（法医学专业论文）改良彗星试验检测兔死后肝细胞核dna含量变化及其法医学意义.pdf

重庆医科大学硬士研究生学位论文 英文缩写 d n a d n a s e e b s c g e a s c g e d s b s s s b s d m s o t r i t o n x 1 0 0 t r i s n 8 ：e d l - a u 妒 a l s p b s t l 删 p m i f | 珊 i a t i s e l h m l n 英汉缩略语名词对照 英文名称 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e a s e s e t h d i u mb r o m i d e s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s a l k a l is i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s d o u b l e s t r a n db r e a k s s i n g l es t r a n db r e a k s d i m e t h y ls u l f o x i d e t - o c t y p h e n o x y p o l y e t h o x y t h a n o l t r i s ( h y d r o x y m e e t h y l ) a m i n o m e t h a n e e d a t h a m i id i s o d i u m a g r o s e ，l o wm e l t i n gp o i n t a l k a l il a b i l es i t e s p b o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e s a i ll e n 【z h t h t a i lm o m e n t p o s t m o r t e mi n t e r v a l f l o wc y t o m e t r y i m a g ea n a l y s i st e c h n o l o g y i ns i t ue n d l a b e l i n g h o u r m i n l i t e 中文名称 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸酶 溴化乙锭 单细胞凝胶电泳 碱性单细胞凝胶电泳 双链断裂 单链断裂 二甲基亚砜 曲拉通- 1 0 0 三羟甲基氨基甲烷 乙二胺四乙酸二钠 低熔点琼脂糖 碱易变点 磷酸盐缓冲溶液 尾长 尾矩 死亡时间 流式细胞术 计算机图像分析技术 原位末端标记法 小时 分钟 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书面使用过的材| f 牛，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名 缈嗍：乎盟一 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期问论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签各： 日 期： 剜刎，j i v 扩 ，矗t g 重庆医科大学暖士研究生学位论文 改良彗星试验检测兔死后肝细胞核d n a 含量变化及其 法医学意义 摘要 目的： 应用改良彗星试验方法检测兔死后肝细胞核d n a 的降解情况，研 究死后细胞核d n a 含量变化与死亡时间的关系，从而探讨死后细胞核 d n a 含量改变在早期死亡时间推断中的应用价值。 方法： 健康成年大白兔经断颈错位处死后，置于室温下，分别在处死后 0 h 、3 h 、6 h 、9 h 、1 2 h 、1 5 h 、1 8 h 、2 1 h 、2 4 h 、2 7 h 、3 0 h 共1 1 个时间 点进行在体肝脏组织取材，并按相应时间段分组共有1 1 个组别。