（微生物与生化药学专业论文）粘红酵母在高氮环境中油脂的合成及关键酶的研究.pdf

作者签名：童擎蓝益 日期： 盈! ! 耳笸目 日 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在必解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：盔晕蛊篓日期：趁2 呈茸五日 导师签名：纠丝翅型日期：2 1 “堡6 曰2 日 一- 吵描“吼j 曲- p - 一一 。一 杜“m “ 舢缸f “。_ ； 。一一一一 学位论文数据集 中图分类号( q 8 1 】学科分类号 3 5 0 2 5 论文编号 1 0 0 10 2 0 1 1 1 2 4 2 密级内部事项 学位授予单位代码 1 0 0 lo 学位授予单位名称北京化工大学 作者姓名 郭贵英 学号 2 0 0 8 0 0 1 2 4 2 获学位专业名称微生物与生化药学获学位专业代码 10 0 7 0 5 课题来源国家自然科学基金研究方向微生物油脂 论文题目粘红酵母在两氮环境中的油脂合成与关键酶的研究 关键词微生物油脂物质代谢，柠檬酸裂解酶和苹果酸酶 论文答辩日期 2 0 1 1 0 5 2 3 论文类型基础研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名职称工作单位学科专长 指导教师张栩副教授北京化工大学生物化工 评阅人1冯嵬教授北京化工大学生物工程 评阅人2徐家立研究员中科院微生物所酶工程、生物化工 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席冯嵬教授北京化工大学生物工程 答辩委员1王芳 教授北京化工大学生物工程 答辩委员2张丽叶教授北京化工大学生物材料 答辩委员3张鹏副教授北京化工大学 微生物学 答辩委员4田平芳副教授北京化工大学分子生物学 答辩委员5 注：一论文类型：1 基础研究2 应用研究3 开发研究4 其它 二中图分类号在( 中国图书资料分类法查询。 三学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b t1 3 7 4 5 9 ) 学科分类与代码中 查询。 四论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成 摘要 粘红酵母在高氮环境中油脂的合成及关键酶的研究 摘要 油价的波动飙升，使生物柴油的前景更加光明。但是较高的生产 成本仍然是制约生物柴油规模化的关键因素。利用粘红酵母发酵味精 废水生产微生物油脂，既可以减轻大量的有机废水对环境的压力，同 时又可得到微生物油脂。因此，该项研究以其经济和环保的双重意义 备受关注。然而味精废水中往往含有较高浓度的铵盐( 1 5 _ 2 5 9 l - 1 ) ，这 严重影响了微生物生产油脂。 本文重点利用摇瓶发酵对经诱变后的粘红酵母在高氮环境下的 生长代谢、油脂积累情况及油脂合成的关键酶一柠檬酸裂解酶和苹果 酸酶进行了研究。 在高氮简单培养基中，粘红酵母经过摇瓶培养7 2 h 后，硫酸铵浓 度为1 4 0 9 l 1 时的最大生物量为6 3 9 l ，仅是2 0 9 l _ 1 时的5 1 1 4 。 培养液中硫酸铵浓度高于2 0 9 l 。1 时，单细胞油脂含量随着硫酸铵浓 度的增加并没有明显的降低反而呈现轻微的上升趋势。硫酸铵浓度为 6 0 9 l 1 时，a t p ：柠檬酸裂解酶的总酶活和比酶活都达到最大值。油 脂的脂肪酸主要为棕榈酸( c 1 6 ：o ) ，硬脂酸( c 1 8 ：o ) ，油酸( c 1 8 ：1 ) 和亚 油酸( c 1 8 ：2 ) 。 在混合废水中，生长情况和在高氮简单培养基中的生长情况具有 相似的变化规律。虽然在同一硫酸铵浓度的环境中，粘红酵母的生物 北京化工大学硕士学位论文 量比在高氮简单培养基中低的多，但是油脂的脂肪酸组成却完全相 同。此外，粘红酵母的油脂含量和苹果酸酶的总酶活呈简单的线性关 系，其中相关系数r 2 = o 9 6 9 7 。这为微生物油脂在高氮环境下的规模 化生产提供了理论支持和指导方向。 