（发育生物学专业论文）斑马鱼视网膜突变体的筛选与研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：日期： 之翌丝丝：口 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者繇鳓新魏纽日 期：。加娠圾口 山东大学博士毕业论文 摘要： 斑马鱼视网膜突变体的筛选与研究 斑马鱼因其胚胎透明、实验室养殖方便和发育速度快等特点，已 逐渐成为一种新的基础生物学研究的模型生物。 根据r a m ac a j a l 所 说“视网膜是一种真正的神经核和一种外周脑”。它的显著特征是透 明、分层化、超薄以及细胞种类少。因而，利用视网膜开展神经生物 学的研究具有特别的优势，而斑马鱼的视网膜是开展有关研究非常方 便的材料。本研究筛选斑马鱼视网膜突交体，并对其进行了功能研究 和鉴定。论文研究主要包括两个方面的工作：分离并鉴定一种斑马鱼 的视网膜的夜盲突变体，开展了一些斑马鱼视网膜电生理学的功能研 究。本研究结果为神经生物学和发育生物学提供了新资料。 1 利用一种简单的行为学方法一一逃避反应，分离到一种斑马鱼 视网膜夜盲显性突变体n b c 。与野生型相比，这种突变体的视觉敏感度 阈值在1 8 月龄升高。比较组织学的研究发现，n b c 突变体的视网膜的 形态变化很大：有些和野生型完全没有区别，有些视网膜的视杆和视 锥细胞萎缩，还有一些是在部分区域发生退形性变，在个别突变体的 视网膜中，整个感光细胞层发生坏死。采用透射电子显微镜观察，发 现一些突变体的视杆细胞明显小於野生型。利用免疫组织化学的方法 检测新生的细胞，与野生型比较，突变型没有很明显的区别。个别突 变体新生的细胞增多，并且这种细胞再生在内核层和外核层都存在。 用电生理的方法( 整体视网膜电图) 检测视网膜的功能，发现突变体与 山东大学博士毕业论文 野生型也没有很明显的区别。 通过自交杂合体可以获得纯合突变体。纯合突变体是胚胎致死的， 并且发育不正常。在5 d 龄的纯合突变体中可以很明显的看到一些鱼缥 的畸形。这说明这种突变体并不是视网膜的特异性突变。通过比较纯 合突变体的数目和野生型以及杂合型的数目，发现n b c 符合经典的孟 德尔遗传定律。这说明n b c 可能是单基因突变。应用免疫组织化学的 方法比较幼体斑马鱼的视网膜的发育，发现在5 d 龄的斑马鱼中，视锥 细胞和视杆细胞的发育在野生型、杂含型和纯合型是相同的。这可能 暗示n b c 是一种视网膜中迟激活的基因，它的功能可能不仅在视网膜 中，也有可能在其他的组织有功能。综上所述，我们通过分离和鉴定 了一种斑马鱼夜盲表型的突变体n b c ，发现该突变体是迟发和渐进的。 视锥细胞和视杆细胞都发生退形性变，并且这种视觉感光细胞的变化 的表型不是视阏膜特异性的。 2 在低等脊椎动物中，长期以来人们一直认为视觉信号的传递通 过混合的双极细胞。通过记录视网膜电图的方法，我们研究了视杆和 视椎信号在斑马鱼的视网膜中的转换，发现在暗适应的过程中，视网 膜电图的b 波和d 波强度反应曲线都发生偏移。b 波的偏移体现了一个 典型的浦肯野式偏移。它的灵敏度升高。与之相对的是，d 波的灵敏度 降低暗适应是一个从视锥细胞转到视杆细胞接受和传递信号的过程， 这个结果可能说明，d 波可能是斑马鱼中由视锥细胞控制，而b 波在暗 适应的早期由视杆细胞和视锥细胞控制，而在暗适应的晚期由视杆细 胞控制。 2 d 】东大学博士毕业论文 总之，本研究的创新之处在于成功分离了一种模型生物斑马鱼的 视网膜夜盲突变体，并利用不同的方法研究这种突变体的生物学特征- 关键词：视网膜，突变体，n b c ，筛选，鉴定，功能，斑马鱼 3 山东大学博士毕业论文 符号说明 英文缩写英文全名 r p d p f e n u p c n a t b s r o s e r g c o s r o s o n l r p e a p b o k r o m r r e t t n i t i sp i g m e n t o s a d a y sp o s tf e r t i l i z a t i o n n - e t h y l - n n i t r o s o u r e a p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n t r isb u f f e r e ds a i i n e r o do u t e rs e g m e n t 引e c t r o r e t i n o g r a m c o n eo u t e rs e g m e n t r o do u t e rs e g m e n t o u t e rn h e l e a rl a y e r r e t i n a lp i g m e n te p i t h e l i a m 2 - a m i n o 4 p h o s p h o n o b u t y r i ca c i d o p t o k i n e t i cr e s p o n s e o p t o m o t o r r e s p o n s e 4 山东夫学博士毕业论文 c h a p t e1 ： as t u d yo n n i g h tb l i n dc ( n b c ) m u t a n t z e b r a f i s h 1 1a b s t r a c t w ed e s c r i b eh e r et h em o r p h o l o g i c a la n df u n c t i o n a la l t e r a t i o n so ft h e r e t i n ao fm u t a n tz e br a f is h ，n i g h tb l i n d n e s sc ( n b c ) ，t h en b cm u t a n tw a s s o l a t e df r o mt h ef1 g e n e r a t i o no fn - e t h y l - n - n i t r o s o u r e a m u t a g e n i z e d f o u n d e r s v i s u a l s e n s i t i v i t y o f w i l d t y p e a n d h e t e r o z y g o u s ( n b c + 一， m u t a n tf is hw a sd e t e r m i n e du s i n gab e h a v i o r a la s s a yb a s e do n v i s u a l i y m e d i a t e de s c a p er e s p o n s e s h i s t o l