应用 改良彗星试验方法技术对各组样本进行电泳，染色，在荧光显微镜下 对电泳图像进行观察、摄像，再用c a s p 图像分析软件对彗星图像尾部 情况进行分析，采用尾长( t l ) ，尾矩( t m ) 两个参数作为主要的分析 指标，最后应用s a s9 0 统计分析软件对图像分析所得数据进行统计 学相关回归分析。 结果： 应用改良彗星试验共制得凝胶体5 2 8 块，无一例损坏脱落，试验 的繁琐程度得到明显的减轻、实验时间明显缩短。彗星试验显示：兔 死后肝细胞核d n a 经过单细胞凝胶电泳出现了明显的彗星图像，并随 2 重庆医科大学碘士研究生学位论文 死亡时间的推移彗星图像变得越清晰明显，而后又逐渐变得模糊不清； 最早出现的时间是在死后3 h ，其拖尾率达到9 8 ，而在死后3 0 h 彗星 图像就变得模糊不清，不能进行准确辨认。图像分析显示：在死后0 - 1 8 h 随死亡时间的延长，彗星尾部逐渐增长、增宽，表现尾部情况的t l 、 t m 参数值逐渐增大，1 8 h 时达到高峰，而后在2 1 - 2 7 h 有所下降并在一 定范围内波动，二参数值表现出相对的稳定性，而在3 0 h 则不能检测 到彗星图像相关数据，表明彗星图像不存在。统计分析显示：在死后 0 - 1 8 h 各组间t l 、t m 值存在显著性差异，而在2 1 - 2 7 h 各组间t l 、t m 值无显著性差别；t l 、t m 在死后3 - 1 8 h 与死亡时间紧密相关，相关系 数分别达到0 9 9 6 1 4 、0 9 9 0 7 7 ，p 1 3 。 1 2 3 9 溴化乙锭染色剂的配制 溴化乙锭( e t h d i u mb r o m i d e ，即) 是一种荧光剂，其分子插入在d n a 双螺旋 结构的两个碱基平面之后，能形成一种在紫外光激发下发出很强荧光的络合物， 1 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 所以十分容易观察，检测的灵敏度非常高，l u g m l 的髓水溶液可检出l o n g 或更 少的d n a 样品，但是e b 产生的荧光在紫外灯下放置时间过长能被淬灭，也容易受 一些化合物的污染而淬灭。 储存剂：称取溴化乙锭粉剂2 m g ，在量筒中用去离子水溶解，然后定容至l o o m l ， 其浓度为2 0 u g m 1 ，最后用棕色玻璃瓶低温避光保存。 使用剂：吸取储存剂l o m l ，在量筒中用去离子水稀释定容至4 0 m l ，其浓度为 5 u g m l ，用棕色玻璃瓶低温避光保存。 1 2 4 单细胞悬液的制备 称取肝脏组织取材0 2 9 ，用冰pb s 液清洗去除血迹，在玻璃匀浆器内用眼科 剪剪碎组织后，向匀浆器内加入5 m l 冰匀浆液，随后在冰浴上进行匀浆，匀浆l o m i n ， 用3 0 0 目的尼龙漏斗过滤，取滤液稀释，在光学显微镜下观察计数，调整单细胞 浓度为卜4 xl o 个l ，最终稀释约为一倍。4 c 冰箱保存。 1 2 5 单细胞凝胶混合液的制备 用微量加样器吸取单细胞悬液1 5 0 u l ，加入到事先在3 7 c 恒温水浴箱中预热的 l m l 规格离心管内，然后再吸取1 低熔点琼脂糖溶液4 5 0 u l 加入到该离心管中， 振动摇匀后保存于该恒温水浴箱中备用。注意该过程中防止气泡的产生。 1 2 6 凝胶体制取改良 1 9 8 8 年s i n g h 啪等人建立了“三明治”制胶方法，具体流程为：吸取l o o u l 正 常熔点琼脂糖滴注在载玻片上，用盖玻片压平，在4 下冷凝l o m i n 后，揭取盖玻 片，从而制得底胶层；随后在底胶层表面上滴加含有细胞的低熔点琼脂糖溶液， 制取第二层凝胶体，仍用盖玻片压平，4 下冷凝l o m i n ，取除盖玻片；最后在第 二层胶面滴加正常熔点琼脂糖，依然用盖玻片压平，于4 c 下冷凝后揭除盖玻片。 