（植物病理学专业论文）抗生素LP2产生菌的改良、纯化技术及防病机理研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 疑皇 时间：爿年厂月萝f t ， 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同 媒体匕发表、传播学位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名：嘭 乐 时问：毒刁年，月g 品 帆7 m 扣 易 ， q 1 7 p 坪 沈m 农业 学碘j 咩位论文 摘要 抗生素l p 2 是枯草芽孢杆菌s n 一0 2 ( b a c i h u ss u b t i l i s ) 产生的脂肽类抗生豢。本文 对其产生菌s n 0 2 菌株进行了遗传改良、摇瓶发酵条件、发酵液代谢物理化性质、化学 成分分析及纯化技术、发酵液对烟草靶斑病菌的作用机理进行了系统的研究。结果如下： 1 采用自然选育和紫外诱变相结合的方法对b a c i h u ss u b t i l 括进行了菌种改良，获得 高产、高效、避传稳定的菌株s n 0 2 3 ，它比原始菌株抑卣活性提高将近3 0 。确定紫 外线最佳诱变剂量为9 0 s ，致死率约7 5 ，正变率为3 0 。 2e 2 9 种植物病原菌为供试菌，杯碟法测定改良菌株s n - 0 2 3 发酵液的抑菌谱；以 烟草靶斑病菌为指示菌，杯碟法测定发酵液的热稳定眭，酸碱稳定性、光照稳定性及时 储藏性。结果表明，s n 0 2 - 3 发酵液抑菌谱较广，对2 7 种供试植物病原菌的抑菌直径在 2 5 r a m 以上，尤其对黄瓜菌核病菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 、玉米大斑病菌( e x s e r o h i l u m t u r c i c u m ) 、番茄灰霉病菌( b o t r y t i sc i n e r e a ) 、烟草靶斑病菌( t h a n a t e p h o r u sc u m c u m e r i s ) 等具有强烈的抑制作用。将发酵液于5 54 c 、8 5 ，1 2 0 c 处理25 h 抑菌活性没有明显变化： 对强酸和强碱稳定性较差；耐储藏性和光稳定性较好。 3 通过单因子试验和正变试验明确了改良菌株s n 0 2 3 的最佳配方。s n 一0 2 3 菌株的 摇瓶发酵的最佳碳源是蔗糖，最佳氯源为花生饼粉，最佳培养基配方( ) ：牛肉膏05 或l 花生饼粉，蔗糖4 ，n a c l0 1 ，n h 4 n 0 30i 。明确了最佳发酵条件，最 佳发酵条件：接种量0 5 ：培养基起始p h 6 8 7 5 ：装液量5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶。研究 表职，无机盐及微量元素对s n 0 2 3 产生菌的摇瓶发酵具有一定的影响，在菌株s n 一0 2 3 发酵过程中适量的m n s 0 4 和k 2 s 0 4 可提高发酵液活性；而f e s 0 4 和z n s 0 4 则抑制抗生素的 产生；加入少量m g s 0 4 后，发酵效果与对照相当。 4 进行了改良菌株发酵液产生活性物质的纯化技术研究，得到了抗生素l p 2 的粗品。 p h 层析研究表明，发酵液是多组分的。以氯仿：甲醇：水( 6 5 ：2 5 ：4 ) 为展层剂利 用薄层层析法( t l c ) 分析了各组分的化学成分，推测有两个组分为脂肽类抗生素，其 中一个为本实验室已确定结构的表面活性素，用硅胶柱层析吸附色谱法得到了另一抗生 素l p 2 的粗品。 5 以烟草靶斑病菌( t h a n a t e p h o r u sc u m c u m e r i s ) 为指示菌，从对病原菌作用和对植 株抗病性影响两方面研究了s n - 0 2 - 3 菌株发酵液防治病害的作用机理。结果表明， s n 0 2 3 菌株发酵液对烟草靶斑病菌具有较强的抑制和杀菌作用。主要表现在：破坏菌 丝体的细胞膜结构，导致细胞内含物外渗，菌丝体畸变、缢缩、断裂和溶解，使菌丝重 量减少，从而抑制菌丝体的正常生长；但是其作用位点不是菌体的蛋白。s n 0 2 3 无菌 滤液也可诱导p p o 、p a l 酶活的提高，但是对p o d 、c a t 的诱导不是很明显。 关键词：枯草芽孢杆菌s n - 0 2 ，菌种改良，抗生素l p 2 ，发酵条件，作用机理 a b s t r a c t t h ea n t i b i o t i cl p 2 哪l i p o p e p t i d ea n t i b i o t i ct h a tp m d a c e db y 口e c i l l u s s u b t i l i s s n 一0 2 t h es t u a yc o n t a i n e di m p r o v e m e n to ft h es t r a i ns n 一0 2 。f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i n h i b i t o r y s p e c t r u m s t a b i i i t y 。