（内科学专业论文）青蒿琥酯对k562细胞中sfrps家庭表达的影响.pdf

目录 i i i i ii ii i ii i i i iii t liiil y 19 012 71 中文摘要o o oooo qooooooio 1 英文摘要o o 000 3 研究论文青蒿琥酯对k 5 6 2 细胞中s f r p s 家族表达的影响 前言一6月i j 舌”一一”“”“”“ 材料与方法o goooo 7 结果一o i oooooooo o o ooo 一1 7 附图o ooooo 1 9 附表2 2 讨论2 4 结论- 0 oooo0 3 0 参考文献0 oooo0 ooo o oo 3 0 综述s f r p s 家族甲基化在肿瘤发生中的作用3 4 致i 身 4 9 个人简历m a0ooo oooooo 0 0oboo 5 0 中文摘要 青蒿琥酯对k 5 6 2 细胞中s f r p s 家族表达的影响 摘要 目的：研究证明w n t 信号通路的异常活化与肿瘤的发生发展密切相 关。细胞表面卷曲蛋白( f r i z z l e d ，f z d ) 是w n t 通路的特异性受体，通过p 连环蛋( a ( 1 3 c a t e n i n ) 激活其下游的一系列信号来刺激肿瘤细胞的生长。分 泌型卷曲相关蛋( j ( s e c r e t e df r i z z l e d r e l a t e dp r o t e i n s ，s f r p s ) 是w n t 通路的 主要拮抗因子，通过与f z d 受体竞争结合w n t 蛋白而抑s g w m 通路的进行。 最近研究发现s f r p s 家族在多种肿瘤细胞中呈现低表达，与肿瘤细胞中s f 印s 基因启动子发生甲基化密切相关。d n a 甲基化转移酶( d n am e t h y l t r a n s f e r a s e s ，d n m t s ) 是参与d n a 甲基化过程的关键酶，d n m t s 基因高表达 可能促使某些抑癌基因启动子区发生甲基化使其转录失活，促进肿瘤的发 生。青蒿琥酯( a r t e s u n a t e ，a r t ) 是青蒿素的衍生物，是治疗疟疾的特效药， 近年的研究表明青蒿琥酯还具有抗多种肿瘤细胞的作用。本实验通过用青 蒿琥酯处理k 5 6 2 细胞，研究s f r p s 家族、d n m t s 家族基因的表达水平及 经典w n t 通路中p - c a t e n i n 蛋白的表达水平，进一步研究青蒿琥酯抑$ i j k 5 6 2 细胞增殖的机制。 方法：利用m t t 法检测不同浓度的青蒿琥酯对k 5 6 2 细胞的增殖抑制 作用；利用a n n e x i n v p i 双染及流式细胞术检测青蒿琥酯处理k 5 6 2 细胞4 8 h 的凋亡率及细胞周期的变化；用r t - p c r 法检测不同浓度的青蒿琥酯( 0 、4 、 1 0 、2 0 、4 0 9 9 m 1 ) 处l 里k 5 6 2 细胞4 8 h 对s f r p l 、s f r p 2 、s f r p 4 矛l d n m t l 、d n m t 3 a 、 d n m t 3 b 的m r n a 市n 对表达水平，用w e s t e r nb l o t t i n g 法检测p c a t e n i n 蛋白的 表达水平。 结果： 1 青蒿琥酯可显著抑$ 1 j k 5 6 2 细胞增殖，诱导细胞发生凋亡。a r t 作 用4 8 时，终浓度4 9 9 m l 的a r t 对k 5 6 2 细胞的生长抑制率达5 4 2 9 ，1 0 9 9 m l 的a r t 对k 5 6 2 细胞的生长抑制率达5 8 0 3 ，与4 9 9 m l 组比较抑制率增加 ( p 0 0 5 ) ；2 0 9 9 m l 的a r t 对k 5 6 2 细胞的生长抑制率达6 9 3 3 ，与前述各 组相比，抑制率明显增强( p 0 0 5 ) ；终浓度4 0 一m l 的a r t 对k 5 6 2 细胞的 生长抑制率达7 7 9 8 ，与其余各组相比，抑制率显著增加( p 0 0 5 ) 。 中文摘要 2 不同浓度a r t 处理k 5 6 2 细胞4 8d 时后，4 9 9 m l 组k 5 6 2 细胞凋亡率 达1 5 8 7 + 2 4 8 ，与0 9 9 m l 组比较凋亡率增高( p 0 0 5 ) ；1 0 9 9 m l 组k 5 6 2 细 胞凋亡率达2 1 9 0 + 2 2 9 ，与4 9 9 m l 组比较凋亡率增高( p 0 0 5 ) ；4 0 1 a g m l 组k 5 6 2 细胞凋亡率达4 9 4 7 + 5 0 8 ，明显高于其他组( p 0 0 5 ) 。 3 不同浓度a r t 处理k 5 6 2 细胞4 8 d , 时后收集各浓度组细胞，用流式 细胞仪检测各组细胞周期分布及处于细胞周期各阶段的细胞数，并对各浓 度组进行两两比较，发现随着药物浓度增加，g 2 m 期细胞数目明显增多 ( p 0 0 5 ) ，g o g 】+ s 期细胞减少。 4a r t 处理k 5 6 2 细胞4 8 小时后，用r t - p c r 法检测0 、4 、1 0 、2 0 、 4 0 9 9 m l 浓度组s f r p l 、s f r p 2 、s f r p 4 及d n m t l 、d n m t 3 a 、d n m t 3 b 的m r n a 相对表达水平，结果提示s f r p s 家族中s f r p l 、s f r p 2 、s f r p 4 的m r n a 表 达水平呈升高趋势，d n m t l 、d n m t 3 a 、d n m t 3 b 的m r n a 表达水平呈下降趋 势。