这种制胶方法获得的凝胶体形似“三明治”此种制胶方法步骤繁琐，形成的凝胶 体较厚，并且凝胶体在后续的操作中容易脱落 本实验对该过程进行了简化、改良，将铺胶三层改为一层铺胶，其过程为： 用微量加样器吸取l o o u l 单细胞低熔点琼脂糖混合液直接滴加在预热载胶片每个 单元上，然后用盖玻片压平，于4 1 2 下避光冷凝l o m i n ，揭除盖玻片，所制得的凝 胶体即可进入后续操作。注意铺胶过程均在3 7 c 恒温水浴箱中进行，滴加混合液 时不要产生气泡。 1 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 7 细胞裂解 将制好凝胶体的载胶片轻放入事先置于4 c 冰箱内的玻璃器皿中，然后倒入裂 解液至载胶片浸没，避光裂解1 h ，细胞裂解完后用吸管吸干裂解液，取出载胶片， 进行下一步操作。 2 8 裂解后清洗优化改良 将裂解完毕的载胶片放入另一个事先置于4 冰箱内的玻璃器皿中，然后向玻 璃器皿中加入去离子水至载胶片浸没，避光保存l o m i n 后，吸千液体，取出载胶 片。 1 2 9 细胞解旋 把清洗后的载胶片放入事先置于4 1 2 冰箱内的水平电泳槽平台上，缓慢倒入预 冷的电泳缓冲液，直至载胶片浸没，使液面高出载胶片表面0 2 5 c m ，避光解旋 l o m i n 。 1 2 1 0 电泳 解旋完毕后，直接接通电泳仪，稳压2 5 v ，电流2 5 0 m a ，电泳3 0 r a i n 。电泳时 通过改变液面高度进行电流调节。 1 2 1 1 中和 电泳完后，吸出电泳槽平台内的液体，取出载胶片放入到事先置于4 冰箱内 的培养皿中，缓慢倒入冷0 4 m o l lt r i s - b c l 缓冲液，直至载胶片浸没，避光静 置1 5 m i n ， 1 2 1 2 染色 中和后，吸干液体，取出载胶片，在4 冰箱内用滤纸吸干凝胶体周边及载胶 片上多余的液体，避光放置l o m i n 。然后从冰箱内取出载胶片，放进冰盒，在每个 单元凝胶体表面滴加l o u l5 u g m 1 的溴化乙锭染色剂，盖上盖玻片，避光染色2 0 m i n 后揭除盖玻片，冰盒内继续避光静置染色，在5 h 内用荧光显微镜观察 1 2 1 3 图像观察及摄像 用n i k o nt e 2 0 0 0 - u 型荧光倒置显微镜对染色后的载胶片进行图像观察：红色 荧光激发，放大2 0 0 倍( 目镜1 0 ，物镜2 0 ) ；采用p e n g u i n6 0 0 c l 图像采集 系统在分辨率为2 7 7 6 2 0 7 4 、自动改变暴光时问的情况下进行图像扫描采集，并 保存于计算机内。 1 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 1 4 图像分析 彗星试验图像分析是该方法的重要组成部分。图像分析参数较多，有可以通 过人工测量的指标( 如拖尾率、彗星长、尾长度等) ，容易获取，但是结果比较粗 略；有只能由图像分析软件才能进行分析的参数指标如尾矩( t m ) 、尾惯量( t a i l i n e r t i a ，t i ) 等，结果精确可靠。目前国内外公认的利用图像分析软件评估d n a 损伤的主要指标为尾长及尾矩，特别是尾矩不仅反映了尾长度的信息，亦包含了 尾部荧光强度的信息，即尾矩是指尾部d n a 占总d n a 的百分比与头尾部中心间距 的乘积，是各实验图像分析系统使用的检测指标嘲。尾长、尾矩两个参数联合使用 能够较为准确地反映d n a 断片数量及其迁移的情况，同时二指标容易测取。 每个样本随机观察1 0 个细胞，每组共观察1 2 0 个细胞，进行细胞拖尾率统计； 然后用c a s p 图像分析软件( 可从曼塑：垒墅：q 兰：p l 网站上下载) 对所采集到的彗 星图像进行分析，分析指标为尾长( t a i ll e n g t h ，t l ) 、尾矩( t a i lm o m e n t ，t m ) 。 每组每个样本随机分析1 0 个彗星图像，计算二参数的平均值，每组共分析1 2 0 个 彗星图像，结果保存于计算机内。 1 2 1 5 结果统计分析 应用s a s9 0 统计分析软件对图像分析所得结果数据t l 、t m 值与死亡时间进 行相关及线性回归分析，用秩和检验对相邻各组间的差异进行分析。 