关键词：微生物油脂，物质代谢，柠檬酸裂解酶和苹果酸酶 i i a b s t r c t s t u d i e so nt h em e c h a n i s mo fl i p i ds y n t h e s i s a n d k e ye n z y m ei nr 日o d d7 刁皿( ，7 l 4g 乞( 厂z m a b s t r a c t t h ep r o s p e c to fb i o d i e s e li sb e c o m i n gm o r ea n dm o r ep r o m i s i n g b e c a u s eo ft h er i s i n gp r i c e so fw o r l d w i d eo i li nn u c t u a t i o n b u th i g h p r o d u c t i o n c o s ti ss t i l lt h em 句o rf a c t o rt oh i n d e rt h e l a r g e s c a l e p r o d u c t i o no f b i o d i e s e l a v e 巧p r o m i s i n g 印p r o a c hp r e s e n t e di no u re y e si st h ep r o d u c t i o n o fm i c r o b i a lo i lv i af e r m e n t a t i o nf 而mm o n o s o d i u mg l u t 锄a t ew a s t e w a t e r b yr 五d 如幻删勉g 觑f 砌括t h i sw a yn o to n l yc a nr e d u c et h ee n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n 铲e a t l yb yd i s c h a r g i n gl e s sw a s t e w a t e r ，b u ta l s oc a np r o c l u c e m i c r o b i a lo i l s ，w h i c hw o u l db eu s e da sa ni n e x p e n s i v ei a wf o rb i o d i e s e l p r o ( 1 u c t i o n t h e r e f o r e ，t h es t u ( 1 y i sc o n c e m e dw i d e l yf o rt h ed o u b l e m e a n i n go f i t s e c o n o m ya n d e n v i r o n m e n t h o w e v e r t h e h i g h a m m o n i u m nc o n c e n t r a t i o n ( 15 2 5 9 l 。1 ) i nt h ew a s t e w a t e rh a sa n e g a t i v ei n n u e n c eo nt h ep r o d u c t i o no fl i p i da c c u m u l a t i o n t h eo l e a g i n o u sy e a s tw a sc u l t u r e di nt h eh i g hn i t r o g e ne n v i r o n m e n t a n ds o m eg r o 叭h ，l i p i da c c u m u l a t i o na n da t p ：c i t r a t el y a s ea n dm a l i c e n z y m ew e r es t l l d i e di nt h i sp a p e r _ _ _ _ 。1 。_ 。_ _ _ _ _ _ _ _ 。 北京化工大学硕士学位论文 i nt h eh i g hn i t r o g e ns i i n p l em e d i a ，t h em a x i i m l mb i o m a s so b t a i n e d w a s6 3 9 l 1a r e r7 2 - h o u rc u l t i v a t i o n ，w h i c hw a s51 1 4 o ft h a tw h e n t h ec o n c e n t r a t i o no fa m m o n i u ms u l f a t ew a s2 9 l - 1 l e v e l so f 锄m o n i u m s u l f a t ei ne x c e s so f2 0 9 l 。