（预防兽医学专业论文）口蹄疫病毒VP1基因的序列分析及巢式PCR检测研究.pdfVIP

摘要 将疑似口蹄疫病料送检到中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验 室进行口蹄疫病毒的鉴定，鉴定该病料为0 型口蹄疫病毒感染病料。 根据g e n b a n k 中注册的0 型口蹄疫病毒株v p l 基因序列，设计出了一对引物，应 用r t p c r 方法对疑似口蹄疫病料进行v p l 基因的检测，并对v p l 基因进行测序。结 果表明，此口蹄疫病毒株的v p l 基因的全长6 3 9 b p ，编码2 1 3 个氨基酸，国内外发表 的0 型毒株v p l 基因核苷酸序列相比较的同源性在7 5 7 9 3 3 之间。v p l 基因所推导 氨基酸序列( 1 d 蛋白) 同源率在8 5 0 9 2 5 之间。该病料株与台湾和南通流行的0 型口蹄疫病毒株亲缘性最近。对v p l 基因的序列测定和分析，丰富了我国f m d v 毒株 v p l 基因资料库。 本研究在应用r t p c r 对v p l 基因的扩增和测序的基础上。选择v p l 基因内相对保守 的区域设计一对引物，建立检测刚d vv p l 基因的巢式p c r 方法。通过对r t p c r 产物的 二次扩增，能特异性的检测出5 0 0 b p 左右的目的片段。本试验所建立的巢式p c r 方法 特异性好，不与猪水泡病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒出现交叉反应。 通过部标r t p c r 方法和n e s t e dp c r 方法的敏感性比较研究，部标r t p c r 方法能检测出 样品中病毒核酸量大于或等于0 2 3 n g ul 的被检材料；n e s t e dr t p c r 能检测出样品 中病毒核酸量大于或等于0 2 3 x 1 0 。2 n g l 的被检材料。本试验所建立的n e s t e dp c r 较敏感。在部标r t p c r 、常规r t p c r 矛i l n e s t e dp c r 方法的基础上，本试验提出t n e s t e d p c r 方法检测口蹄疫病毒的操作规程。 关键词：口蹄疫病毒，v p l 基因，r t p c r ，巢式p c r t h ea n a l y s i so ft h ef o o t a n d - m o u t hd i s e a s ev i r u s sv p l g e n e s e q u e n c ea n dr e s e a r c ho fd e t e c ti o nt h eg e n eb yn e s t e dp c r s d c a n d i d a t e w a n gg a n g s u p e r v i s o r ：w a n gh o n g n i n g ( c o l l e g eo f n i 1s c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ，s i c h u a na g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，y a a n6 2 5 0 1 4 。p r c h i n a ) a b s t r a c t f o o t a n d - m o u t hd i s e a s ev i r u s ( f m d v ) w a si s o l a t e df r o me p i t h e l i a lt i s s u e a n de p i t h e l i a lf t u i df r o mp o r e i n ea n dc a t t l e t h ei s o l a t e dv i r u sw a s c h a r a c t e r i z e di nn a t i o n a lr e f e r e n c ef a c i l i t yl a n z h o uv e t e r i n a r yr e s e a r c h i n s tit u t e t h es e p a r a tio nv i r u sisf o o t a n d - m o u t h ( f h v ) w h i c ht y p eis0 a c c o r d i n gt ot h ep u b li s h e ds e q u e n c eo ff m d vv p if r o mg e n e b a n k ，o n ep a i r o fp r i m e rw a sd e s i g n e df o ra m p l i f y i n gv p lg e n eo ft h ev i r u s t h e na n a l y s i so f t h eg e n es e q u e n c e ac o m p a r i s o no ft h eg e n es e q u e n c ew i t h8o t h e