1 2 1 6 实验条件控制 环境条件特别是环境温度对实验具有一定的影响作用。低温不仅对d n a 降解 有抑制作用旧m ，防止温度带来的额外d n a 损伤，而且还能够使铺好的凝胶体迅速 凝固且牢固性好。但是由于琼脂糖在低温下处于凝固状态，无法进行铺胶，故选 择在保持其液体状态的最低温度范围内( 3 6 - 3 7 8 ) 制取凝胶体，不仅能够顺利 铺胶而且能够最大限度地减少不必要的d n a 损伤。温度对电泳缓冲液p h 亦有明显 的影响( 见表3 ) 短暂的铺胶环节在3 7 恒温水浴箱中进行，其余全部实验过程 均在4 条件下进行，保证了制取凝胶体的成功，有效防止了不必要的d n a 损伤， 以及保证了电泳缓冲液p h 值始终大于1 3 ，从而保持了实验高度的精确性和灵敏性。 另外整个实验过程均在暗光条件下进行。 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表4 电泳缓冲液p h 值与温度的关系 t a b l e 4r e l a t i o nb e t w e e np hw i t ht e m p e r a t u r eo f t h ee l e c t r o p h o r e t i cs o l u t i o n 2 结果 2 1 彗星试验 本实验应用改良彗星试验共制取凝胶体5 2 8 块，无一例发生损坏脱落，在操 作步骤上改传统的3 层铺胶为1 层灌胶、裂解后分次清洗改为1 次浸洗和电泳后 分次中和改为1 次性浸没中和，明显减轻了实验的繁琐程度，操作变得更为简便、 顺利，使得实验时间缩短半个小时以上。实验发现在- 1 0 c 以下条件保存的样本在 1 0 天内进行彗星试验，其结果无明显差异。 载胶片选择使用9 6 孔聚苯乙烯培养板盖，并经一定的改造形成一定大小的单 元，单层灌胶后制得的凝胶体胶面光滑平整，胶体大小合适( 1 6 2 4 m m ) 、厚度适 中( 约0 2 - 0 3 m m ) 蜘、厚薄均匀；在整个试验过程中除了操作不当引起的凝胶体 损坏和脱落外，无凝胶体脱落现象发生，使得实验得以顺利进行；在图像观察时， 该材料载胶片背景荧光强度较载玻片为低( 见图2 ) ，能与彗星图像荧光强度形成 鲜明的对比，彗星图像清晰。单层铺胶减轻了“三明治”法给实验带来的繁琐程 度，使得实验操作更为简便、快速，同时减少了因凝胶体厚度带来的对图像的影 响作用，所得彗星图像更为清晰。 单细胞悬液与琼脂糖溶液混合的比例关系着混合液凝固性、单细胞在凝胶中 散布等的良好程度，实验告诉我们二者为1 ：3 的比例时形成的混合液凝胶体凝固 性好，单细胞分散均匀，电泳图像质量佳。由于本实验组所制得载胶片单元稍大 于盖玻片，因此经过反复实践发现铺胶用量在1 0 0 u l 最为合适，刚好形成与单元 槽缘高度一致、与盖玻片大小一致的平整的凝胶体。 本实验组采用浸洗法去除裂解后的载胶片上多余的盐分和应用浸没法对电泳 后载胶片上的碱液进行中和，使得实验步骤得到简化、缩短了实验时间，更重要 的是减少了促进脱胶的人为因素，在上述过程中未见脱胶现象 1 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ab 图2 背景荧先强度a 聚苯乙烯材井b 裁玻片 飚2b a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e n t e n s i i y ap o l y s t y r e n es t u f fb g l a | | s l i d e 2 2 图像观察结果 本实验条件下，在兔死后3 h 就能检测到彗星拖尾现象，并且拖尾率达到9 8 ， 至死后6 h 拖尾率达到1 0 0 ，说明死后不久( 3 h ) 兔肝细胞核d n a 就已经开始发 生降解了。随着死亡时间的延长，彗星尾部呈现逐渐增长、增宽、荧光强度逐渐 增强趋势，在死后1 2 1 8 h 降解明显加速，并于死后1 8 h 达到峰值，而彗星头的变 化则刚好相反( 见附图) 。