（生物化学与分子生物学专业论文）ihh信号通路与骨发育相关研究.pdf

上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：移八 日期：妒年弓月矽e l i f j l 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。， ?、 保密曰，在立年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ) 指导教师签名：己之以z 日 7 月7 e l j 0 尸 ，v e 9 孙 月 签 乡 者 年 ，i 刘 敝 矿 位 期 学 日 a j 0 上海交通人学溥七论文 h 信号通路与骨骼发育相关研究 摘要 本文围绕i h t t ( i n d i a nh e d g e h o g ) 信号通路与骨骼发育进行了一系 列探讨，包括筛选i i - i h 信号通路相关基因和维生素对该通路及骨骼发育 的影响。2 0 0 1 年，本实验室通过开展a 1 型短指( 趾) 畸形的分子遗传 学研究，发现了该病致病基因i f t - 及其三种致病性突变；使用这三种突 变体及野生型i h t t 蛋白诱导具有h e d g e h o g 信号通路活性的小鼠间叶干 细胞株c 3 h i o t l 2 ，然后与小鼠全基因组寡核苷酸芯片杂交，比较几组 杂交数据我们获得一批与i h h 信号通路相关的新基因，这些基因在i h h 诱导下表达水平有显著变化，因而很可能是受i h h 信号调控的靶基因。 在此基础上，为了对这批基因作进一步筛选，本研究的工作得以开展。 我们引入r n a 干扰技术，通过干扰h e d g e h o g 通路上已知功能的成员进一 步考察上述芯片实验筛选基因的表达变化，从而判断这些基因在该通路 上被调控的可能性。我们选择了干扰s m o 和睨力。s m o 是h e d g e h o g 通 路上位于i h h 受体p t c 下游的基因，对通路起正调控作用；钇朋则是s m o 下游的基因，在通路上充当下游靶基因的转录因子，也起正调控作用。 对这两个基因的干扰必然导致通路下游靶基因表达水平的改变。这两组 干扰数据再结合上述诱导实验数据综合分析，我们得到了两个与i h h 信 上海交通大学蹲七论文 号通路高度相关的基因m a 7 n 4 及i g f b p s o 前者在两组干扰数据中皆显著 下调，而在i h h 蛋白诱导实验中是显著上调，三组数据十分吻合，表明 该基因极有可能在g l l l 下游受到i h h 信号通路的调控；后者在诱导实验 中表达水平显著上调，而在对s m o 干扰时则是下调，这两组数据是相互 吻合的，但在干扰钇以时没看到该基因的显著变化，因而推测该基因可 能在s m o 的下游受i h h 信号调控，但不受g l l l 的调控，而可能与g l l 2 或g l l 3 有关。m a t n 4 是m a t r i l i n 家族的成员，该家族是一个胞外低聚 蛋白家族，是构成软骨细胞基质的重要成分；i g f b p 5 是胰岛素样生长因 子结合蛋白家族的成员，在骨组织中有表达，与羟磷灰石有很高的亲和 力，显然与骨骼发育有关；而i h h 的功能目前也认为主要是调节软骨发 育。这些提示m a t n 4 与i g f b p 5 可能参与i h h 信号通路对软骨发育的调节。 本研究是首次报道i h h 通路与m a t n 4 及i g f b p 5 的高度相关性，值得进一 步深入探究。 维生素a 的代谢物视黄酸( r e t i n o i ca c i d ，r a ) 被证明能够影响 骨细胞的增殖与分化，在胚胎发育期间无论是过量还是不足都会引起骨 骼发育的缺陷。r a 对h e d g e h o g 通路的影响也有报道，有证据表明r a 能 够诱导原代培样的鸡胚肢芽软骨细胞表达i h h 。研究表明b m p 在体外能 够诱导c 3 h i o t l 2 细胞向软骨发生及骨发生方向分化，最近本实验室的 工作表明i h h 也能诱导该细胞类似的分化。因此我们有兴趣探讨维生素 a 在体外能否诱导c 3 h i o t l 2 细胞向骨细胞分化，重点关注在该过 上海交通大学嬉士论文 i t n 及其通路是否也参与作用。我们的结果表明在适当浓度( 1 0 8 m 左右) 的维生素a ( r e t i n 0 1 ) 诱导下，软骨细胞( c h o n d r o c y t e ) 的分子标记 c o l 2 a l 及处于软骨细胞分化晚期的肥大型软骨细胞( h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e ) 的分子标记c o l x 表达水平均有显著性上调，i h h 及其通 路成员p t c i 和碰刀也显著上调；造骨细胞( o s t e o b l a s t ) 的分子标记 a k p 在较高浓度( i 0 娟m 1 0 一铂) 的r e t i n o l 的诱导下，表达水平上调明 显，造骨细胞分化晚期的分子标记骨钙蛋白( o s t e o o c a l c i n ) 也有上调 表现。上述结果提示维生素a 在体外能够诱导c 3 h i o t l 2 细胞向骨细胞 分化，但是与浓度有关，1 0 一( ；m 1 0 5 m 诱导该细胞向造骨细胞方向分化， 1 0 娟m 则诱导向软骨细胞分化并且i h h 及其信号通路可能在此过程中参与 调节。此外，我们也观察到了维生素a 对m a t n 4 与i g f b p 5 的诱导作用， 其中对m a t n 4 的诱导是首次发现。根据前面的工作，m a t n 4 和i g f b p 5 与 i h t t 信号通路密切相关并能被后者所诱导，因此我们推测，m a t n 4 和 i g f b p 5 实际上是被i h h 信号通路所诱导，得益于后者被维生素a 所激活。 维生素a 诱导c 3 h i o t l 2 细胞向软骨细胞分化是否依赖于i h h 信号通路， 本文尚不足以下结论，还需要更多的证据支持。维生素a 是如何对i h h 信号通路施加影响也有待于更深入的研究。 1 ，2 5 ( o h ) 。