1s u p p r e s s e dt h eg r o w t ho fm i c r o o 玛a n i s m s i g n i f i c a n t l y w h i l ec e l l u l a r l i p i d c o n t e n tw a s s l i g h t l yr i s i n g t h e m a x i m u mv a l u e so ft o t a la n ds p e c i f i ca t p ：c i t r a t el y a s ea c t i v i t i e sw e r e o b s e r v e da tt h e1 e v e lo f 6 0 9 l 1 1 1 el i p i d sw e r em a i n l yc o n l p o s e do f f o u r l ( i n d so f n t ya c i d s ( f a m e s ) ，i n c l u d i n gp a l m i t i ca c i d ( c16 ：o ) ，l i n o l e i c a c i d ( c 1 8 ：2 ) ，o l e i ca c i d ( c 1 8 ：1 ) a n ds t e a r i ca c i d ( c 1 8 ：o ) i nt h em i x e dm o n o s o d i u mg l u t a m a t ew a s t e w a t e r ，t h eg r o w t ht o o ko n as i m i l a rt e n dw i t ht h a ti nt h ea b o v em e d i a t h o u g ht h eb i o m a s si sm u c h l o w e ra tt h es a m el e v e lo fa 衄o n i u ms u l f a t e ，t h ec o n l p o s i t i o no ff a t t y a c i d s ( f a m e s ) h a sn od i f f e r e n c e i na d d i t i o n ，t h e r ei s as i h l p l el i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h el i p i dc o n t e n ta n dt h et o t a la c t i v i t yo fm a l i c e n z y i i 】ea n dt h ec o 玎e l a t i o nc o e m c i e n ti so 9 6 9 7 k e y w o r d s ：m i c r o b i a lo i l s ，s u b s t a n c em e t a b 0 1 i s m ，a r p ：c i t r a t el y a s ea n d m a l i ce n z 弭n e 目录 目录 第一章绪论1 1 1 国内外能源的现状和发展前景1 1 2 味精废水简介4 1 3 微生物油脂的相关研究5 1 3 1 产油微生物的种类和微生物油脂简介5 1 3 2 微生物油脂的研究现状5 1 3 3 生产微生物油脂的原料6 1 3 4 微生物油脂的代谢7 1 3 4 1 脂肪酸的合成代谢8 1 3 4 2 脂肪酸的分解代谢9 1 4 选题依据、研究意义及研究思路1 1 1 4 1 选题的依据及研究意义1 2 1 4 2 研究思路1 2 1 4 2 1 粘红酵母在高氮优化培养基中的培养培养1 2 1 4 2 2 粘红酵母在混合味精废水中的培养1 2 1 4 2 3 粘红酵母油脂代谢关键酶的研究1 3 第二章实验材料和方法15 2 1 实验材料1 5 2 1 1 实验试剂1 5 2 1 2 实验仪器1 5 2 1 3 菌种1 5 2 1 4 培养基1 5 2 2 菌种培养方法1 6 2 3 分析方法1 6 2 3 1 生物量的测定1 6 2 3 1 1 称重法1 6 2 3 1 2 浊度比色法1 6 2 3 2 发酵液中葡萄糖含量的测定1 7 北京化工大学硕士学位论文 态氮的测定1 7 值测定1 9 脂的提取1 9 脂脂肪酸成分的测定2 0 活的测定2 0 检测方法2 0 粗酶液的制备2 1 蛋白质浓度的测定2 1 酶活性检测2 2 粘红酵母在高氮简单培养基中的生长与油脂积累2 3 ：3 材料2 3 验试剂2 3 验仪器2 4 种2 4 养基2 4 培养方法2 4 方法2 4 物量测定2 5 酵液中葡萄糖含量的测定2 5 态氮的测定2 5 值测定2 5 脂的提取2 5 脂脂肪酸成分的测定2 5 和讨论2 5 酸铵浓度对粘红酵母生长的影响2 6 