（物理化学专业论文）纳米二氧化钛在竹红菌甲素研究中的应用.pdf

撼萼?南京师范大学硕士学位论文 纳米氧化钛在竹红菌素研究中的应用 摘要 竹红菌素是从竹红菌中提取出的一种天然光敏剂，属于3 ，l o 一二羟基一4 ，9 一 花醌衍生物，它是一种新型的光敏剂，具有极低的暗毒性和对肿瘤、病毒( 如h i v 等) 强的光毒性，对恶性肿瘤及病毒都有明显的杀灭作用，正越来越在世界范围 内受到重视，是极具有应用前景的天然光疗药物。本文对竹红菌素主要进行了以 下几个方面的研究： 1 由于竹红菌素为亲脂性化合物，将竹红菌素应用于光动力疗法所面临的 困难之一难以满足血液中的有效传输和细胞有效吸附的双重要求。本文利用溶胶 一凝胶法合成了氧化钛包裹竹红菌素的纳米粒，该纳米粒子的平均大小为1 2 0 n l - n ，该纳米粒均易溶于水、磷酸缓冲液和生理盐水等溶液中，从而达到有效地 改善h a 水溶性的目的，可以通过静脉注射方式进入人体，到达靶体部位。 2 利用红外、紫外、荧光光谱研究了氧化钛包裹竹红菌素纳米粒的光谱性 质并与竹红菌素在水溶液中的光谱进行了比较。结果表明，竹红菌素被成功的包 进了氧化钛纳米粒中；被包裹后由于纳米粒中光敏剂局部浓度过大的猝灭作用纳 米粒包裹竹红菌素的荧光较其在水溶液中，强度下降，峰位红移；包裹后由于竹 红菌素分子周围微环境的变化使得紫外吸收峰较其在水溶液中相比，峰位红移， 强度增加，上述这些改变对于将竹红菌素用于光疗都是有利的。 3 测定了氧化钛包裹竹红菌素纳米粒的光稳定性，结果表明由于纳米氧化 钛的保护，包裹后竹红菌素的光稳定性增强了，从而使得在整个治疗过程中，光 敏剂始终具有有效的杀伤浓度。 4 测定了氧化钛包裹竹红菌素纳米粒的单线态氧和三线态氧的量子产率， 结果均表明由于氧化钛纳米粒的保护作用，能够减少溶剂对产生的活性氧猝灭， 活性氧的量子产率大大增加了，这就表明了光疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力增强 了。 5 运用分子直径不同的系列荧光猝灭剂( 如k i 、二乙胺、三乙胺、乙二胺 等) 猝灭包裹在二氧化钛纳米纳米粒中h a 荧光的方法来确认包裹效果、估算二 氧化钛纳米空心球表面微孔直径和h a 的不可释放性。使用g a u s s i o n0 3 软件计 算可得，乙二胺及k 一的直径分别为0 5 3 n m 及0 4 4 n m ，由此可以推断该种方法制 撼要南衷唧范人学颀 ：学位论交 备的氧化钛包裹竹红菌素纳米粒的表面孔径介于0 4 4 n m 与0 5 3 n m 之间。 6 利用光谱法研究了氧化钛包裹竹红菌素纳米粒对c t - d n a 的光敏损伤能 力，结果表明其对d n a 的损伤能力强于竹红菌素的水溶液。 关键词：光动力疗法，光敏剂，竹红菌素，氧化钛，纳米微球 a b s t r a c t 南京师范大学硕十学位论文 t h ea p p l i c a t i o no fn a n o t i t a n i u md i o x i d ei nt h er e s e a r c ho fh y p o c r e l l i n s o n gk a i x i ( p h y s i c a lc h e m s i t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rf e n gy u y i n ga n da s s o c i a t ep r o f e s s o rz h o uj i a h o n g a b s t r a c t h y p o c r e l l i n ( i n c l u d i n gh y p o c r e l l i naa n dh y p o c r e l l i nb ) ，i s o l a t e d f r o m t h e p a r a s i t i cf u n g u so fh y p o c r e l l ab a m b u a s es a c c ，b e l o n g st o3 1 0 一t w oh y d r o x i d e r a d i c a l 一4 ，9 一c h i n o n ed e r i v a n t s i ti s a ne f f i c i e n t p h o t o t h e r a p e u t i c sa g e n ta n d p h o t o s e n s i t i z e r s t u d i e s i n d i c a t eh y p o c r e l l i nh a sl o wt o x i c i t ya n ds i g n i f i c a n t a n t i - t u m o ra n da n t i v i r a la c t i v i t i e s m o r ea n dm o r ep e o p l eh a sp a i e da t t e n t i o nt o h y p o c r e l l i na l la r o u n dt h ew o r