c h e m i c a lc o m p o n e n ta n a l y s i sa n da c t t 0 1 1m e c h a n i s mo ft i l ei m p r o v e m e n t s t r a i nf e r m e n t a f i o nb r o t ht h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ： 1 t h i d u 曲n a t u r eb r e e d i n ga n du vi r r a d i a t i o n , t h es t r a i ns n 一0 2h a sb e e ni m p r o v e d a n d t h es t r a i ns n 0 2 - 3w i t h1 l i g l ly i e l d ，h i g he l g l c i e n c ya n dg e n e t i cs t a b i l i t yw a so b t a i n e dt h e i n h i b i t o r yd i a m e t e ro fs t a i ns n 一0 2 - 3w a sl n c r e a s e db y3 0 c o m p a r i n gt oo r i g i n a ls t r a i nw n h d e a t hr a t e7 5p e r c e n t sa n dp o s i t i v em u t a t i o nr a t e3 0 口e r c e n 把9 0 sw a sa s c e r t a i n e da s a p p r o p r i a t ed o s eo f u v 2t a k i n g2 9p l a n tp a t h o g e n sa so b j e c t f u n g i c i d a la c t i v i t yo f b i o a s s a yo fs t r a i ns n - 0 2 3 f e r m e n t a t i o nb r o t hw a ss t u d l e db y c y l i n d e r - p l a t e 勰s u y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e f e r m e n t a t i o nb m t hh a dd i f f e r e n td e g r e e so fi n h i b i t o r ya c t i v i t y , a c t i v i t ya g a i n s ts c l e r o l i n i a s c l e r o t i o r u m e x s e r o h i l u mt u r c 耙“朋b o t r y t i sc i n e m aa n dt h a n a t e p h o r u sc u m c u m e r i sw e r e t h e s t r o n g e s t ，r e s p e c t i v e l y c y l i n d e r - p l a t ea s s a y w a su s e dt od e t e r m i n es t a b i l i t yo ft h e 岛r m e n t a t i o nb r o 也o fb a c i l l u ss u b t i t i ss n 0 2 3o i lt h a n a t e p h o r u sc “卅c ；删p r i st h er e s u l t s s h a w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o nb r o t hg o u l dk e e pa c t i v i t yw h e nt r e a t e da tt e m p e r a t u r e1 2 0 f o r 2 5 ha n dt h ep hv a l u eb e t w e e n4t o9 w a ss t a b l et od i f f e r e n tt e m p e r a t u r es t o r e da n ds t t n sr a y s h a w e v e r , t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yd e c r e a s e do b v i o u s l yw h e np hv a l u eb e t w e e n1 协3a n dp h v a l u e l 0 3 1 1 塘f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fs n 0 2 3w e r es t u d i e sb ys i n g l ef a c t o ra n da r t h c 。