w e s t e mb l o t 显示，1 3 - c a t e n i n 蛋白的表达水平呈浓度依赖性降低 ( p 0 0 5 ) 。 结论：青蒿琥酯处理k 5 6 2 细胞后，s f r p s 家族m r n a 水平表达增 加，d n m t s 家族m r n a 水平表达减低，推测青蒿琥酯可能通过抑制k 5 6 2 细胞d n m t s 家族的表达，发挥去甲基化作用，使s f r p s 基因启动子甲基 化程度降低，使s f r p s 表达增加，与f z d 受体竞争结合w n t 蛋白，抑制 了经典w n t 通路的持续激活，进而使1 3 - c a t e n i n 表达下降，可能是青蒿琥 酯抑制k 5 6 2 细胞增殖的机制之一。本实验为青蒿琥酯治疗白血病提供了 新的理论依据。 关键词：青蒿琥酯；k 5 6 2 细胞；w n t 通路；s f r p s 家族；1 3 - c a t e n i m d n m t s 家族 英文摘要 s f r p sf a m i l yi n v o v l e di ng r o w t hi n h i b i t i o no fk 5 6 2c e l l s i n d u c e db ya r t e s u n a t e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：s t u d i e sh a v es h o w nt h a ta b n o r m a la c t i v a t i o no fw n ts i g n a l i n g p a t h w a ya n d i sc l o s e l yr e l a t e dt ot u m o rg e n e s i s c e l ls u r f a c ec o i lp r o t e i n ( f r i z z l e d ，f z d ) i sas p e c i f i cr e c e p t o rf o rw n tp a t h w a y t oa c t i v a t ei t sd o w n s t r e a ms i g - n a l i n gt h r o u g h1 3 - c a t e n i nt os t i m u l a t et h eg r o w t ho f ar a n g eo ft u m o rc e l l s s e c r e t e df r i z z l e dr e l a t e dp r o t e i n s ( s f r p s ) i st h em a i na n t a g o n i s to fw n t p a t h w a y ， a n df u n c t i o n st h r o u g hc o m p e t i n gw i t hf z dr e c e p t o rt ob i n dw i t hw n t p r o t e i n s t oi n h i b i tw n tp a t h w a y r e c e n ts t u d i e sh a v ef o u n dt h a ts f r p s f a m i l ym e m b e r e se x p r e s s e da tv e r yl o wl e v e l si nav a r i e t yo ft u m o rc e l l s ，w h i c hw a sc l o s e l y r e l a t e dt ot h em e t h y l a t i o no fs f r p sg e n ep r o m o t e r d n am e t h y l t r a n s f e r a s e ( d n m t s ) a r et h ek e ye n z y m e si n v o l v e di nt h ep r o c e s so fd n am e t h y l a t i o n ，w h i c hc a np r o m o t et h em e t h y l a t i o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n ep r o m o t e r sa n di n h i b i tt r a n s c r i p t i o no ft u m o rs u p p r e s s o rg e n e s ，a n ds u b s e q u e n t l yi n d u c et u m o rg e n e s i s a r t e s u n a t e ( a r t ) ，as e m i s y n t h e t i cd e r i v a t i v eo fa r t e m i s i n i n ，i sv e r ye f f e c t i v ei na n t i m a l a r i a r e c e n ts t u d i e sh a v es h o w nt h a tt oa r tc a ni n h i b i tt h eg r o w 一也o fs e v e r a lk i n d so ft u m o rc e l l s t oe v a l u a