及氨氮的利用情况2 6 物转化情况2 8 脂成分的分析3 0 3 1 粘红酵母在高氮味精废水中的生长及油脂积累3 3 目录 4 1 前言3 3 4 2 实验材料3 3 4 2 1 实验试剂3 3 4 2 2 实验仪器3 4 4 2 3 菌种3 4 4 2 4 培养基3 4 4 3 菌种培养方法3 5 4 4 分析方法3 5 4 4 1 生物量测定3 5 4 4 2 发酵液中葡萄糖含量的测定3 5 4 4 3 氨态氮的测定3 5 4 4 4p h 值测定3 5 4 4 5 油脂的提取3 6 4 4 6 油脂脂肪酸成分的测定3 6 4 5 结果与讨论3 6 4 5 1 粘红酵母在味精废水中的生长情况3 6 4 5 2 粘红酵母在味精废水中氨氮的代谢3 8 4 5 2 1 粘红酵母对氨氮的利用3 8 4 5 2 2 氨氮在细胞中的分配4 l 4 5 3 粘红酵母在混合味精废水中p h 的变化4 2 4 5 4 混合味精废水中粘红酵母油脂含量及成分分析4 2 4 5 4 1 混合味精废水中粘红酵母油脂含量4 2 4 6 小结4 4 第五章粘红酵母油脂合成代谢中关键酶的研究4 5 5 1 前言4 5 5 2 实验材料4 5 5 2 1 实验试剂4 6 5 2 2 实验仪器4 6 5 2 3 菌种4 6 5 2 4 培养基4 6 5 3 菌种培养方法4 6 5 4 分析方法4 6 5 4 1 生物量测定4 6 i t i 北京化工大学硕士学位论文 5 4 2 油脂的提取4 7 5 4 3 酶活的测定4 7 5 5 结果和讨论4 7 5 5 1 粘红酵母苹果酸酶活性的研究4 7 5 5 1 1 粘红酵母在氮源浓度较低的高氮简单培养基中油脂产量及苹果酸酶的 活性4 7 5 5 1 2 混合味精中粘红酵母在废水中苹果酸酶中的活性4 9 5 5 2a t p ：柠檬酸裂解酶的酶活5 0 5 6 小结5 l 第六章结论5 3 参考文献5 5 附录一实验所用试剂5 9 附录二实验所用仪器6 1 致谢6 3 研究成果及发表的学术论文6 5 作者与导师简介6 7 i v 第一章绪论 第一章绪论 1 1 国内外能源的现状和发展前景 上个世纪7 0 年代，相继发生的两次石油危机使各国政府和地区更加清楚地认 识到能源在新时代的战略作用。但是世界人口的急速增加和国民经济发展水平的 逐渐提高，能源消耗却没有丝毫减少的趋势。2 0 1 0 年b p 能源消费报告表明： 从2 0 0 0 年到2 0 0 9 年中国的能源消耗以每年9 4 的平均增长水平快速增加，其中 仅煤炭就增加了9 6 。工业革命以后，人们一直都把煤、原油和天然气作为主 要能源。其中石油在世界能源的消耗中充当了一个重要的角色，占能源总消耗量 的3 8 。目前虽然石油的应用技术非常成熟，但其不可再生性促使其产量逐年减 少。而煤炭的存储量却相对较大，再加上煤炭汽化、液化等高新技术的出现及逐 渐成熟，在今后相当长的一段时间内，煤炭势必将成为人类生产、生活中无可取 代的能源之一【l 】。煤炭和石油不具有可再生的能力，因此它们的产量将会逐年减 少直至枯竭。除此之外这些矿物能源在燃烧过程中会排放大量的废气和灰尘，造 成空气和环境的严重污染【2 】。日益加剧的能源危机和恶化的环境已经成为困扰人 类的重要问题之一。 表卜1 世界新能源的优缺点 1 1 a b l e l 1t h e a d v a i l t a g e sa i l dd i s a d v a n t a g e so fn e we l l e r g ya l lo v e rm ew o r d 北京化工大学硕士学位论文 近年来，随着人们环保和能源危机意识的提高，可持续发展战略被提上了日 。虽然天然气的比例在逐步上升，但是石油、煤炭所占比例却得以缓慢下降。 时，清洁能源也逐渐得以广泛的开发和利用，如核电站的建立、风力和水力发 站的开发、以及太阳能和生物质的应用。 由于经济的发展，另外大量的基础设施也正在建造过程中，中国对石油的 求越来越多。但是我国石油储量较少，只占世界总储量的2 。从1 9 9 3 年开始， 国已由石油进口国成为纯粹的石油进口国。2 0 0 2 年，全国石油总消耗量的1 3 约7 0 0 0 万吨) ，均依靠于进口【3 】。紧接下来的十年间，中国的石油进口总量就 达9 7 4 1 万吨。据估计下个十年，我国的石油进口量还将持续逐年增加。到2 0 2 0 ，对石油进口的比重将达到6 0 以上。由于对进口石油具有较高的依赖程度， 界范围内石油价格的波动往往会对我国经济发展，人民生活水平和国防建设产 巨大的冲击和影响。从经济的持续发展和国家战略安全的视角来看，发展新的 再生的清洁能源势在必行。 