g o n a l t e at h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc a r b o ns o u r c ew a sc a n es u g a r ，t h eo p t i m u m n i t r o g e ns o u r c ew a sp e a n u tf l o wt h eo f t i m u mm e d i u mo f f e r m e n t a t i o nc o n s i s to f c a n es u g a r 4 p e a n u tf l o u r 1 s o d i u me h l o r i d e01 a m m o n i u mn i t r a t e01 t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o ni n c l u d e dt h eo p t i m u mi n i t i a ip h 70 75 ，o5 o ft h ei n o c u l a t i o na m o u n t ，t h e v o l u m eo f m e d i u mi ns h a k i n gf l a s k sa b o u t5 0 m 1 2 5 0 m jf l a s kt h ey i e l da t s n 一0 2 3c o u l db e a f f e c t c db ym i c r o e l e m e n t m a n g a n e s es u l f a t ea n dk a l i u ms u i f a t ec o u l dp r o m o t et h ey i e l do f s n 0 2 3u n d e rt h eo p t i m u r nc o n c e n t r a t i o nw h i l ef e i t o u ss u l f 乱ea n dz i n cs u l f a t ei n h i b i t e di t 4a c c o r d i n gt ot h em e t h o d so fp u r i f i c a t i o n c r u d ee x t r a c to fo n ea n t i b i o t i cl p 2w a s o b t a i n e d b yt h es m d i a so fp hp c ，i t w a sf o u n dm o r et h a nt w oc o m p o n e n t sw a sl nt h e f e r m e n t a t i o nh r o t h 1 址et r i e h h i r o f o r mt oc a r b i u o lt ow a r t e r ( 6 5 ；2 5 ：4 ) a ss o l v e n t ，t l cw a s s t u d i e dt od e t e r m i n ec h e m i c a lc o m p o n e n to fc r u d ed i s t i l l e dl i q u i d ，i ti sp r e s u m e dt h mt w oo f e o r n p o n e n t aw e r el i p o p e p f i d ea n t i b i o t i c s ，w h i c ho n ew a ss u r f a e t i o nh a db e e na s c e r t a i n e db y o u r s t h eo t h e r o l l ec f d d ee x t r a c tw a so b t a i n e da c c o r d i n gt os i l i c ag e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h 5 c o n t r o l l i n gm e c h a n i s mo fs n - 0 2 - 3f e r m e n t a t e db r o m t op r e v e n tt o b a c c ot a r g e ts p a t w 甜a t u d i e d t r e a t e dw i t hs n 一0 2 - 3f e r m e n t a t a db r o m ，t h em e m b r a n eo fm y c e i i u mc e l l sw 日s d a m a g e d ，c o m p a n y i n gr e l e a s eo fs o l u b l ec o n s t i t u e n t s ，m d t h em y c e l i u mb r o k e no rt h e m a l f o r m a t i o na p p e a r a n c e a n vo ft h e mc o u l di n h i b i tm y e e l i u mg r o w t ha n dz o o s p o r e f o n n a t i o nc o m p l e t e l y , h o w e v e r , t h ef e r m e n t a t e db r o t ha i b u m e nc o u l dn o ta c to nt h ea l b u m e n o fm y c