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缩略词表 英文缩写英文全称 a m p a m p i c i u i n b c hc a r o t e n e1 3 - r i n gh y d r o x y l a s e c c s c d n a c s c 丑气b d e p c 中文全称 氮苄青霉紊 胡萝h 紊8 环羟化酶 c a p s a n t h i n c a p s o r u b i ns y n t h a s e辣椒红,辣椒玉红寨合成酶 c o m p l e m e n t a r yd n a c i t r a t es y n t h a s e c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 互补d n a 柠檬酸合成酶 十六烷基三甲基溴化铵 焦碳酸二乙酯 d m _ d 巾p d i m e t h y l a l l y ld i p h o s p h a t e 3 ,3 = 甲基丙烯基焦磷酸 d n a s ei d e o x yr i b o n u c l e a s ei 脱氧核糖核酸酶i d d x r d x s e b e c h e d l a g g p p g g p s h d s h m b p p 1 - d e o x y - d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e 1 - d e o x y - d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e r e d u c t o i $ o m e r a s e 1 脱氧木酮糖一5 磷酸 1 一脱氧木酮糖- 5 磷酸还原异构酶 1 - d e o ) c y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e1 - 脱氧木酮糖5 磷酸合成酶 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 c a r o t e n es - r i n gh y d r o x y l a s e 胡萝h 素环羟化酶 乙二胺四乙酸 橇牛几基犍牛几基焦磷酸 g e r a n y l g e r a n y lp y r o p h o s p h a t es y n t h a s e 栊牛儿基糖牛儿基焦磷酸合成酶 ( e ) _ 4 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l b u t - 2 - e n y l d i p h o s p h a t es y n t h a s e ( e ) 4 h y d r o x y - 3 - m e t h y l b u t - 2 - e n y l d i p h o s p h a t e m ( e ) 4 羟基一3 - 甲丁- 2 烯基二磷酸合成酶 ( e m 羟基一3 - 甲丁- 2 - 烯基二磷酸 英文缩写 英文全称 l d i i d s i p p l b l c y - b l c y e m c k m c s m c t i s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a t eid i m e t h y l a l l y l d i p h o s p h a t ei s o m e r a s e i s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a t eid i m e t h y l a l l y l d i p h o s p h a t es y n t h a s e 中文全称 异戊烯焦磷酸,3 ,3 - 二甲基丙烯基焦 磷酸异构酶 异戊烯焦磷酸,3 ,3 - 二甲基丙烯基焦 磷酸合成酶 i s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a k 异戊烯焦磷酸 l u 晒b e r t a n lm e d i u m l y c o p e n ep - c y c l a s e i y c o p e n es - c y c l a s e l b 培养基 番茄红素b 环化酶 番茄红寨e 环化酶 2 - c m e t h y l - d - e q l t h d t o l4 - p h o s p h a t ek i n a s e 2 - c 甲基一弘赤藻糖醇4 磷酸激酶 2 - c - m e t h y l - d - e r y t h d t o l - 2 r4 - c y c l o d i p h o s p h a t e2 - c 甲基d 赤藻糖酵- 2 ,4 环二磷酸 s y n t h a s e 合成酶 2 - c - m e t h y l - d - e r y t h r i t o l4 - p h o s p h