感器它是利用抗原与抗体之间的高选择特性，已经初步成功的研制了 8 扬州人学硕十学何论文 。1 。一= 。1 。一 各种免疫传感矧2 1 。2 2 】。例如压电免疫传感器，具有高灵敏度、高特异性、响应快和 小型简便等特点。它是利用压电部件的质量敏感特性，与生物免疫识别性质结合而 形成的一种可自动化分析检测传感器，这种生物传感器可对多种抗原或抗体进行实 时、快速的定量分析检测，而且可用在反应动力学的研究中。 微生物传感器此电化学生物传感器是由作为识别元件的微生物( 常用的主要 是细菌和酵母菌) 和电极构成。其大致可分为三种类型工作原理：( 1 ) 可以通过氧 电极测量体系中氧的减少从而检测底物的浓度，因为微生物对底物有同化作用，； ( 2 ) 由于不同的微生物中含有不同的酶，故可以此来识别分子，这种类型类似于酶 电极；( 3 ) 问接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物，即可以通过测定对电极 敏感的代谢产物。由于微生物电极传感器价格便宜且使用寿命长而具有很好的发展 前景，但是它的选择性以及使用寿命等需要有所改进【2 3 之6 1 。 组织传感器组织传感器的基本原理与酶传感器相同，是利用动植物组织薄片 作为识别元件与基础电极相结合的电化学传感器称为组织传感器，故这类传感器可 以看作是酶传感器的衍生形式【27 。优点是组织传感器克服了酶传感器的一些缺点， 且原料易得【2 8 1 ，制备简单，还可用于酶催化途径不清楚的体系等。但在选择性、重 现性、使用寿命等方面还存在不足 2 9 1 。 1 1 4 生物传感器的应用领域及展望 由于生物传感器能够使生物活性物质与底物( 如抗原和抗体、受体和配体等) 发生生物化学反应，所以其能把生化反应的非电信号转换为可数量化的电信号，并 且经过放大、显示等处理，因此生物传感器具有响应速度快、特异性强、灵敏度高 和使用寿命长等优点。它既适用于自动化工业生产；又适于生物医学和临床诊断。 目前生物传感器在发酵工艺【3 0 】、环境监测【3 1 1 、临床医学【3 2 1 、食品工程【3 3 】、军事及 军事医学等方面得到了很高的重视和广泛应用。例如在发酵工业、食品工业方面 0 4 - 3 s 】，可以采用生物传感器来快速、在线分析食品中的各种成分，包括营养物、添 加剂、防腐剂等；在临床医学诊断1 3 6 1 、环境监测与保护【3 7 】方面，采用生物传感器可 以快速检测人体内的各种生化指标、环境污染物的含量等，所以传感器的研发及运 用避免了传统方法的耗时的缺陷。 秦艳：基于类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 9 j ，- _ 。_ = 。一 虽然至今已开发和研制了许多类型的生物传感器，但由于生物传感器在很多方 面有很多的不足之处，如再现性、稳定性以及可批量生产性等，所以生物传感器技 术还不太成熟，因此，今后生物传感器将被继续完善和开发研制，同时将进一步研 究发展生物活性物质的固定化技术和生物传感器的固定化材料。随着生物材料学、 微电子技术、微制造技术和信息技术的飞速发展，使得生物传感器将与微处理器和 数据交流系统结合，那么就可以批量的生产新一代的成本低、稳定性好、灵敏度高、 体积小、多功能的生物传感器，同时可以应用在各个领域，如卫尘、药品、食品、 发酵、环境工业等【3 8 】。由此可以想到在不久的将来，生物传感器必将能够在市场 上开辟出一片新的天地【3 9 】。 1 2 酶生物传感器 1 2 1 酶生物传感器的类型及其应用 从1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n 7 】提出酶电极的概念以后，开始逐渐的探索和研究如 何结合电极响应的高度灵敏性和酶催化反应的高度专一性。在1 9 6 7 年时，u p d i k e 和h i c k s 9 在氧电极表面固定葡萄糖氧化酶( g o d ) 膜，制备了第一种生物传感器， 即葡萄糖氧化酶电极。在生物传感器的构筑中，生物活性材料部分为敏感元件，检 测与测量装置为信号转换部分。