r0f b d vs t r a i n s t h ev p ig e n ew a s6 3 9b pi ns i z ea n de n c o d ea b o u t2 1 3a m i n oa c i d s t h er e s u l t s h o w st h a tt h ev p ig e n es t r a i nd e m o n s t r a t e7 8 6 - 8 4 2 s e q u e n c eh o m o l o g y r e s p e c t i v e l y t h ec o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i d ss t r a i nd e m o n s t r a t e8 5 o 9 1 7 s e q u e n c eh o m o l o g yr e s p e c t i v e l y t h i ss t r a i ni sc l o s et oo t h e r0f m d vs t r a i n s w h i c hi s o l a t e di nt a i w a na n dm a l a y s i a t h es t u d ye n r i c h e dm o l e c u l a r e p i d e r m i o l o g i cs t u d yo ff m d vi n f e c t i o n o u rs t u d yw a sb a s e do nt h er t p c rt e s t s e l e c t i n ga p i e c eo fc o n s e r v a t i v e g e n eo nv p ig e n e ，w ed e v e l o p e dn e s t e dp c rm e t h o dt od e t e c tv p lg e n ea g a i n t h em e t h o dc a ns p e c i a l l ya m p l i f y6 3 9b pg e n ei ns i z e ，n o ti n t e r c o u r s e dw i t h s v d n e s t e dp c rw a sc o m p a r e dw i t hr t p c ri ns e n s i t i v e n e s si no u rt e s t w h e n d e t e c t i n gf o o t a n d m o u t hd i s e a s ev i r u sv p ii nd i s t i l l e dr n a ，w h e nt h eq u a n t i t y o fn u c l e i ca c i de x c e e do rb ee q u a lt o0 2 3 n g u1 ，r t p c rc a nd e t e c t ： w h e n t h eq u a n t i t yo fn u c l e i ca c i de x c e e do rb ee q u a lt o ，0 2 3 x i 0 1 n g pln e s t e dp c r c a nd e t e c t s ow ec a nc o n c l u d et h a tt h ed e v e l o p e dn e s t e dp c rm e t h o di s s e n s i t i r e b a s e do nt h es t a n d a r dr t p c r ，n o r m a lr t p c ra n dn e s t e dp c r ，w e f i r s t l ya d v a n c et h er e g u l a t i o n so fn e s t e dp c ri no u re x p e r i m e n t a t i o n k e yw o r d s ：f o o t a n d m o u t hd i s e a s ev i r u s ，v p ig e n e ，r t p c r ，n e s t e dp c r 论文独创性声明 毫7 8 3 5 5 0 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 王向习 0 r 略。年月z ，善日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名是声虱 ，7 导师签名： 如 沙 赢心年0 月邛e l c 2 呵年f 月蕊日 1 、月q 吾 1 1 口蹄疫的研究概况 1 1 1 概述 口蹄疫( f o o t a n d m o u t hd i e a s e ，f m d ) 是由口蹄疫病毒( f o o t - a n d m o u t hd i e a s e v i r u s ，f m d v ) 引起的一种急性高度接触性传染疫病，被国际兽疫局列为a 类动物传染 病之首。