a t ec y t i d y l 2 - c 一甲基一d 赤藻糖酵4 磷酸胞苷转 t r a n s f e r a s e 移酶 m e p 2 - c - m e t h y i - d - e r y t h f i t o l4 - p h o s p h a t e m r n a m e s s e n g e rr n a n x s n e o x a n t h i ns y n t h a s e p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p d s p h ”o e n ed e s a t u r a s e p s y p h y t o e n es y n t h a s e r h a s ca r i b o n u d e a s ea r p m v d e z d s z e p r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e v i o l a x a n t h i nd e - e p o x i d a s e - c a r o t e n ed e s a t u r a s e z e a x a n t h i ne p o x i d a s e 2 - c 一甲基一d 赤藻糖醇4 磷酸 信使核糖核酸 新黄质合成酶 聚合酶链反应 八氢番茄红素脱饱和酶 八氢番茄红素合成酶 核糖核酸酶a 娥t 贷铵 堇莱黄素脱环氧酶 胡萝 素脱饱和酶 玉米黄素环氧酶 摘要 类胡萝卜素是柑桔果实重要色素,其组分与含量影响果实色泽和保健功效。柑 桔类胡萝h 素分子研究多集中于合成途径的下游部分。对上游途径少有涉及。红肉 脐橙积累高含量的类胡萝h 素,但其分子机制尚不清楚。本研究从甜橙中分离了卜 脱氧木酮糖一5 一磷酸合成酶( 脚回和卜脱氧木酮糖- 5 - 磷酸还原异构酶( 删基因 片段,并对红肉脐橙和普通脐橙中7 种类胡萝h 素合成基因的表达差异进行了分析。 以甜橙成熟果实的果皮c d n a 为模板,应用普通p c r 获得口瞄和口阶目标片断。 所得片段长度分别为4 5 8 b p 和3 5 9 b p ,均位于编码区,分别编码1 5 2 个和1 1 9 个氨 基酸。基于核苷酸序列,b l a s t 研究表明) a s 和脚与番茄、烟荜等植物的相应基 因同源8 0 以上。 设计了砒又历报八氢番茄红素合成酶( 肋、八氢番茄红素脱饱和酶( 彪卵、 番茄红素e 一环化酶( 三钟勺) 和b 一胡萝p 素羟化酶( 成功这6 种类胡萝卜索合成 基因的实时p c r 引物并建立了实时p c r 体系。应用这6 个基因以及实验室先前建立 的番茄红索1 3 一环化酶( 强6 ) 基因实时p c r 体系,以实验室先前建立的柑桔柠檬 酸合成酶基因( 嚣) 为内标,分别以红肉脐橙与普通脐橙成熟果实的果皮和果肉为 材料,对这7 个基因的表达丰度进行了分析。结果表明,在上述7 个基因中,表达 丰度最高的是及烈可能是导致柑桔果实类胡萝p 素以叶黄素为主的原因。类胡萝 h 素合成上游途径中p s y 和d x r 的表达丰度较强,而d x s 的表达较弱,表明础,可 能是柑桔类胡萝 素合成的限速位点。总体而言,红肉脐橙果肉中的几个基因表达 丰度均高于普通脐橙,增幅达i - 4 倍,基于这些结果,初步认为红肉脐橙积累高含 量的类胡萝卜素是多基因协同表达的结果。 关键词:类胡萝p 素、红肉脐橙、普通脐橙、d x s d x r , 愿kp d s 、l c y b 、l c y - e 、 b c h , 基因分离、基因表达、实时荧光p c r v 第一章文献综述 类胡萝卜素( c a r o t e n o i d s ) 通常是指4 0 碳的碳氢化舍物( 胡萝卜素) 和它们的氧化 衍生物( 叶黄素) 两大类色素的总称。在自然界,类胡萝 素广泛存在于动物,植物 及微生物中。在植物中,类胡萝h 素存在于叶绿体和有色体膜上( 任永霞等,2 0 0 5 ) 。 在高等植物中,类胡萝卜素积累在花和果实的色素母细胞中,使花和果实呈亮黄色、 橙色或红色。在这些组织中,植物利用类胡萝卜素来吸引传粉昆虫( 王玉薄等, 2 0 0 6 ) 。不少类胡萝卜素具有v a 原和抗癌活性( y e 等,2 0 0 0 ) ,因而是入和动物食 物中不可缺少的成分类胡萝卜素也是植物生存所必不可少的。它可保护叶绿素免 受强光导致的光氧化破坏,同时它又是光合天线和反应中心复合体不可缺少的结构 成分,另外,环氧的类胡萝卜素,堇菜黄素和新黄质是植物激素a b a 合成的前体 ( p o c k 等。1 9 9 1 ) 。所有植物均能合成类胡萝 素。对其生物合成途径的研究近年来 取得巨大进展,关键酶基因先后得到克隆,并已初步实现通过基因工程调控类胡萝 h 素合成,为人类造福。 1 植物类胡萝卜素研究概况 在上一世纪二三十年代,就有研究指出柑桔( 粉红葡萄柚等) 果实的主要色素 是番茄红素。五六十年代的柱色谱技术以及后来的h p l c 技术为更多类胡萝p 素的 分离和鉴定作出了贡献。生物化学研究使得在1 9 9 0 年前后植物类胡萝p 素合成的主 链途径得到阐明( 徐昌杰等,2 0 0 0 ) 。