敏感元和信号转换器有很多种类，将不同的生物活 性材料的敏感元与信号转换器进行组合，可构筑出多种类型的物理或化学传感器。 例如利用热敏电阻测量温度的传感器、利用电化学信号的测量( 包括电流、电位、 阻抗测定、电导等) 传感器、测量光学信号( 表面等离子共振技术、光致发光) 的 传感器。生物传感器就是通过敏感元件对被测量分子产生特异的相互作用，再由相 互作用转化成可测量的信号，从而实现待测物的检测。因此生物传感器对待测物可 以进行直接分析，反复使用，且操作简单。 酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一个系列。生物酶的种类很多， 在载体材料上固定不同的酶，通过不同的信号转换，可构筑出多种类型的酶生物传 感器，如：测定葡萄糖、尿酸、氨基酸、酚类物质、抗坏血酸、半乳糖、乳酸、胆 固醇等【舡5 7 1 。目前已有2 0 0 种以上酶生物传感器达到实用的水平，广泛的用在化工、 l o 扬州人学硕十学位论文 医药、生物等领域。酶生物传感器具有一些独特的优点：如( 1 ) 高度的专一性， 选择性好，灵敏度高，不需处理复杂试样，能够直接检测试样；( 2 ) 响应快，样品 用量少，而且可反复多次使用；( 3 ) 采用同一种信号转换装置，可实现多种底物的 同时测定；( 4 ) 生物传感器的体积小，便于携带，因此可以实现连续现场检测；( 5 ) 由于生物传感器中的活性组分是被固定化的，因此可以反复多次使用，且而是的检 测成本低于传统的分析方法。 1 2 2 酶生物传感器的发展历程 酶生物传感器是由固定化酶与各类信号转换装置组合而形成的生物传感器，相 较于其它几种类型的生物传感器( 如组织传感器、免疫传感器、微生物传感器、等) ， 酶生物传感器的发展在生物传感器领域最具代表性，它不仅是出现得最早的生物传 感器，而且还是研究得最多的一种生物传感器。根据生物传感器反应过程的不同， 酶生物传感器经历了三个阶段，主要根据发生催化反应的的基础分为耗氧型的g i 物 传感器、媒介体为电荷传递的酶生物传感器和利用酶的直接电化学的生物传感器。 许多专家常将经典酶生物传感器看作是第一代生物传感器，而介体酶生物传感器为 第二代生物传感器，利用酶的直接电化学特性的看成是第三代生物传感器【5 8 】。本论 文中主要涉及第一代和第二代生物传感器，下面重点阐述一下这两种生物传感器的 原理和特点。 第一代生物传感器 利用天然媒介体一氧的催化机理研制成了第一代生物传感器。在1 9 6 2 年，由 c l a r k 并1 1 l y o n s 7 】第一次提出了关于葡萄糖生物传感器的机理：在氧电极表面将一定 量的葡萄糖氧化酶固定，然后待测液中溶解氧的消耗量利用此氧电极检测，则葡萄 糖的含量可以被间接的测算出。这种通过测量反应物中0 2 的减少量或产物中h 2 0 2 的产生量这两种方法来得到数量化的电信号，这归因于还原态葡萄糖氧化酶 ( g o d r , x i ) 氧化还原的活性中心在酶分子内部，被蛋白质所包围，不太容易直接与常 规的电极传递电子，故不能够输出电信号。在此过程中，经葡萄糖还原后的葡萄糖 氧化酶，又经溶液中的溶解氧氧化，所以葡萄糖氧化酶能够得以循环使用。如图1 2 所示。此后在1 9 6 7 年，u p d i k e 并1 h i c k s l 9 又根据这一原理，首次在铂电极的表面上覆 秦艳：基丁类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 i l 。1 。1 。一。1 7 一 盖了一层葡萄糖氧化酶膜，从而得到了葡萄糖生物传感器，血清中的葡萄糖能够被 其定量的分析，由此第一支葡萄糖生物传感器成功地完成了，这代表着第一代生物 传感器的已经初步形成。从此以后，学者进一步的发展和研究了酶电极生物传感器 的性能。 