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铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量 分析中的应用 专业：分析化学 硕士：董秋鹏 指导老师：凌连生副教授 摘要 多吡啶氨基酸铜配合物在光物理、电化学、分子自组装等研究 领域占有重要的位置，在d n a 结构识别、光谱探针、裂解试剂和抗 癌药物等方面的应用也受到越来越广泛的重视。近年来，这种类型的 配合物与d n a 的独特作用方式成为化学领域引人注目的研究课题。 本文合成了一种新的多吡啶氨基酸铜三元配合物 c u ( d p p z ) ( l s e r ) n 0 3 h 2 0 】。通过元素分析、f a b 质谱、紫外可见 光谱、红外光谱、荧光光谱等手段，对配合物进行了表征和性质研 究。通过紫外可见光谱和荧光光谱等方法，研究了铜配合物与小牛胸 腺d n a 的作用情况。实验结果表明：铜配合物与d n a 发生明显结合 作用，表现在它的光物理性质受到d n a 较大程度的影响，d n a 的加 入使得铜配合物的紫外吸收峰出现明显的减色现象。 t 本文同时研究了配合物与d n a 作用的共振光散射光谱。在p h 7 2 的t r i s 缓冲液中，d n a 的加入导致铜配合物共振光散射的增强，在 4 0 0 n m 处存在一个共振光散射增强峰，其强度与d n a 的浓度呈线性 关系，据此建立了一种测定d n a 的共振光散射法。该方法的线性范 围为0 9 2 9 2 9 m o l l ，线性方程为i r l s = 5 9 7 + 10 5 c d n a ( m i i o i l 。1 ) ，相 关系数为0 9 9 8 2 ，检出限为0 6 4 1 m a o l l 。将该方法用于混合样品中 d n a 的测定，结果令人满意。 关键词：多吡啶氨基酸铜配合物，共振光散射，d n a s y n t h e s i so fc o p p e r ( i i ) 一d p p zc o m p l e x ea n d i t sa p p l i c a t i o n i nq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fd n a m a j o r ： n a m e ： a n a l y t i c a lc h e m i d t r y d o n gq i u p e n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rl i n gl i a n s h e n g a b s t r a c t p o l y p y r i d y lc o p p e rc o m p l e x e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e s e a r c h f i e l d ss u c ha sp h o t o p h y s i c s ，e l e c t r o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a ra s s e m b l i n g r e c e n t l y , m u c ha t t e n t i o nh a sb e e np a i di nt h e i rp o t e n t i a l sf o rd n a s t r u c t u r e r e c o g n i t i o n ，s p e c t r o s c o p i cp r o b e s ，h y d r o l y t i cr e a g e n t sa n d a u t i c a n c e rd r u g s an o v e l p o l y p y r i d y la m i n oa c i dt e r n a r yc o p p e rc o m p l e x ew a s s y n t h e s i z e d ，a n di t s s t r u c t u r ew a sc h a r a c t e r i z e dw i t he l e m e n t a la n a l y s i s 、 f a b - m s 、u v - v i sa n df l u o r e s c e n c es p e c t r u m u v - v i sa n df l u o r e s c e n c e s p e c t r u mh a v eb e e nu s e dt os t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc o p p e r c o m p l e xa n dc a l ft h y m u sd n a t h eu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o no fc o p p e r c o m p l e xd e c r e a s e dd r