1 9 8 7 年番茄p s y 基因的分离以及随后的功能 验证标志着植物类胡萝卜素代谢研究进入分子时代。近2 0 年来,模式植物番茄和拟 南芥等植物的类胡萝卜素研究取得了飞速发展。 1 1 植物类胡萝卜素的生物合成途径 类胡萝卜素通过类异戊二烯途径合成。该途径是一个十分庞大的次生代谢途 径,除合成类胡萝h 素外还合成叶绿素、细胞分裂索、赤霉素及脱落酸等物质。绝 大多数类胡萝卜素是由8 个c 5 异戊烯单位聚合而成的碳氢四萜类( 胡萝卜素) 及其 含氧衍生物( 叶黄素) 。 i i 1 前体g g p p 的合成 i p p 是类胡萝卜素合成途径中第一个较为直接的前体物质,它由葡萄糖分子转 化而来。几乎所有萜类物质都起源于异戊烯基焦磷酸( i p p ) 或者它的异构体3 ,3 二甲基丙烯基焦磷酸( d m a p p ) 。 类胡萝h 素合成的最终前体是细胞代谢中间产物丙酮酸和3 一磷酸甘油醛,该两 种底物在d x s 催化下转化成d x p 并释放出c 0 2 。d x p 在d x p 还原异构酶( d x r ) 催化下先异构后还原转化成m e p ,该反应需要n a d p h 和m n 2 + 作为辅因子( p r o t e a u , 2 0 0 4 ) 。 m e p 继而在m c t 、m c k 、m c s 和h d s 催化下转化成h m b p p 。h m b p p 在i d s 催化下生成口p 或d m a p p 。i p p 和d m a p p 之间可以在i d i 催化下发生相互转化。 最后在g g p s 催化下,3 分子i p p 和1 分子d m a p p 缩合生成1 分子糖牛儿基栊牛 儿基焦磷酸( g g p p ) ,前体合成途径如图i - i 。 葡 萄 糖 丙 酮 酸 囊蓬 拦m e p d x p +叫 图卜1g g p p 合成图 g g p s g p p 卜g g p p 丙酮酸:c i ,3 - 磷酸甘油醛:已h 羽- p - b x s :卜脱氧术酮糖一5 一磷酸合成酶,i ) x p :卜脱氧术酮糖一5 一磷酸,d x r : d x p 还原异构酶,衄p :2 - c 一甲基一d _ 赤藻糖醇一4 - 磷酸i p p :异戊烯焦磷酸,d 姒p p :3 。3 - 二甲基丙烯基焦磷酸, i d i :异戊婶焦磷酸3 t3 - 二甲基丙烯基焦磷酸异构酶,g p p :单萜共化台物g g p s :糖牛儿基栊牛儿基焦磷酸 合成酶,凹p :铭牛儿基钱牛儿基焦磷酸 i i 2 类胡萝卜素的合成与转化 2 个c k p p 在八氢番茄红素合成酶( p s y ) 作用下形成第二个无色的类胡萝h 素 八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢反应,共轭双键延长,直至形成 链孢红素,番茄红素。番茄红素是类胡萝h 素进一步合成代谢的分支点:一条途径 2 是在番茄红素p 一环化酶( l c y b ) 的作用下产生d 一胡萝p 素;另一条途径是在番茄红 素环化酶( l c y - b ) 和番茄红素环化酶( l c y - e ) 的共同作用下合成弘胡萝卜素。从八 氢番茄红素起至甜胡萝 素和p 胡萝h 素,均不含氧原子,统称为胡萝卜素。在小 胡萝h 素、p - 胡萝 素分子中引入羟基、甲氧基、酯键等之后形成结构更为复杂的 含氧衍生物,叶黄素。由廿胡萝卜素转化而来的主要为叶黄质。而绝大多数叶黄素 如隐黄质、玉米黄素、环氧玉米黄素、虾青素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素等 则由d 胡萝b 素转化而来( 详见图卜2 ) 。 图卜2 类胡萝卜素合成途径 1 2 生物合成相关酶及关键基因 。 1 2 1d x s 卜脱氧木酮糖一5 一磷酸合成酶( d x s ) 是植物类胡萝 素等萜类物质合成的关键 酶。它将丙酮酸( c 3 i q 4 0 3 ) 和3 - 4 酸甘油醛( c 3 h 7 d 6 p ) 催化成1 - 脱氧木酮糖5 磷 酸( d x p ) 并释放出c o z 。其编码基因最早从拟南芥中获得,但当时功能未知,d x s 基因的分离与功能鉴定首先在薄荷和青椒中获得成功,随后该基因在番茄和水稻等 多种植物上获得( 金蓉等,2 0 0 7 ) 。拟南芥d x s 基因以家族形式存在,共有三个成 员,但只有d x s l 在多种组织中广泛表达且表达强度较高。可占总e s t 的0 0 2 , 缺失d x s l 功能的拟南芥突变体表现白化。拟南芥三种d x s 均具有定位于质体的信 号肽,进一步的研究表明d x s 定位于类囊体( k r u s h t m l 等,2 0 0 3 ) 。该基因在柑桔中 也还未相关报道。 1 2 2d x r d x p 在d x p 还原异构酶( d ) 文) 催化m e p ,植物d x p 除了用于合成萜类物 质,还可用于非萜类物质v b l 和v b 6 的合成,而d x r 活性的高低决定了d x p 用于 萜类物质合成的比例,因此对类胡萝p 素合成也起着十分重要的作用。但d x r 是 否是类胡萝h 素合成的限速因子还与植物种类、器官类型和发育阶段有关。 