丌，口 口口e n z y m e ，- i i 产 e l e c t r o d e j 刚嗽 e - - s o l u t i o n f i g u r e1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h ef i r s tb i o s e n s o rg e n e r a t i o n 然而，由于大气中的氧气分压是不断变化的，溶液中溶解氧的浓度会不断变化， 测定的准确性将受到影响，同时灵敏的信号也很难得到。由于受到诸多外部环境因 素的约束第一代生物传感器测量的准确度和灵敏度都不够理想。但是，由于它的出 现，使得生物传感器技术得到了进一步的发展。 第二代生物传感器 采用一些化学介质( 如二茂铁、铁氰化钾等) 或特定的生物大分子作为媒介体 掺杂到酶层中制备了第二代生物传感器，该种生物传感器使得酶与电极间的直接电 子传输的能力得到了加强，可看成是酶与电极间的电子开关，并使得电极快速反应， 减少了溶解氧的干扰【5 9 1 。 第二代生物传感器的原理如图1 3 所示。酶是一种蛋白质，在生物分子里面包 埋了它的氧化还原活性中心，由于电极表面与其活性中心间的电子传递速率是随两 者| 日j 距离的增加而呈指数衰减，故它与电极表面之间很难进行直接的电子传递，虽 然有时能够传递，但传递速率也很低。在敏感膜中加入电子传递介体后，其可以氧 化酶，使酶蛋白处于还原状态，而电子传递介体本身被还原，但电子传递介体在电 极上可以重新被氧化成氧化状态，由该氧化电流的大小检测待测物的浓度。 扬州人学硕十学位论文 i m m o b i l i z e de n z y m e + m e d i a t o r ：s o l u t i o n e l e c t r o d e j e ub s t r a t e r o d u c t f i g u r e1 js c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h es e c o n db i o s e n s o rg e n e r a t i o n 1 3 酶在电极上的固定方法 在生物传感器中，生物活性物质是传感器的核心部分，制备生物传感器的关键 技术是生物分子的固定化技术唧】，其中生物传感器研制丌发的重要的技术基础是酶 分子的固定化技术。酶是一种具有极高的催化效率、特异性以及高的灵敏度的天然 活性的生物高分子催化剂。但是水溶性的酶其稳定性较差、保存时间短且不能重复 使用，其它产品会在反应过后掺杂在其中，使得很难纯化，所以很难在工业生产中 推广普及，因此，提出了固定化酶的概念和技术并得到了发展。 所谓的固定化酶，就是在特定载体上固定酶分子，底物可以与固定化酶进行分 子交换。币如化学反应中所用的化学催化剂一样，固定化的酶既具有催化特性，又 可以回收，循环使用，可节约大量酶。固定化后可以使得生物活性分子不仅能够处 于不泄漏的状态，而且还可以保持其原有的生物活性，传感器的探头就是由这样固 定化酶与信号转化器的探头组合而成，由此可见，传感器的性能( 如选择性、稳定 性、灵敏度、检测范围与使用寿命等) 很大程度上受固定化技术的影响。 有很多种固定化酶的方法 6 1 - 6 2 ，常见的固定化途径主要有以下几种，大致可分 为四类：吸附法即将酶通过物理或化学方法吸附于无机多孔的具有强吸附特性的载 体材料中( 如分子筛、氧化铝、五氧化二钒等) ；另外，在高分子膜上吸附酶，首 先将一层高分子膜( 如纤维素膜、生物高分子膜等) 先修饰在电极表面，再将生物 敏感分子吸附于高分子膜上，从而制成感应膜电极。包埋法【6 3 】的基本原理是均匀混 合载体和酶溶液后，将酶分子利用物理作用限定在载体的网格中，凭借引发剂来进 秦艳：基丁类水滑石复合材料的酚l 乜化学生物传感器研究 1 3 行聚合反应，酶的固定化得到了实现的方法。此法中没有酶分子的化学变化及酶的 构象变化，而且其反应条件较温和，因而具有较高的酶活力的回收率。共价结合法 的原理：利用载体表面的具有活性的功能基团与酶分子的非必须基团构建成化学共 价键，从而使酶和载体达到不可逆结合的固定化方法，又称载体偶联法。利用共价 结合法所得的固定化酶能够牢固得与载体连接，这样酶不易脱落，且具有良好的稳 定性及重复使用性，同时其不容易在高浓度的基质溶液和盐类等溶液中解离。