但是风能、水能和太阳能的开发利用过程都会对生态和环境造成不同程度 的破坏或污染。核能虽然具有诸多的优点，一度被许多国家认为具有广阔发展 景的能源。但是无论是今年3 月份日本福岛核电站泄露的灾难还是1 9 8 6 年苏联 尔诺贝利发电站的核泄漏噩梦，都不能不让人们对核能讳莫如深。最近欧美等 国民众抗核声浪迭起，各国政府纷纷停止核项目审批或对核电站停工进行全面 修。综合现今新能源的优点和缺点，生物质能源成为解决世界能源危机的最具 希望的方向之一。 生物质能包括两个组成部分：一为传统生物质能，一为现代生物质能。传 生物质能源是生物质资源的初级利用形式，在农村得以广泛的应用，如柴薪等。 代生物质能源是指利用厌氧发酵技术、气化技术等生物转化手段将农林的废弃 转化为可利用的能源。它具上取代常规能源的巨大潜力，实现废物的再利用和 低环境污染的目标。现代生物质能源通过在城市实现废物资源化，在农村发展 气，利用作物秸秆发展燃料乙醇以及生物柴油或者用来发电等，为生产生活提 燃料和能源【4 1 。目前，生物柴油虽然是我国主要的现代生物质能源，但目前每 只能生产2 - 4 万吨左右，因此具有广阔的发展空间。欧洲和美国等许多国家把 物油作为生产生物柴油的主要原料，这在我国是不可取的。首先，我们有限的 地能够保证众多人口的吃饭问题已经是一个了不起的突破，如果再种植油料作 以生产生物柴油是非常不现实和不科学的。其次，以植物油为原料来生产生物 油，势必造成成本过高，原料成本就占总成本的7 0 以上【5 】。另外，由于植物 般生长期很长，造成生物柴油的生产周期也长。种种弊端就使人们不得不开始 开始寻找一种新的生产油脂的方法。目前国内外虽然也采取了一些措施来缓解世 2 第一章绪论 界对油脂的需求，但研究主要集中餐饮废弃油脂方面。但是餐饮废弃物相对比较 分散，因而造成收集非常困难。这为大规模地使用餐饮废弃油脂来生产生物柴油 设置了巨大的障碍。 一战期间，德国人的食用油严重不足，为了解决这一问题，科学家们发现 一些微生物可以生产油脂，并利用这些微生物来生产油脂，从此拉开了人类开发 和利用微生物油脂的序幕。之后美日等国也逐渐开始对微生物油脂进行研究及开 发和生产【6 】。 由于技术不成熟等多种因素，之前的微生物油脂生产的很难达到规模化。 但是，随着自然科学技术的进步尤其是工业微生物的发展，微生物油脂生产无论 是原料还是发酵过程都取得了日新月异的变化。经过短短的半个多世纪的发展， 微生物生产油脂就以其菌体细胞增殖快、生长周期短、底物来源广且价格低廉、 受季节气候变化的影响小、易于进行大规模生产、生产成本低等优势日益受到人 们的青睐。 表卜2 世界各国生物柴油的主要原料及发展现状 t a b l el - 27 n l em a i nm wm a t 嘶a l sa i l dt h ep r e s e n ts i t l l a t i o no f b i o d i e s ed e v e i o p m e n t 北京化工大学硕士学位论文 1 2 味精废水简介 在中国，无论是味精的年平均生产量还是年平均消费量都稳居世界第一，超 过世界总量的7 0 。仅2 0 0 6 年中国味精的生产总量就高达1 4 0 万吨，随之产生的味 精废水总量为2 8 0 0 万吨左右【2 4 1 。这些废水主要来源于各个工艺阶段的洗涤用水、 冷凝水和废弃的发酵液以及离交尾液【2 5 】( 见图1 6 ) 。 每制造一吨味精，就需要洗涤用水l o o 吨，耗水量相当地大。其c o d 为， 1 0 0 0 2 0 0 0 m g l _ 1 。冷凝水虽然也会对环境具有污染，但幅度很小。废弃的发酵 液以及离交尾液虽然在三种废水中排放量最小，但c o d 却最高。另外它的p h 在2 左右【2 6 】。另外，由于在提取谷氨酸的过程中需要添加入大量的浓硫酸和浓氨水， 因此含有较高的铵态氮( 1 5 2 5 9 l - 1 ) 和硫酸根离子( 1 5 2 5g l - 1 ) 。此外，菌体 含量也很高。 味精废水作为一种含糖有机废水，它的c o d 、b o d 、s 0 4 玉、氨氮和菌体 含量都很高，但是p h 却很低，这就是所谓的五高一低的特剧2 1 7 1 。这决定了它是 无法直接排放到环境中去的。否则不仅造成了物质的浪费，也会污染环境。因此 需要找出一种能够处理味精废水的科学方法。现在，尽管有很多种处理味精废水 的方法，但无外乎就是运用物理、生物及化学的技术手段。处理原理源于物理学 的方法有蒸发浓缩法、离心分离法和沉淀法等。蒸发浓缩和离心分离两种方法成 本较高，无法得以广泛使用。沉淀法虽成本低廉，但是无法消除高的c o d 值。 