拟南芥d x r 基因于1 9 9 9 年最先得到分离,它由单基因编码,如d x s 一样在多 种组织中广泛表达。在柑桔中还没有分离d x r 的相关报道( c a r r e l e r o p a u l c t 等, 2 0 0 2 ) 。 1 2 3p s y 八氢番茄红素合酶( p s y ) 是公认的植物类胡萝卜素合成的关键酶,它是一种膜 蛋白,其活性依赖二价阳离子并有时需要a t p 和表面活性剂。p s y 编码基因已经从 多种植物中得到分离,在有些植物中编码基因以家族形式存在( 朱长甫,2 0 0 4 ) 。拟 南芥只有1 个p s y 基因,而番茄和烟草有2 个,黄花龙胆中则有4 个。在番茄中的 2 个p s y 基因,其中殿朋基因在果实和花中特异性表达,而p s y 2 基因则主要在叶 片中表达。 1 2 。4p d s 和z d s 八氢番茄红素脱饱和酶( p d s ) 、( 胡萝卜素脱饱和酶( z d s ) 是植物类胡萝卜 素合成中去饱和的非常重要的一类酶,和嘧啶衍生物互相作用,抑制其活性。植物 用z d s 抑制剂处理后,导致- 胡萝p 索和八氧番茄红素积累。p 0 s 基因己从番茄、 大豆、胡椒和烟草等植物中分离出来。 1 2 5l c y - e 和l c y 二b 番茄红素及其之前的类胡萝卜素均为无环分子。番茄红素的线性未端在番茄红 素1 3 环化酶( l c y - b ) 催化下形成b 环,而在番茄红素环化酶( l c y - g ) 催化下则 4 形成e 环。如果番茄红索只在前一种酶催化下,就形成两个p 环,为b 胡萝h 素; 如果只在后一种酶催化下,通常只能形成1 个8 环,另一端仍然保持线性,为6 一胡 萝h 素,只有在莴苣中可形成2 个环,为胡萝p 素;如果在两种酶共同催化下, 则形成分别具一个b 环和6 环的a 胡萝p 素( 徐昌杰等,2 0 0 0 ) 。两种酶的活性均 依赖n a d p h ,其编码基因已经从多种植物中得到分离,在拟南芥中,它们的编码 基因均为单基因。 1 2 6b c t l 和e c h 胡萝 素p 环羟化酶( b c h ) 和胡萝卜素e 环羟化酶( e c h ) 是一种含铁蛋白, 其活性依赖铁氧还蛋白和n a d p h 。拟南芥b c h 由2 个基因家族成员编码,而e c h 则由单基因编码,两基因及所编码的蛋白质序列存在较大的差异,表明有着不同的 进化起源。在b c h 和e c h 的催化下生成具羟基的含氧类胡萝h 素,即叶黄素。叶 黄质是叶片中含量最丰的类胡萝h 素。 1 2 7 z e p ,v d e 及n x s 玉米黄素可在玉米黄素环氧酶( z e p ) 和堇菜黄素脱环氧酶( v d e ) 活性分别 依赖还原态铁氧还蛋白和v c ,在拟南芥中均由单基因编码。新黄质合成酶( n x s ) 催化堇菜黄素下生成新黄质。对n x s 的酶学特性人们知之不多,其编码基因已从 番茄中得到分离。 1 3 类胡萝卜素合成的调控 近年来,研究表明类胡萝卜素与基因调控有一定的关系。它们之间主要的相互 作用是连接蛋白和几种类胡萝卜素( 主要包括能形成维生素a 的类胡萝i - 索,如b 萝h 素和不能形成维生素a 的其它类萝p 素,如角黄素) 之间的相互作用。胡萝l - 素在调节基因表达方面的另一个作用是类胡萝p 素不抑制直接活化的基因毒物,但 能够抑制代谢活化的基因毒物( 韩利军等,2 0 0 2 ) 。 1 3 1 不同发育期的调控 植物绿色组织均有类胡萝h 素存在。处于不同发育阶段的花和果实所积累的类 胡萝h 素的含量及种类也有所不同,这表明类胡萝卜素合成在一定程度上也受发育 阶段的调控。 l - 3 2 不同物种的调控 随物种不同,果实发育期间类胡萝卜素变化模式可能不同。例如番茄果实成熟 时只盯基因表达增强是类胡萝h 素得以积累的主要原因之一,而非跃变型果实辣椒 成熟时类胡萝h 素合成并不是由于船】,基因受诱导之故。 1 3 3 理化调控 光照量充足有利于类胡萝 素积累,但过强的光会引起光氧化胁迫,对类胡萝 h 素具有破坏作用反而可使其含量下降。还有研究表明,3 0 c 以上高温抑制番茄果 实番茄红素合成,不利于柑桔果实类胡萝h 素积累,但对1 3 胡萝h 素合成的抑制作 用不明显。另外各种化学物质也会对类胡萝h 素的积累起作用,比如m n 2 + 、茉莉酸 甲酯、a b a 、二苯胺以及乙烯等等( 徐昌杰等,2 0 0 0 ) 。 1 3 4 基因工程调控 近年来类胡萝h 素生物合成基因的分离与功能鉴定,为应用基因工程技术改变 植物体内类胡萝h 素成份和提高类胡萝卜素含量提供了新的基因资源。类胡萝卜素 合成在体内调控的研究不断进展,使通过遗传操作调控植物体内类胡萝卜素生物合 成途径成为可能。例如“金大米”、“金色菜油”,成功提高了水稻和泊菜中的类胡萝 卜素含量( y e 等,2 0 0 0 ;s h e w m a k e r 等,1 9 9 9 ) 。 2 柑桔类胡萝h 素研究进展 2 i 柑桔果实主要类胡萝卜素成分及含量分析 陶俊等应用h p l c 技术分析了我国5 3 个柑橘品种资源的6 种类胡萝h 素成分 叶黄素、玉米黄素、p 一隐黄质、舢胡萝卜素、p 胡萝卜素和番茄红素的含量。