o g y ，i m m u n o c y t o c h e m i s t r y ， a n d e l e c t r o r e t i n o g r a p h yw e r eu s e dt os t u d ys t r u c t ur a la n df u n c t i o n a lc h a b g e s o ft h eo u t err e t i n a t h eb e h a v i o r a lv i s u a l r e s p o n s e o fn b c + 一m u t a n t s s t a r t e dt od e t e r i or a t ea t1 2m o n t h so fa g e c o n s i d e r a b l ev a r i a t i o n se x is t e d b e t w e e nt h ee x t e n t so fr e t i n a ld e g e n e r a t i o no fi n d i v i d u a lf is h i nt h em o s t s e v e r e c a s e s ，b o t hr o da n d c o n eo u t e r s e g m e n t s w e r ed e g e n e r a t e d t n m o d e r a t ec a s e s ，o n l yr o do u t e rs e g m e n t sw e r ea f f e c t e d 。y e ti no t h e rc a s e s n od e g e n e r a t i o nw a sd e t e c t e d t h er e t i n ao fh o m o z y g o u s ( n b c 一一) i a r v a e h a dan o r m a l a p p e a r a n c e h o w e v e r ，t h e yd e v e l o pa b n o r m a l l y a n dd l e d b e f o r e9d a y sp o s tf er t i l i z a t i o n i nc o n c l u s i o n ，n b cc a u s e si a t e o n s e ta n d p r o g r e s s i v e d o r a i n a n tr e t i n a l d e g e n e r a t i o n o fb o t hr o da n dc o n e p h o t o r e c e p t o rg e l is h o w e v e r ，n b c isn o ta r e t i n a s p e c i f i cg e n e ，a s t h e 山东凡学博士毕业论文 h o m o z y g o u sf i s hd is p l a y e de x t r a - r e t i n a ld e f e c t s 1 2i n t r o d u c t i o n d o m i n a n tm u t a t i o n st h a tc a u s er e t i n a ld e g e n e r a t i o nh a v eb e e n f o u n di n m a n ys p e c i e si n c l u d i n g f l i es ，m i c e ，r a t s ，d o g s ，a n dh u m a ns ( d o w l i n g & s i d m a n ，19 6 2 ；b e n z e r ，19 6 7 ；s t e e l e o t o u s a ，i9 9 0 ；dr y j ae la 1 ，19 9 0 o i s s o ne t a 1 ，19 9 2 ) i n h u m a ns ，a c o m m o n f or mo fi n h e r i t e d r e t i n a d e g e n e r a t i o n isr e t i n i t i sp i g m e n t os a ( r p ) r pa f f e c t sa p p r o x i m a t e l y 1i n 3 5 0 0p e r s o n sw o r l d w i d e ，i tc a nb ei n h e r i t e d i na na u t os o m a ld o m i n a n t a u t o s o m a lr e c e s s i v e ，o rx - l i n k e dm a n n e r ( b e r s o n ，i9 9 3 ；f a r b e r ，l9 9 5 ) 1 1 l a b o u t4 0 5 0 o ft h ec a s e s ，r pisd o m i n a n t l yi n h e r i t e d ( b e r s o n ，i9 9 3 ) s o m em u t a t i o n st h a tc a u s er pa r ef o u n di n g e n e st h a ta r e s p e c i f i c a l l y n v o l v e di ns t r u c t ur e so rp r o c e s s e sp e r t a i n i n gt op h o t o r e c e p t o rf u n c t i o r ls s u c ha sv i s u a ltr a ns d u c t i o n ，r e t i n o i dc y c l e ，o rp h o t o r e c e p t o r m o r p h o i o g y ( f a r r a r e l a 1 ，2 0 0 2 ) o t h e r m u t a t i o n sa r ef o u n d i n g e n e s t h a tar e e x p r e s s e d i nn o n r e t i n a lt iss u e s ，s u c ha st h o s e c o d i n g f o ra d h e s i o n m o l e c u l e s ( d e nh o l t a n d e r e t a t ，1 9 9 9 ) o r p r e m r n as p l i c i n g f a c t or s ( b a e h r c h e r t ，2 