v d 3 是维生素d 3 的生物活性形式，通过与其受体结合在 生物体内发挥多种重要功能，其中与骨骼发育相关的内容是促进钙磷的 吸收、维持钙代谢平衡、调节造骨细胞和破骨细胞的分化。而i h h 也被 上海交通人学博士论文 证明与造骨细胞的形成有关，体外研究表明i h h 能够诱导c 3 h 1 0 t 1 2 向 骨发生方向分化。因而我们有兴趣考察v d 3 与i h h 信号通路之间的关系。 通过1 ，2 5 ( o h ) 。v d 3 体外诱导c 3 h 1 0 t 1 2 细胞我们观察i h h 及其信号通路 成员的表达变化，同时也关注了软骨发生及骨发生的几个分子标记基因 的表现。我们首次发现适当浓度的v d 3 能够显著诱导i n 及其信号通路 ( 以1 0 峭m 效果最明显) 。软骨细胞的分子标记c o l 2 a l 与造骨细胞的分 子标记a k p 均无明显变化，因此我们认为c 3 h i o t l 2 细胞在v d 3 的诱导 下不能向软骨细胞分化，也未能分化为造骨细胞。进一步的分析，我们 推测v d 3 可能通过诱导i h h 信号通路促进细胞朝骨化的方向分化，在这 过程中，骨钙蛋白、i g f b p - 5 以及p t h r p 可能参与作用，但最终可能因 为体外培养缺乏某些关键因素而不足以完成该分化。 此外，利用实验室的资源还开展了少量精神分裂症易感基因的关联 分析研究。我们的结果显示，d g c r l 4 基因启动子区的几个位点的多态性 表现出与精神分裂症的强阳性关联( b e s tp - v a l u e = 0 0 0 0 3 8 ，g l o b a l p - v a l u e = 0 0 0 0 8 ) ；我们的工作是有关d g c r l 4 基因与精神分裂症易感性 关联分析的首家报道，并且得到强阳性关联结果，因而该基因也值得更 进一步的关注和研究。 关键词：i h h ，r n a i ，t n 4 ，r e t i n o l ，1 ，2 5 ( o h ) ：v d 3 ，d g c r l 4 上海交通人学蹲七论文 s t u d i e s0 ni h hs i g n a l i n gr 气t h a y a n ds k e l e t o nd e v e l o p m e n t a b s t r a c t i nt h i sa r t i c l e ，w em a d eas e r i e so fs t u d i e so nt h ei h hs i g n a l i n gp a t h w a y a n dt h es k e l e t o nd e v e l o p m e n t f i r s t l y , w ee x p l o r e dt h ep u t a t i v en e wm e m b e r s o ft h ei h h p a t h w a y i nt h ey e a ro f2 0 0 1 ，o u rg r o u pf o u n df o rt h ef i r s tt i m e t h r e em u t a t i o n so fi h hg e n ew h e ns t u d y i n gt h ec h i n e s ef a m i l yo fb d a l p a t i e n t s l a t e r , t h em o u s em e s e n c h y m a lc e l l l i n ec 3 h 1 0 t 1 2 ( w h i c hh a d b e e np r o v e dt oh a v et h ep a t h w a ya c t i v i t y ) w a sc u l t u r e du n d e rt h ei n d u c t i o n o fi h h p r o t e i nw i t hb o t hw i l dt y p ea n dm u t a t i o n s t h e nt h et o t a lr n a so f t h ec e l l sw e r eu s e dt oh y b r i d i z ew i t ho l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a yc o n t a i n i n g m o u s ew h o l eg e n o m e t h r o u g ha n a l y z a t i o n ，w eg o tag r o u po fg e n e sw h o s e e x p r e s s i o nw e r ef l u c t u a t e ds i g n i f i c a n t l yu n d e rt h ei n d u c t i o no fi h h sa n dt h e n c o u l db et h et a r g e tg e n e so ft h ei h hp a t h w a y j u s to nt h eb a s eo ft h e s ew o r k ， w ec o n d u c t e do u rn e ww o r k ，i e s c r e e n i n gs o m en e wc a n d i d a t eg e n e s r e g u l a t e db yt h ep a t h w a y w ef u r t h e ro b s e r v e dt h eb e h a v i o r so ft h eg e n e sg o t f r o mt h em i c r o a r r a yd a t aa b o v em e n t i o n e du n d e rt h ec o n d i t i o no fk n o c k i n g d o w ns m oo rg l h ，b o t hb e l o n gt oa n df u n c t i o n i n gp o s i t i v e l ya c t i v a t et h e 5 上海交通夫学蹲七论文 p a t h w a y ( a sar e s u l t ，t h ee x p