t et h eg r o w t hi n h i b i t i o ne f f e c to f a r t e s u n a t eo nk 56 2c e l l sa n di n v e s t i g a t et h ep o t e n t i a lm e c h a n i s m ，t h ee x p r e s s i o no fs f r p sf a m i l y ，d n m t sf a m i l ym r n aa n d1 3 - c a t e n i np r o t e i nw e r em e a s u r e d i nt h ep r e s e n ts t u d ya n dr e v e a l e dt h a ts f r p sf a m i l yw e r ei n v o l v e di nt h eg r o w t hi n h i b i t i o no fk 5 6 2c e l l si n d u c e db ya r t e s u n a t e m e t h o d s ：c y t o t o x i c i t y ，a p o p t o s i sr a t ea n dc e l lc y c l ed i s t r i b u t i o no fk 5 6 2 c e l l si n d u c e db ya r t ( 0 ，4 ，10 ，2 0 ，4 0 1 a g m 1 ) w e r em e a s u r e db ym t ta s s a ya n d b y f l o wc y t o m e t r y ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，p r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l so f1 3 一c a t e n i ni nk 56 2c e l l sw e r ed e t e c t e db yw e s t e r nb l o t t h em r n ae x p r e s s i o nl e v e l s o fs f r p1 ，s f r p 2 ，s f r p 4a n dd n m t l ，d n m t 3 a ，d n m t 3 bi nk 5 6 2c e l l sw e r ee v a l u a t e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) r e s u i t s ： 3 英文摘要 1a r t e s u n a t es i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dp r o l i f e r a t i o na n di n d u c e da p o p t o s i so fk 56 2c e l l s a f t e rt r e a t e dw i t ha r tf o r4 8 h ，t h eg r o w t hi n h i b i t i o nr a t eo fk 5 6 2c e l l st r e a t e dw i t h4 p g m la r tw a s5 4 2 9 ，a n di nk 5 6 2c e l l st r e a t e dw i t h 10 9 9 m la r tw a s5 8 0 3 ，w h i c hw a s s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n th i g h e rt h a ni n4 p m la r tg r o u p ( p 0 0 5 ) t h eg o w t hi n h i b i t i o nr a t ew a s 6 9 3 3 i nk 5 6 2c e l l st r e a t e dw i t h2 0 9 9 m la r ta n dw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni nt h ef o r m e rt - h r e eg r o u p s ( p 0 0 5 ) ，a n d7 7 9 8 i nk 5 6 2c e l l st r e a t e dw i t h4 0 9 9 m la r t ，w h - i c hw a st h eh i g h e s to n ea m o n gt h ef i v eg r o u p s ( p 0 0 5 ) 2a f t e rk 5 6 2c e l l sh a db e e nt r e a t e dw i t ha r ta td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s f o r4 8h o u r s ，t h ea p o p t o s i sr a t eo fk 5 6 2c e l l sf r o m4 p g m la r t g r o u pw a s15 8 7 士2 4 8 ，i n c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a ti n0 k t g m la r tg r o u p ( p 0 0 5 ) ；t h