结果 表明,柑橘果皮和果肉中均以叶黄素、玉米黄素、p 隐黄质为主,b 胡萝p 素含量 较低,a 胡萝h 素极低。 柑橘果肉中类胡萝卜素的含量因不同类型的组成特点存在明显差别甜橙的红 肉脐橙果肉中,叶黄素、玉米黄素、p - 隐黄质含量明显比普通脐橙果肉中低,但是 p 胡萝卜素含量明显高于普通脐橙,且还含有大量的番茄红素,不含有a 胡萝p 素。 不同类型柑橘果皮中类胡萝 素统计结果表明,宽皮柑橘类果皮的5 种类胡萝 卜素成分的含量都最高,其次为杂柑、酸橙、甜橙,柚类最低,不同类型柑橘之间 类胡萝卜素组分的积累具有明显的特征。红肉脐橙果皮中,叶黄素,隐黄质,玉米 黄素明显少于普通脐橙。且红肉脐橙中没有发现b 胡萝卜素,0 t 胡萝b 素,也未发 现积累番茄红素( 陶俊等,2 0 0 2 ) 。 柑橘果皮与果肉中类胡萝卜素含量的比较除了类胡萝p 素组成比例明显不同之 外,两者的含量也存在显著差异。陶俊等研究表明类胡萝b 素含量丰富的宽皮柑橘、 甜橙、酸橙和杂柑中果皮与果肉的时黄素、玉米黄素、b 隐黄质比值。结果表明果 皮叶黄素、玉米黄素、p 隐黄质含量分别为果肉的5 2 1 0 1 倍、3 6 1 5 3 倍和2 5 6 6 4 倍,说明柑橘果皮是柑橘类胡萝b 素的主要贮存库位。 2 2 襁桔类胡萝b 素合成关键基因 d x s 是植物类胡萝b 素等萜类物质合成的关键酶。继大肠杆菌和拟南芥的分离 之后,多种微生物和植物的d x s 基因陆续分离出来。d x r 对类胡萝卜素合成也起 着十分重要钓作用,d x r 基因最早在1 9 9 9 年拟南芥中分离出来。但在柑桔中,还 没有d x s ,n 积基因相关报道目前,我们从甜橙中分离了n 醛,d x re d n a 片断 并建立了实时p c r 基因表达体系,旨在分析柑桔种类和品种间类胡萝卜索含量存在 巨大差异的原因。 p s y 编码基因已经从多种植物中得到分离,在有些植物中编码基因以家族形式 存在。第一个柑橘熙y 基因由韩国研究者k i r n 等分离,并登记了温州蜜柑 p s y l m r n a 序列,登记号为a f 2 2 0 2 1 8 。对温州蜜柑娜y 基因的表达特性进行了研 究。结果表明该基因在花、果实和叶片中都可表达,但生长叶中表达比幼叶强,果 皮和囊瓣中该基因的表达均随果实发育而增强( 1 k o m a 等,2 0 0 1 ) 。因此p s y 编码基 因成为应用植物基因工程技术改善转基因植物中类胡萝 素含量的首选目的基因, 也成为我们此次的研究对象。 p d s 也是植物类胡萝卜素合成的限速酶( p e c k e r 等,1 9 9 2 ) 。第一个柑橘p d $ 基因于2 0 0 0 年9 月由日本研究者m o d g u c h i 分离。克隆成熟柑橘果实p d s 和z d s 的部分和全长c d n a 序列,发现z d s 对柑橘果实中类胡萝h 素的积累起重要正调控, p d s 基因表达与果实形成时类胡萝 索含量呈正相关( 王玉萍等,2 0 0 6 ) 。柑橘成熟 果实中类胡萝b 素的积累是成1 y ,p d s 和z d s 等基因协同表达的结果。 徐昌杰等已分离到柑桔番茄红素d 环化酶基因片段,从基因组文库中筛选全长 基因的工作正在进行之中,现已分离得到环化酶基因的植物有拟南芥和番茄( 徐 昌杰等,2 0 0 0 ) 。k a t o 等对不同柑橘品种类胡萝h 素积累和生物合成基因表达进行 研究,表明在柑橘果实成熟时,l c y - b 表达增强,l c y - e 表达消失,同时母环的玉 米黄素和堇菜黄素大量增加。 b c h 催化1 8 - 胡萝卜素转化成8 隐黄质继而转变成玉米黄素,是催化b 系列叶 黄素合成的第一个关键酶。韩国研究者k i m 等( k i m 等,2 0 0 1 ) 于2 0 0 0 年9 月从 温州蜜柑中分离了该基因的两个全长e d n a ,均长1 2 3 9 b p ,都编码3 1 1 个氨基酸, 两者之间存在3 个氨基酸序列差异。该两e d n a 序列的登记号分别为a f 2 9 6 1 5 8 和 a f 3 1 5 2 8 9 。k i m 等研究表明,温州蜜柑b c h l 和艿c 目2 基因在果实、叶片和花各个 发育阶段组成型表达,可能这是大多数柑橘品种的果实和叶片等组织不能积累较多 b 胡萝卜素的原因。 2 0 0 1 年1 1 月1 2 月日本研究者k a t o 等在c - e n b m a k 中登记了温州蜜柑z e p 基因 序列( a b 0 7 5 5 4 7 ) ,全长1 9 9 5 b p ,编码6 6 4 个氨基酸。徐昌杰等获得的甜橙z e p 同 源基因与温州蜜柑的核苷酸序列同源性达9 8 6 0 。目前尚未见该基因表达模式的研 究报告。v d e 催化的反应刚好与z e p 相反。该基因已于2 0 0 1 年1 1 月在g e n b a n k 中登记( a r 4 4 4 2 9 7 ) ,是唯一已知的柑橘v d e 同源基因序列。目前正在开展关于光 照调控v d e 和z e p 基因表达的研究。 2 3 柑桔类胡萝卜素合成积累突变体 柑桔也有较多与类胡萝卜素相关韵突变种。在众多突变种中红色突变种数量众 多。