r e s s i o no ft h er e a lt a r g e tg e n e so ft h ep a t h w a y s h o u l db ea f f e c t e d ) w ec a r e f u l l ya n a l y z e dt h et w or e s u l t so ft h ea b o v e m e n t i o n e dr n a i ，c o m b i n e dw i t ht h em i c r o a r r a yd a t a f r o mt h er e s u l t s ，w e d i df i n dt w og e n e sn a m e dm a t n 4a n di g f b p 5 ，w h i c ha r em o s tp r o b a b l y r e g u l a t e db yt h ei h hs i g n a l i n gp a t h w a y m a t n 4w a sd o w nr e g u l a t e di nb o t h t h er n a i s ，w h i l eu p r e g u l a t e du n d e rt h ei n d u c t i o no fw i l dt y p ei h h p r o t e i n ， p e r f e c t l yc o i n c i d e n ta m o n g t h er e s u l t s ，i n d i c a t i n gt h a tm a t n 4i sr e g u l a t e db y t h ei h h s i g n a la tt h ed o w n s t r e a mo fg l i 1 i g f b p 5w a sa l s od o w n r e g u l a t e d d u r i n gt h er n a io fs m oa n dn oc h a n g ei nt h er n a io fg l h ，w h i l e u p r e g u l a t e db y t h ei n d u c t i o no fw i l dt y p ei h hp r o t e i n ，i n d i c a t i n gt h a t i g f b p 5i sr e g u l a t e db yt h ei h h s i g n a la tt h ed o w n s t r e a mo fs m o b u tn o t g l l l ，s u g g e s t i n gi g f b p 5m a yb er e g u l a t e db yg l l 2o rg l l 3o ro t h e r f a c r o t s m a t n 4b e l o n g st ot h ef a m i l yo fm a t r i l i n s ，af a m i l yo fo l i g m e r i c e x t r a c e l l u a r p r o t e i n s ，w h i c hi s t h ei m p o r t a n tc o m p o n e n to fc h o n d r o c y t e m a t r i x ；i g f b p 5i s am e m b e ro ft h ef a m i l yo fi n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r s b i n d i n gp r o t e i n s ( i g f b p s ) ，e x p r e s s e di nb o n et i s s u e ，w i t hh i g ha f f i n i t yt o h y d r o x y a p a t i t e ；h e n c e ，b o t hm a t n 4a n di g f b p 5a r ea s s o c i a t e dw i t hb o n e d e v e l o p m e n t a n d i h hs i g n a l p a t h w a yi s a l s o p r o v e dt or e g u l a t e t h e c h o n d r o g e n e s i sa n do s t e o g e n e s i s ，d u r i n gw h i c hm a t n 4 a n di g f b p 5m a y p l a yr o l e sa ss u g g e s t e db yo u rr e s u l t s t oo u rk n o w l e d g e ，w er e p o s e dt h e 6 上海交通大学博士论文 a s s o c i a t i o nb e t w e e nm a t n 4o ri g f b p 5a n di h h s i g n a l i n gp a t h w a yf o rt h e f i r s tt i m ea n di tw o u l db ew o r t h yt ol e a d i n gt h es t u d yaf u r t h e rs t e p r e t i n o i ca c i d ( r a ) ，am e t a b o l i t eo fr e t i n o l ，h a sb e e np r o v e dt or e g u l a t e the p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n c i a t i o no fc h o n d r o c y t e s b o t hd e f i c i e n c ya n d e x c e s s i v ed u r i n gt h ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n tw o u