在2 1 - 2 7 h 彗星图像出现相对的稳定性，但较前荧光强 度有所减弱，图像清晰度较前减低。而在3 0 h 就不能观察到明显的彗星图像了， 说明d n a 己降解完全。 2 3 图像分析及统计分析结果 2 3 1 彗星图像相关参数的测定 t l 、t m 是衡量d n a 损伤程度的较好参数指标，本实验组采用c a s p 图像分析软 件对所采集图像进行了该参数的测定，结果见表5 。t l 、t m 均值在死后0 - 1 8 h 随 死亡时间的推移逐渐增大，在2 卜2 7 ht l 、硼值轻度下降，并保持相对稳定( 见 图3 、4 ) ，3 0 h 未能检测到二者值。经w i l c o x o n 秩和检验，0 - 2 1 h 各组之间存在显 著性差异，2 卜2 7 h 组间无显著性差异。散点图显示t l 、t m 均值在3 - 1 8 h 与蹦i 几 乎呈正向直线变化趋势，见图3 、4 。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表5 兔死后不同时间肝细胞t l t m 值( ；岛) t a b l e 5t l a n d t m o f r a b b i t s l i v e r c e l l sa t d i f f e r e n t p o s t m o r t e m i n t e r v a i pmi(h)tl(uln)tm(um) 00 0 3 2 3 1 9 0 1 1 6 0 6 2 9 9 0 5 0 3 6 3 2 3 5 5 1 2 0 99 9 4 5 i 9 5 6 9 4 3 3 0 0 2 4 4 7 1 4 1 2 2 4 - 2 1 4 1 1 2 5 5 7 3 5 2 3 2 6 2 1 5 9 1 4 - i 6 3 5 1 5 6 0 7 7 0 0 7 9 2 2 4 0 3 0 4 - i 4 4 0 1 8 7 4 0 8 0 4 - 2 7 4 32 7 5 0 5 2 0 9 6 2 1 5 9 1 1 0 1 3 2 9 2 1 4 4 4 i 8 6 9 5 9 2 3 5 4 - i 3 5 0 2 2 0 8 1 _ 4 - i 4 9 2 7 6 1 1 0 0 0 4 2 4 2 1 3 1 4 i 1 4 4 注：。一一”表示数据未能测出 图3t l 值随p m i 延长的变化散点图 f i g3 螂t t e rc h a r tb e t w g e l lt l a n dp m i 2 1 重庆医科大学硕士研究生学位论文 图4t m 值随p m i 延长的变化散点图 f i 9 4 s c a t t e rc h a r tb e t w e e nt mn n dp m i 2 3 2 相关分析 根据散点图的变化趋势对死后3 - 1 8 h 的t l 、t m 值与p m i 关系进行p e a r s o n 相 关分析，t l 与死亡时间的相关系数为0 9 9 6 1 4 ，p 0 0 1 - t m 与死亡时间的相关系 数为0 9 9 0 7 7 ，p 0 0 1 ：孔、t m 与死亡时间存在紧密的相关关系。 2 7 3 回归分析 根据散点图的变化趋势对死后3 - 1 8 h 的t l 、t m 值与p m i 关系进行线性回归分 析，直线回归方程见表6 。 表6 t l ，t m 与p m i 的线性回归方程 t a b l e6r e g r e s s i o ne q u a t i o n 注：t 为死亡时间( p m i ) ，如为尾长( t l ) 勋为尾矩( 删) 3 讨论 死亡时间的推断在国内外法医病理学研究中一直是一个极其重要的课题，找 到一种较为准确的推断方法是研究的一个重要内容。早期学者主要通过肉眼观察 所见到的尸体现象如尸斑、尸僵、角膜浑浊等的发展来进行p m i 的推断。但是结 2 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 果的准确性受到较多因素的影响，如环境温度、死亡原因、细菌等，同时还与推 断者的判断能力和经验密切相关，使得结果带有一定的主观性和经验性，这些都 促使结果的推断出现较大误差 9 h 1 0 ) 。