葡萄柚( c i t r u s p a r a d i s i m a c f ) 在所有柑桔中红色突变体数量最多( 1 0 种以上) , 早在上世纪三十至五十年代这些葡萄柚突变种中的主要色素也己被证实为番茄红素 和b 类胡萝b 素,但其它的胡萝b 素以及叶黄索类类胡萝 、素却没有相关报道。 l e e ( 2 0 0 0 ) 的报道中指出了在红葡萄柚的果汁中测得了六氢番茄红素以及 胡萝卜素的存在,但是没有给出含量相关的数据。r o u s e f f 等人( 1 9 9 2 ) 对r u b y r e d 与s t a r r u b y 果肉中5 种胡萝h 素进行了分析,但是皮中的情况并没有进行研究。 脐橙中已知2 个品种能积累番茄红索。m o n s e l i s e 与h a l v e y ( 1 9 6 1 ) 从s h a r n o u t i 甜 橙的突变种s a r a h 中发现了番茄红素,但是其它的类胡萝h 素没有提及,但至今未 见迸一步的报道。另一种积累番茄红索的是红色脐橙突变体c a r a c a r a ,其果肉中的 类胡萝b 素成分已得到了分析,但果皮中的情况也没有进行研究。柚通常具有金光 色的皮,自色或是黄色的果肉,但是也有一些品种被报道具有粉红色的果肉( 徐娟, 2 0 0 2 ) 。此外在1 9 3 4 年便有报道提及了一种积累番茄红素的印度红柚,本研究小组 先期初步研究结果表明来自于浙江省的处州早红柚( 起源不明但极可能与玉环柚接 近) 是一种能积累番茄红素的柚类突变体。 最近徐娟等人采用h p l c 对5 种,3 类( 脐橙、柚和葡萄柚) 柑桔红色突变体 果肉中的番茄红素以及8 胡萝h 素的含量进行了测定,在5 种柑桔红色突变中s t a r r u b y 葡萄柚的番茄红索以及b 胡萝p 素含量最高,在对这5 种柑桔进行产后贮藏 试验时发现,在贮藏2 个月后,瑁西蜜柚红色突变种种的番茄红素以及b 胡萝h 素 含量有显著的提高,显示在该品种类胡萝索合成存在产后积累的现象( x u 等, 2 0 0 6 b ) 。 2 4 尚需开展的研究 类胡萝h 素合成途径可包括上游( 八氢番茄红素的合成) 和下游( 类胡萝p 素 种类间的转化) 途径。以往类胡萝卜索合成研究主要集中在下游途径( 从p s y 起) 。 研究表明,下游途径的调控通常只影响类胡萝b 素组成而对总含量影响较小。柑桔 果实( 不包含突变体) 通常以叶黄素为主,胡萝h 素含量很低( 徐昌杰,2 0 0 4 a ) , 表明从胡萝卜索易向叶黄素的转化,因此类胡萝 素分子间的转化对总含量应无大 的影响。探讨柑桔类胡萝卜素舍成的关键位点,宜着重分析合成途径的上游部分, 即从细胞呼吸代谢中间产物丙酮酸和3 磷酸甘油醛到第一种类胡萝h 素八氢番茄红 素的合成。因此,该对上游部分的关键合成基因n 璐、n 妆进行深入研究。 3 实时p c r 技术及其在基因表达研究中的应用 实时荧光定量p c r ,就是在p c r 体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实 时检测整个p c r 进程,最后通过标准曲线对未知模扳进行定量分析的方法。它是一 种新技术,灵敏度高,特异性好,实时鉴定,节约时间,且重复性好,测定偏差小, 最初多使用于医学领域,仪器及相关用品价格昂贵,随着多家公司加入仪器的生产 以及相关试剂耗材价格的下调,实验所需成本大幅度下降,这项技术也越来越成为 植物研究中的一项常规技术。传统p c r 技术主要用来定性分析,实时荧光p c r 技术 最大的不同之处在于能对d n a ( 或e d n a ) 进行定量分析,它的灵敏度可达传统的 点杂交的1 0 0 0 倍( m a l i n e n 等,2 0 0 3 ) ,甚至能检出单拷贝的基因。根据需要可以 采用绝对定量或是相对定量,相对定量最为常见的方法就是将目的基因和内参基因 进行比较( 王伟杰等,2 0 0 6 ) 。本研究选取相对定量法,使用实时荧光p e r 技术对 d x s 、d x r ,p s y ,口c 阿、l c y - e ,l c y - b 、p d s 基因在红肉和普通脐橙果肉中的表 达进行了研究。 9 第二章脐橙d x s 和d x r 基因的分离 类胡萝b 素是果实重要色素之一,广泛分布于红色、橙色和黄色果实中。果实 类胡萝 素不仅为果实着色,在人体中起着抗癌、抗氧化、防止衰老、可防治眼疾 等功能并且是维生素a 前体,营养价值深得人们信赖。但人体可以积累类胡萝卜素 并不具备合成能力只能从食物中获取。随着人类生活水平的不断提高,水果成了 人类不可缺少的营养品。果实作为植物类胡萝h 素的主要贮藏器官,是人们获取类 胡萝h 素的主要食物。而柑桔是浙江省的大型水果产业之一,如何使柑桔成分中含 有更多的类胡萝卜素,如何使柑桔的外观更加完美,如何提高我省柑桔的产业,成 了亟于解决的问题。 果实类胡萝b 素的生物合成途径主链及其关键基因已基本得到阐明,但是合成 前体g g p p 的合成及其酶的研究还未深入。d x s 酶是催化类胡萝卜素前体合成第一 步反应重要的酶,是一种转酮酶同时也是该生物合成途径的限速酶之一。这类酶研 究较少,已登录d x s 基因的植物包括小麦、玉米、烟草、金鱼草、黄水仙、夏侧金 盏花和曼地亚红豆杉等,柑桔中尚未相关研究报道。