ea p - o p t o s i sr a t eo f k 56 2c e l l sf r o m10 9 9 m la r t g r o u pw a s21 9 0 士2 2 9 ，i n c r e a - s e dc o m p a r e dw i t ht h a ti n4 9 9 m la r t g r o u p ( p o 0 5 ) ；t h ea p o p t o s i sr a t eo f k 5 6 2c e l l sw a s4 9 4 7 士5 0 8 i n4 0 9 9 m la r t g r o u p ，w h i c hw a s t h eh i g h e s to n ea m o n gt h ef i v eg o u p s ( p 0 0 5 ) 3r e s u l t sf r o mf l o wc y t o m e t r ya n a l y s i ss h o w e dt h a ta f t e rk 56 2c e l l sb e i n gt r e a t e df o r4 8h o u r sw i t ha r t a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ，c e l ln u m b e r si n g 2 mp h a s ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p o 0 5 ) ，w h i l et h ec e l ln u m b e r si ng o g ! + sp h a s ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r ，w h e nc o m p a r e d w i t ht h a to fc o n t r o lg r o u p 4r e s u l t sf r o mr t - p c r a s s a ys h o w e dt h a tt r e a t m e n tw i t ha r t a tt h ef i n - a lc o n c e n t r a t i o n so f0 ，4 ，10 ，2 0a n d4 0 9 m l ，t h er e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v e l so f s f r pl ，s f r p 2 ，s f r p 4m r n a i nk 5 6 2c e l l si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，w h i l et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fd n m t l ，d n m t 3 a ，d n m t 3 bm r n ad e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r - e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p r e s u l t sf r o mw e s t e r nb l o ts h o w e dt h a t1 3 - c a t e n i np r o t e i nl e v e l sd e c r e a s e di nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r ，w h e nc o m p a r e dw i t ht h a t o ft h ec o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ：a r t e s u n a t ei n c r e a s e dt h em r n a e x p r e s s i o no fs f r p sa n dd e c r e a s e dt h em r n a e x p r e s s i o no fd n m t si nk 5 6 2c e l l s ，i n d i c a t i n gt h a ta r t e s u n a t e c o u l di n h i b i t et h em r n a e x p r e s s i o no fd n m t sf a m i l ya n dm i n i m i z et h em e t h y l a t i o no fs f r p sg e n ep r o m o t e r t h e r e f o r e ，s f r p sc o u l di n h i b i tt h ef u n c t i o no f 4 英文摘要 w n tp a t h w a yb yc o m p e t i n gw i t hf z dr e c e p t o r st ob i n dw i t hw n t p r o t e i n s ，a n d d e c r e a s et h ee x p r e s s i o no f1 3 - c a t e n i ni nk 5 6 2c e l l s i tm a yb eo n eo ft h em e c h a 。