易感动物包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等2 0 个科的7 0 多种家养和野 生哺乳动物，是一类人畜共患传染病。猪和牛的临床表现最严重，羊只表现亚临床感 染。 在自然条件下，含口蹄疫病毒组织和被污染的饲料、饲具、皮毛及土壤等可保持 传染性达数周到数月之久。在低温和有蛋白质保护的条件下，有利于延长病毒存活时 间。病毒对酸碱十分敏感，p h 低于6 或高于9 时，能很快杀死病毒。因此，1 2 的氢 氧化钠，3 的草木灰，1 2 的甲醛溶液等都是口蹄疫的良好消毒剂，日光直射6 0 m i n 后病毒即可死亡。食盐、酚、酒精、氯仿等化学试剂对口蹄疫病毒不起作用。病毒可 在动物的咽、食道部上皮内持续存在很长时间，常表现为隐性带毒。 由于口蹄疫病毒抵抗力较强，发病率几乎达1 0 0 。该病的病程一般呈良性经过， 死亡率只有2 3 ，有时达5 ，犊牛和仔猪以及恶性病型，死亡率可达5 0 7 0 。但 主要的经济损失并非动物死亡，而是来自患病期间肉和奶的生产停止，病后肉、奶产 量减少，种用价值丧失及产品废弃，动物的生产性能降低等损失，并引发严重的公共 卫生安全问题。由于该病传染性极强，可造成巨大的经济损失和政治影响。因此，口 蹄疫被称为“政治经济病”。 近两年来，我国周边的部分国家和地区连续发生口蹄疫，其流行之广，损失之大， 令人震惊。1 。从口蹄疫的地理分布态势可见，我国东与爆发疫病的日本、韩国和中国 台湾隔海相望，南与疫情常年发生的越南、缅甸陆路相通，北与疫情复杂的俄罗斯、 蒙古比邻而居。从所存在的病毒血清型种类、病毒存储和变异的自然环境，以及社会、 经济等方面的诸多因素来综合分析。更大的威胁来自位于我国西南的有“口蹄疫毒库” 之称的印度和西北的“病毒通道”中亚数国。这些接壤国家的a 、c 、a s i a l 等毒型和 众多的0 型变异株随时都有可能侵入我国，并可能造成大的流行。 1 1 2 口蹄疫病毒的分型 口蹄疫病毒的毒力和抗原性极易发生变异，经过不断的抗原“漂移”过程，导致 一系列亚型的产生。到目前为止，已发现了七个血清型，即0 、a 、c ( 称欧洲型) ，s a t i 、 s a t 2 、s a t 3 ( 南非1 、2 、3 型，称非洲型) 和a s i a i ( 亚洲i 型，称亚洲型) 。0 、a 、 c 型f m d v 几乎遍布亚、非、拉、欧各洲；s a t1 、2 、3 型f m d v 主要分布在非洲；a s i a 1f m d v 主要分布在亚洲。七个血清型病毒可用核酸杂交分成两群，o 、a 、c 和a s i ai 为一群，南非的三个型为第二群，群内各型核酸同源性达6 0 一7 0 ，但两群之间仅为 2 5 4 0 ，a 型和0 型内亚型之间的同缘性高于7 0 。血清型间无血清学交叉反应和交 叉免疫现象，同一血清型内不同病毒的抗原性亦有变化。到本世纪7 0 年代，已发现 6 2 个亚型，其中0 型1 0 个，a 型3 0 个，c 型5 个，s a t i7 个，s a t 23 个，s a t 34 个，a s i ai3 个。0 、a 、c 型f m d v 的毒力和抗原性均易发生变异，这种独特的演化 给防治和消灭口蹄疫带来了一系列复杂问题，致使f m d 在一些国家或地区长期流行。 病毒血清型的鉴别比较容易，可采用动物交叉免疫试验或一般血清试验方法。型内亚 型的鉴别则需借助双向血清学方法来完成。进入8 0 年代后，对新亚型不再编号，甚 至到目前已不再强调亚型的鉴定，只强调新的分离物与疫苗株进行比较，以便正确选 择疫苗种毒“。 1 2 口蹄疫病毒分子生物学国内外研究进展 1 2 1 病毒的基因组 口蹄疫病毒( f m d v ) 是j j 、r n a 病毒科( p i c o r n a v i r i d a e ) 口蹄疫病毒属( a p h t h o v i r u s ) 的唯一成员。口蹄疫病毒呈球形，为正二十面体结构，直径2 0 - 3 0r l m 。病毒颗粒由单 股r n a 和衣壳蛋白构成，不含囊膜。r n a 全长约8 5 0 0 个碱基，占病毒组分的3 0 ( 结构 示意图见图1 ) ”。基因组两端为5 7 u t r 、o r f 斤和3 u t r 组成，其中5 u t r 长约1 3 0 0 b p ， 含有v p g z 级结构、p o l y ( c ) 区段和内部核糖体进入位点等“”；o r f 约6 5 k b 由l 基因、 p 1 结构蛋白基因、p 2 和p 3 非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，其中p l 结构蛋白基因编码4 种主要的衣壳蛋白，a p v p 、v p 2 、v p 3 和v p 4 ，v p l - 3 组成衣壳蛋白 亚单位，v p l 、v p 2 、v p 3 和v p 4 四种结构多肽各6 0 个分子构成，每种多肽分别含2 1 3 、 2 1 8 、2 2 0 和8 5 个氨基酸碱基。衣壳蛋白由其中v p ，大部分露在病毒粒子表面，是决定 病毒抗原性的主要成份，能诱导机体产生中和抗体；v p 。大部分埋在病毒粒子内部； v p 。和v p 。的情况介于v p 。和v p 。