淀粉质粮食一 羔 乳化 l 一_ 爿吾瓣潲腓及 液化 矿 扩 一、 发酵液提取谷氨酸后 糖化 一液以及离交最液。 1l ， 等点结晶、离子交换等 籀精自ell耸看硝带磕蒲ll 牵盏i 硝 嗣到琚h 甘魏鼠反醉似l- l 口飘鼠 图l - 6 产生昧精废水的工艺阶段一 f 逛，l _ 6t h e 或a g eo fd i s c 蛔r g eo f w a s t e w a t 叮c h j n n gt h ep r o 咖c t i o no f m 供o d i u m 曲皿a l 硇上e 4 第一章绪论 废物资源化是环保社会应该时刻坚持的理念。薛飞燕等人用粘红酵母发酵味 精废水生产微生物油脂f 2 8 之9 】，既降低了废水的c o d 值，减轻了对环境的污染，又 可以获得良好的经济效益。 但是废水中高浓度的铵根离子会对产油微生物的生物量和油脂积累产生抑 制作用【3 0 】。r a t l e d g e 等人也认为限氮环境有利于微生物合成油脂。但也有人认为 当环境中的氮源消耗殆尽时，就会抑制苹果酸酶的活性，从而不利于油脂的合成。 1 3 微生物油脂的相关研究 1 3 1 产油微生物的种类和微生物油脂简介 产油微生物是指在适宜的条件下，能够在细胞体内产生并积累的油脂超过 其菌体干重2 0 的微生物。目前在细菌、霉菌、酵母和藻类中均已发现产油微生 物，其中主要是酵母和霉菌f 7 1 。微生物油脂又称单细胞油脂，是产油微生物在一 定的条件下把葡萄糖、废糖蜜、蔗糖或乳糖等不同的碳源转化为油脂，这种油脂 可以在细胞体内积累。微生物油脂主要分布在细胞中的细胞质部位，要么用来组 成细胞的结构即体质脂( 如糖脂或脂蛋白) ，要么以游离的滴状或颗粒状存在。 个别产油微生物的油脂积累甚至可高达菌体干重的7 0 以上。在大多数微生物油 脂中，甘油三酯占油脂总体积的8 0 以上。脂肪酸组成和植物油非常接近，以偶 数碳为主要组成部分。对微生物油脂进行甲酯化后，再利用气相一质谱连用仪器 对其进行分析，发现微生物油脂的脂肪酸主要是由棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂 酸四类物质组成。但也有部分微生物生产的油脂中含有功能性油脂，主要是多不 饱和脂肪酸，如d h a 和e p a 等。这些功能性油脂对血管软化及清理血管垃圾等都 具有重要作用。 1 3 2 微生物油脂的研究现状 虽然微生物发酵油脂的开始利用的历史时间不长，也经历了一段曲折的发 展过程。一战时，德国人为了补充食品供应的不足，利用微生物生产油脂，从此 拉开了人们利用微生物油脂的序幕。二战时，微生物油脂技术得以一定程度上的 北京化工大学硕上学位论文 发展，越来越多的油脂微生物种类被开发出来，并且部分产品还实现了规模化的 生产。但在随后的一段时间内，由于其在成本上与动植物油相比，处在不利的位 置上，因此关于油脂微生物的研究曾经一度被转移到开发功能性油脂上面。1 9 8 6 年，来自于英日等国家的科学家首先把微生物生产的油脂用于保健食品等产品的 生产上，使其开始走向实用化的道路【8 】。 近年来，随着能源危机的加剧、生活水平的提高和人们环保意识的提高， 微生物油脂又一次被提上了日程。同时，微生物油脂无论在用途的开发上和还是 在原料上的选择上都得以大规模的拓展。2 0 0 4 年，p a p a n i k 0 1 a o l l s ，k d m a i t i s 等人 采用深黄被孢霉在高糖浓度下( 1 0 0 9 - l _ 1 ) 进行发酵，发现生物量可高达3 5 9 g l _ ，细胞内油脂含量为5 0 5 5 ，油脂生产能力可达1 8 1 9 l - 1 【9 】。 我国的微生物油脂起步稍微晚一些，上个世纪6 0 年代，国内一些人开始使 用酵母和霉菌来生产微生物油脂。受到国际形势的影响，我国许多科学家曾经也 利用微生物来生产功能性油脂。1 9 9 2 年罗玉萍等分离到一株酿酒酵母 s a c c h a r o m v c e sc e r e v i s i a e 。该菌株单细胞油脂含量可达3 2 0 6 ，棕榈油酸是其主 要的组成部分【l o 】。2 0 0 7 年孔祥莉等人在糖浓度为7 0g l - 1 的高糖培养基上，用斯 达氏酵母菌株进行发酵。结果发现：培养基中9 0 以上的糖都被利用；起始碳源 为7 0 9 l - 1 葡萄糖的条件下，生物量可达1 4 1 9 l - 1 ，单细胞油脂含量为5 5 7 ：起始 碳源为7 0 9 l - 1 木糖的条件下，生物量可达1 3 1 9 l _ 1 ，单细胞油脂含量为5 2 6 ：起 始碳源为混合糖( 葡萄糖4 6 9 l _ 1 ，木糖2 4 9 l - 1 ) 时，生物量可达1 5 o g l - 1 ，单细胞油 脂含量分数分别为4 0 o 【1 1 】。 