l d i ti sav e r yp o t e n t i a ln a t u r a lp h o t o t h e r a p e u t i c d r u g i nt h i sp a p e rh y p o c r e l l i nh a sb e e ni n v e s t i g a t e di nt h ef o l l o w i n gr e s p e c t s 1 b e c a u s eh y p o c r e l l i ni sa no l e o p h i l i cc o m p o u n d ，o n eo ft h ed i f f i c u l t i e si s t h a ti tc a n ta f f o r dt h ed o u b l er e q u i r e rb e t w e e ne f f e c t i v et r a n s i ti nb l o o da n dt h e e f f e c t i v ea d s o r p t i o no nc e l l s i nt h i sp a p e r ，h y p o c r e l l i ne n c a p s u l a t e di nt i t a n i u m d i o x i d en a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e t i z e dw i t hs o l - g e lm e t h o d t h ea v e r a g es i z eo f t h en a n o p a r t i c l e si s1 2 0n m ，i tc a nb ed i s s o l v e di nw a t e r 、p h o s p h a t eb u f f e r e d s a l i n e 、p h y s i o l o g i c a ls a l ts o l u t i o ne a s i l y i tc a nb ei n j e c t e di n t r a v e n o u s l yi n t o t h ep a t i e n t sa n dg e tt ot h et u m o rt a r g e t 2 t h es p e c t r a lp r o p e r t i e so fh y p o c r e l l i ne n c a p s u l a t e di nt i t a n i u md i o x i d e n a n o p a r t i c l e sw e r es t u d i e db yi rs p e c t r o p h o t o m e t e r , u v v i ss p e c t r o p h o t o m e t e r a n ds p e c t r o f l u o r i m e t e ra n dc o m p a r e dw i t hh y p o c r e i l i ni nw a t e r t h er e s u l t s s h o w e dt h a th y p o c r e l l i nw e r ee n c a p s u l a t e di nt i t a n i u md i o x i d en a n o p a r t i c l e s s u c c e s s f u l l y , b e c a u s eo fh i g hp a r tc o n c e n t r a t i o n ，t h ef l u o r e s c e n c ew a sq u e n c h e d t h ei n t e n s i t yd e c r e a s ea n dt h ep e a kr e d s h i f tc o m p a r e dt oh y p o c r e l l i ni nw a t e r a f t e re n c a p s u l a t i n g ，t h em i c r o e n v i r o n m e n to fh y p o c r e l l i nw a sc h a n g e da n dt h i s m a d et h eu v v i ss p e c t r u mr e ds h i f ta n di n t e s i t yi n c r e a s e d a l lt h e s ec h a n g e sa r e b e n e f i c i a lt oh y p o c r e l l i ni np h o t o t h e r a p e u t i c s 3 t h ep h o t o s t a b i l i t i e so fh y p o c r e i l i ne n c a p s u l a t e di nt i t a n i u md i o x i d