a m a t i c a l l ya f t e rd n a w a sa d d e d ，i tr e v e a l e dt h a tt h e i c o p p e rc o m p l e x b i n d ss i g n i f i c a n t l yw i t hd n a t h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) s p e c t r u mo fc o p p e rc o m p l e x w i t hd n aw a sa l s os t u d i e d t h er l so fc o p p e rc o m p l e xw a sg r e a t l y e n h a n c e db yd n ai nt h et r i sb u f f e ro fp h 7 2 ar e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n gp e a ka p p e a r e da t4 0 0n n l ，a n dt h ee n h a n c e di n t e n s i t yo f r l sa t t h i sw a v e l e n g t hw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fd n a t h u sa r l sm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fd n aw a se s t a b l i s h e d t h el i n e a rr a n g e w a s 0 9 2 9 2 岬n o l l ，a n d t h el i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o n w a s i r l s = 5 9 7 + 10 5 c d n a ( t m o l l 。1 ) t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 8 2 ， a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s0 6 4 l x m o l l s a t i s f a c t o r yr e s u l tw a so b t a i n e d w h e n a p p l i e dt h i sm e t h o di n t ot h ed e t e r m i n a t i o no f m i x e d s a m p l e s k e y w o r d s ：p o l y p y r i d y la m i n oa c i dc o p p e rc o m p l e x e s ，r e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n g ，d n a i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：苏移 日期：m 声6 月彦e l f 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：鼍秋膨导师签名：逸：囊沽二 吼7 年6 月g 日日期淅爷6 月日 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文是本人在导师指导下完 成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识产 权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利， 均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以任何 方式，以任何其他单位作为全部和局部署名公布学位论文成果。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 第1 章绪论 第1 章绪论 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 提出d n a 的双螺旋结构模式，从分子水平上阐述了 生命遗传信息通过d n a 的半保留复制机理，从此生物学进入了分子生物学的新 时代。分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平上理解某些疾病的 发病机理，并通过分子设计来寻找有效的治疗药物。 构成核酸的单体是核苷酸，核苷酸由核苷( 包括碱基，戊糖) 和磷酸组成。按戊 糖是p d 核糖或p d 2 脱氧核糖，将核酸分为核糖核酸( r n a ) 和脱氧核糖核酸 ( d n a ) 。d n a 的碱基是腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 四种。 r n a 的碱基中，除尿嘧啶代替了胸腺嘧啶外，其余三种与d n a 相同。 