d x s 的表达能够调节番茄类胡 萝卜素产物的积累( 任彦等,2 0 0 5 ) 。e s t v e z 等将该基因转移到拟南芥中表达,拟 南芥工程植株中脱落酸和维生素e 的含量较对照分别提高了4 倍和2 倍,说明d x s 是该途径的重要限速酶之一,其过量表达能促进大肠杆菌和植物中各种类异戊二烯 产物的积累。 该途径中的第二步反应是由另一更为重要的关键酶d x r 催化的d x r 的作用还 不十分清楚。在大肠杆菌中共同过量表达d x s 和d x r 与单独过量表达d x s 相比, 提高了番茄红素的含量( k i m 等,2 0 0 1 ) 。从绿薄荷中分离了一个编码d x r 酶的 e d n a ,它有1 4 2 5 个核昔酸的序列,编码一个具n 端质体多肤的前体蛋白,该蛋自 在质体中加工成成熟的酶,而质体正是d x p 途径的引发之处。成熟的酶大约有4 0 0 氨基酸,分子大小约4 3 5 k d ,它与植物细胞来源的其它还原异构酶类似、d x r 酶 催化反应是类胡萝卜素生物合成途径的慢反应步骤( 罗永明等,2 0 0 3 ) 。 目前为止,类胡萝b 素合成主链上的所有9 个基因已经在柑桔中分离,也对这 些基因特性做了深入的研究( 徐昌杰等,2 0 0 2 ) 。但是类胡萝b 素前体i p p 合成所需 要的两个关键酶d x s 、d x r 还没有在柑桔中分离,相关研究也相当有限。因此, 1 0 加强这些方面的研究,有利于从整体角度更全面地阐述类胡萝p 素代谢细节及其机 制,进而为类胡萝 索合成的调控研究作出贡献。 1 材料 成熟果实普通脐橙果皮组织,普通脐橙果肉组织;红肉脐橙果皮组织,红肉脐橙 果肉组织,2 0 0 4 年采自浙江台州。 2 方法 2 1r n a 的提取 采用本实验室已经建立的适于柑桔果实r n a 提取的方法进行( 徐昌杰等, 2 0 0 4 b ) 。简述步骤如下:取4m lc t a b 提取液,加8 0m b 巯基乙醇,加入1g 经 液氮研磨果皮、果肉汁囊组织,混匀涡旋,放置6 5 c 水浴5m i l l ,加入4m l 氯仿, 异戊醇混匀,1 5 e ,1 0 0 0 0r p m 离心1 0 分钟,吸取上清,加入等体积氯仿异戊醇混 匀,1 5 c ,1 0 0 0 0r p m 离心1 0 分钟,再次吸取上清,加入1 5 体积1 2m o l ll i c i 混 匀,置于4 c 过夜。 过夜后试荆于4 c 。1 0 0 0 0r p m 离心2 0 分钟,弃上清,将沉淀溶于5 0 0 ms s t e ( 6 5 c 预热) ,加等体积氯仿异戊醇,振荡混匀,1 5 c ,1 0 0 0 0r p m 离心1 0 分钟, 取上清,加入2 倍体积乙醇置于一7 0 沉淀3 0m i n 以上,4 c ,1 0 0 0 0r p m 离心2 0 分钟,沉淀用7 0 7 , 醇洗净,晾干,最后视沉淀量加入2 0 4 0 恤id e p c 水溶解。通 过电泳检测,并使用分光光度计根据a 2 6 0 值对提取的r n a 进行粗略定量。 2 2d n a s e i 处理 采用晶美公司( f e r m e n t a s ) 的无r n a s e 活性的d n a s ei 及其方法,建立1 2u 1 的去d n a 体系。体系包括6 0 u g r n a ( 按照定量浓度计算相应体积) ,l t 2m m g c h 的1 0 x 反应缓冲液,4 0 m d n a s e i ,再用d e p c 水补足1 2 m 体系。在3 7 ( 3 普通p c r 仪中保温3 0m i n ,加入1 0m2 5 0m m o l le d t a :6 5 c 中1 0r a i n 。用分光光度仪进 行定量测试去d n a 后r n a 浓度。 2 3 去d n a 后r n a 定量 除d n a 污染后采用r i g a 特异的荧光染料r i b o g r e e n ( i n v i l r o g e n ) 对总脯a 进 行定量,方法如下:检测在b i o r a di c y e l e ri q 实时荧光p c r 仪上进行,检测采用 2 5 m 体系。将r i b o g r e e n 稀释1 0 0 0 倍后取1 0 山加入2 5 山体系,取1 m 除d n a 后 的r n a 样品,剩余体积用d e p c 水补足。当2 5m 体系中r n a 量在1 0n g - 1 0 0l a g 时,产生的荧光值与含量成良好线性关系,以2 0n gr n a 标准品( r n am a r k e r r l 6 0 0 0 ,o ,5 斗i d ,t a k a r a ) 产生的荧光值作为参照便可得到样品中的总r n a 含 量,进而可求出样品中总r n a 的浓度。 2 4 逆转录 采用晶美公司( f e r m e n t a s ) 的e d n a 逆转录套盒按试剂说明书,进行e d n a 第 一链的合成。建立1 2 “l 逆转录体系:取4 0u gr n a ( 按照定量浓度计算相应体积) , 1 0m o l i g o ( d t ) 1 8 ( 引物,o 5r t g r t d ,d e p c 水加至1 2 0m ,7 0 c5r a i n ,立即 置于冰上冷却2 r a i n ,短暂离心。