e l i u mm o r e o v e r , t h ec h a n g eo fd e f e n s i v ee n z y m ea c t i v i t yi nh o s th a db e e ns t l l d l e d r e s u i t ss h o w e d t h a t p p o 、p a l a c t i v i t y c o u l da d v a n c e i n d u c e d b ys n 一0 2 3 f e r m e n t a t a db r o t h t h ed e r i v a t i o n a le f f e c to f s n 一0 2 3o i lp o da n dc a ti su o te v i d e n c ei nt h ew h o l ec o t l l y s eo f 沈| 5 兀农业上学碘1 学位论空 r e s u l t ss h o w e dt t m tp p o 、p a la c t i v i t yc o u l da d v a n c ei n d u c e db ys n - 0 2 3f e r m e n t a t e db r o t h n ed e r i v a t i o n a le f f e c to fs n 0 2 3o np o da n dc a ti sn o te v i d e n c ei nt h ew h o l ec o i j , i s co f t 弛a t m e n t k e yw o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i ss n - 0 2 ，i m p r o v e m e n to ft h es t r a i n ，a n t i b i o t i cl p 2 ， f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n , c o n t r o l l i n gm e c h a n i s m 刖吾 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 是一种嗜温性的好氧产芽孢干状细菌，其，上理特征 丰富多样，分布广泛，极易分离培养。该茁在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不 污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。一些菌株在 国外已登已为生物杀菌剂，用于防治白粉病、狄霉病、纹枯病、菌核病等多种气传和土 传真菌病害。 枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素有表丽活性素( s u f f a c t i n ) 、抗真菌素( f e n g y c i n ) 和伊枯草菌素( i t u r i n s ) 三大类。s u f f a c t i n 足高活性的生物表面活，陡剂也是具有，泛用 途的生物活性物质。它表现出抗病毒、抗肿瘤和支原体、抗真菌以及一定程度的抗细菌 活性。而f e n g y c i n 对真菌，尤其对丝状真菌有极好的抑制效果。l t u r i n s 是从枯草杆菌菌株 培养中提取出来的一大类脂肽类化台物，包括i t u r i n sa 、b 、c 、d 、e ，芽他茼素d 、f l 猷及抗霉枯草菌素等等。它们对大多数的霉菌具有强烈的抗菌能力， 抗生素l p 2 的产生菌s n 0 2 菌株是本实验室从福建烟草土壤中分离得到的一株枯草 芽他杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 对该菌株的研究已开展了一些工作明确了其分类地位： 针对烟草黑胫病已开笈出高效防病、解钟、解磷及增产特性的多功能生防菌剂：而且已 经从其代谢产物中成功提取了其中一种脂肽类抗生素一生物表面活性素( s u r f a c t i n ) ， 但通过对s n 0 2 菌株发酵液的理化性质研究发现，其代谢产物中还含有其它脂肽类抗生 索的活性成分( 暂定为抗生素l p 2 ) ，有必要对其进行深入研究。 本文在前期工作的基础上对抗生素l p 2 的产生菌s n - 0 2 进行了改良，刘改皇后的菌 株进行了摇瓶发酵条件、发酵液抑菌谱、发酵液中活性物质稳定性、发酵液中其它活性 物质化学成分分析及纯化技术进行了研究，并对其发酵液对烟草靶斑病菌的作用机理进 行了较系统的研究，进一步丰富了枯草芽孢杆菌s n 0 2 的研究内容，为其进一步的丌发 提供了重要的理论依据。 缱阳墩业 竽城上学位论史 第一章文献综述枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展 第一节枯草芽孢杆菌的研究及应用现状 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 于1 9 4 1 年在非洲战役时被德舀医疗军团发现，从马 和骆驼的粪便中分离出来。根据菌落形态以及形成芽他的特点而命名为枯草芽孢杆菌， 是内生芽孢的革兰氏阳性细萄。