0 0 1 ；c h a k a r o v a e t a l ，2 0 0 2 ) i n t h e s ec a s e s ，t h e p a t h o l o g ym a y o rm a yn o tb ec o n f i n e dt ot h er e t i n a us h e rs y n dr o m et y p e 1d ，f o r e x a m p l e ，i s c a u s e d b y am u t a t i o no f g e n e c d h 2 3c o d i n g a m e m b e ro ft h ea d h e s i o nm 0 1 e c u i e sc a d h e r i n ( b o i ze la 1 ，2 0 0 1 ) b e s i d es v i s u a l i m p a ir m e n t ，t h ep a t i e n t s a l s oh a v ea u d i t o r y a n dv es t ib u l a r 6 山东大学博士毕业论文 p r o b l e m s ( w a y n ee ta 1 ，19 9 6 ) r p 11 ，w h i c hisc a u s e d b ym u t a t i o n so fa s p l i c i n g f a c t o r g e n e ，p r p f 31 ，d o e s n o ts e e mt ob e a c c o m p a n i e db y n o n 。r e t i n a l d y s f u n c t i o n s t h er e a s o nf or t h i s m i g h tb et h a tt h es p l i c i n g d e m a n do ft h e r o d p h o t o r e c e p t o rc e l l s i s h i g hc o m p a r e dt o o t h e re e l is ( d e er y e ta 1 ，2 0 0 2 ) s e v e r a la u t o s o m a ld o m i n a n tf o r m so fr pi n v o l v i n g u b i q u i t o us l y - e x p r e s s e dg e n e sh a v eb e e nd e s cr i b e d r p1 0 ，f or e x a m p l e ，i s c a u s e d b y m u t a t i o n so ft h ei m p d h1 g e n e t h a tc o d ef oro n eo ft w o s o e n z y m e st h a tp l a y ar o l ei nd en o v o g u a n i n e n u c l e o t i d e s y n t h e s i s ( b o w n ee ta 1 ，2 0 0 2 ) r p i1 ，13 ，a n d18a r ec a u s e db ym u t a t i o n so ft h e s p l i c i n gf a c t o r g e n e sh p r p 3 ，p r p f 8 ，a n dp r p f 3 1 ，r es p e c t i v e l y ( b a e hr c h e n ，2 0 01 ；c h a k a r o v ae ta 1 ，2 0 0 2 ) d e s p i t et h eu b i q u i t o us e x p r e s s i o no f t h e s e g e n es ，n o n e o ft h em u t a t i o n sh a v es of a rb e e n r e p o r t e d t oc a us e n o n 。r e t i n a l d y s f u n c t i o ns r e c e n t l y ，z e b r a f i s hh a v eb e c o m eam o d e lf or g e n e t i cs t u d i e so fd e v e l o p m e n ta n dd e g e n e r a t i o no ft h ev e r t e b r a t er e t i n a ( b u r r i l e a s t e r ，1 9 9 4 ；s c h m i t t d o w l i n g ，19 9 4 ；r a y m o n de ta 1 1 9 9 5 n e u h a usse l a 1 ，19 9 9 ) z e b r a f is ha r e h i g h l y v i s u a l a n i m a l s ，a n dt h e i r r e t i n a sc o n t a i nb o t hr o da n dc o n e p h o t or e c e p t o re e l i s ( n a wr o c k i ，1 9 85 l a r i s o n br e m i l l er 19 9 0 ) m u t a t i o n si ns e v e r a lg e n e st h a tc a u s ed e f e c t s n e a r l y r e t i n a l d e v e l o p m e n ta n d f u n c t i o n sh a v eb e e ni d e n t i f l e d s o m e b l o c kn e ur o n a l d i f f e r e n t i a t i o n ，p a t t e r n i n g ，o rl a m i n a t i o n ( m a l i c k ie ta l 1 9 9 6 ) o t h e r s c a u s e e a r l y r e t i n a l d e g e n e r a t i o n ( m a l i c k i e t a 1 ，1 9 9 6 br o c k er h o f fe t a 1 ，19 9 7 ；l i n k e t a 1 ，2 0 0 1 ) i n e l i p s a m u t a n t s ，f o r e x a m p l e ，t h e i n i t i a l d e v e l o p m e n t o f p h o t o