e a b s t r a c t 南京师范大学硕士学位论文 n a n o p a r t i c l e sw e r et e s t e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb e c a u s et h ep r o t e c t i o no f t i t a n i u md i o x i d en a n o p a r t i c l e s ，t h ep h o t o s t a b i l i t i e se n h a n c e d t h i se n s u r e d p h o t o t h e r a p e u t i c sd r u ga l w a y sp o s s e s se f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o nd u r i n gt h ew h o l e p h o t o t h e r a p yp r o c e s s 4 t h eq u a n t u my i e l do fs i n g l e to x y g e na n ds u p e r o x i d ea n i o nw e r et e s t e d ， a l lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e c t i o no ft i t a n i u md i o x i d en a n o p a r t i c l e sc a n r e d u c et h eq u e n c hc h a n c et oa c t i v eo x y g e ni nw a t e r t h i si n d i c a t e dt h a tt h e a b i l i t yo fk i l lt u m o rc e l l sh a sb e e ne n h a n c e d 5 t h ep a s s a g e ss i z eo nt i t a n i u md i o x i d en a n o p a r t i c l e sw e r em e a s u r e db y a p p l y i n gas e r i e so fq u e n c h i n ga g e n t sw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l ed i a m e t e r ss u c ha s k i ，d i e t h y l a m i n e ，t r i e t h y l a m i n e ，q u a d r 0 1 ) t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep a s s a g e s s i z eo nt i t a n i u md i o x i d e n a n o p a r t i c l e s w e r e b e t w e e ni o d i d ei o na n d d i e t h y l a m i n e 6 t h ep h o t o s e n s i t i v e d a m a g ea b i l i t y t oc t - d n aw e r et e s t e dw i t h s p e c t r o f l u o r i m e t e r , r e s u l t ss h o w e dh y p o c r e l l i ne n c a p s u l a t e di nt i t a n i u md i o x i d e n a n o p a r t i c l e sh a sb e t t e rp h o t o s e n s i t i v ed a m a g ea b i l i t yt h a nt h a ti nw a t e r k e y w o r d s ：p h o t o t h e r a p y , p h o t o s e n c i t i z e r , h y p o c r e l l i n ，t i t a n i u md i o x i d e ， n a n o s p e r e i v 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索：有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 瓷一鼋魄论南京师范天学硕士学位论文 光疗药物的研究概述 第一章绪论 1 1 1 光疗药物的研究进展 众所周知，恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的的常见病和多发病，人类因 恶性肿瘤而引起的死亡率占所有疾病死亡率的第二位，仅次子心脑血管疾病 1 ， 2 ，3 ，4 】。