在芽孢形成初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异 性的防治作用。枯草芽孢杆菌( b a c i f l u ss u b t i l i s ) 是一种嗜温| 生的好氧产芽孢手r 状细菌， 其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养。设菌在自然界中广泛存在，对人畜无 毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。 枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在同时还是植物体 内常见的植物内生细菌，尤其是在植物的根部和低茎部位，目前浚菌已经在黄瓜、辣椒、 水稻、小麦、玉米等农作物上显出很好的病害防治效果。枯草芽孢杆菌最突出的特征足 生长快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽孢，这也有利于生防菌剂的生产、剂型加i 一及 在环境中的存活，定殖与繁殖而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便储存 期长，是一种理想的生防微生物，当今人们的环保意识不断增强生物农药i f 在引起越 来越多的关注，枯草芽孢杆菌杀菌剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生 抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在微生物杀菌剂市场中初露头角。 11 抑菌机制 关于枯草芽孢杆菌防病促生作用机制，近些年国内外学者进行了大量研究，认为其 作用方式多样主要包括营养和空间位点的竞争、分泌抗菌物质、溶菌作用车促进植物 生长等几个方面。 111 营养和空间位点的竞争 拈抗细菌大多为植物根细菌，本身能在植物根部( 包括根内和根面) 和根际土壤中眭 期定殖，人工导入的拮抗体固能抢先到达根的分泌物处，并随根的伸长而沿根尖移动， 优先占领根部的幼嫩部位，较之病原菌而言，抢占了有利的物理学位点和生物学位点， 造成对病原菌侵染的物理阻隔或生态( 位) 排斥应效，使病菌无法接近侵染位点而不能侵 染寄主。另一方面，拮抗菌与病原菌间对相同位点的营养争夺( 包括有机质和微量元素) ， 是拮抗菌控制病菌繁殖的又一重要方式。营养竞争只在少数菌株中发现，有些菌株通过 产生一种铁载体与植物病原菌竞争铁元素，抑制病原菌的生陡，从而使枯草芽孢丰t 菌占 据一定的生态位，枯草芽孢杆菌以位点竞争占优势，位点竞争方式是在植物根际、体表 或体内及土壤中定殖。等研究表明，b a c i l l u ss u b t i l i sb s 一2 和b s 一1 菌株可通过浸种、灌根 和涂叶等接种方法进入番茄等多种非自然宿主植物体内定填。b a c 订m ss u b t i l i sb s 一2 0 8 菌 株存番茄叶面分布不均，大多定殖于伤口周围叶面豹凹陷处和绒毛的根部，且能够在自 然土壤中成功定殖，在温室条件下3 0 d 种群数量才开始下降，在e 日h 条件1 3 d 丌始显著下 牮一帝卫i 瓠综述i 1 毕并化 f 诎m 疗棺物， 占们圳，：j 艟 降。a s a k a 等对b a c i l l u ss u b t i l l s r b l 4 和n b 2 2 研究表晴其在土壤中以细胞存衍- + q t 日_ 1 州后 ( 大约】4 d ) 主要以芽孢形式在土壤中长期存活。b a c o n 分离的玉米内生枯草芽孢十r 菌与玉 米病原真菌串珠镰孢菌( f u s a r i u m m o n i l i 如r m es h e l d o n ) 有相同的生忐位，枯草芽纯剃国 能在玉米体内迅速定殖和繁殖，可有效降低串蛛镰孢菌及其毒素的积累。 1 12 分泌抗茁物质 1121 抗菌物质的种类 自1 9 4 5 年j o t m s o n 等报道枯草芽抱杆菌产生抗菌物质后，近半个多世纪以来，人们从 枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现t s o 垂：种抗生素。枯草芽孢丰f 菌产生的抗苗物质大多为 低分子抗菌肽，有环状肽或环状腊肚，也有些为线状肽，分子量约1 0 0 0 d a ( 介j ：3 0 0 3 0 0 0 d a ) ，但也有一些为蛋白类拮抗物。大致包括以下几类：细菌素( b a e t e r i o c i n ) ，荧光素 ( f l u o r e s c e i r d p y o v e r d i n e s ) 、酚类物质、多肽类抗生素、蛋白质类抗真菌景及挥发性抑菌 物质等其它抗生素。