l dc a u s eb i r t hd e f e c t so f s k e l e t o n t h e r ew a se v i d e n c et h a tr ac a ni n d u c et h ee x p r e s s i o no fi h hi n t h ec u l t u r e d c h d r o c y t e so fc h i c ke m b r y o n i cl i m bb u d s a l s o ，t h eb o n e m o r p h o g e np r o t e i n s ( b m p ) w e r eo b s e r v e dt oi n d u c eb o t hc h o n d r o g e n e s i s a n do s t e o g e n e s i so fc u l t u r e dc 3 h 1 0 tc e l ll i n e nv i t r o r e c e n t l y , o u rg r o u p f o u n di h h p r o t e i nh a st h es i m i l a rf u n c t i o na sb m eh e n c e ，w eh a v ei n t e r e s t t oe x p l o r et h a tw h e t h e rr e t i n o lc a ni n d u c et h ed i f f e r e n c i a t i o no fc 3 h 10 t 1 2 i n t oc h o n d r o c y t e sa n do s t e o b l a s t s nv i t r o ，w i t hs p e c i a li n t e r e s to nw h e t h e r t h ei h h s i g n a lp a t h w a yp l a ya r o l ed u r i n gs u c hi n d u c t i o no fr e t i n 0 1 o u r r e s u l t si n d i c a t e dt h a tw i t hp r o p e rc o n c e n t r a t i o n ( a b o u t1 0 8 m ) ，r e t i n o lc a n i n d u c et h ee x p r e s s i o no fb o t hc o l 2 a la n dc o l x ，c h a r a c t e r i s t i cm o l e c u l a r m a r k e ro fc h o n d r o c y t e sa n dh y p e r t r o p h i cc h o n d r o c y t e sr e s p e c t i v e l y , a sw e l l j ta st h ee x p r e s s i o no fi h ha n di t st a r g e tg e n e s ( p r c la n da t n ) ；w h i l eu n d e r t h ei n d u c t i o no fr e t i n o lo n h i g h e rc o n c e n t r a t i o n ( 1 0 6 m 1 0 。5 m ) ，t h e e x p r e s s i o nl e v e lo fa k p 2 ( ac h a r a c t e r i s t i cm o l e c u l a rm a r k e ro fo s t e o b l a s t ) d r a m a t i c a l l yi n c r e a s e d ，a n d t h ee x p r e s s i o no fo s t e o c a l c i n ( am a r k e ro f 7 上海交通大学媾士论文 o s t e o b l a s ta tl a t es t a g e ) w a sa l s oi m p r o v e d o u rr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tr e t i n o l c a ni n d u c ec 3 h 1 0 t 1 2c e l ll i n ei n t ob o t hc h o n d r o c y t e sa n do s t e o c y t e s ，a n d s u c hi n d u c t i o ni sc o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n t ：o nt h ec o n c e n t r a t i o no f1 0 6 m 1o m ，r e t i n o li n d u c et h ec e l ll i n ed i f f e r e n c i a t i o ni n t oo s t e o b l a s t s ，w h i l e 1 0 8 mo r s oi n t oc h o n d r o c y t e sd u r i n gw h i c hi h h s i g n a l i n gp a t h w a ym a yp l a y a ni m p o r t a n tr o l e i na d d i t i o n ，w ea l s oo b s e r v e dt h ei n c r e a t i o no fe x p r e s s i o n l e v e l so fb o t hm a t n 4a n di g f b p 5u n d e rt h ei n d u c t i o no fr e t i n o l ( m 删i s t h ef i r s tt i m et ob el i n k a g e dt or e t i n o li n d u c t i o n ) ，s u g g e s t i