然而 共价键法有不足之处，如比较复杂的反应条件，一酶的处理条件较剧烈，活化时会使 得酶的高级结构容易发生变化，降低酶的活性。交联法是利用在酶分子和交联试 剂( 如双功能或多功能交联试剂) 之间形成共价键，来构筑三向的交联网架结构， 即发生了酶分子之间交联，同时还存在着一定的分子内交联。目前交联剂中以戊二 醛应用最广。一般其它固定化方法的辅助手段都是交联法。采用不同的交联条件， 可以生成物理性质各异的固定化酶。近年来，还有运用在电化学聚合法来制备酶电 极。这些方法各有利弊，在实验中我们选择的方法( 既可以只使用一种方法，也可 以是两种或多种方法并用) 必须以具体的酶与环境为依据。但无论采用怎样的方法， 酶的固定化应当遵循以下一些原n - ( 1 ) 酶与载体之间应该有一定的结合度，酶不 容易从载体中渗漏出来 ( 2 ) 被固定后的酶要具有较好的稳定性，要在较为宽广的 温度和p h 范围内保持较高的活性：( 3 ) 酶的催化活性要能够保持，酶的结构不能 被破坏；( 4 ) 载体对酶的负载量要大，以保证传感器有较高的灵敏度；( 5 ) 构筑的 酶要保持其选择性，测定过程的干扰少等畔】。 1 4 酶生物传感器的固定化材料 影响电极表面生物酶的活性的因素很多，其中固定化材料的选择对最大保持固 定化酶的活性也起着至关重要的地位，酶生物传感器的检测性能受到酶的固定化程 度直接影响。因此，我们传感器的制备过程中，所需要的固定化材料必须具备良好 的生物相容性、高度亲水性能、化学性质稳定并且能在最大程度上保持固定在电极 上生物酶的活性。常用到的酶固定化材料有很多，主要是无机纳米材料【6 5 舶1 做载体， 也可以有机聚合物【6 7 1 来构筑传感器，同时像凝胶材料以及其它一些生物材料等【6 9 】 都可以用于制备传感器。而在这些材料中，我们更加重视无机粘土的应用，这归因 1 4 扬州人学硕十学位论文 于其具备的优点，如比表面积较大、亲水溶胀特性较好和生物相容性优良等性质。 在本论文中我们主要采用的是三种：类水滑石( l d h s ) 、蒙脱土( 1 a p o n i t e ) 、单壁 碳纳米管( s w n t s ) 。我们将对这三种材料的具体性质作详细介绍。 1 4 1 无机粘土 无机粘土可以用来作为修饰电极的材料，无机粘土材料具有胶体性质和层状结 构。结晶格架有硅氧四面体和铝氧八面体构成结构的基本单元，根据它们的结 合情况，可分为三层格架和二层格架两种，这种无机粘土大部分都是属于页硅酸 盐一类的自然形成的矿物。它们具有如下优点：化学性质比较稳定，具有强氧化性， 且可以经受住高温等。经研究发现通过离子交换这些无机材料能把离子( 如离子交 联聚合物) 结合起来作为电活性离子的载体。固定化酶与电极表面间的电子传递和 催化反应在无机粘土中能够很快的发生。由于这些材料含量( 如天然形成的粘土) 丰富，价格便宜，所以应用更加广泛，已经有相关文献报道关于粘土用来做载体制 备各种生物传感器，故在本文中选用这种无机材料作为生物传感器的固定载体。 类水滑石( l d h s ) 阴离子无机粘土类水滑；石( l d h s ) 7 0 1 是以八面体为基本构造单元，八面体中以会 属离子作为八面体中心，而六个顶角则是氢氧根离子，然后依赖共用边m ( o h ) 6 联 结相邻的八面体从而构成二维延续的配位八面体结构层，由于单元层以面面堆叠形 成的晶体颗粒构成了层状结构，所以它的存在形态大部分是片状的。我们可以将 l d h s 的理想分子式写为【m i ix m i l l l 嘱( o h ) 2 i m 髓【a m 洳n n 2 0 i n t 盯，这里，a 代表阴离子， 金属阳离子由m 和m 川代表，而层内空问和层间地域由i n t r a 和i n t e r ，多余的m 电 荷的产生是由于部分m 被m 川取代，使得l d h s 带有讵电荷，多余的诈电荷可以 用晶体结构中层间的阴离子来平衡，从而维持整个分子的电中性，而且部分水分子 和阴离子存在于类水滑石层板问可供进行交换，故带正电的层板之间的距离我们可 以调控，这样就可以将在类水滑石的层板之间固定生物分子 7 1 - 7 3 】。 