u t l d a e d e 和r a h e ( 1 9 8 0 ) 发现b s u b t i l i s 能产生抑韦l j s + c e p i v o r u m 的抗生 素；b r o a d b e n t 等( 1 9 7 1 ) x c a l a 菌株在离体条件下的广谱抗生作用研究后认为媛菌是通 过对聚居于植株根部的有害微生物或其毒素的抑制作用促进植株生长的ic u b e a 等 ( 1 9 8 5 ) 对b s l 菌株的抗生试验研究显示，该菌株自对包括青霉菌( p e n i c i l l i u ms p p ) 在内的 2 6 种大豆种子病菌起杀菌或抑菌作用，即使经高压灭曲后的培养物滤液仍能抑制病菌 p h o m o p s & s p p 的生长和子座的形成：d u a l e a w ( 1 9 5 5 ) 、m c k e e n 等( 1 9 8 6 ) 、b a k e r 等( 1 9 8 3 ) 、 p u s e y n l w i l s o n ( 1 9 8 4 ) 分别用bs u b t i l i s 的不同分离物进行的兽类病害防治试验一致表明， 产生抗生素是巨菌的共同肪病机理，业已发现r s u b t i l i s 类抗生体可产生诸如枯草菌象 ( s u b t i l i n ) ，杆菌毒霉素( t o x i m y c i n ) 、伊枯草菌素a ( i t u r i n a ) ，抗霉枯草菌素( m y c o s u b t i l i n ) 、 酶基肽( a c y l p e p t i d e ) 、优霉素( e u m y c i n ) 、伊枯草菌素c 及枯草杆葫肽( b a c i t r a c i n ) 等多肽 类抗生素，多肽抗生素2 6 a 和杆苗毒素sl d ( b a c i l l o m y c i ns l d ) 等蛋白类抗真菌素，有的 甚至还能产生挥发性的抑菌物质。这些抗菌物质或抑制菌丝生长或抑制孢子萌发或一者 兼具，对病菌产q 二有效的拮抗作用。例如r s u b t i l i s n c b 8 8 7 2 及p r s 5 ( 杨佐忠，1 9 9 2 ) 等 菌株产生的挥发性代谢物质几乎可完全抑f f l l p e n i c i l l i u ms p p ，a s p e r g i l l u so c h r a c e m 及 r s o l a n i 等病菌菌丝的生长、孢子及毒素的形成，阻止病害的发生。生产实践中上要通过 改变土壤或特定空间f 如包装容器) 的气体组成而抑制病菌生长的。在己知的j o 多种抗生 素和植物毒索中，绝大多数都是不常见的氨基酸，多肽或含氨( n ) 杂坏化合物等次生代 谢产物。 枯草芽孢丰菌抗菌代谢物还有几丁质酶、b 1 3 葡聚糖酶等。上海市农业科学院 植物保护研究所已研究证明，产几r 质酶枯草芽孢杆菌( m 菌株的固体培养物在对黄瓜扶 霉病菌和番茄叶霉病菌抑菌试验中，抑茼活性物质存在于过滤上清液中，它们是从酸沉 淀物中提取出的伊枯草菌素、生物表面活性素和存在于赫析耦蛋白中的几丁质酶。 许多枯草芽孢杆菌生长代谢过程中还会分泌一些抑制植物病害的活性蛋白，生防作 用显著。b s 一9 8 菌株能强烈抑制苹果轮纹病菌( p h y s a l o s p o r a p i r i c o l a ) 等植物病原真菌。氯 基酸组分分析表明该蛋白含1 1 种不同的氨基酸，尤其富含省氯酸和半胱氮酸等。纯化 后的蛋白组分对苹果轮纹病菌、芦笋茎枯病菌等有很强的抑制作用其抑菌机理主要是 溶解细胞壁，造成菌丝畸形。艳子不发芽或发芽异常。还有一些未知蛋白在抑制植物病 原菌方面也表现出强烈的作用。8 0 1 1 3 菌株对水稻自叶枯病菌( x a n l h o m o n a s o r y z a e p v o r y z a e ) 有强烈的抑菌作用，对中国各稻区的白叶枯病菌的7 种致病型都有强烈的抑杀 作用，它分泌的蛋白对水稻白叶枯病菌表现出良好的广谱抗性以及丰富的抗苗洒性峰。 b - 9 1 5 菌株能分泌多种抑菌蛋白，对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑制作用； b s l x 0 4 菌株对桑炭疽病病原菌的菌丝生长和分生孢子的萌发具有较强的拮抗作用其 产生的蛋白能使菌丝生长受阻并产生畸形。 t a m e h i r o 等研究发现，一种新的磷脂类抗生素( 命名为b a c i l y s o c i n ) 在1 5 8 菌株细胞中 积累，通过核磁共振和质谱结构测定，阐明其结构为卜( 1 2 一甲基四要酰基)3 一磷酸甘 油，针对某些真菌b a e n y s o c i n 的抗菌活性显著。 b 2 菌株多烯类化合物已报道的有b a c i l l a e n e ，d i f f i c i d i n 和o x y d i f f i c i d i n ，通过抑制原核 生物的蛋白台成来抑制病原细菌的活性。高学文等研究发现的多烯娄化台物与b a c i l l a e n e 具有相近的分子量组成和紫外吸收光谱，推测其由碳链变异体( i s o f o r m s ) 组成有抑制真 菌孢子萌发的作用；而推测另种抑菌活性物质的分子量为5 6 4 d a ，紫外吸收峰为3 7 0 n n 。 这些抑菌物质的具体化学组成和结构，咀及对其他植物病原微生物的抑制活性有待于进 一步鉴定。b s l 菌株能产生抗酵母类真菌和革兰氏阳性菌的抗生素。b s i 在p d b 培养基 中发酵至少产生3 种亲水性的抗真菌活性化台物，对其中一种化合物结构的初步分析表 明，该化合物含有共轭双键但无任何氨基酸残基，与目前己知的枯草芽孢杆菌产生的抗 生桑都不同，很可能是一种新的非肽类抗真菌化台物。该化合物分子中不含氨基酸残基 这与枯草芽孢杆菌抗生素绝大部分是肽类或带有氨基酸残基的现象不同，也与l q 前我们 所知的枯草芽孢杆菌非氨基酸类抗生素不同。 