n gt h a tb o t hg e n e s m a y b ei n v o l v e di nt h ep r o c e s so fc h o n d r 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r s tt i m e ，t h a tt h ei h h s i g n a l i n gp a t h w a y w a s s i g n i f i c a n t l y i n d u c e d b yv d 3 ，w h i c hw a s c o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n t ( t h e1 0 mh a dt h eb e s te f f e c t ) h o w e v e r , c o l 2 a l a n da k p , t h em o l e c u l a rm a r k e r so fc h o n d r o c y t e sa n do s t e o b l a s t sr e s p e c t i v e l y , e x h i b i t e dn oc h a n g e ，w h i c hs u g g e s t i n gt h a tt h ec e l l sw a sn o ta b l et o t r a n s f o r m e dt oc h o n d r o c y t e so ro s t e o b l a s t su n d e rt h ei n d u c t i o no fv d 3 a f t e r af u r t h e ra n a l y z a t i o n ，w eh y p o t h e s i s e dt h a tv d 3m a yp l a yar o l eo nt h e p r o c e s so fo s s i f i c a t i o nb yr e c r u i t i n gt h ei h hs i g n a l i n gp a t h w a y , d u r i n gw h i c h o s t e o c a l c i n ，i g f b p 一5a n de v e np t h r pm a ya l s ob ei n v o l v e d h o w e v e r , t h e c e l l sf a i l e dt ob ed i f f e r e n c i a t e di n t oo s t e o b l a s t sb yt h ei n d u c t i o no fv d 3 ， 一w h i c hm i g h td u et os o m ek e yf a c t o r s a b s e n c eu n d e rt h ec o n d i t i o no f nv i t r o l a s t l y ，w ea l s ol e da na s s o c i a t i o ns t u d yb e t w e e ns c h i z o p h r e n i aa n da c a n d i d a t eg e n e o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a ts o m ep o l y m o r p h i s m si nt h e p r o m o t e rr e g i o n o fd g c r l4e x h i b i t e da s t r o n g a s s o c i a t i o nw i t h 9 上海交通人学博七论文 s c h i z o p h r e n i a ( b e s tp - v a l u e = 0 0 0 0 3 8 ，g l o b a lp - v a l u e = 0 0 0 0 8 ) t o o u r k n o w l e d g e ，o u rw o r ki st h ef i r s ts t u d yo ne x a m i n i n g t h ea s s o c i a t i o nb e t w e e n t h ed g c r l 4l o c u sa n ds c h i z o p h r e n i a t h e r e f o r e ，t h ed g c r l 4 g e n ei sw o r t h t ob ef u r t h e rf o c u s e d k e y w o r d s ：i h h ，r n a i ，m a t n 4 ，r e t i n o l ，1 , 2 5 ( o h ) 2 v d 3 ，d g c r l 4 1 0 上海交通人学博七论文 目录 缩写符号说明1 4 第一章h - 1 型短指( 趾) 及ih h 信号通路研究综述1 5 第一节短指( 趾) 畸形及其分子遗传学研究概述1 5 1 人类短指( 趾) 畸形1 5 2 a l 型短指( 趾) 的分子遗传学研究进展。1 6 第二节h e d g e h o g 家族及其信号通路研究概况。1 8 1 h e d g e h o g 家 唳1 8 2 h e d g e h o g 蛋白的加工、修饰与分泌1 9 3 h e d g e h o g 信号通路研究概况2 3 第三节i 嗍与骨骼发育2 9 1 骨骼发育概述2 9 2 i h h 对骨骼发育的影响3 0 第二章r n a 干涉( r n ai ) 用于i h h 信号通路的研究3 3 第一节r n a i 技术原理及其应用策略3 3 1 r n a i 技术基本原理3 3 2 r n a i 技术用于信号通路研究的基本策略3 4 3 本研究的具体思路3 8 3 1 实验设计3 8 3 2i h h 诱导实验及基冈芯片筛选结果的提示。3 9 第二节r n ai 用于筛选i 删信号通路相关基冈的研究4 1 1 材料与方法。4 1 1 1 短发夹状r n a ( s h r n a ) 表达载体的构建4 l 1 2 细胞培养