脱氧核苷酸之间由3 ，5 磷酸二酯键连接起来形成单链，称为d n a 的一级结 构。两条单链之间碱基由氢键联系起来，形成两种特定碱基配对a t 和g c 。相 邻碱基对平面之间的间隔处于v a i ld e rw a a l s 距离内，因此碱基平面上分布的电子 云系统之间的吸引力、碱基上永久性偶极间的作用力和诱导偶极的相互作用等分 子间作用力，使碱基之间存在堆积作用。堆积作用的大小表现出嘌呤嘌呤 嘌呤 嘧啶 嘧啶嘧啶的趋势，而且还受碱基排列顺序的影响。氢键和堆积作用使两条 脱氧核苷酸单链组成一条双螺旋，就是d n a 的二级结构。 碱基对与糖环的连接不是在碱基对的两侧而是在同侧，这种不对称的连接导 致双螺旋表面形成两个凹下去的沟，宽的称为大沟，窄的称为小沟。大沟携带了 其它分子能阅读的信息( 碱基顺序) ，沟足够大，能允许蛋白质分子进入。相比之 下，小沟的信息较少些。 金属配合物可作为d n a 的结构和构象的探针，因此研究金属配合物与d n a 的键合和识别机理成为国际上较活跃的研究领域之一【l 引。过渡金属配合物具有 独特的光谱或反应特征，通过设计配合物分子的形状，对称性及官能团结构，使 其与d n a 分子在相应的方面匹配，从而对d n a 进行特异性识别。同时通过配合 物的光化学，光物理，氧化还原性质，探测它们与d n a 的作用，使其作为d n a 的结构探针得到进一步发展。 中山大学硕士学位论文：铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 1 1 多吡啶氨基酸铜配合物研究概况 以2 ，2 联吡啶( b p y ) 和邻菲咯琳为代表的多吡啶配体具有大的平面芳 香环结构，易于插入d n a 的碱基对平面之间，既是电子给体又是兀电子受体， 有丰富的光谱性质。它们能与多种金属离子形成稳定的配合物，是现代配位化学 中应用非常广泛的一类配体。 铜是重要生命元素。在生物体内，大部分铜离子与两种或两种以上生物配体 形成配合物，与生命过程中酶的催化、物质的储存和运送及金属离子的转运过程 有关。由于多吡啶具有咪唑、嘌呤碱和嘧啶碱等生物配体类似的配位性质，因此 多吡啶氨基酸铜配合物可作为酶金属离子底物的模型化合物【4 j 。 近十几年来，多吡啶铜配合物的研究受到广泛关注。研究发现多吡啶铜配合 物对d n a 具有识别断裂作用、对超氧阴离子自由基具有催化歧化作用，因此研 究多吡啶铜配合物对了解生物体内铜酶的作用机理以及开发新型高效低毒的药 物都具有重要意义。s u g i m o r i 5 1 和古琴【6 】等人合成和研究了一系列多吡啶氨基酸 铜配合物。他们以一系列多吡啶小分子作为第一配体，以小氨基酸作为第二配体， 合成了一系列铜配合物，并用多种方法研究了这些配合物的结构、性质及其与 d n a 的相互作用。 1 2 配合物表征方法 1 2 1 红外光谱 配体与金属离子键合后红外谱带会有很大的变化，因此红外光谱在配合物的 研究中得到了广泛的应用。如氨基酸和多吡啶形成铜类配合物后，氨基酸的v n - h 发生位移，羧基c o o 的非对称和对称伸缩振动发生分裂和位移，并且强度会有 所下降，多吡啶配位后芳环上的特征吸收峰同样会发生明显变化。如周晓华【7 1 研 究了配合物 c u ( b p y ) ( l - f i e ) c 1 0 4 0 5 h 2 0 配位后的l - f i e 在3 10 0 - 2 7 0 0 c m 。1 v n - h 伸缩 振动峰发生了位移，并出现了对称伸缩峰( 3 1 5 1 c 面1 ) 和反对称伸缩峰( 3 3 1 7 c m 1 ) ， 表明了氨基参与配位。多吡啶配体b p y 配位后b p y 环的骨架振动明显变弱。 1 2 2 紫外可见光谱 2 第l 章绪论 紫外可见光谱主要包括金属离子d d + 轨道能级间的跃迁以及多吡啶配体分 子内的一兀跃迁。对于含有芳香环的氨基酸配合物，由于堆积作用可能会在近 紫外区产生归属于堆积作用引起的芳环之间的电子转移吸收峰。周晓华【8 】研究了 a 氨基酸铜( i i ) 联吡啶混配配合物的紫外可见吸收光谱，并指出了各个吸收峰的 归属。如表1 1 i s 】所示： 表1 1a 一氨基酸铜( i i ) 联吡啶混配配合物的紫外可见光谱数据 1 2 3 电导率 电导率是判断配合物电解质结构类型的简便、有效方法之一。它通过把配合 物溶解在合适的溶剂中，测定溶液的电导率，根据经验值初步判断电解质的结构 类型，这对于未知结构配合物结构的进一步推测提供了有力的信息。g e a r y 9 】在此 方面做了大量的研究工作，他把有关各种类型的配合物在不同溶剂中的电导率 的研究结果综合归类，为别人的研究提供了很好的依据。乐学义【1 0 】i 9 1 8 得配合物 【c u ( t a t p ) ( l p h e ) c 1 0 4 0 5 h 2 0 在甲醇中的电导率为9 7 3 s c m 2 t o o l 一，g e a r y 9 】给 出的1 ：1 型配合物在甲醇中经验值为7 0 1 1 5 s c m 2 t o o l ，表明该配合物为1 ：1 型电解质。 