依次加入4 0 m5 x 反应缓冲液,1 0 m r r l a s e i n h i b i t e r ( 核糖核酸酶抑制剂,2 0 0u i _ t 1 ) ,2 0 山1 0 0m m o l ld n t p s ,3 7 5m i n ,再加入 1 0mr e v e r s et r a n s e r i p t a s e ( 逆转录酶,2 0 0 0u i j t i ) ,4 2 6 0m i n ,7 2 1 0r a i n 结 束反应。合成的第一链e d n a - 2 0 保存使用。由于e d n a 定量的需要,在逆转录前, 每个样品需各取2 0 山,备用分别加6u l1 3 3 m m o l l e d l 1 3 3 咖o l l n a o h ,参与 逆转录,同时需要d e p c 水做空白样品对照,以备定量使用。 2 5e d n a 定量 将逆转录后空白样品和待测样品的反应液,7 0 c 保温2 0m i n ;用6 埘o 5 m t r i s h c l ,p h6 4 中和,各取1 0u l 与1 0u l 稀释1 0 0 0 倍后的r i b o g r e e n 混合,以标 准单链d n a ( 2 5n g h1 ) 产生的荧光作为参照,在4 9 0 5 2 0n l l 处用实时p c r 仪测 定荧光值。用逆转录样品的荧光值减去相应的逆转录前空白样品的荧光值,作为计 算e d n a 浓度的数据。 2 6p c r 引物设计 首先从g e n eb a n k 中检索得到已分离报道的d x r 、d x s 序列信息,依据已有序 列使用c l u s t a l x 软件排列保守区( 即同源性高的序列) ,根据引物设计遵循的基本原 则设计选择最佳引物。 2 7 基因克隆 2 7 1p c r 反应体系与循环条件 以合成的第一链e d n a 为模板,进行p c r 反应。2 5m 的反应体系包括:1md n a 模板;各0 5 山上下游引物( 1 0p m o l 9 1 ) ;2 5 山1 0 x p c rb u f f e r ,2 山2 5 m m o f lm g c l 2 , 0 5 山1 0m m o l ld n t p s ,0 2mt a q 酶( t a k a r a ) ,d d h 2 0 补足2 5m 体系。p c r 循 环条件为9 4 预变性5r a i n ,9 4 ( 2 变性4 0s ,5 0 退火4 0s ,7 2 延伸1 5r a i n ,共 进行4 0 个循环,最后7 2 延伸1 0 w i n 。 2 7 2 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖加入配制凝胶,由于胶的浓度会影响不同长度的d n a ,本实验选择o 5 的最佳浓度,并在电泳胶中添加少量0 5 “g m ie b 。d n a 样品与6 上样缓冲液混合 后点样后,选用t a k a r a 的d n a m a r k e rd l 2 0 0 0 ,放入电压电泳缓冲液( 1 1 a e ) 以9 5 v 的电压跑胶( 电泳电压通常以电泳槽的长度5 为佳) 。 2 7 3p c r 产物纯化 使用上海赛百盛基因技术有限公司的p c r 产物纯化试剂盒,将回收含目的d n a 片断的琼脂糖凝胶小块中加入0 4 m l 纯化树脂( 使用前充分混匀) ,7 0 c 保温5 1 0 分钟,每两分钟颠倒混匀1 次,使琼脂糖凝胶完全融化,融化后的混和液装入离心 纯化柱,1 3 ,0 0 0 r p m 离心3 0 秒,倒掉收集管中的废液,加入5 0 0m8 0 乙醇,1 3 ,0 0 0 r p m 离心3 0 秒,倒掉收集管中的废液,加入5 0 0 山8 0 乙醇,1 3 ,0 0 0 r p m 离心2 分钟, 务必将乙醇除尽,若纯化柱上还残留有乙醇,再离心1 分钟,将纯化柱套入干净的 1 5i i l l 离心管中,加入2 0 山超纯水于纯化树脂上,放置2 分钟后,1 3 ,0 0 0 r p m 离心 3 0 秒。得到的离心管中的纯化的d n a 片段,取3u l 产物,1 0 0v 电压电泳检测回 收结果。 2 7 4p c r 产物与t - 载体连接 选用上海生工p u c m - t 连接试剂盒,反应体系:0 5 山载体d n a ,1mp c r 纯 化产物,lm 连接缓冲液,o 5 i t 4d n a 连接酶p u c m - t ,加d d h 2 0 至1 0 斗l ,1 2 - 1 6 c 连接过夜。 2 7 5d n a 转化感受态细胞 按分子克隆中c a c h 方法,自制t g l 感受态细胞进行转化。简单步骤如下: 将连接产物与感受态细胞充分混合,冰上放置3 0r a i n ,于4 2 c 热激9 0 s 后迅速放冰 上放置2m i n ;加入1i 谢液体l b 培
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