之间，但四种结构多肽都参于免疫原性的决定，特别是对 细胞免疫而言，v p 。的作用更不能忽视“”1 。3 u t r 长约1 7 2 b p ，由p o l y ( a ) 以及p o l y ( a ) 和p 3 区之间的碱基组成“。目前，对p o l y ( c ) 上游序列知之甚少，一般认为其5 端呈 三叶草结构，p o l y ( c ) 的长短因毒株不同而有很大的差异，这可能与病毒的毒力有关。 许多毒株的p o l y ( c ) 下游有一些假结结构，其功能尚不清楚“_ 2 1 “。 嚣船紫嘟”黜 喁 邶r附喇岫哪垤lp 1 2 阱 p “v 一嘶哺 ，b r r i 竺竺! 弛堡竺垡! ! ! 竺竺：1 2 竺! ! ：! ! 翌 图1f 州基因组r n a 结构图( 单位：棱苷酸- - n t ) f i g l s t r u c t u r eo fg e n o m er n ao f 胁v ( u n i t ：n u c l e o t i d e 2 n t ) 1 2 2v p i 基因的研究概况 f n ) v 的抗原易发生变异，其变异是由衣壳蛋白v p 卜v p 4 的氨基酸组决定的，4 种结 构蛋白变异的顺序是v p l v p 3 v p 2 v p 4 v p 4 几乎不发生变异。f m d v 的抗原变异是抗原 表位的氨基酸取代、插入或缺失造成的，发生在f m d v 颗粒表面的多肽环上，特别是v p i 的g h 环。引起f m d v 抗原变异的另一种机制是抗原位点外的氨基酸变化，通过蛋白质 空间构象的变化改变抗原特异性“”。由于v p l 基因的核苷酸易发生变异，在分子流 行病学调查中，可通过比较分析v p i 基因的核苷酸序列差异来建立遗传系谱树。“”1 。 f m d v 抗原结构研究表明，v p l 结构蛋白是主要的抗原蛋白，是病毒血清型特异性蛋白， v p i 是f m d v 的主要抗原位点，能诱导机体产生保护性的中和抗体，并能产生部分的保护 作用、”5 “。 在口蹄疫疫苗的研制过程中，国内外研究者一直在研制更为安全有效的新型疫苗 并取得一定的成绩，主要为合成肽疫苗和基因工程苗。在这些研究中，v p i 作为f m d v 产生中和抗体的主要成分，无论是整个v p l 片段或其重要的抗原表位序列，一直是国内 外研究者关注的热点。、。 由于v p l 基因编码主要的抗原蛋白，最早的f m d v 基因工程疫苗研究就是将在大肠 杆菌中表达的v p i 编码蛋白作为疫苗使用。但v p i 直接作为疫苗使用，其免疫原性不够 强m 1 。后来的研究表明，v p i 编码蛋白中的1 4 1 1 6 0 和2 0 0 2 1 3 为氨基酸序列是决定 f m i ) v 免疫原性的主要抗原决定簇片段。化学合成的这些肽段都有免疫原性，而且将这 些肽段串联成多拷贝后，其免疫原性有所增强“。 f m i ) v 的v p i 既是f m d v 的主要抗原基因，又能通过v p i 进行疫源追踪。”。研究v p i 基 因在口蹄疫疫菌和流行病学调查等具有重要的意义。因此，p c r 鉴定通常针对v p i 基因 。1 。由于v p i 基因上下游区域相当保守，所以在保守区域内设计引物可扩增出v p l 基 因的全序列o “。 1 3 口蹄疫病毒检测方法的研究进展 口蹄疫预防控制的基础和前提是诊断方法的建立和应用，敏感、特异、准确的诊 断技术对于口蹄疫流行国家尤其重要。检测方法必须能准确快速的确定病毒分离物的 病原特性，确保疫苗毒株能有效的控制田间流行毒株。根据发病动物的口、蹄部的水 疱和烂斑，以及流行病学可以作出初步的诊断，但确诊以及鉴定毒型需实验室诊断。 口蹄疫常规鉴定内容是抗原鉴定和核酸鉴定。抗原鉴定主要使用的是免疫学方法，主 要技术方法有微量补体结合试验( 国际标准) ，间接夹心酶连免疫吸附试验( 国际标 准，国际贸易指定方法) ，反向间接血凝试验( i l i a ) ( 国内行业标准) 。核酸鉴定是近 年发展起来的较新的鉴定技术，其中最常用的是r t p c r 技术( 国际标准) 。、“。 1 3 1 病毒的分离 口蹄疫病毒的分离鉴定必须在生物安全三级实验室或政府指定的有专门防护设 旌的实验室进行。分离口蹄疫病毒一般采用组织培养、实验动物和鸡胚三种方法。1 9 5 1 年s k i n n e r 用田间样品接种2 7 日龄乳鼠分离增殖病毒成功。由于鸡胚对口蹄疫病 毒的敏感性没有乳鼠、细胞高，f m i ) v 的分离培养是实验室常规技术，所以现在通常 使用组织培养和实验动物分离病毒“。1 9 5 5 年s e l l e r s 培养初代猪肾细胞获得成功 后，很快用于病毒分离增殖，与c f t 结合用于口蹄疫的诊断。f m d 病毒可在猪、牛、羊 等动物的原代或传代细胞上增殖，最敏感的是犊牛原代细胞，最常用的是b h k 2 1 和 i b r s 一2 传代细胞。我国从6 0 年代开始系统的利用单层细胞对口蹄疫病毒进行研究， 现己发展成为大瓶旋转培养及深层悬浮培养。如果病料中含有口蹄疫病毒，接种实验 动物可出现典型的临床症状。乳鼠经次或数次传代接种后，其四肢体麻痹，呼吸促 迫，最后死亡。再接种豚鼠一般在接种后3 6 4 8 小时于接种部位形成口蹄疫特征性 4 水泡，严重时起立困难。