迄今为止，都是合成几十到几百个纳米的类水滑石，由于类水滑石( l d h s ) 是 一种层状的化合物，其具有层间催化、层间聚合、层问交换、层间吸附、层问柱撑 秦艳：基丁类水滑石复合材料的酚电化学生物传感器研究 1 5 的性质，可利用不同实验方法将不同的化学物质插入到类水滑石的层板问距，由此 可见，类水滑石的层间区域为化学反应提供了一个良好的微环境7 0 1 【7 3 】【7 5 1 。由于其在 结构上和化学方面具有特殊的物理化学性质，所以它作为离子交换、吸附和催化方 面【7 l 】【7 4 1 的新材料发展潜力巨大。因此，它成为国内外催化学科研究的热点。所以现 在已有采用l d h s 来作为生物传感器的多孔膜材料的报道，在其层板问引入所测物 质的酶，通过响应电流的测定确定是否存在所测物质，这是l d h s 研究的一个具有 发展潜力的方向。 f i g u r e1 4t h es t r u c n i r eo f l a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s 由于类水滑石具有很好的渗透性，多孔性；具有粘土在水溶液中特有的“膨胀” 以及粘土层板独有的插层和离子交换能力，可以有效地提高电化学传导效率【7 3 1 。所 以，类水滑石可有效地固定生物大分子，而且可以应用快速简单的方法制备酶电极， 是构制生物传感器的一种优良的材料。此外，可以利用粘土具有纳米微晶结构的特 性制备透明的胶状溶液，故可同时固定多种酶。从而可以进一步研究多酶系统生物 传感器。 无机粘土l a p o n i t e l a p o n i t e 是人工合成的锂蒙脱石，它是一种阳离子无机粘土，含有镁、锂、硅、 钠等元素，其分子式为： ( m 9 5 5 l i o 5 ) s i 4 0 j o ( o h ) 2 ( n a 十o 7 3 n h 2 0 ) 人工合成锂皂石和天然锂皂石一样，是三八面体层状硅酸盐矿物。单位晶胞由两层 1 6 扬州火学硕十学位论文 s i o 四面体央一层m g ( o o h ) 三八面体组成，顶端的一个氧原子被四面体和八面体 共同拥有。静电作用存在于结构单元问( 图1 5 ) ，如果其它相同晶形阳离子替代了 s i 或者a l 电荷就会使出现在粘土的板层间。例如，f e 2 + 或l i + 、a 1 3 + 被m 9 2 + 替代 后有部分负电荷就将出现在板层中。因此，必须要其它带正电荷的离子来补偿层板 上多余的负电荷，此吐拍反离子积聚在带电层板表面这样就形成了双电层。吸附在 粘土表面或内部的、处于电荷平衡状态的可交换阳离子容易被其它的阳离子取代 1 7 6 。同时，由于l a p o n i t e 在水溶液中较容易发生溶胀形成带负电的胶状悬浮液，有 较好的吸附能力，特殊的结构特征和强大的阳离子交换能力，从而为化学反应提供 了疏松多孔的惰性环境【7 7 】【7 8 1 。 o o x y g e n e o rh y d r o x y l e a l u m i n i u m s i l i c i u i n t e r n a le x c h a ng e a b l e - - f i g u r c l 5c l a yl a y e r sa r ec o m p o s e do f 2 ：l ( t e t r a h e d m l o c t a h e d r a l s h e e t s ) c l a yl a y e r s 1 4 2 单壁碳纳米管 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e ，c n t s ) 是近二十多年来崛起的一种新型纳米碳材 料。由碳原子六元环构成的石墨片卷曲而成的无缝、中空管体。从1 9 9 1 年同本的电 镜专家i i j i m a 【7 9 1 用真空电弧蒸发石墨电发现了碳纳米管，