后来，通过生物化学、组织化学、生物物理 学等方法技术对尸体化学成分变化进行了研究，特别是玻璃体液钾浓度一度成为 研究的热点，研究亦表明，玻璃体钾浓度与p m i 显著性正相关，并且不少学者还 建立了自己的直线回归方程“”，但是玻璃体钾浓度较易受到死亡原因、环境温度、 玻璃体生化情况“吼”1 等因素影响，因此该方法具有较大的局限性。时至今日，仍 没有一种方法可以准确客观的推断死亡时间。随着细胞生物学和分子生物学技术 的发展进步，生物体遗传物质d h a 受到众多学者的关注，并且正尝试用各种方法 从细胞和分子水平进行死亡时间推断的相关性研究，为死亡时间的推断开辟了一 条新的途径。 d n a 作为生物细胞核中较为稳定的遗传活性物质，具有相当的保守性，同一物 种不同个体组织细胞d n a 含量是恒定的“帅剐1 劬。机体死亡后，组织细胞失去生活 功能，细胞内各种酶类获得释放，逐渐降解组织蛋白质和核酸等高分子化合物以 及糖蛋白、糖脂等复合物，组织细胞结构破坏。在该过程中，胞核染色质凝聚、 核碎裂，最后溶解消失，而在脱氧核糖核酸酶( d e o x y r i b o n u c l e a s e s ，d n a s e ) 的 作用下刀，双螺旋结构的d n a 发生崩解，降解为d n a 碎片。d n a 碎片因核膜的破裂 分散在胞浆中，最后染色质中残余蛋白质被溶蛋白酶溶解，核便完全消失。故死 后一段时间，细胞核d n a 会发生降解、减少，直至消失“小州，即细胞核d n a 含 量随着死亡时间的延长呈现下降趋势。自上个世纪7 0 年代初以来，国内外法医工 作者应用各种方法如流式细胞术( f l o wc y t o m y t e r ，f c m ) 伽乜1 1 蚴、分光光度计度 量法旧、图像分析技术嘲剀等研究了死后细胞核d n a 含量变化与p m i 的关系，结果 表明随着p m i 的增加，细胞核d n a 含量呈规律性减少，认为研究细胞核d n a 死后 变化规律对p m i 推断具有重要的意义，不仅可以拓宽p m i 推断研究的思路，也可 以发展成为一种薪的、实用的p m i 推断方法。 彗星试验( c o m e ta s s a y ) ，又称单细胞凝胶电泳( s i n g l ec e l lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s c g e ) 或微凝胶电泳( m i c r o g e le l e c t r o p h o r e s i s ) ，是由o s y l i n g 和j o h a n s o n 哺1 于1 9 8 4 年建立的一种在单细胞水平上检测细胞核d n a 损伤的评估方 法。1 9 8 8 年s i n g h 伽等人建立了碱性单细胞凝胶电泳( a l k a l is i n g l ec e l lg e l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 e l e c t r o p h o r e s i s ，a s c g e ) ，极大地提高了彗星试验的检测灵敏度、拓宽了该方法 技术的应用范围。经过不断的改进、试验拓展研究，彗星试验目前不仅是遗传毒 理学中检测细胞d n a 损伤的经典方法，而且还广泛应用于相应的各个领域如放射 生物学、环境生物监测、基因毒性检测、分子流行病乜力等。该方法通过观察凝 胶中单个细胞核d n a 电泳特征直接分析核d n a 的降解程度，降解的d n a 断片在电 场中向正极移动，经染色呈现出形似“彗星”样的图像，彗星尾部的光密度代表 降解为d n a 片断的量，尾长度则与降解为d n a 碎片的大小有关。通过测定d n a 迁 移部分的光密度和迁移距离可以推定d n a 的损伤程度。本实验应用改良彗星试验 技术对自然室温下( 1 5 2 0 ) 兔死后肝细胞核d n a 降解情况进行了研究。 