2 5 日龄的初生的乳鼠对口蹄疫非常敏感，病毒滴度( l d 。) 可达1 0 7 。据兰州兽医研究所长期实验研究证明，实验动物( 乳鼠和豚鼠) 对口蹄疫 病毒的敏感性比有些细胞系高“。 1 3 2 血清学诊断技术 口蹄疫最常用的免疫学诊断方法有补体结合试验、病毒中和试验、琼脂扩散试验、 放射免疫试验、免疫荧光抗体以及反向间接血凝试验等。这些方法普遍存在诊断周期 较长等不足，但在实践中仍发挥着重要的作用”、”1 。 1 9 5 2 年b r o o k s b y 建立了补体结合实验( c f t ) ，c f t 既可鉴定抗原，又可鉴定抗体， 并可进行定量测定。“。病毒分离增殖和c f t 在口蹄疫诊断中沿用了近3 0 年，尽管这 种技术准确可靠，但不敏感，检测效果易受样品中抗补体活性的影响。琼扩实验既可以 检测抗原，也可以检测抗体。琼扩实验能在4 8 h 之内提供结果，长期以来，该方法被 用于从大量血清样品检测动物是否感染过f v 。2 0 世纪7 0 年代末期，r w e y e m a m u 等建立 了病毒中和试验( v n t ) 4 m ，v n t 具有型特异性，是最经典的f m d 检测方法，常作其它方法 的参照。酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 。、3 、6 “3 是应用抗原一抗体结合的特异性和酶催 化的敏感性而建立起来的一种检测方法，既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 反向间接血凝试验国内已有商品化的试剂盒，可以向有关单位( 如兰州兽医研究 所) 购买。反向间接血凝试验可作为f m d 病毒抗原型别鉴定的初步方法，该方法操作 简单、结果准确，试验条件要求不高，可数小时内判断结果，该方法在国内口蹄疫的 l 临床检验中得到了大量的应用。是我国f m d v 鉴定的一种行业标准，未列入国际标准。 但该试验灵敏度较差、同时还要受到被检样品类型和环境等因素的影响。1 。 近年来由于免疫学方法的不断发展，免疫层析快速诊断试纸条，在生物领域已经 得到了广泛的应用。该方法应用于口蹄疫病原的诊断中具有安全、快速、经济实惠的 优点，但该方法具有主观性和容易受到外界环境的影响。m r g a j e n d r a g a d ，k n y k a m a t h 等将免疫生物传感器亚电晶体应用于口蹄疫的诊断和病毒分型“，目前，该 方法在口蹄疫病毒实验室诊断中得到应用州。该试验方法中，包被的p z 晶体保存的 时间长，可多次重复使用：该方法比常规方法敏感，对e l i s a 阴性样品也可检测到病 毒。该方法的另一个优势是经济实惠，花费的时间较少，仅需要l 小时左右“”。 在f m d 病原学诊断中，对于含毒量较高的病料，用免疫学方法可较容易诊断。而对于 含毒量低的病料，用免疫学方法无法诊断，必须接种乳鼠或细胞以增殖病毒，这样就 延长了时间，通常需要3 1 0 天才能出结果。 1 3 3 口蹄疫病毒分子生物学诊断国内外研究进展 近年来由于分子生物学技术的迅速发展及其在f m 9 诊断中的广泛应用，建立了各 种f m d v 的分子生物学诊断技术。核酸探针是应用f m d v 的c d n a 克隆片段，用”p 或生物素 等标记后制备探针，根据标记片段的不同，可以检测各群( 群特异性探针) 或某一型 ( 型特异性探针) f m d v 的r n a ”1 。电聚焦是根据等电点的不同来分离像蛋白质这样的 两性电解物。电聚焦技术在f m d 流行病学研究中具有较大的运用潜力，常被用于f m d v 的病毒株的遗传变异，以及特异型别的研究中。1 。由于口蹄疫可持续感染“2 “，而未 使用放射性探针的原位杂交已经发展成为了在细胞水平上研究口蹄疫持续感染的有 力工具“。然而，原位杂交敏感性较低，在机体感染口蹄疫病毒1 7 天以后，细胞内 才能检测到病毒，原位杂交遇到了特异性和敏感性问题。应用酪胺信号放大系统能显 著提高其敏感性，在隐性感染牛群中能检测到口蹄疫病毒“。 随着分子生物学的不断发展。，利用t a q m a n 技术的原理已建立了荧光实时定量 p c r 技术( t a q b l a np c r 技术) 。”和基因芯片技术。“。由于t a q m a np c r 技术具有敏感 性、特异性和实时、定量检测拷贝量，得到越来越多的重视和应用。但该项技术也 有缺点，如针对像口蹄疫一样高度变异的病毒，引物设计的难度较大，检测成本高。 实时定量r t p c r 却能针对这种高度变异的病毒提供一套比较方便和准确的方法，该方 法设计在变异较小的3 d 基因处设计引物，该引物不但设计简单，还能对各血清型进行 区别。在临床检验中，该方法和普通的p c r 技术敏感性相同。1 。基因芯片技术是利用 芯片技术，将具有血清型、基因型代表性的v p i 、3 a 基因片段点阵于芯片上，与荧光 分子标记的流行毒e d n a 或r n a 杂交，再用芯片扫描仪和相关软件进行荧光信号读取和 数据转化分析，可很快查明该样品与芯片中的哪个毒株关系密切，从而明确该样品毒 株的血清型和基因型。1 。但上述方法由于对实验条件要求较高，在口蹄疫病毒的检测 中应用较少，而r t p c r 因其诊断准确、方便，得到了大量的应用“、。 