肿瘤的治疗方法包括手术治疗、放射治疗和药物治疗( 化学治疗) ， 很大程度上以化学治疗为主。然而，目前化疗药物存在这两大缺陷：严重的副反 应和耐药性。产生副反应的原因是化疗药物的选择性差，即药物在抑制和毒害增 生活跃的肿瘤细胞的同时，对其它增生较快的正常细胞，如骨髓细胞，肠上皮细 胞，毛发细胞和生殖细胞也同样产生抑制作用，因而会产生严重的副反应，如恶 心、呕吐、骨髓抑制、脱发等。这样，探索、研究高选择性的治疗方法和新的治 疗药物一直是科学工作者的目标。 光疗药物是一种本身( 或其代谢产物) 能选择性地富聚于要作用细胞的化学 物质，它( 或其代谢产物) 在适当波长光的激发下能发生光动力反应而破坏靶细 胞，光疗药物分子对光动力疗法起着决定性作用 5 , 6 ，7 】。光敏剂种类很多，早期 人们使用的光敏剂是某些染料，如丫啶橙、亚甲基蓝等。目前临床常用的是血卟 啉衍生物( h e m a t o p o r p h y r i nd e r i v a t i v e ，h p d ) 。用于光敏疗法的光敏剂应具备以 下特点：光疗窗口( 6 0 0 - - 9 0 0 h m ) 吸光能力强，水溶性适当，活性氧物种产生 能力强，在癌组织分布和吸收能力强，暗毒性低，皮肤光敏性弱，从体内清除时 间短。 自光动力疗法的应用研究开展以来光疗药物的发展经历了两代，p h o t o f r i n 、 h p d 是第一代光疗药物，在1 9 8 8 年由n y b u f f a l o 的r o s w e l lp a r kc a n c e ri n s t i t u t e 开发的，获得有限制的应用于光动力治疗。后来b r i t i s hc o l u m b i av a n c o u v e r 的 q l tp h o t ot h e r a p e u t i c s 购买了p h o t o f r i n 的专利并在全世界范围注册。现在， p h o t o f r i n 在美国、加拿大、日本、法国、荷兰可用于治疗食管癌，在日本用于治 疗胃癌和子宫癌。虽然h p d 在肿瘤的临床诊断和治疗中取得了肯定的疗效，但 仍有许多不足之处，如都是混合物，组成不定，其最大吸收波长不在对人体组织 臻一毒魄论南束帅范夫学颀 ? 学位论更 透过率较佳的红光区，药效不尽理想，且皮肤光毒性大等，因而临床应用受到限 制【8 】。 为克服h p d 的缺点，人们又发现或合成出一系列具有优良光敏性能的光敏 剂，即第二代光疗药物，如酞菁类，芳香阳离子类，稠环醌类( 竹红菌素，金丝 桃葸酮等) ，噻吩嗪类，花青染料等。较h p d 在性能上有了很大的提高，它们 的组成和结构明确，舣红移，且摩尔消光系数增大，药代动力学显示，肿瘤组 织中光敏剂的选择性和摄取率也有很大的提高 9 】。其中，竹红菌素，出于是我 国的天然产物，且早就作为治疗皮肤病的传统中药在民间得到广泛的应用，因而 一直受到从事光动力疗法领域研究的工作者的密切关注。 1 1 2 光疗药物发展史 。 光动力疗法( p h o t o d y n a m i ct h e r a p y , p d t ) ，概念在上世纪初提出，并在7 0 年 代有了实质性进展，最终于9 0 年代实现了合法化，以下是其基本的年代标志： 1 9 0 0 ：r a a d 首次发现草履虫在丫啶橙和光的协同作用下发生衰亡。 1 9 0 4 ：t a p p e i n e r 和j o d l e b a u e r 首次将有光敏剂、氧气和光参与的生物体杀伤 作用命名为光动力作用。 1 9 1 0 ：ha u s m a n n 将注射了血卟啉的小鼠光照后，发现光动力作用的大小与光 敏剂的剂量和光照的时间成正比例关系。 1 913 ：m e y e r b e t z 在人体注射血卟啉后，对同光呈现光敏特性，表现出极强 的水肿和滞留效应。 1 9 6 0 ：l i p s o n 和b a l d e s 将血叶琳的衍生物( h p d ) 用于小鼠的光敏作用。 1 9 6 1 ：l i p s o n 对有支气管肿瘤的患者进行h p d 的光敏治疗。 1 9 6 6 ：l i p s o n 首次将h p d 用于治疗乳腺癌。 1 9 7 2 ：d i a m o n d 将h p d 输入大鼠肿瘤体，用同光照射，发现肿瘤遭到破坏。 1 9 7 6 ：k e l l y 和s n e l l 用h p d 治疗膀胱癌：w e i s h a u p t 证实h p d 光疗破坏肿瘤的作 用来源于光敏产生的单重态氧。 1 9 7 8 ：d o u g h e r t y 用h p d 治疗皮肤癌。 1 9 8 1 ：h a y a t a 币l j 用光纤对支气管肿瘤进行光动力治疗。 1 9 8 4 ：d o u g h e r t y 从h p d 中分离纯化出二血卟啉醚，最p p h o t o f r i n i i 。 1 9 9 3 ：加拿大批准将光动力疗法用于早期膀胱癌的治疗。 糠一章鲐论南京师范大学颈：e 学位论文 1 9 9 7 ：法国和荷兰批准将光疗用于深度肺癌和食道癌的治疗，德国批准将光 疗用于早期肺癌的治疗。 