中山大学硕士学位论文：铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 1 2 4x - 射线单晶衍射 x 射线单晶衍射是目前研究物质结构最有力的方法，它能够对于具有单晶形 态的物质给出结构的精确结果。除了能够提供有关晶体结构和分子结构的各种 基本参数之外，还能揭示分子内或分子间的配体与配体之间的相互作用【】。如乐 学义【1 2 】等在研究 c u ( t a t p ) ( l - t y r ) c 1 0 4 h 2 0 体系时，通过单晶衍射数据数据证 明了分子内( 氨基酸芳环和t a t p 芳香环之间平面距离为0 3 3 n m ) 和分子间( 相邻 分子的芳香环间距离为o 3 4n m ) 的芳香环堆积作用。 1 3 多吡啶铜配合物与d n a 作用的研究进展 1 3 1 研究背景 平面四方形的铜多吡啶配合物具有丰富的光谱性质氧化还原性质【1 4 1 和大 的平面芳香环结构。随着对这类配合物与d n a 作用本质认识的加深，这类配合 物可作为核酸切割剂，结构探针和光谱探针【1 5 以6 】的应用日益受到人们的关注。 核酸切割剂也称化学核酸酶，是指对核酸特定部位可进行选择性断裂的一类 化合物。自1 9 7 9 年s i g m a n b t 和他的同事研究发现配合物c u ( 1 ) ( p h e n ) 2 在h 2 0 2 ( 0 2 ) 和还原剂同时存在条件下具有核酸酶活性后，多吡啶铜配合物在核酸化学领域 引起了越来越多的重视。他们对配合物c u ( i ) ( p h e n ) 2 断裂d n a 的机理做了深入 的研究，发现【c u ( p 1 1 e n ) 2 】2 + 和 c u ( p h e n h + 之间的氧化还原反应产生的活性氧是断 裂反应的关键。v e a l 1 8 。1 9 】等人对c u ( 1 ) ( p h e n ) 2 插入d n a 的究表明，配合物中的一 个配体( p h e n ) 插入或结合在d n a 双螺旋小沟，而另外一个p h e n 则与小沟在空间 上保持最匹配的位置。c h i k i r a 2 0 】等人通过e p r 方法对 c u ( p h e n ) 】2 + 与d n a 的作 用做了初步研究，结果表明， c u ( p h e n ) 2 + 与d n a 的非插入结合模式多于插入结 合模式。为了更好地探讨铜多吡啶配合物与d n a 作用的机理，t h o m a s 2 1 】和他的 同事以p h e n , d p q ，d p p z 为配体合成了一系列小分子配合物，并且揭示了配体的平 面大小对于配合物与d n a 之间的作用大小有直接影响。 铜多吡啶配合物的光谱性质主要表现在配体上。以邻菲咯啉和联吡啶为代表 4 第1 章绪论 的多吡啶配体，由于具有共轭的平面体系，既是电子给体又是电子受体，具有 丰富的光谱性质，但与铜的多吡啶配合物作为核酸酶的应用相比，研究铜配合物 与d n a 作用的光谱性质变化的则相对较少。 张荣丽【捌等曾研究了d n a 的类似物腺嘌呤及其衍生物与【c u ( p h e n ) 2 】2 + 和 c u ( b p y ) 2 2 + 作用的光谱变化情况。w u 2 ：；】等曾研究桥联配体5 ，6 二酚的双核c u ( u ) 配合物与d n a 作用的光谱变化情况。这类研究均发现，铜多吡啶配合物与d n a 之间有相互作用，有些还存在插入结合。一些抗肿瘤药物分子就是通过插入d n a 令d n a 构象发生改变，使其不能或不易复制，而显出抗肿瘤，抗病毒的活性的。 因此，研究铜多吡啶配合物与d n a 的作用对核酸分子生物学和药理学的发展也 必将产生深远的影响。 1 3 2 配合物与d n a 作用的基本方式 1 3 2 1 共价键结合 共价键结合是配合物金属离子与d n a 双螺旋链上某些基团以配位方式结合 的特有方式，对于过渡金属配合物则通过过渡金属离子与碱基对上的n 原子形 成配位键。软金属离子如p t ( i i ) ，p d ( i i ) ，r u ( i i ) 和碱基的亲核性部位之间可产生共价 结合。与非共价结合相比，配合物与d n a 共价结合的序列特异性识别能力要强 得多。晶体衍射等方法已证实【2 4 1 ，顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链 上相邻鸟嘌呤 d ( g p g ) 的n 7 共价结合形成链内加成物，使d n a 双链解旋并产生 弯曲。 1 3 2 2 插入结合 平面或近似平面的芳香环配体比较容易插入到d n a 的碱基对平面之间。这 种插入作用的结合力来自多吡啶配体与碱基芳环间一丌相互作用。一些有机小 分子或配位饱和的配合物都能与d n a 发生插入作用。金属多吡啶配合物与d n a 的插入作用正是基于多吡啶平面结构插入d n a 双螺旋的碱基对之间。一般来说， 分子插入d n a 后，d n a 的稳定性增加，其物化性质表现特征是熔点升高，粘度 增加。由于分子的插入，d n a 的双螺旋也会适当解旋。 5 中m 大学硕士学位论文；铜- d p p z 类台物的台成及其在d n a 定量分析中的应用 13 23 静电作用 d n a 是一种带负电荷的多聚阴离子，而许多金属配合物带有正电荷，因此静 电结合也是金属配合物与d n a 作用的一种模式。