r e c e p t o r c e l i si sn o r m a 7 山东大学博士毕业论文 h o w e v e r ，t h e yu n d e r g or a p i dd e g e n e r a t i o n b y5d a y sp o s tf e r t ili z a t i o n ( d p f ) ，t h eo u t e rn u c l e a rl a y e risa b s e n t ( m a l i c k ie ta 1 ，19 9 6 ) u s i n g a s i m p l e b e h a v i o r a l a s s a y b a s e do n v i s u a l l y m e d i a t e des c a p e r e s p o n s e sd i s p l a y e db yz e b r a f i s hw h e ne n c o u n t e r i n gar o t a t i n gs e g m e n t w es cr e e n e dt h efi g e n e r a t i o n o f n e t h y l n ni t r o s o u r e a ( e n u 、 m u t a g e n i z e d z c b r a f is hf ord o m i n a n t m u t a t i o n st h a tc a u s er e t i t q a d e g e n e r a t i o n w eh a v ei d e n t i f l e d s e v e r a im u t a n t st h a ts h o w e da b n or m a v is u a lb e h a v i o r s ，f o re x a m p l e ，n i g h tb l i n d n e s s 口( n b a ) ，n i g h tb l i n d n e s sb ( n b b ) ，a n dn i g h tb l i n d n e s sd ( n b d ) ( l i & d o w l i n g ，19 9 7 ，2 0 0 0 ；m a a s w i n k e e t a 1 。2 0 0 3 ) n b a + 一a n d n b d + 一f i s ha r ec h a r a c t e r i z e d b y v is u a t h r es h o i de l e v a t i o n ，w h e r e a si nn b b + 一f i s hb e h a v i o r a lv i s u a lt h r e s h o l d f l u c t u a t e sa f t e rp r o l o n g e dd a r ka d a p t a t i o n n b a + 一，n b b + 一a n dn b d + - f i s hs h o wd o m i n a n tr e t i n a l d e g e n e r a t i o n i nn b a + 一a n dn b d + 一f i s h t h e o u t e rr e t i n ai s a f f e c t e d ，w h e r e a si nn b b + 一t h e d o p a m i n er g i c n t e r p l e x i f o r m e e l i sa r e d e g e n e r a t e d i n t e r e s t i n g l y ，w h e n b r e dt o h o m o z y g o s i t y ，a 1 1 t h r e em u t a t i o n sc a u s e e m b r y o n i cl e t h a l i t y e m br y o s s h o wm a s sn e u r a ld e g e n e r a t i o ni nt h er e t i n aa sw e l la si nt h e b r a i n t h e y d e v e l o p a b n o r m a l l y a n dd i ea b o u t5 - 7 d p f i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w e d e s cr i b ea n o t h e rm u t a t i o n ，n i g h tb l i n d n e s sc ( n b c ) ，t h a tw a si s o a t e di n t h ef1 g e n e r a t i o no fe n u t r e a t e dz e b r a f i s h t h eor i g i n a ln b c + f i s hw a s d e n t i f i e da si ts h o w e de l e v a t e dv is u a lt hr e s h o l d t h e g r o ss m o r p h o l o g y o fn b c + 一f is his n o r m a l ，a n dt h e ys h o wn o r m a ls w i m m i n ga n dm a t i n g b e h a v i or b e f o r e12m o n t hso fa g e ，t h eb e h a v i o r a lv i s u a l s e n s i t i v i t y o f 当查查兰竖主兰些堡奎 一 h 6 c + 一f i s hi si n d is t i n g u is h a b l ef r o mw i l d t y p ea n i m a l s a t 12m o n t h s ，i t s t a r t s t od e t e r i o r a t e h o m o z y g o u sn b c 一一l a r v a es h o wd e f e c t s i no t h e r o r g a n sa n d d i eb e f o r e9d p f ，s u g g e s t i n gt h a tt h e m u t a t i o ni sn o tr e t i n a s p e c i f i c 1 3m a t e r i a la n dm e t h o d s 1 3 1a n i m a la n dm a i n t e n a 【n c e z e br a f is h ( d a n i or e r i o ) w e r em a i n t a i n e da sd e s c r i b e d ( w e s t e r f i e l d ，i9 9 5 ) t h e yw e r ek e p ti n a1 4 ：1 0h o u r sl i g h t - d ar kc y c l e ( r o o mf l u o r e s c e n tl ig h t ， 6a m 一8p r o ) i nr e c ir c u l a t i n gw a t e r ( r e v e r s eo s m o s i s w a t erw i t hi n s t a n t o c e a ns a l ta d d e d 3g r a m g a l i o n p h ：7 0 - 7 4 a t2 8 。