1 9 9 8 ：美国食品药物管理会( f d a ) 批准将光疗用于早期支气管癌的治疗，美国 f d a 委员会建议批准将光疗用于阻塞期支气管肿瘤的治疗。 2 0 0 0 ：由加拿大的q l t 公司开发的苯卟啉衍生物单环酸a ( b p d m a ) ，是目 前唯一被批准应用于临床的第二代光敏剂，于2 0 0 0 年被美国食品与药物管理局 ( f d a ) 批准试用于肿瘤和视网膜黄斑变性的临床治疗。 1 1 3 竹红菌素研究进展及评述 竹红菌 h y p c r e l l ab a m b u s a e ( b e r k e tb r ) s a c c 】，别名竹砂仁、竹小肉座菌， 属子囊菌纲、肉座菌目、肉座菌科、个个红菌属。子座近半球形，直径0 7 - - 2 0 c m ， 较松软。新鲜时表面呈粉红色或浅肉色，干后变为灰黄色或红褐色，较坚硬。表 面有不规则的喙状突起，内部粉红色至深红色。子囊壳单列，埋生于子座外围， 壳壁透明无色，椭圆形，子囊细长。子囊孢子8 个，蠕虫形，螺旋状纽曲在一起， 透明无色或微黄色，有横隔，成熟后断裂成段，每段长2 0 3 0 “m ，侧丝细长稍 长于子囊，顶端略膨大 1 0 】。生长在云杉、冷杉林中或在箭竹属( s i n a r u n d i n a r i a ) 的竹子节间或近节处围生或生于竹子的幼芽梗部。目前仅知分布于云南、四川、 西藏等。我们使用的竹红菌采自云南省。 图2 1 竹红菌形态1 子座2 孢子、子囊和侧丝 竹红菌素( h y p o c r e l l i n ) 是从竹红菌中提取出的一种天然光敏剂，属于3 ，l o 一 二羟基4 ，9 花醌衍生物。通过提取可以得到竹红菌素，它有竹红菌甲素 焦一章魄论南京蛹范大学硕士学位论文 ( h y p o c r e l l i na ，简称i - t a ) 和竹红菌乙素( h y p o c r e l l i nb ，简称h b ) 两种主要成分， 均具有光敏产生各种活性氧的能力。竹红菌中最重要的光敏剂成分是h a ，同时 也有少量的h b ，h b 是h a 失去一分子水后的产物，酸和碱催化都能使h a 转化为 h b 。 竹红菌甲素的纯品为红色晶体，熔点2 0 9 - - 2 1 0 。c ，易溶于氯仿、吡啶、丙酮、 二甲亚砜等有机溶剂中，难溶于水。其亲脂性使这种色素易于聚集在细胞膜上。 竹红菌素的光谱特性，在二甲亚砜( d m s o ) 溶液中，其在可见光区均呈现3 个吸 收峰，波长为4 7 5 、5 4 5 、5 8 5 n m ，它的吸收峰位不随浓度改变而位移，谱形亦无 变化，只是吸收值随浓度的增加而增高，说明竹红菌素在高浓度下并不形成聚集 态。 1 9 8 0 年万象义、陈远藤首次报道h a 可以作为光疗药物使用 1 l 】，1 9 8 1 年陈 维新等人确定了h a 的结构 1 2 】，1 9 8 5 年万象义等人从竹红菌中分离至0 h b 1 3 】， 张曼华等人用光谱方法鉴定了乙素的结构 1 4 1 ，梁丽等人用x 射线晶体衍射确定 了它的结构【1 5 】。 o l l n c h 3 0 l 丁 洲3 笱 i | o 图1 3h a 和h b 的结构 h b 竹红菌素作为一种新型的光动力抗肿瘤药物，与血卟啉衍生物( h p d ) 相比， 具有原料易得易纯化，光敏剂三重态氧量子产率和单重态氧量子产率均较高，光 毒性高，暗毒性低，从正常组织的排除速度快等优点，其最大优点在于容易进行 定点化学修饰，获得纯的单体衍生物 1 6 ，1 7 】，是一种很有应用前景的光疗药物。 4 。一书跫葡锯跫 一 唔 h h 刚 o 奏一葺锩论南袁师范夭学硕 ? 学位论文 自从八十年代初以来，蒋丽金院士等率先开始对竹红菌素这种新型光敏剂的研 究，并对甲素和乙素的化学结构鉴定、光物理、光化学及光动力作用的分子机制 作了系统的研究【1 8 ，1 9 】。九十年代以来，竹红菌素的研究引起了国内外多个研究 小组的兴趣，对竹红菌素的光物理、光化学及光生物性质做了有意义的研究。加 拿大a l b e r t a 大学的l o w n 教授等在竹红菌素的人工合成、同位素标记竹红菌素的 合成、胺基化竹红菌素的合成及其光生物学性质方面做了大量的工作 2 0 】。美国 i o w a j i i 立大学的p e t r i c h 教授等开展了对竹红菌素抗病毒、细胞毒性及其机制方面 的研究，并将竹红菌素和结构相似的金丝桃葸酮( h y p e r i c i n ) 作了对比 2 1 2 8 。国 内一些研究小组在竹红菌素的激发态性质、结构修饰、光敏机制、量化计算、对 脂类及d n a 等生物大分子的光动力损伤作了一些有意义的工作 2 9 4 1 。 竹红菌素及其衍生物对许多癌细胞( 如海拉细胞、e m t 6 、内植s 1 8 0 、肝肿 瘤细胞和人体恶性上皮癌细胞等) 的光动力作用己经在细胞水平上被进行了广泛 深入的研究 4 2 4 5 。e s t e y 等对1 6 种竹红菌素衍生物进行了系统的理化、生物学 特性研究 4 6 ，从中筛选出三种竹红菌乙素的衍生物进行了临床前的评估，这三 种衍生物主要定位在溶酶体和高尔基氏器，主要通过i i 型机制产生光敏毒性，可 完全治愈小鼠的e m t 6 e d 移植瘤而几乎没有皮肤光毒效应，不具有致突变性。