1 33 1 反转录聚合酶链反应( r t p o r ) r t p c r 诊断f 的报道始见于1 9 9 1 年“，国内外已经有许多国家报道t h t p c r 技 术在口蹄疫诊断和流行病学调查的研究。m e y e r 等根据编码f m d vr n a 的高度保守区多 聚酶基因序列设计合成一对引物和探针，经r t p c r 扩增，获得4 5 4 b p 扩增产物。l a o s ， m e y e r 等( 1 9 9 1 ) ，h o u s e 等( 1 9 9 2 ) ，v a n g s p e r r e 等( 1 9 9 6 ) 应用保守引物扩增2 b 编码 区，结合运用v p l 编码区的型特异性引物，能快速检测口蹄疫病毒。国内吴时友、刘 在新等学者就r t - p c r 在f i 蜘d v 检测研究作了报道。朱彩珠等也将此项技术应用于f m d v 的诊断，经与接种乳鼠测毒法比较，灵敏度提高6 1 2 倍，检测时间也由常规方法的2 3 周大大缩短到2 4 h 。蒋正军等1 运用依据国外已经发表的口蹄疫全基因序列，选择保 守区域设计两对引物，用r t p c r 一步法检测口蹄疫病毒，经过两次扩增后，电泳观察 扩增产物。前后过程不超过1 2 小时，进一步缩短了检测时间“1 。r t p c r 所检测 病毒材料的类型也十分广泛，包括细胞、乳鼠组织、牛猪羊等家畜的组织样品( 淋巴 结、扁桃体、水疱皮等) 、部分野生动物组织样品、牛羊o p 液样品、屠宰品( 淋巴结、 脊髓和肌肉等) “，在灭活疫苗中也能检出相应的f 锄v 核酸“、“2 “。 1 9 9 2 年起，为了达到用r t p c r 定型的目的，国外研究者对f m d v7 个血清型众 多毒株的i n a 序列进行了比较和引物设计。1 9 9 7 年，c a i l e n sm 和d ec l e r e qk 在 v a n g r y s p e r r ew 和d ec l e r e qk 的工作基础上，利用多重引物技术o ”建立了可区分 f m d 病毒7 个血清型的r t - p c r 方法，多重引物混合物p 3 3 - p 可特异的区分a 、0 、c 、 a s i a l 型，另一套引物混合物p 卜p 则可特异地扩增出s a t i 、s a t 2 、s a t 3 的特异片段 ”1 。抗原捕获p c r 方法是一种快速的病原检测方法p 6 3 7 3 8 1 。1 9 9 9 年，v e l u v a r t i s u r y a n a r a y a n a “”建立了抗原捕获r t p c r 检测方法( a n t i g e nc a p t u r er e v e r s e t r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，a c - r t - p c r ) 。该方法特异性和敏感性 分析表明：该反应是e l i s a 反应的1 2 5 倍，反应时间仅需要几小时。 1 3 3 2 巢式p c r 诊断方法的研究概况 巢式p c r ( n e s t e dp c r ) 是建立在p c r 方法上的一种核酸检测方法。其原理是将p c r 产物再进行一次扩增，以增大拷贝数，提高检测的敏感性。b o h a iw e n 等o ”将n e s t e dp c r 方法和p c r 方法在临床中检测e h “i c h i ac a n i s 病原体时进行了比较，结果发现n e s t e d p c r 方法l k p c r 方法敏感，特别在血液样品的检验中，虽然p c r 方法为阴性的样品， n e s t e dp c r 方法却能检测出特异性核酸。j g r e e n ，k h e n s h i lw o o d 等通过对s r s v s 核酸进行检测的研究中发现，n e s t e dp c r 方法比p c r 方法敏感1 0 0 倍。在检测核酸的研 究中，c h r i s t i n el e ta l 等将n e s t e dp c r 方法和p c r 方法进行了比较研究“”。1 9 9 7 年，蒋正军等“在口蹄疫病毒基因组保守区域内设计了两对引物，建立t f m d v 的 n e s t e dp c r 方法。 1 3 3 3 核酸序列分析 核酸序列分析是将r t p c r 与核酸序列测定相结合而成的一类分析方法“”，在f m d v 7 研究中已得到日益广泛的应用。1 9 8 8 年，d o p a z o 等以v p l 的核酸序列绘制了反映口蹄 疫病毒不同型间的关系树。序列分析表明，编码v p l 蛋白的基因核苷酸易发生变异， 在分子流行病学调查中，分析编码v p l 基因核苷酸序列差异可建立遗传变异谱树和对 疫源追踪。无论整个编码v p l 蛋白的基因或其重要的抗原表位序列，以及应用r t p c r 检测该基因片段一直是国内外研究者关注的热点。将口蹄疫序列分析和统计学方法结 合起来，利用v p l 基因的不同区段的核酸序列的同源性绘制口蹄疫病毒系统发生树， 可以使核酸序列分析的方法更加科学。