112 2 枯草芽孢扦菌产生的脂肽类抗生素 枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素有s u r f a c t i n 、f e n g y c i 暗g i t u r i n s = 大类。s u r f a c t i n 是高活性的生物表面活性剂，也是具有广泛用途的生物活性物质。它表现出抗病毒、抗 肿瘤和支原体、抗真菌以及一定程度的抗细菌活性。i 葡 f e n g y c i n 对真菌。尤其对丝状真 菌有极好的抑制效果。目前枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质研究比较多的有伊枯草菌素 ( i t u r i n s ) 等。 ( ”伊枯草菌素( i t u r i n s ) 伊枯草菌素是从枯草杆菌菌株培养中提取出来的一大类脂肽类化合物，包括i t u r i n s a 、b 、c 、d 、e ，芽孢菌素d ，f 、l 以及抗霉枯草菌素等等。它们对大多数的致病酵母 和霉菌具有强烈的抗菌能力但是它们对细菌的抗菌能力仅限于某些细菌，如藤黄微球 菌( m i c r o c o c c u s l u t e u s ) 。c h o - - s o o - - j i n 等报道将抑制炭疽病害的b ，s u b l l i sk s 0 3 通过肉 汤培养之后经过丁醇提取，d e a e 琼脂糖凝胶c l 一6 b 层析，制各型薄层层析仪分离纯化 第一常业被练过协毕* 他朴西j j i 掐+ 口物仙* 的川，e 血腱 通过串联质谱仪分析证明，其土要抗卣化合物是分子量为i i ) 4 2d ，的伊枯草茼景 ，。 ( 2 ) 生物表面活性素( s u r f a c t i n ) 生物表面活性素由于其卓越的表面活性剂性质最初由a r i m a 等鉴定和命名，它是分 子量约1 0 0 0 d a 的环腊肽类物质，其化学结构山k a k i n u m a 等确定为含有7 个u 一氮基酸和县 有1 3 、1 4 或1 5 个碳原子的b 一羟基脂肪酸构成的大环内酯型脂肽娄化台物被称为杯擀 表面活性素( s t a n d a r ds u r f a c t i o n ) 。它是已发现的最强的一类生物表面活性剂，具肯广 泛的潜在工业应用价值，如洗涤剂制造、油类回收、细胞破砰等此后表皿活性索家版的 成员不断增加，分别来源于天然的、生物台成的或基因工程产生的肽链或脂肪酸链的受 异体。此后，表面活性素家族的成员不断增加，分别来源于天然的、生物合成的或基因 r 程产生的肽链或脂肪酸链的变异体。 表面活性素不仅是高活性的表面活性剂，同刚也是具有广泛用途的生物活性物质。 它的作用机制包括能与细胞膜上的磷脂互作引起离子通道的形成，螫舍一，二价阳离子 从而抑制多种酶类c y c l i c a m pp h o s p h o d i e s t e r a s e 和胞质p l a 2 的活十牛。而膜活| 生的的表面 活性素还可以与病毒脂膜豆作束破坏病毒脂膜和衣壳，从而具有抗情毒活性。一般认为 由枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性素无直接抗真菌能力但是n j 以加强伊枯草菌素的 抗真菌能力。由此可见，表面活性素在医学和农业生物防治领域具有广阔的应用前景， 是很有希望丌发的环保型生物源农药， ( 3 ) 抗真菌素( f e n g y c i n ) f e n g y c l n 是另一种研究得比较深入的脂肽类抗真菌素，包括f e n g y c l na 和b 。f 2 9 3 菌株产生的f e n g y c i n 是环状脂肚。 1123 抗菌物质的合成途径 枯草芽孢杆菌抗菌物质合成途径包括核糖体途径和非核糖体途径，非核糖体途径合 成的脂肽抗生素在多数菌株中被合成，是拮抗活性作j i j | 的主要成分。脂肽抗生素根掘其 结构上的差异分为i t u r i n 家族、s u r f a c t i n 和f e n g y c i na 、b ，加上一些结构未知的坏肚抗生 素，如b a c i 8 珊s u b t i l i s t g 2 2 6 产生的一种新的抗真菌d , i 盘l p 2l 。i t u r i n 家族成员包括l t u r i n a 、c 、d 、e ，b a c i l l o m y e i nl 、d 、f ，m y c o s u b t i l i n 。其他非核糖体途径合成的抗菌物 质如某些菌株分泌的挥发性抗菌物质( a v f s ) 、2 肽抗坐素，环状i ：t a m y c o b a c i l l i n 等。仫 糖体选径合成的抗茼物质直n b o t r y c i d i na j l 3 1 6 、a l i r i n b 2 1 等细菌素，几丁质酶及乙酰基 氨基葡糖苷酶( n a g a s e ) 等细胞壁降解酶娄、一些未鉴定的抗菌蛋白如谢海平等投现 b a c i l l u ss u b t i l i sb s l 合成一种新的非肽类抗真菌化合物。 11 3 溶菌作用 许多i r s u b t i l i s 类拈抗体产生的次生性代谢物质对病原菌的苗丝或孢子的细胞壁产，上 溶解作用，致病菌细胞壁穿孔、畸形、菌丝断裂、原生质消解、外溢而砖失活力。