通常认为这种作用模式影响 较小，但有的金属卟啉带正电荷的侧链与d n a 磷酸骨架的静电作用对它能嵌入 结合在碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 13 2 4 沟槽结合 很多蛋白质与d n a 的特异性结合是通过太沟作用，而小分子化合物一般在 d n a 小沟结合。配合物主要通过分于内的芳环扭转来连接，由此产生合适的扭 转力来配合小沟区内的螺旋曲线，取代沟中的水分子并与d n a 双螺旋链中沟槽 的碱基对边缘通过氢键，范得华力形成接触口”。 图1 1 多吡啶配合物与d n a 的沟槽结合吲 啤 第1 章绪论 1 3 3 研究配合物与i ) n a 作用的方法 1 3 3 1 顺磁共振法 顺磁共振( e p r ) 研究方法常用来研究金属离子或配合物分子中心离子的电子 构型情况及其所处的环境特征。不同的金属、同一金属不同自旋状态、处于不同 化学环境的相同自旋态的同一种金属，其e p r 谱都有很大差别。顺磁共振方法 也可以用来测定配合物分子与d n a 的结合情况，可以从e p r 线形状的变化中估 算磁场中g ( 9 8 + ，9 8 ) 线轴相对于d n a 双股螺旋轴线的夹角，由这些e p r 线形状 的变化可以推测出配合物在d n a 上的结合情况的变化。c h i k i r a 2 0 】等利用e p r 研究了铜与邻菲咯啉或其衍生物与氨基酸的配合物。结果表明，凡是那些g 值几 乎与d n a 双股螺旋轴平行的配合物，邻菲咯啉环平面是以插入方式与d n a 结 合。 1 3 3 2 电化学方法 电化学方法作为研究电子转移方面的有力手段，可对光谱测量结果进行有 效地补充，从而更深入地反映金属配合物与d n a 相互作用的机理【2 6 1 。电化学方 法包括循环伏安法、脉冲伏安法和极谱电导法等。在用循环伏安法测定配合物的 电化学行为时经常会出现一对准可逆氧化还原峰【2 7 镒】，有时由于配合物的中心 离子的价态发生变化，整个配合物分子的结构也发生改变，致使电子在传递过程 中受到一定程度的阻碍，这时氧化还原峰电位也会发生变化。没有经过d n a 修 饰的电极在测定时，将出现一对准可逆氧化还原峰；而对于d n a 修饰后的电极， 由于配合物与d n a 的结合作用，导致氧化还原峰向负方向转移【2 9 1 ，表明邻菲咯 啉配体能很好地稳定d n a 配合物复合物，或者是两者发生了某种强烈的相互作 用才导致这样的结果。 1 3 3 3 紫外可见光谱 紫外可见光谱是研究配合物与d n a 相互作用的有效证据之一。当配合物分 7 中山大学硕士学位论文：铜- d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 子与d n a 作用时，由于配体所处的环境发生变化，使得吸收波长和强度会发生 一系列的变化，特别是当配合物与d n a 以插入作用结合时，通常发生减色效应， 并伴有定程度的红移。这种作用效果通常有两种解释：一种是反馈兀键作用， 即金属离子向配体提供孤对电子形成的反馈键在加入了d n a 后受到了一定影 响而使配合物的吸收波长红移。另一种是配体与d n a 碱基对之间产生芳环堆积， 配体的丌空轨道与碱基的轨道发生偶合，轨道能量降低，导致丌一丌跃迁 能量减小，从而产生红移现象；同时偶合后的兀轨道因部分填充电子，使得配体 丌一跃迁几率减小，产生减色效应。 1 3 3 4 荧光光谱法 许多过渡金属配合物或碱土金属配合物在溶液中本身发出荧光，并且有一定 的强度，对于这类配合物可以直接通过加入d n a 后配合物溶液荧光强度的变化 来判断配合物与d n a 是否发生作用。当加入d n a 后，有些体系发生荧光强度 增强效应，这是因为配合物在溶液中时水分子对配合物有淬灭作用，加入d n a 后由于d n a 的疏水保护作用使得配合物的荧光强度增强；有些体系荧光减弱可 能是因为配合物的体积过大，支链过多，在溶液中小分子对配合物的荧光强度几 乎没有影响。而加入d n a 后，配体部分与d n a 发生插入作用，使其发光部位被 d n a 掩盖，从而使得配合物的荧光强度减弱。对于本身不发荧光的配合物可以 通过荧光探针来进行研究。 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ，e b ) 是一种荧光染料，它可以插入到d n a 双链 的碱基对之间，当加入一定量的d n a 时，e b d n a 复合物中e b 的荧光强度比游 离态e b 的荧光强度强。但是当有能与d n a 发生插入作用的配合物存在时，会 将e b 从e b d n a 复合物中挤出，e b d n a 的荧光强度将显著降低，从而可推断 出配合物与d n a 之间相互作用情况，并且可以通过下式估算配合物与d n a 的结 合常数【3 0 】。 k 功 e b = k a p p c o m p l e x ( 1 1 ) 其d 0 c o m p l e x 为荧光强度降到5 0 时所需配合物的浓度，k 口为经验值。 8 第1 章绪论 1 3 3 5 粘度方法 流体力学法即粘度法是研究配合物与d n a 作用模式的另一种最有力的实 验方法【3 1 。3 2 】。小分子配合物与d n a 作用时有三种情况：完全插入作用、不完全 插入作用和静电沟槽结合。