初 步实验表明，细胞凋亡是它们介导光敏毒性的主要途径。对实验动物无明显毒理 作用，体内半衰期为2 小时左右，显示出良好的药物代谢动力学特性。另外，值 得一提的是，竹红菌素能明显杀灭h i v 病毒 4 7 】，而且竹红菌甲素和乙素均有良 好的抗单纯性疤疹类型i 病毒幂l s i n d b i s 病毒的活性【4 8 】。 但是，作为抗癌药物来说，天然的竹红菌素在光疗窗口( 6 0 0 9 0 0 n m ) 几乎没 有吸收，极大的限制了其在临床上的应用。另外，天然的竹红菌素是亲脂性化合 物，水溶性不好，不便于制成药剂。为了得到在光疗窗口有强吸收( 即波长红移 以配合激光治疗) 和脂水兼容( 便于药物制剂) 的光疗药物，近年来，人们以结构 修饰的方法合成了一系列竹红菌素的衍生物，并取得了一些突破性进展。 1 1 4 竹红菌素的结构修饰方法 总的说来，竹红菌素有下面几个反应位置：芳坏，酚羟基，醌羰基，七元环 和甲氧基，下节将系统介绍一下前人对竹红菌素所作的结构修饰并对这些衍生 物作以对比。 瓷一章魄论南京4 乖范大学硕士学位论文 ( 1 ) 竹红菌素化学修饰 目前，通过对竹红菌素进行化学修饰来提高其水溶性和吸光能力的途径主要 有如下几种： 卤代 主要是氯、溴和碘的单取代或二取代产物，取代的位置是5 位或8 位。另外， 在醋酸溶液中，竹红菌素和溴、碘发生反应时，除了生成5 ，8 位取代产物外，侧 链七元环中的甲基也会发生取代反应。与母体相比，该类产物的单重态氧的量子 产率有所提高，但是水溶性降低 4 9 ，红光吸收能力也不够强。 磺化 光照竹红菌素和亚硫酸钠( n a 2 s 0 3 ) 的溶液，可生成5 和8 位磺化的竹红菌素衍 生物e 5 0 ，5 1 。该类衍生物的水溶性得到明显的增强，但是其脂溶性相对较差， 而且相对于其母体化合物来说，它们的长波吸收能力并没有得到改善。另外，该 类衍生物单重态氧的量子产率略有降低，但超氧阴离子自由基的量子产率只有母 体的6 0 左右，所以它的光损伤效率不高。 竹红菌素与胺类化合物的反应 由于许多葸酮类抗癌药物( 如柔毛霉素、道若霉素、丝裂霉素等) 均含有 一n h c h ：c h ：o h 基团，因此一些胺类化合物( 如氨水、乙醇胺和正丁胺等) 也被用与竹 红菌素反应，得到相应的衍生物。若将竹红菌素溶解于氨水中反应，可得到七元 环上的席夫碱产物和花醌环上的氨基取代产物：在吡啶溶液中进行，则只得到七 元环上的席夫碱产物。另外，若竹红菌乙素与乙酰胺反应，即可生成一系列的七 元环胺基取代物 5 2 ，5 3 。研究发现，此类衍生物在光疗窗口的吸收大大增强，而 且暗毒性较母体低，但是它们的水溶性仍有待于进一步改善。 竹红菌素与疏基化合物的反应 由于竹红菌素能够使膜蛋白中的巯基含量降低，因此有关竹红菌素与一些巯 基化合物( 如正辛硫醇、巯基乙酸等) ，以及半胱氨酸和半胱胺等具有重要生物功 能化合物之间的反应得到广泛的研究。巯基化合物是一种亲核性很强的化合物， 能够与酮类进行亲核加成，生成取代氢醌，取代氢醌很容易被氧化成取代醌。除 了得到5 ，8 位的取代物外，还可以得到了环合化合物。一般来说，巯基化使衍生 物的类型i 反应增强，使类型i i 反应减弱 5 4 。 6 亮一鼋凌i 论 南京黼范大学硕士学位论文 竹红菌素与氨基酸的反应 一些反应位阻较小的氨基酸( 如：甘氨酸、丙氨酸等) 通过一定的途径也能达到 修饰到竹红菌素上的目的。由于氨基的引入，竹红菌素氨基酸衍生物的水溶性得 到一定提高，光疗窗口的吸收能力也有所增强，但是各种活性氧的量子产率均远 小于竹红菌素，如在苯中h b 的单重态氧的量子产率是0 7 6 ，而竹红菌素氨基酸衍 生物的单重态氧量子产率最高的仅为0 6 5 5 5 ，5 6 。 糖苷类衍生物 竹红菌乙素先与巯基乙醇、巯基乙酸通过光反应得到取代物，然后再和糖类 分子反应，即可得到糖苷类的竹红菌素衍生物。糖苷类的竹红菌素衍生物具有较 好的水溶性，高的光敏性，增强了类型i 反应，但是大大地减弱了类型i 工反应。 增强的原因可能是由于三重态衍生物与基态衍生物之间的自身电子转移效率增 高了 5 7 。 环糊精类衍生物 b 一环糊精修饰竹红菌素得到的衍生物具有一定的水溶性，同时光疗效率也 得到增强，主要是增强了类型( i ) 机制( 减弱类型( i i ) 机制) ，这可能是由于所接 的1 3 一环糊精的存在，提高了该衍生物与d n a 分子之间亲和力 5 8 。 ( 2 ) 竹红菌素与金属离子络合 竹红菌素及其衍生物能够与多种金属离子( m 9 2 + ，c a 2 + ，z n 2 + ，f e 3 + ，f e 2 + ，m n 2 + 等) 生成络合物，这些络合物都能溶于水及有机溶剂，如二甲亚砜，d m f ，乙醇等， 吸收光谱也发生较大的红移，同时对竹红菌素的光动力性质也有很大影响，主要 表现在其单重态氧量子产率急剧下降 5 9 6 3 ， ，总的来说，这些竹红菌素金属配 合物都不太稳定，并且单重态氧量子效率较母体有很明显的降低。 ( 3 ) 水溶性药物载体 目前，除了进行结构修饰和金属配合物的途径以外，还有一种方法可以改善 竹红菌素水溶性差和光毒性大的缺点，即利用脂质体、天然生物蛋白( 药用明胶 阿拉伯胶、人血清蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白) 、多糖类生物大分子( 海藻酸钠、 壳聚糖) 、可生物降解的高分子聚合物( 聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸烷烃酯、聚氰 基丙烯酸烷烃酯) 和脂肪乳等，这些载体在助溶剂和分散剂存在下对脂溶性的竹 红菌素进行包封，可以制成适合于静脉注射的竹红菌素纳米粒子 6 4 ，6 5 。但是 7 1 泰一章娥南隶的范人学硬| j 学位论文 利用上述的载体来包裹竹红菌素，虽然使得肿瘤细胞吸收的药物效果比游离的药 物好，却仍然存在缺陷，如该类药物载体的制备工艺要求高、所制得的产品长期 放置后稳定性低等。特别是由于这类传统的药物载体是基于药物在体内缓慢释放 的原理构建的，并不适合应用于光动力药物。这是因为光动力疗法主要是通过光 照光敏药物产生活性氧损伤肿瘤组织的途径来治疗肿瘤，在此过程中不考虑光敏 药物本身是否对肿瘤组织存在损伤的作用，因此该疗法并不需要从载体中释放出 光敏药物，只需有能让活性氧进行扩散的小通道即可。而利用上述传统的药物载 体来包封竹红菌素，当其被注射入人体后，从载体内释放竹红菌素在血液中同样 会发生不同程度上的自发聚集，导致毛细血管形成栓塞，从而不可避免地产生光 毒副作用。因此寻找具有很好的水溶性和稳定性，以及能够不释放药物的载体成 为从事光动力疗法领域研究的人们追求的目标。 1 2 光动力疗法的研究进展 1 2 1 光动力治疗法简介 光动力治疗法( p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ，简称p d t ) 是正在研究发展中的一 种新型医疗技术，被公认为临床上除手术、放疗、化疗之外的第4 种治疗癌症的 方法 6 6 ，6 7 ，6 8 ，6 9 。自2 0 世纪7 0 年代进入临床研究以来，p d t 已为治疗恶性 肿瘤提供了一种新的手段。与传统的肿瘤疗法相比，具有独特的优点：( 1 ) 具有 很好的选择性，能选择性地消灭局部的原发和复发肿瘤而不危及正常组织：( 2 ) 可与放疗和化疗同时进行且对两者均有一定的协同作用；( 3 ) 可借以缩小手术的 范围和改善手术的预后，光疗药物的特征发射荧光可指示肿瘤的浸润程度，因而 使手术切除肿瘤既正确又彻底；( 4 ) 引起的副作用小，接受光动力治疗的患者只 需要在短期内避免强光直射，就不会产生局部光敏皮炎：( 5 ) 可多次使用。因此， p d t 备受全世界的关注。 目前，光动力疗法在临床癌症治疗中已取得了令人瞩目的成就，1 9 9 3 年加 拿大卫生部门首先批准将p h o t o f r i n 应用于膀胱癌和食管癌的光动力治疗，到目 前为止，光动力疗法在荷兰、法国、德国、日本和美国等国相继获得批准，还有 1 1 个欧洲国家正在寻求获得批准。 1 2 2 光动力疗法原理 8 赛一毒。魄论南京师范大学硕士学位论文 p d t 的基础是靶体中生物物质的光敏氧化。首先，将光敏剂导入体内并让 它在组织间分布，然后，当光敏剂在靶体和非靶体中的浓度比达到最大值时，用 与光敏剂吸收光谱相匹配的光照射靶体组织，通过一系列光物理、光化学和分子 生物学过程，在氧的参与下，产生对靶体细胞功能有害的活性氧和氧化物，使靶 体组织破坏直至死亡。 1 2 3 光动力疗法机制 光动力疗法的作用机制可分为化学机制和生物机制。 p h o t o d a m a g e t y p ei t r a n s f e r o h v i p s + oo ， 3 p s 。c = = = = ：= 三兰= = 葛 n e n e r g yt r a n s f e r 图1 1 光动力疗法的化学机制 化学机制中主要包括i 型机制和i i 型机制 7 0 ，7 1 ， 。光敏剂在注入患者体内，间 隔一段时间，待其相对富聚在肿瘤组织中后，使用恰当波长的光( 一般为激光) 照射肿瘤部位，此时，富聚在肿瘤中光敏剂能引发光动力反应而破坏靶细胞，具 体过程如下所述：光敏剂吸收光以后，由基态( 单重态) 跃迁到寿命较短的单重 态激发态，激发单重态经过系间窜越生成寿命较长的激发三重态。在光敏剂的激 发三重态，将发生两类反应( 如图1 1 ) ，( 1 ) 直接与底物或溶剂发生抽氢反应或 电子转移 7 1 ，生成自由基或自由基离子，直接损伤生物组织，或者再和0 2 作用， 产生氧自由基。这一过程称作t y p ei 机制，也即自由基机制。( 2 ) 直接与氧发生 能量转移反应，生成单重态氧。而单重态氧是一种具有高反应活性、高氧化性的 活性体，它具有亲电性，能高效氧化生物分子，如不饱和脂肪酸、蛋白质、核酸 等 7 2 。这一过程称为t y p ei i 机制，也即单重态氧机制。 9 薏烹 仰 蝣 n u 嚣 p 第一章绪论 t y p ei 和t y p ei i 可同时进行，二者的比例取决于光敏剂的性质、底物、氧 浓度以及底物与光敏剂的结合程度。因此，光动力效果与氧有关。对于大多数光 敏剂而言，光动力效果受单重态氧调控，但其它一些活性氧，如超氧负离子和羟 基自由基也起到了一定的作用。