本实验最早出现彗星图像是在死后3 h ，说明兔死后小于3 h 肝细胞核d n 在自 溶作用下已经开始了降解过程，这与齐凤英嘲等应用流式细胞仪研究的结果有一 定差别，他们实验发现死后肝细胞核d n a 在o - 6 h 无明显变化；在死后0 - 1 8 h ，彗 星图像逐渐变得明显，这说明降解是一个渐进的过程，t l 、t m 值在该时段呈现逐 渐增大的趋势，说明d n a 碎片逐渐增多，同时碎片也在逐渐减小；而死后1 8 2 1 h ， t l 、t m 却发生了转折，出现了下降，这一结果与o l i v e 矧研究报道不同，o l i v e 认 为，d n a 片段在电流作用下泳动一段距离后，t l 会出现一个平台期，而t m 则会随 着尾部片段的增多、荧光密度的增加而继续增大，分析原因，可能因为o l i v e 等 总结的t l 、t m 的变化规律是建立在遗传毒理学实验基础上的，使用的是链断裂剂 对活细胞进行作用。这与死后组织细胞的自溶过程中酶的作用促使d n a 链发生断 裂降解有所不同，酶作用是一个持续过程，这就决定了d n a 降解是一个渐进过程， 因此，在此时间段，可能一些d n a 断片因酶降解作用已发生了完全降解消失，从 而导致尾部总d n a 片段的减少，表现出t l 、t m 值的减小。死后2 1 2 7 ht l 、t m 值 的变化不显著，这可能与脱氧核糖核酸酶的活性丧失有关。为了更好地体现d n a 降解与死亡时间的相关性，本实验在死后的3 - 1 8 h 内对每个指标的测定值与死亡 时间进行了相关回归分析，得出直线回归方程( 见表6 ) ，发现实验数据与方程拟 合系数较高，相关性较好，提示死后肝细胞核d n a 降解与死亡时间紧密相关，二 者几乎呈现直线正相关关系。本实验首次得出应用s c g e 检测兔死后3 - 1 8 h 肝细胞 核d n a 含量变化推断p m i 的直线回归方程，为以后该方面的研究提供了一定参考 价值。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 多方面研究认为彗星试验检测d n a 的损伤非常敏感，每1 0 9 道尔顿中0 1 个d n a 的断裂都能被检测出来嘲。本实验在兔死后3 h 的肝脏组织样本电泳图像上就出现 了彗星拖尾现象，且拖尾率达到9 8 ，明显高于何远咖等应用传统s c g e 检测所得 到结果，然而齐凤英踟等用流式细胞仪检测大鼠死后各组织细胞d n a 含量时，发 现o _ - 6 h 肝细胞核d n a 含量无明显改变，涂彬。”等用显微分光光度计定量测定2 0 时大鼠肝细胞核d n a 平均含量时，发现o - 6 h 内肝细胞核d n a 含量无显著性变化； 林乐泉嘲1 等用图像分析法研究大鼠死后肝细胞核d n a 含量时，发现在死亡最初的 3 h 内，变化较小，几乎呈平台现象。而本实验表明了在死后兔肝细胞核内总d n a 含量减少之前，d n a 就已经发生了降解变化，经本实验改良的方法检出率较传统 s c g e 灵敏，上述其它方法均不能灵敏地对其检测，经改良s c g e 则可直接地、灵敏 地检测d n a 分子的降解成分，其灵敏性明显高于其他检测方法，说明经改良s c g e 在检测肝细胞核d n a 损伤方面较其它方法更具有明显的优势，是研究死后细胞核 d n a 含量变化与p m i 关系的一种较好的方法技术。改良s c g e 可望成为一种较为准 确客观的推断早期死亡时间的更为灵敏的方法技术。 本实验另一个值得注意的关键点在于对实验过程的部分改良，( 1 ) 选择在碱 性液体中保持稳定的材料作为凝胶体的载体，有效防止了载胶片与碱作用发生的 脱胶问题，同时材料自然凹槽对制胶带来了方便，并对凝胶体起到保护作用，显 著减少了盖玻片揭取推移带来的损坏脱落作用，( 2 ) 单层灌胶减轻了传统方法铺 胶的繁琐程度，从而大大节省了实验时间，( 3 ) 清洗和中和过程均进行1 次性浸 没清洗和中和较以往多次滴注法更为简洁省时，( 4 ) 在进出液体过程中，均先放 入载胶片或吸干液体再倒入液体或取出载胶片，大大减少了液体表面张力对凝胶 体脱落的促进作用。