1 3 3 生产微生物油脂的原料 过去昂贵的发酵底物，导致微生物生产的油脂成本过高，与动植物油相比， 不具有竞争性，更无法实现微生物油脂的规模化生产。因此，寻找廉价的生产原 料是目前亟待解决的问题。近年来科学家对许多的农业废弃物及其他廉价的原料 进行了尝试，并且取得了非常不错的结果。 沈瑁瑁等将大米草水解液经过初步脱毒处理后，采用酵母菌皮状丝孢酵母 ( t r i c h o s p o m nc u f i m 即m ) 直接进行发酵生产微生物油脂。结果表明：该菌的产油 量可高达6 0 9 l - l 【1 2 l 。2 0 0 5 年，李永红等人发现许多产油酵母菌可直接发酵生物 质水解得到的碳水化合物，如五碳糖和六碳糖等，这是和酿酒酵母截然不同的地 方。另外，他们还发现产油酵母油脂中的脂肪酸成分和一般植物油相比，基本上 没有差别。在此基础上，他们还利用生物质水解所得到的混合糖进行微生物发酵， 6 第一章绪论 经过一系列的菌株筛选和发酵、分离和油脂转化条件优化，最终获得了一支高产 油脂菌株，上罐体系油脂产量可高达在5 0 9 l - 1 以上，单细胞油脂产量在5 5 以上 【1 3 】。同年，赵宗保等人还分离出来4 株产油酵母菌。这些菌株可以同时转化葡萄 糖、木糖和阿拉伯糖，并且单细胞含油量都可达5 5 以上。这些特性对木质纤维 素水解物中的全糖利用具有非常重要的意义，可能会在未来生物柴油产业中发挥 重要作用【1 4 1 。2 0 0 8 年薛飞燕等人探索了一种新的生产油脂方法，即利用粘红酵母 发酵含糖废水生产微生物油脂。c o d 降解率可以达到8 5 5 1 士1 o o ，单细胞油 脂含量为9 0 4 士o 1 1 。这不仅带来了经济效益，也可以降低环境污染【1 5 】。 1 3 4 微生物油脂的代谢 人们认识微生物生产油脂已有一百多年的历史，但对油脂微生物油脂积累的 研究也不过二三十年的时间，对微生物油脂代谢的研究则更少。到目前为止，我 国在这一方面的研究较少，几乎查不到相关的中文文献。国外虽然已有较多的研 究，但主要集中在较少数的科研团队或者个人，如r a t l e d g e 等人。所涉及的文章 也大多数是涉及油脂酵母和丝状真菌。 缓棘缚囊麴 黼 。 j 。-t 一 j 1 - h1 桴露囊辫鬻j ：0 ： 一： 囊纛蠢 j j 。 图1 1 柠檬酸转运 f i g 1 一lt h es y s t 锄o fc i 缸吼en 彻s p o r ts y s t 锄 公众的认识就是：当培养环境中碳源充足，而其他营养成分尤其是氮源缺乏 时，微生物油脂往往可以达到一个较高的水平。因为在这种条件下，油脂微生物 细胞由于限制营养缺乏而停止繁殖，将会把环境中多余的糖或其它碳水化合物转 化为脂类。本节将会详细介绍微生物油脂的合成和分解代谢的生物化学和分子生 7 北京化工大学硕士学位论文 物学机理。 目前，人们对产油酵母和产油霉菌以葡萄糖为碳源合成并积累t a g 的代谢途 径的研究已经非常深入。脂肪酰辅酶a 合成t a g 是油脂合成的重要过程。微生物 在油脂的合成过程中的这一重要代谢途径，和其它动植物油脂的合成过程没有太 大的区别，因此不必赘述。图1 1 展示了脂肪酸合成的主要步骤及合成过程中参 与反应的酶。 1 3 4 1 脂肪酸的合成代谢 微生物油脂的合成的起始，和动植物的油脂一样，首先在乙酰c o a 羧化酶 的催化作用下由两分子的乙酰c o a 合成一分子的丙二酸单酰c o a 。然后在丙二酸 单酰c o a 的基础上逐次增加乙酰单位来延伸碳链。 l ；k c o s e 图1 - 2 产油酵母油脂积累代谢调控途径简图 f i g 1 - 21 1 1 em e t a b o l i c 舱g l l l a t i o na p p r o a c ho f l i p i d c 唧u l a t i o ni i lo l e a g i l l o 啦y e a s t 众所周知，脂肪酸的合成是在细胞溶胶中进行，而酰基单位的积累则是在 线粒体中发生，因此一个有效的酰基转运途径是必不可少，而柠檬酸丙酮酸转 运体系( 见图1 2 ) 充当了这一角色。a t p 柠檬酸裂解酶( a c l ) 是三羧酸转运体系 中一种关键酶，它催化胞浆中的柠檬酸转化为乙酰c o a 和草酰乙酸。这样，即使 第一章绪论 培养环境中的氮源或其它的营养元素枯竭，蛋白停止合成的情况下，油脂微生物 仍然可以利用环境中的葡萄糖或其它碳源来合成油脂。