除此之外，化学机制中还包括光热效应、光诱导 构型变化等。 总而言之，无论起初的反应是按i 型还是按i i 型进行，都导致氧化损伤和自 由基链式反应。最终，两种机理均导致肿瘤组织中的氧化损伤，从而致使细胞死 亡进而肿瘤被摧毁。 p d t 的生物机制是以其化学机制为基础的。研究表明，p d t 对肿瘤的作用主 要体现在两个方面：一是对肿瘤细胞的直接杀伤作用；二是间接杀伤，通过作用 于肿瘤组织的微血管造成血管完全封闭，是肿瘤组织缺氧或营养枯竭，从而导致 肿瘤组织坏死。两种作用方式以何种为主，依不同类型的光敏剂而异 7 3 。从医 疗的角度看，直接杀伤是较理想的方式，因为间接杀伤存在以下缺点：当肿瘤组 织的血管系统恢复正常后癌细胞又复活；临床上不利于溃疡性肿瘤的治疗；还导 致某些血管作用素的释放，这些物质的释放，除了引起局部的毒性效应外，还可 能触发系统毒性而使机体致死。此外，对p d t 生物机制的研究还表明，p d t 杀死 肿瘤细胞的能力还包括免疫系统的参与等 7 4 。其特征为：首先细胞膜的通透性 增加，细胞肿胀并发生不规则变化，内质网扩张，核染色质不规则移动，进而线 粒体及细胞核肿胀，溶酶体和细胞膜破裂，胞浆外溢，引起炎症反应，组织充血 水肿。两种作用中何种作用为主，依不同光敏剂而异。对于现在广泛用于临床的 光敏齐u p h o t o f r i n l i 而言，第二种作用尤为重要。 近年来，越来越多的实验证据表明光动力疗法还可以诱发细胞凋亡，细胞凋 亡是机体细胞自身基因参与调控的一种细胞死亡过程。其特征为：细胞首先变 圆，随即与邻近细胞分离，核d n a 断裂成核小体片断并形成有膜包裹的凋亡小 体，进而迅速被邻近细胞或吞噬细胞所吞噬。p d t 诱导细胞凋亡可迅速发生，而 且没有溶酶体和细胞膜的破裂，不会引起炎症反应，所以被认为是一种更为理想 的机制。 另外，p d t 不仅对体表恶性肿瘤有治疗作用，对体腔内脏器官肿瘤也可通 过光纤内窥镜进行治疗。目前临床可用于皮肽癌、肺癌、胃癌、食管癌、膀胱癌 l o 繇一鼋j 强论南京师范久学颀| ? 学位论义 等。 p d t 是近年来发展起来的一种新方法，其治疗机理尚在进一步的研究之中。 随着研究的不断深入，会有更多更好的光敏剂被发现，更先进的技术被应用，加 之与其他治疗方法的联合使用，p d t 势必会在肿瘤治疗中发挥更重要的作用。 1 3 课题的提出及意义 随着纳米技术的发展，纳米材料在生物医学上的应用也开始崭露头角。近年 来t i 0 2 在光催化氧化在环境和能源方面显现出广阔的应用前景，人们在这些领域 进行了广泛研究和开发，但在医学领域中的研究和应用才刚刚开始。 纳米t i 0 ：是一种比较稳定和安全的化合物，它对动物体无毒性，生物相容性 好，t i 0 ：颗粒能够被正常组织内的巨噬细胞所吞噬，不会引起白细胞减少等副作 用 7 5 。刘清，治洪，郭宝岗等进行了纳米t i 0 ：毒性的试验研究。结果表明，纳 米t i o 。对小鼠急性经口毒性l d 5 0 1 0 0 0 0m g k g 体重，属实际无毒级：小鼠蓄 积毒性k 5 ，为弱蓄积性：一次完整皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺 激试验结果为无刺激性：3 个剂量诱导p c e 微核细胞率与阴性对照组比较差异 无统计学意义( 尸 0 1 0 5 ) ，对小鼠骨髓p c e 无诱变作用 7 6 。另外，徐志兵， 魏先文等报道 7 7 ，7 8 ，7 9 ，利用溶胶一凝胶法可以制得三维具有立体网状结构 囊，纳米多孔球状的t i 0 2 纳米粒，可以得到在水中悬浮稳定，不产生聚沉的稳定 透明分散体系。纳米粒为固念胶体颗粒，其尺寸小适宜配制注射针剂供静脉注射， 进行表面修饰后，可以实现主动靶向性。 因此，若将纳米t i 0 2 粒作为药物的载体引入光动力疗法研究领域，对于推动 光疗药物性能的改善，以及加快竹红菌素的应用化进程均具有十分重要的理论和 实际价值。 簧一葺氧论南京嶂范大学硕士学位论文 参考文献： 【l 】杨玲，李连弟，陈育德中国2 0 0 年及2 0 0 5 年恶性肿瘤发病死亡的估计与预测 【j 】中国卫生统计，2 0 0 5 ，2 2 ( 4 ) ：2 1 8 - - 2 2 1 2 】韩秀霞，陆如山w h o 号召全球抗击癌症( j ) 国外医学情报，2 0 0 6 ，6 ：4 5 【3 】游伟程肿瘤的预防一2 l 世纪肿瘤防治研究的焦点( j 1 北京大学学报( 医学版) ， 2 0 0 5 ，3 7 ( 3 ) ：2 2 9 - - 2 3 0 4 鲁风珠我国肿瘤防治工作的回顾与展望( j ) 中国肿瘤，2 0 0 1 ，1 0 ( 1 ) ：1 2 5 l e s t e rm d a v i d s ，b r i t t ak l e e m a n n ，d e n i s ak a c e r o v s k f i ，k a r lp i z i n g e ra n d s u s a nh k i d s o n ，h y p e r i c i np h o t o t o x i c i t yi n d u