c ) z e br a f i s hw e r e f e dt w i c ea d a y w i t h f r e s h l yh a t c h e d b r i n es h r i m pa n d dr i e d p l a n k t o n r e s p e c t i v e l y 1 3 2t h eb e h a v i o r a lt e s t m e t h o dsu s e df o rb e h a v i o r a la n a l y s i so fz e b r a f i s hv i s u a ls e n s i t i v i t yw e r e s i m i l a rt ot h os ed e s c r i b e d ( l i d o w l i n g ，19 9 7 ) t h e t e s t a p p a r a t u s c o n s is t e do fac ir c u l a r t r a n s p a r e n tp l a s t i c c o n t a i n e rs ur r o u n d e db y a r o t a t i n g dr u m ab l a c k s e g m e n tw a s m a r k e d0 1 1 w h i t e p a p e r t h a tw a s 山东大学博士毕业论文 a t t a c h e dt ot h ei n s i d eo ft h ed r u m t h edr u mw a si i l u m i n a t e df r o ma b o v e b yaw h i t ei i g h ts o u r c e ，i i g h ti n t e ns i t y 4 2 5 10 3 w c m 2 t h i si sa b o u t o r e1 0 9u n i ta b o v et h ea b s o l u t es e n s i t i v i t y 1 e v e lo fw i l d t y p ez e br a f ts h ( l i d o w l i n g ，19 9 7 ) w i t h i l l u m i n a t i o na to ra b o v et h i sl e v e l ，z e b r a f i s h s h o w n o n h a b i t u a t i n ge s c a p er e s p o n s e st oat hr e a t e n i n g o b j e c t ，e g a b l a c k s e g m e n tr o t a t i n g o u t s i d et h ec o n t a i n e r w et e s t e dt h isv is u a 1 y m e d i a t e de s c a p er es p o n s e si nt h ez e b r a f is ho v e rap e r i o do ft w om i n u t e s w h e nt h ef i s hr e a c t e dw i t ha ne s c a p er e s p o ns e ，t h i s w a ss c o r e da sa p o s i t i v er e s p o n s e ，o t h e r w i s e a san e g a t i v e r e s p o n s e t h ep e r c e n t a g eo f e s c a p er e s p o n s e s w a sc a l c u l a t e d b yd i v i d i n g t h en u m b e ro f p o s i t i v e e s c a p er e s p o n s e sb yt h en u m b e ro ft o t a l e n c o u n t e r s t h ef i s hw e r ef u l l y d a r k a d a p t e d f o ra b o u t3 0r a i nb e f o r et h et e s t b e h a v i or a lv is u a s e n s i t i v i t y w a sa s s e s s e di nt h el a t ea f t e r n o o nh o u r s ( b e t w e e n4 - 6p m ) ， w h e nz e b r a f i s ha r em o s ts e n s i t i v et o1 i g h t ( l i & d o w i i n g ，19 9 8 ) + t h ef i s h w e r et e s t e da t4 ，7 ，1 2a n d18m o n t h so fa g e 1 3 3m e t h o df o rt h eg e n e r a t i o na n di s o l a t i o no ft h en b c m u t a n t t h em e t h o df o rt h e g e n e r a t i o na n d i s o l a t i o no fz e b r a f i s hm u t a n t sw i t h v is u a l s y s t e md y s f u n c t i o n sh a sb e e np r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( b