不同的作用结果使d n a 溶液的粘度也出现三种情况： 即粘度增加、降低和不变。当配合物分子以插入方式与d n a 作用时，会使溶液 的粘度大大增加，类似作用的药物分子有n e t r o p s i n 和d i s t a m y c i n 。当以部分插入 方式结合时，碱基对的相对位置将会发生变化，而导致整个d n a 分子发生扭曲， 使溶液粘度减少。如果两者以静电沟槽结合方式相互作用，d n a 溶液的粘度几乎 不发生变化。 1 3 3 6 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是研究d n a 分子构象及断链的重要手段，质粒d n a p b r 3 2 2 已广泛用于金属配合物及药物对d n a 断裂作用的研究。完整的p b r 3 2 2 通常呈超螺旋型( i 型) ，当其中一条链上出现一个切口( 即单链断裂) 时就变为切 口环形( i i 型) ，当两条链在同一位置都发生断裂时就变为线型( i i i 型) 。p b r 3 2 2 d n a 的3 种形式在电泳上有完全不同的迁移率，通常i 型迁移最快，i i i 型次之，i i 型最慢，因此借此可研究金属配合物及药物对d n a 的断裂作用。这种方法操作 简单、快捷，需要的仪器和药品也容易得到，因而应用比较广泛【3 3 3 4 j 。 1 4d n a 的定量分析方法 1 4 1 分光光度法 分光光度法是测定d n a 的经典方法，它主要包括定糖法、定磷法、直接光度 法和染料结合法，其中基于有机染料结合的光度法是最为常用的方法【3 5 】。d n a 本身具有光吸收特性，许多种染料可以和d n a 发生相互作用而导致吸收谱带的 变化，如变宽、红移、减色等。该方法主要基于多核苷酸中两个单核苷酸残基在 9 中山大学硕士学位论文：铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 碱性条件下全部解离呈多阴离子状态，与某些阳离子染料结合后形成超分子复 合物，而导致吸收光谱的变化。常用的有机试剂有甲基绿、甲苯胺蓝、 乙基紫、 甲基紫【3 6 】等。 1 4 2 荧光法 荧光分析法比分光光度法有较高的灵敏度，但由于d n a 的内源性荧光较弱， 一般引入有机小分子荧光探针来研究相互作用，它是基于荧光试剂的加入，导致 溶液中荧光强度的增强或淬灭来测定d n a 。常用的荧光试剂有有机染料探针、 稀土离子和过渡金属配合物【3 7 1 。表2 汇总了常用的荧光分析法测定d n a 的有机 试剂体系。 表1 - 2测定d n a 的荧光光度法 1 4 3 电化学分析法 电化学分析法在研究d n a 的结构形态碱基序列、d n a 的损伤、基因诊断等 方面具有重要的意义，它作为光度分析的补充，可以获得其他方法难以了解的信 1 0 第1 章绪论 息。研究方法通常是基于考察加入d n a 分子前后电活性有机试剂的电化学性质 的变化，如反应体系的电位变化、电流变化、扩散系数的变化等电化学参数的差 别。 表1 - 3测定d n a 的电分析化学 1 5 共振光散射在d n a 定量分析中的研究进展 1 5 1 光散射现象 光散射( l i g h ts c a t t e r i n g ，l s ) 现象指的是一束光线通过介质时其中一部分光 偏离了主要的传播方向，本质是电磁辐射与介质分子之间相互作用的结果。光的 散射是原子或分子体系从入射光波中获得能量后，改变传播方向及相位，甚至改 变频率的再辐射过程。产生散射光的条件就是介质必须具有不均匀结构。 散射光的分类有两种，根据散射粒子的大小可以分为反射和折射、丁达尔散 射和瑞利散射；根据入射光与散射光之间的波长关系可以分为弹性散射、非弹性 散射和准弹性散射，瑞利散射就是弹性散射的一种。 光散射现象自从发现以来，经过不断的完善和发展，已广泛应用于物理、化 中山大学硕士学位论文：铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 学、生物以及气象学等。近年来，随着电子技术和计算机技术的飞速发展使得光 散射已经发展成为高分子和胶体科学研究中一种常规的测试手段。例如，它可以 表征聚合体微粒的粒径分布，胶体粒子的形成，生物高分子的自聚集等【5 3 5 5 1 ，此 外光散射光谱还能够提供有关细胞组织的结构和功能信息【铜。 1 5 2 共振光散射技术的简介 1 5 2 1 共振光散射技术的建立 共振光散射( r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，r l s ) 是指当瑞利散射位于分子吸收带 中或附近时，由于电子吸收电磁波的频率与散射光的频率相同，电子因共振而强 烈吸收散射光的能量再次发生散射的过程。1 9 9 3 年，p a s t e m a c k 等通过在普通的 荧光分光光度计上测定散射光信号建立起共振光散射( r l s ) 技术，并首次将之用 于研究卟啉类化合物的j 型聚集【5 7 1 。1 9 9 6 年，h u a n g 5 8 】等将此技术用于d n a 分 析和研究，发现增强的r l s 信号在一定的范围内与d n a 浓度成正比关系，从而 建立了共振光散射光谱分析法。