例如， b , s u b t i l i s p r s 5 菌株的代谢产物可使r s o l a n i 菌丝分隔增多、隔日变短、胞内原生质消斛、 胞壁大量穿孔或不规则消解、菌丝缩短、断裂、原生质外溢解体而失活。林福呈等在分 i j ：相农业大学埘! j 。学位论上 离了9 7 6 株细菌分离物后发现来自甘蔗根围的1 株枯草芽孢打菌f l , u 对立丰古丝核病 ( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、终极腐霉护h v t h i u mu l t i m u m ) 和西瓜枯萎病菌( f u s a r i u mo x y , y p o r m f s p n i v e u m ) 在p d a 平板上的对峙培养过程中不形成抑菌幽，但4 d 后可使上述植物病原真 菌的菌丝溶解。s 9 菌株对立枯丝核菌的作用过程是通过吸附在病原真菌的菌丝上，片随 着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质消解菌丝体。 1 1 4 促进植物生长 很多b s u b t i l i s 抗生体除能直接拈抗病菌外，还能加速植物种子萌发，增强植株生势 起到避病或抗病作用。b a c k m a n 等( 1 9 8 2 ) 、b r o a d b e n t 等( 1 9 7 7 ) 分别用a b g ) 4 0 0 0 菌株处理 花生种子，用a 1 3 菌株处理灭菌土壤均大大加快了花生、茄子、马齿苋、石竹等种子的出 苗进度，减少了种腐和猝倒病的发生。经处理的幼苗根系发达，苗茎增丰几，叶数增多， 抗病性增强产量增加。福建农林大学植保学院从辣椒叶片筛选到的内生枯草芽绝卡f 菌 b s 一2 能在多种植物体内定殖，对多种植物炭疽病具有良好防治效果，并能促进多种植物 生长。 12 生防枯草芽孢杆菌育种研究 通过育种可以提高有效产物的产量或质量、改善蔺种特性、简化工艺条件以及开发 新品种等，其方法有诱变育种、杂交育种、基因工程育种及代谢控制育种。对生防帖草 芽孢杆菌的育种研究主要集中在诱变育种和基因工程育种，通过育种提高其抗菌物质产 量和改善菌种特性。诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等优点，通过诱变提高枯 草芽孢杆菌生长速度及其抗菌物质的产量，增强枯草芽孢杆菌拮抗活性。o i u l i a n ob e m a l 等使用a c r i d i n e o r a n g e 作诱变荆以b s u b t i l i s m 7 为出发菌株选育出突变株m 4 0 ，废突变株 在p d a 培养基上对r c i n e r e a 拮抗效果明显增强。陈志谊等通过自然选育、紫外诱变和硫 酸二乙酯诱变选育出1 株突变株，其拮抗性能比原始出发菌株b 一9 1 6 提高t 2 1 0 ，生长 速度提高t 3 2 9 。叶枝青等利用离子注入诱变筛选获得了高效真菌拮抗菌b a c i l l u s s u b b l # j a 。随着生防枯草芽孢杆菌拮抗基因的分离克隆、表达调控，抗菌物质产生遗传 机理研究工作的进展，通过基因工程育种改善枯草芽孢杆苗菌种特性，提高枯草芽孢杆 菌抗菌物质的产量及开发新的品种成为可能。陈中义等通垃质粒载体将b t 杀虫蛋白基凼 c r y l a c 毒性编码区导入水稻生防菌株b a c i l l u ss “6 f 玎括b - 9 1 6 中，室内试验显示重组菌株具 有良好的杀虫防病作用和遗传稳定性。王益民将s e f r a t i a m a r c e s c e n s 的几丁质酶基园和 r c i c u l a n s 的b 一1 ，3 葡聚糖酶基因导入菌株b 9 0 8 中，积价工程菌株对rs o l a n i 菌丝的裂解 作用得到进一步提高。高学文等将i p a 8 3 基因转入枯草芽孢杆b a c i l l u ss u b t i l i s1 6 8 菌株所 构建的工程菌g e b 3 产生的脂肽类抗生素种类表明，g e b 3 能产生一种脂肽类抗生素表面 活性素( s u r f a c t i n ) 。由于枯草芽孢丰丁菌拮抗基因特别是抗生素合成基因有结构复杂的基 因旗构成，遗传操作比较困难导致构建基因工程葡株难度增加，但枯草芽孢杆已作为革 兰氏阳性细菌的典型代表第一个完成全基园组序列测定，具有良好的遗传操作性，有芙 技术还需进一步研究。杂交育种技术也被尝试应用于生防枯草芽孢杆菌，如唐史华将 靖一帝蔓献绵墟 * 芹出轩菌阢店植物埘击的川，lj 腱 b a c i l l u ss u b t i l i b 9 0 8 与b t h u r i n g i e n s l ，7 2l 6 原生质体融合，构建丁蒹防编增产和杀虫作 用的融合子c f i 。育关枯草芽孢杆菌代谢控制育种的研究还来见报道。 13 枯草芽孢杆菌作为生防因子的应用现状 枯草芽孢丰t 菌具有抑制植物疠害的能力又是自然界中广泛存在的非致病细茼和植 物内生细菌，对人畜无害，不污染环境而备受各国研究工作省的占睐。其芽也具自抗逆| ，士 好、利于保藏的特点，叉能忍受极端的外部环境而长期存活，较适合于制成生物制剂应 用。目前一些枯草芽孢杆菌优势菌株已经作为生物农药投八到植物病害应h j 中。迄今 为止，已报道的枯草芽孢杆菌豢生物农药产品基本都是芽孢制剂还没有见到将枯草芽 孢杆菌抗菌代谢产物直接加工成生物农药产品的报道