r o c k e r h o f fe t a 1 ，1 9 9 5 ；l i d o w l i n g ，19 9 7 ) m a l e z e b r a f i s hw e r et r e a t e dw i t he n u ( s i g m ac o ，m o ) t h e f i s hw e r et h e ncr os s e dw i t h w i l d - t y p e f e m a l e s 山东大学博士毕业论文 f r o mt h efl g e n e r a t i o n f is h ，5 0 6i n d i v i d u a lsw e r et e s t e d f o r e s c a p e r e s p o n s e se l i c i t e dw h e ne n c o u n t e r i n gav i s u a ls t i m u l u s w ei d e n t i f l e d t e n f i s ht h a ts h o w e dn oo rar e d u c e dn u m b e ro fe s c a p er e s p o n s e sw h e nt e s t e d u n d e rd i mi l i u m i n a t i o nf 42 5 1 0 39 w c m 2 ) w e c r o ss e dt h e mw i t h w i l d t y p e f i s ha n dt e s t e dt h ee s c a p er es p o n s eo ft h eo f f s p r i n g i t t ur n e d o u tt h a tt h er e d u c t i o no fe s c a p e r e s p o n s e i nt w oo ft h et e n o r i g i n a c a n d i d a t e sw a si n h e r i t e di n ad o m i n a n tm a l l n e r ，ie b ya p p r o x i m a t e i y 5 0 o ft h eo f f s p r i n g ( s e ea ls om a a s w i n k e le ta 1 ，2 0 0 3 ) h e r ew ed e s c r i b e o n eo ft h es em u t a t i o n s ，n b c c o m p i e m e n t a t i o nt es t r e v e a l e dt h a tn b cis n o ta l l e l i cw i t hp r e y i o u s l yd e s c r i b e dn b a ，n b b ，o rn b dm u t a t i o n s 1 3 4 h i s t o l o g y a d u l t e y e s o r e m b r y o s w e r ef i x e di n 1 p a r a f or m a l d e h y d e a n d2 5 g i u t a r a l d e h y d e i n0 0 6 m s o d i u m p h os p h a t e b u f f e r ，t h e n i n1 o s m i t i m t e t r o x i d ei n0 0 6ms o d i u mp h o s p h a t eb u f f e r t h e yw e r ed e h y d r a t e di na g r a d e d s e r i e so fe t h a n o l s t e p s ，a n d e m b e d d e di n e p o n a r a t d i t e r e s i n ( e l e c tr o nm i c r o s c o p ys c i e n c e s ，p a ) s e c t i o n so f1 0 u ma n d0 0 8 b , m w e r em a d ef o r l i g h t a n de l e c t r o nm i c r o s c o p i c a l ( e m ) h is t o i o g y r e s p e c t i v e l y ( s c h m i t t & d o w l i n g ，1 9 9 9 ) 1 3 5 i m m u n o e y t o c h e m i s t r y 山东大学博士毕业论文 t h ep r e s e n c eo fp r o l i f e r a t i n ge e l in u c l e a ra n t i g e n ( p c n a ) w a sa s s e s s e d t o i d e n t i f yd i v i d i n g r e t i n a le e l i s t h e p r o t o c o li ss i m i l ara sd e cr i b e d ( v i h t e l i c h y d e ，2 0 0 2 ) i ns h o r t ，a d u l tz e b r a f i s h e y e sw e r ee n u c l e a t e d a n df i x e d o v e r n i g h t a t4 。ci n9 ：1e t h a n o l i c f o r m a l d e h y d e a n d c r y o p r o t e c t e d i n3 0 s u cr o s e p h o s p h a t e b u f f er e d s a l i n e ，e m b e d d e d i n o c tc o m p o u n d ( e l e c t r o n m i c r o s c o p y s c i e n c e s ，p a ) ，a n d t h e nf r o z e n c r y o s e c t i o n s o f2 0 g m w e r em o u n t e do n g l a s s s l i d e s s e c t i o n sw e r e r e h y d r a t e dw i t ht r i sb u f f e r e ds a l i n e ( t b s ) ，b l o c k e dw i t h5 n o r m a lg o