a t p ：柠檬酸裂解酶( a c l ) 和苹果酸酶( m e ) 在产油微生物油脂合成代谢调控中起着无可替代的关键作用。 a c l 最早是从老鼠肝脏【1 6 】和粘红酵母【1 7 】中纯化出来。它存在于细胞胞浆中， 将柠檬酸裂解为草酰乙酸和乙酰c o a 。而乙酰c o a 是油脂合成所必需的原料。到 目前为止，油脂微生物无一不具有a c l 的活性。但是具有a c l 的活性的微生物不 一定可以定义为油脂微生物。如一些酵母菌具的却具有a c l 的活性，但是单细胞 油脂含量却不超过l o 。由此可以说，具有a c l 的活性是油脂积累的一个必要条 件，但并不能作为判定是否为油脂微生物的标准【l 8 1 。 另外一个产物草酰乙酸，在苹果酸脱氢酶的催化作用下，生成一分子 苹果酸。这一分子苹果酸再在m e 氧化作用下，脱去一个羧基得到一分子丙酮酸， 同时将一分子n a d p + 接受苹果酸脱下来的h 变成一分子的n a d p h 。丙酮酸可通 过自由扩散，进入线粒体，从而参与新的柠檬酸转运。而n a d p h 为脂肪链的延 伸提供独一无二的还原力。 线粒体中的丙酮酸存在有两条代谢途径，线粒体中的丙酮酸存在有两条代 谢途径，一是通过脱氢、脱羧生成乙酰c o a ；二是通过羧化反应生成草酰乙酸。 一分子乙酰c o a 和一分子草酰乙酸在柠檬酸合成酶( c s ) 作用下生成一分子的柠 檬酸。柠檬酸再次在a c l 的作用下被裂解，从而实现了脂肪酸合成的最重要的物 质循环。 由于脂肪酸的合成需要消耗n a d p h ，因此有人相信油脂积累的量与m e 酶 有人认为油脂积累量与m e 酶的活性关系非常密切。如果苹果酸酶的活性降低， 则油脂的合成将会有明显的下降趋势。w v i l i lj p 等人在培养油脂微生物时，在培 养基中加入芝麻酚( m e 的一种抑制剂) ，结果发现菌株几乎丧失了产油能力【1 9 】。 这是因为：虽然细胞内合成n a d p h 的途径很多，也存在三类m e 酶，但是绝大多 数f a s 只能利用由专一依赖n a d p + 的m e 产生的n a d p h 【2 0 之1 1 。 由于这个原因，一些人怀疑细胞内存在这成脂代谢体( l i p o g e l l i cm e t a b o l o n ) 【勿。据推测：真菌mc 讹伽p 肋抛中含有六个以上的m e 同功酶，这些同功酶 的活性随时空范围或生长环境的变化表现出对不同调控作用【2 3 1 。因此如果能分离 出m e 的基因，并在菌株体内得以选择性地调控m e 的活性，可能会得到油脂产 量令人无法想象的菌株。 1 3 4 2 脂肪酸的分解代谢 9 北京化工大学硕士学位论文 当培养基中的营养尤其是碳源缺乏时，油脂微生物就会利用自身的积累的 级代谢物一高级脂肪酸充当碳源维持自身生长。脂肪酸的代谢主要包括以下几 方面。 灞魏度)泼趁饽) ( 线貔体覆覆) 瑙一 始l 钼 鸯毒 黪醺隗 f 燃陵禳矧ii ； 内 ： 藤戴q i a 墙一q 渡 图l - 3 长链脂肪酸转运体系 f i g 1 - 3 t h es y s t e mo fl o n 争c h a i l lf a t 够a c i d 托髓s p o r t 在真核微生物中，脂肪酸的合成过程发生在细胞胞浆中，而降解过程则发 在线粒体中。由于长链的脂肪酸无法穿越细胞膜，因此一条转运长链脂肪酸的 径非常必要。这就是肉毒碱脂酰c o a 转移体系( 见图1 3 ) 。 是螂i 诉a 即删【 豫辑媛 图l - 4 脂肪酸的b 一氧化 f i g 1 - 4p 帕x i d a t i o n0 ff a t t ya c i d l o i 麝氍辅一 曩 囊静 矗坶娥麓舅 表 台醇 舡p 一齄晴表辩蠢 a 强篡醣 j v ，塌钝簟舅 第一章绪论 链比较长的脂肪酸在脂酰c o a 合酶的催化作用下生成脂酰c o a 。脂酰c o a 经过肉毒碱脂酰转移酶的转运下进入线粒体。研究肉毒碱脂酰转移酶在油脂微生 物不同生长阶段活性的差异，可以对油脂微生物的发酵具有重要的指导意义。 肉毒碱脂酰转移酶作为脂肪酸分解代谢的一种关键的酶，已经得广泛的研 究。1 9 8 5 年c o l i nr a t l e d g ea 1 1 ds a r a l lc g i l b e n 研究了油脂酵母中c a t 的活性。 他认为产油酵母中c a r 和a c l 的活性与油脂的含量没有关系。1 9 8 8 年，c o l i n r a t l e d g e 研究了油脂酵母在积累和使用外源和内源脂时，a c l 、c a t 、i c l 和 m a l i c 酶的变化。1 9 9 3 年，h a n l ”k i