在一定的实验条件下，r l s 强度与分析物的浓度 成正比，这是r l s 定量分析的基础。 共振光散射的研究不需要专门的仪器，在普通的荧光分光光度计上选择合适 的激发和发射狭缝宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色 器所得的同步光谱( 即a 护o ) ，即为光散射粒子的共振散射光谱。由于共振光散 射光谱属于同步光谱，可看作散射粒子是能发射出与激发光相等波长的发光体， 故而共振光散射信号属于同步发光5 9 1 。根据同步发光方程【删： i s l = k c b e e x ( x e x ) e e m ( x e x + a 柚( 1 - 2 ) ( 1 2 ) 式中e e x 是在给定激发光波长处( x e x = 沁m a ”的激发函数，e e m 是在对 应的发射波长处( x e m = k e x + a 柚的发射函数，k 是与仪器条件有关的常数，b 是 比色皿液池厚度。当al = 0 时，即得共振光散射强度为【5 9 1 ： i r e s = k c b e e x ( ) 旧x ) e e n g x( 1 - 3 ) 由式( 1 3 ) 可知在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度c 成正比， 据此可以用于散射粒子的分析测定。 1 2 第1 章绪论 1 5 3 共振光散射用于d n a 定量的研究 1 5 3 1 有机染料试剂 在共振光散射分析测定d n a 的技术中，常用一些染料分子作为r l s 探针。 它是基于染料在d n a 等生物大分子上进行堆积，即生物大分子对染料起了富集 作用，使其上染料浓度远大于溶液中游离的染料浓度，相当于聚集体的生成，使 散射球体体积增大，所以尽管吸收谱图无变化，但却观测到增强的r l s 信号【6 1 1 。 h u a n g 6 2 1 等利用m e s o - 4 ( 对- 三甲基氨基) 卟啉( t a p p ) 在p h 7 4 8 条件下与 d n a 作用能产生增强的共振光散射信号，并在4 3 2i 吼附近产生特征吸收峰，结 果表明利用d n a 对t a p p 的共振光散射增强现象可以测得纳克级的d n a ，测定 检出限比荧光淬灭法低一个数量级。 醌亚胺类的染料如中性红1 6 3 - 6 6 1 、亚甲基蓝【6 7 】可以在d n a 分子表面进行长距 离组装，能产生特征的共振光散射光谱。某些碱性三苯甲烷染料如乙基烈6 8 - 6 9 、 结晶紫【6 9 - 7 0 1 、甲基紫【6 9 7 1 1 和玫苯剧7 2 】能与d n a 结合而使r l s 急剧增强并产生新 的r l s 光谱，用于d n a 的分析测定，具有较高的灵敏度。 酚藏花红与d n a 作用能导致体系折光指数发生变化，使r l s 强度急剧增加 【7 3 】；耐尔蓝的硫酸盐【7 4 书】用于小牛胸腺d n a 的测定，灵敏度很高，检出限最低 可达o 4n g m l 。1 ：刘晨【7 6 1 和向海斟7 7 】等还进行了灿烂甲酚蓝和副品红的共振散 射法测定d n a 的研究。近来关于罗丹明染料如罗丹明b i 7 8 1 丁基罗丹明b 【7 9 1 、罗 丹明6 g t 1 与d n a 作用的共振光散射光谱的研究也有报道。陈小兰【8 1 】等人将合 成的四氨基铝酞菁用于测定纳克级d n a ，并将其用于金黄色葡萄球菌d n a 的测 定，所得结果与紫外吸收法一致。 在一些表面活性剂存在下，d n a 与染料产生共振光散射光谱的增强作用的研 究也有报道。如碱性三苯甲烷染料亮绿和孔雀石绿与d n a 结合后的r l s 强度 变化不明显，而在溴代十六烷基甲基铵( c t m a b ) 的存在下，b g 8 2 郴1 和m g 蚓与 d n a 体系的共振光散射大大增强。其它的研究还有十六烷基三甲基溴化铵使得 阴离子染料间苯二酚黄【8 5 】与d n a 结合使得体系的共振光散射大大增强，即表面 活性剂对d n a 与染料作用产生的共振光散射具有敏化作用。 c h e n 8 6 1 等研究发现，在p h 5 8 7 的b r ( b r i t t o n r o b i n s o n ) 缓冲液中，痕量的 中山大学硕士学位论文：铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 c t - d n a 对n o r f l o x a c i n 在4 0 5 5 n m 处的共振散射峰有极大的增强作用，通过电子 扫描电镜，紫外可见和荧光研究了它们的作用机理。基于增强的共振光散射强度， 建立的检测d n a 的方法的线性范围为0 0 2 - 2 3 l a g m l 一，检出限为1 2 n g m l 。 l o n g 8 7 】等利用共振光散射研究了一系列有机小分子与单链d n a 和双链d n a 的相互作用。结果表明，有机小分子与d n a 的结合主要沟槽结合，共振光散射 的强度主要取决于有机小分子的体积大小和双链d n a 上的g c 序列。基于上述 条件，他们建立了利用有机小分子定量d n a 的新方法。 1 5 3 2 表面活性剂 刘绍璞嗍等研究了5 种阳离子表面活性剂与d n a 反应的共振光散射光谱。 