以上改进方法提高了彗星试验制胶成功率，保证实验的顺利 进行，同时使实验步骤得以简化，缩短了实验时间，提高了实验效率，为该方法 的规范和推广打下了良好的基础。 当然，本研究只是对一定环境条件下的动物肝细胞核d n a 降解进行了分析研 究，但法医学实践中的环境因素迥异，特别是温度差异可能对d n a 的降解速率产 生显著影响，因此在以后的研究中将予以关注，并将从动物实验研究进展到人体 死后肝细胞核d n a 含量变化的研究，不断积累，并分析各种环境因素下( 特别是 不同温度条件下) 不同p m i 对应的肝细胞核d n a 含量变化数据，以及二者的相关 重庆医科大学硕士研究生学位论文 性，为早期死亡时间的客观准确推断提供科学依据，从而不断完善早期死亡时间 推断方法。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 结论 通过实验研究本文作者认为，死后早期时间肝细胞核d n a 含量的改变与p m i 紧密相关，检测死后肝细胞d n a 含量的变化进行法医学死亡时间推断将是一个重 要的方法，其结果更为准确可靠，特别是对早期死亡时问的推断更有价值。 改良彗星试验操作更简单、快速、灵敏、经济，实验效能明显提高，是检测 d n a 变化的一种良好的方法技术。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 参考文献 1 丛峰松主编生物化学实验 m 上海：上海交通大学出版社，2 0 0 5 ，4 7 - 4 8 2 李凡，刘永茂主编基础医学实验教程 m 北京：高等教育出版社，2 0 0 2 ， 2 0 4 - 2 0 6 3 t i c er r ，a g u r e l le ，a n d e r s o nd ，e t a l s i n g l ec e l lg e l c o m e ta s s a y ： g u i d e l i n e f o ri nv i t r oa n di nv i v o g e n e t i ct o x i c o l o g y t e s t i n g j e n v i r o nm o lm u t a g e n ，2 0 0 0 ，3 5 ( 3 ) ：2 0 6 - 2 2 1 4 s i n g hn p , m c c o ym t ，t i c er r ，e t a l as i n g l et e c h n i q u ef o rq u a n t i f i c a t i o n o fl o wl e v e lo fd n ad a m a g ei ni n d i v i d u a l j e x pc e l lr e s ，1 9 8 8 ，1 7 5 ( 1 ) ： 1 8 4 - 1 9 1 5 b o w d e nr d ，b u c k w a l t e rm r ，m c b r i d ej f , e t a l t a i lp r o f i l e ：am o r ea c c u r a t e s y s t e mf o ra n a l y z i n gd n ad a m a g eu s i n gt h ec o m e ta s s a y j m u t a t r e s ，2 0 0 3 ，5 3 7 ：1 6 a d l e rc p ，b e c k h o v ep p o s t m o r t e md n ac h a n g e si nh e a r tm u s c l e j b e i t r p a t h o l ，1 9 7 1 ，1 4 2 ( 3 ) ：3 0 6 3 2 0 7 a t m a d j ad s ，t a t s u n oy ，u e n oy ，e t a l t h ee f f e c to fe x t r a c t i o nm e t h o d t h ek i n do fo r g a ns a m p l e sa n dt h