一旦出现新的毒株流行，只要运用序列资料进 行遗传分析，就可指导选择亲缘关系最近的毒株制造疫苗进行预防免疫，对及时有效 地防制口蹄疫具有重要的指导意义。b e c k 等将欧洲当时f m d v 暴发中分离的流行毒株与 2 0 年前分离并作为疫苗株的9 株病毒v p l 基因序列进行比较分析，结果表明大多数毒株 同疫苗毒株关系密切，因而大多数欧洲暴发的f m d 并不是外部传入的而可能是灭活不 彻底引起的0 1 “。 1 4 存在问题 对于病毒含量低的样品，r t p c r 方法的检出率较低。据朱彩珠等报道，r t - p c r 方法可检出2 0 t c i d 。细胞病毒量，可检出猪水泡皮0 1 6 l d ；。病毒量。若样品中低于 r t - p c r 方法检测的病毒量( 细胞病毒量小于2 0 t c i d 。猪水泡皮病毒量小于0 1 6 l d 。) ， 则r t p c r 不能检测。 1 5 本研究的目的和意义 本研究在用r t - p c r 对v p l 基因的扩增、测序的基础上。将n e s t e dp c r 方法和 v p l 基因的扩增相结合，建立检测f m d vv p l 基因的n e s t e dp c r 方法，对含毒量低的 病料，进行n e s t e dp c r 方法检钡4 ，可提高诊断的敏感性。 2 、技术路线 9 3 、试验材料及仪器 3 1 毒株与病料： 0 型f m l ) v 标准株抗原、猪水疱病( s v d ) 标准抗原，购于中国农业科学研究院兰州 兽医研究所；猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒标准株由四川农业大学动物预防医 学与生物工程实验室保存；疑似感染口蹄疫疾病的水泡皮( 液) 。 3 2 试剂盒、试剂： 反向间接血凝试剂盒购于中国农业科学院兰州兽医研究所。d n a 胶回收试剂( 上 海华舜生物公司) 、r n a d n a 病毒抽提试剂盒( 上海华舜生物公司) 。n a c l 、k c l 、 n a 2 h p 0 4 、k h 2 p 0 4 等化学试剂均为分析纯。葡萄糖、n a c i 、柠檬酸钠、甘油、琼脂 糖、氯仿、异丙醇、7 5 乙醇、无水乙醇、d l 2 0 0 0 m a r k e r 、t a p d n a 聚合酶及其b u f f e r 、 d n t p 、a m v 酶等试剂购于相关公司。 3 3 主要仪器： j o u a n - m r l 8 1 2 高速冷冻离心机、t g l - 1 6 b 型常温离心机、美国b i o m e t r a 公司 p e r s o n a lc y c l e rp c r 仪、p o w e r 3 0 0 稳压稳流电泳仪、b i o - r a d 凝胶成像系统、c c h 培养箱、h h s i i 2 型电热恒温水浴锅、w h - 8 5 1 旋涡混合器、，7 5 2 紫外分光光度计、 m i l l i - - qp l u s 超纯水系统( 法国h i l l i p o r e 公司) 、超净工作台s 、v c h f 、倒 置荧光显微镜( n i k o n 公司) 、电泳槽、e p p e n d o r f 微量加样器( 0 s o l 1 0 儿) 、 f i n n p i p e t t e 微量加样( 4 0 p l 一2 0 0 p l ) 、e p p e n d o r f 管、t i p 头、一次性塑料手套等。 4 、试验方法 4 1 样品的收集与处理 4 1 1 样品的采集、保存和送检 按0 i e 国际兽医疾病诊断和免疫手册( 1 9 9 6 ) 所指定的采集数量与概率原则 进行采集“。并按文献所述方法进行样品的保存和送检。 4 1 2 病毒材料的处理与准备 选取适量洁净组织剪碎研磨，) m o 0 4m o l lp b s ( p h 7 2 7 4 ) i ：1 0 稀释( 水泡液 直接按l ：1 0 稀释) ，并加青霉素和链霉素1 0 0 0 单位毫升。室温浸毒3 4 h 或4 冰箱 过夜。3 0 0 0 r m i n 离心1 0 1 5 m i n ，取上清。将该上清液5 6 。c 水浴4 0 m i n ，即为灭活病 原的病毒材料。 4 2 反向间接血凝试验 按口蹄疫、猪水疱病反向红细胞凝集反应检验规程。1 进行。 4 2 1 被检抗原的稀释 试管架上摆上一排试管8 个，自左向右用稀释液将样品进行倍比稀释( 即1 ：6 、l ： 1 2 、l ：2 4 1 - 7 6 8 ) ，每管体积0 5 m l 。 4 2 2 反应 在9 6 孔微型聚苯乙烯滴定板( 1 3 0 度) 上进行。 4 2 3 滴加待检抗原 取9 6 7 l 微型聚苯乙烯滴定板，在每排的第8 ；l 滴加第8 管稀释抗原5 0ul ，第7 5 l 滴 加第7 管稀释抗原5 0 p1 ，以次类推到第t - i , ，每排的第9 孑l 滴加稀释液5 0 p1 ，作为阴 性对照，每排的第l o l l 分别滴加“0 ”型f m d 和s v d 标准抗原( 1 ：3 0 稀释) 5 0 1 1l ，作 为阳性对照。 4 2 4 滴加红细胞诊断液 用前将红细胞诊断液摇匀，于微型板每排的各孑l 分别滴加红细胞诊断液2 5 p1 。 