结果表明，在近中性介质中阳离子表面活性剂与d n a 反应使其r l s 急剧增强， 而且5 种阳离子表面活性剂与d n a 具有相同的反应条件和光谱曲线，文中还对 五种阳离子表面活性剂与d n a 的反应机理、d n a 构象对r l s 的影响等进行了 讨论。 l i 【8 9 】等采用两种新的表面活性剂作为探针，利用共振光散射技术成功的对 d n a 进行定量分析。在优化条件下，在f c l 3 4 和f c 9 5 中加入d n a 后，两个体 系都在3 7 0 n m 出现增强的共振散射峰，并与d n a 浓度在一定浓度范围内成线性 关系，检出限分别到了3 5 和2 0 0 1 t g l - 1 。 1 5 3 3 大粒子散射试剂 l i 9 0 将大粒子散射( 粒子直径在2 0 0 7 0 0 r i m , 其散射光的性质属于d e b y e 散射 和m i e 散射，称其为大粒子散射) 技术用于d n a 的共振散射分析，效果很好。在 强酸性介质中，d n a 首先变性，然后单链d n a 聚集为大粒子，粒子的大小与紫 外可见光的波长相当，由动态激光散射仪测得在强酸性介质中粒子的水合半径 与其浓度呈线性关系。由大粒子产生的光散射强度在很宽的范围内与d n a 的浓 度成正比，该方法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便、所用试剂易得的优点， 应用前景广泛。 1 4 第1 章绪论 硫酸鱼精蛋白是一种小分子蛋白。它能与d n a 通过强静电力作用结合为大 粒子的复合物，其散射光强度在p h 2 2 4 4 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液中达到 最大9 1 1 。由此建立的d n a 的大粒子散射分析方法的线性范围为0 0 5 6 0 o 嵋m l 以； 其检出限分别为1 2 5n g m l 。1 的小牛胸腺d n a 、9 0n g m l 。1 的鱼精子d n a 、 1 8 0n g m l 以的酵母r n a 。其优点是蛋白质、核苷酸和大部分金属离子都不干扰 对d n a 测定的结果。 1 5 3 4 金属离子及其配合物 有关金属离子及其络合物与d n a 作用的共振光散射现象的研究也越来越多。 h u a n g 6 2 发现c o ( i i ) 5 c i - p a d a b 在d n a 上的堆积对共振光散射增强现象，并 将其用于d n a 的高灵敏测定。在p h2 2 1 的酸性介质中，础3 + 与d n a 分子表面 的磷酸根发生静电作用，产生增强的共振光散射【9 2 】。与染料不同的是，金属离子 没有生色基团，因而它们与d n a 和蛋白质等生物大分子的作用受光吸收的影响 小，主要体现出粒子大小对r l s 信号的影响。z h o u l 9 3 1 等研究发现，铝离子在银 纳米粒子d n a 体系中通过静电吸附作用，使得银纳米粒子铝离子d n a 形成网 状聚合体( a g n p s a 1 3 + - d n a ) ，导致溶液的共振光散射的强度极大的增强，并据此 建立了一种简单，快速和有效的d n a 检测方法，对f s d n a ，c t d n a 和y r n a 的 检出限都达到了1 0 以o g m l d 水平。 朱昌青【9 4 】等发现d n a 对氯化银溶胶的共振光散射有猝灭作用，认为是游离 的银离子与d n a 的碱基结合力很强，影响了胶体氯化银的沉淀平衡而导致的， 并将其用于d n a 的测定。 z h e n t 9 5 1 等研究发现，在p h 7 0 的六亚甲基四胺盐酸( h e x a m e t h y l e n e t e t r a m i n e h c l ) 缓冲溶液中，d n a 能够淬灭e u 3 + 1 队p h e n 体系的共振光散射，并 据此建立了一种灵敏的定量d n a 的方法。在优化的实验条件下，对体系的共振 光散射的淬灭与d n a 的浓度成线性关系分别为：f s d n a ，1 0 1 0 q o _ 2 0 1 0 6 9 m l 1 ；y r n a ，1 0 1 0 。1 1 2 0 1 0 6 9 m l 。1 ；c t d n a ，5 0 x1 0 - i i 5 o 1 0 。7 9 m l ， 检出限( s n ) 分别为0 0 3 ，0 0 0 6 和0 0 0 2 r i g m l 一。同时研究了d n a 与 e u 3 + t t a p h c n 之间的相互作用。 中山大学硕士学位论文：铜d p p z 类配合物的合成及其在d n a 定量分析中的应用 h u a n 9 1 9 6 1 等在p h 2 7 的条件下利用r u ( b p y ) 2 p i p ( v ) 2 + 对d n a 有强烈的共振光 散射增强作用，建立了测定d n a 的新方法。测定的范围达到了1 6 - 5 1 2 0n g r n l 一， 相关系数为r - 0 9 9 9 9 ，检出限为5 0 2n g 血，并用于实际样品的分析。 黄剑平【9 7 】等研究了r u ( b p y ) + 与d n a 作用的共振光散射光谱。基于d n a 对 r u ( b p y ) + 共振光散射的