轻轻振摇微型板，使红细胞均匀分布。室温放置1 5 至2 4 , 时观察结果。 4 2 5 结果判定 按以下标准判定红细胞凝集程度。 “+ + t + ”1 0 0 凝集。红细胞均匀分布于孔底周围。 “十+ + ”7 5 凝集。红细胞均匀分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的 小点。 “+ + ”5 0 凝集。孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点。 “+ ”2 5 凝集。孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞沉积于孔底。 “一”不凝集。红细胞完全沉积于孑l 底成园点。 观察血凝板上各排孔的凝集图形，假如只有第一排孔凝集，且稀释液对照孔不凝 集，阳性对照孔凝集，即证明此种凝集是与0 型红细胞诊断液同型病毒所致的特异性 凝集，被检样品即判为0 型。致敏红细胞5 0 凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。 若出现2 排以上的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2 个对数( 以2 为底) 滴度以上即可判为阳性，其余判为阴性。 4 3 病毒的鉴定 将所收集到疑似口蹄疫病料送至中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫国家参 考实验室进行病原的鉴定。 4 4 病毒r n a d n a 的抽提 4 4 1 病毒r n a 的抽提 将处理好的病料、猪瘟病毒和水泡病毒，参考上海华舜生物工程公司小量病 毒f n a d n a 抽提纯化操作手册进行r n a 的抽提。 ( 1 ) 在1 5 m l 离心管中加入2 5 0u1 病料液或培养液，如不到该体积，用d e p c 水调整， 再加入5 0 0 u1 r v 液，盖上盖子，高速振荡2 分钟后，置于室温静置5 分钟。 ( 2 ) 加入7 5 0ul 异丙醇，颠倒离心管以混匀。 ( 3 ) 移取7 5 0 ul 至吸附柱中，离, 0 1 5 s ，倒掉收集管中的液体。 ( 4 ) 将吸附柱移入同一收集管中，将剩余裂解物移入吸附柱中，离心1 5 s ，倒掉收集 管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中。 ( 5 ) 自n * 5 0 0 u1 r p 液，离心3 0 s ，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中。 ( 6 ) 加入5 0 0ul w 3 液，静置1 分钟后，离, & 1 5 s 。 ( 7 ) 将吸附柱移入另外一个干净收集管中，n a 5 0 0ul w 3 液，离心1 5 s 。 ( 8 ) 倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中，离心1 分钟。 1 2 ( 9 ) 将吸附柱放入另一干净的1 5 m l 离心管中，在吸附膜中央加入3 0 ul 纯水，室温 静置1 分钟( 若室温低于2 0 ，室温静置时间延长到5 分钟) ，离心1 分钟，将1 5 m l 离 心管贮存于一7 0 。 4 4 2 病毒d n a 的抽提 将圆环病毒和细小病毒参考上海华舜生物工程公司小量病毒r n a d n a 抽提纯化 操作手册进行d n a 的抽提。 4 4 3r n a 反转录 参照分子克隆实验指南”1 操作。将所收集r n a 病毒( 口蹄疫、猪瘟和水泡病) 的r n a 反转录得到e d n a 。反应总体积2 0ul ，向0 5 m l 带盖离心管中依次加入下列 反应物( 以2 0 ul 反应体系为例) ： r n a 9 p1 d n t p ( 各l o m m ) 2 u l 0 1 i g o dd t 1u r n ai n h i b i t o r 0 5 u 6 5 4 分钟，冰浴5 分钟后加入： 5 r tb u f f e r4 u 1 m g ” 3 “1 n “v a s e0 5 1 1 1 r n ai n h i b i t o r0 5 u 混匀，3 0 l o 分钟，4 2 c 1 - 1 5 小时，9 5 。c 5 分钟，4 保存。 4 5v p l 基因的r t - p c r 检测 4 5 1 引物设计 参考g e n b a n k 上登记的f m d v 几个不同血清型毒株的病毒基因组核苷酸序列经多 重比较，参考文献 9 方法，用p r e m i e r5 0 软件根据实验要求设计了以下引物： w gl ( 上游引物)5 一t a c c t t t c g g c g g c t g a t t a - 3 w g2 ( 下游引物)5 一g t c c t t t g a c c g t g c t g c t a 一3 l 和2 扩增片段大小为i i l 2 b p ，w g1 位于v p l 基因上游保守区域内( 相应 基因组第3 2 2 9 3 2 5 1 核苷酸序列) ，聪2 位于v p i 基因下游保守