n i s m si ni n h i b i t i n gp r o l i f e r a t i o no fk 5 6 2c e l l si n d u c e d b ya r t e s u n a t e t h er e s u - i t sf r o mt h i se x p e r i m e n tp r o v i d e san e wt h e o r e t i c a lb a s i sf o rc l i n i c a la p l i c a t i o no fa r t e s u n a t ei nl e u k e m i at r e a t m e n t k e yw o r d s ：a r t e s u n a t e ；k 56 2c e l l s ；w n tp a t h w a y ；s f r p sf a m i l y ； 1 3 - c a t e n i n ；d n m t sf a m i l y 5 研究论文 青蒿琥酯对k 5 6 2 细胞中s f r p s 家族表达的影响 - 屿! 苎 月日瞢 白血病是造血系统的恶性疾病，我国白血病发病率约3 0 4 0 10 万。在恶性肿瘤相关死亡率中，白血病在男性中居第6 位，在女性中 居第8 位，而在35 岁以下人群中居首位。小儿的恶性肿瘤中以白血病的 发病率最高。白血病的治疗以化疗为主，大部分患者可取得缓解，也可行 造血干细胞移植治疗，一部分患者可长期存活甚至治愈，但多数患者最终 因复发、难治而死亡。白血病的发生有多种机制参与，几乎涉及所有已知 的细胞信号通路。 近年大量的研究证明，w n t 信号通路的异常活化与肿瘤的发生发展密 切相关。w n t 基因是1 9 世纪8 0 年代在小鼠乳腺肿瘤中发现的一种能在细胞 间传递增殖和分化信号的癌基因，它能与细胞表面特异性受体卷曲蛋白 ( f r i z z l e d ，f z d ) 术h 结合，通过p 连环蛋白( p c a t e n i n ) 激活下游的一系列信号 来刺激肿瘤细胞的增殖。1 3 - c a t e n i n 是w m 信号通路的关键因子，它由胞浆 向胞核的转移被认为是w n t 通路激活后行使功能的标志。分泌型卷曲相关 蛋i 刍( s e c r e t e df r i z z l e d r e l a t e dp r o t e i n s ，s f r p s ) 是w n t 信号通路的主要拮抗 因子，s f r p s 家族与具有同源结构的f z d 受体竞争结合w n t 配体而抑$ 1 w n t 通路的进行，因此，s f r p s 家族在抵抗肿瘤发生中发挥重要作用。哺乳动 物中s f r p s 家族包括s f r p l 5 。最近研究发现s f r p s 家族在多种肿瘤细胞 中呈低表达，与肿瘤细胞中s 邱s 基因启动子甲基化密切相关 2 1 。d n a 甲基 化主要发生在c p g - - 核苷酸的胞嘧啶上。s 邱3 的启动子区不含c p g 结构， 因而不能被甲基化修饰。d n a 甲基化转移酶( d n am e t h y l t r a n s f e r a s e s ， d n m t s ) 是参与d n a 甲基化过程的关键酶，d n m t s 高表达可能促使某些抑 癌基因启动子区发生甲基化，使其转录失活，促进肿瘤的发生。 青蒿素是从中药黄花蒿中分离出的单体物质，是我国在世界上首先研 制成功的抗疟新药。青蒿琥酯( a r t e s u n a t e ，a r t ) 是青蒿素的衍生物，化学名 为二氢青蒿素1 0 伐琥珀酸单酯，具有良好的酯溶性和水溶性，抗疟活性 高，且长期使用不易产生耐药性。近年来国内外的学者对青蒿素及其衍生 物进行了大量研究，发现它们在体内外具有抗多种肿瘤细胞的作用。 研究论文 e f f e r t h 等【3 】研究了a r t 对白血病、结肠癌、乳腺癌、肺癌等5 5 种肿瘤细胞 株的作用，研究结果表明a r t 具有广谱抗肿瘤作用。 本实验用不同浓度的青蒿琥酯作用不同的时间处理慢性粒细胞白血 病细胞株k 5 6 2 细胞，观察青蒿琥酯对k 5 6 2 细胞的增殖抑制作用，检测 s f r p s 家族中s f r p l 、s f r p 2 、s f r p 4 ，d n m t s 家族中d n m t l 、d n m t 3 a 、d n m t 3 b 的m r n a 表达水平及w n t 信号通路中1 3 - c a t e n i n 蛋白的表达水平，初步探 讨青蒿琥酯抑制k 5 6 2 细胞过程中s f r p s 表达水平的变化与w n t 通路之 间的关系。本实验在前期实验的基础上进一步研究青蒿琥酯抑制k 5 6 2 细 胞增殖的机制，为青蒿琥酯治疗白血病提供新的实验依据。 1 材料 1 1 仪器 仪器名称与型号 d n a 扩增仪( p e 4 8 0 ) 紫外透射仪( u v - 2 0 0 0 ) 读胶仪( a l p h a i m a g e r l2 0 0 ) 酶标仪 电泳仪 水平电泳槽 垂直电泳槽 水浴式转膜电泳槽 普通光学显微镜 流式细胞仪 电子天平 恒温水浴箱( h x s h ) 8 0 低温冰箱 2 0 低温冰箱 4 低温冰箱 低温高速离心机 材料与方法 产地 美国p e 公司 上海天能公司 美国s t 公司 美国p e 公司 北京六一厂 北京六一厂 北京六一厂 北京六一厂 日本o l y m p u s 公司 美国b d 公司 德国m e t t l e r 公司 哈尔滨东联公司 日本s a n y o 公司 日本s a n y o 公司 青岛海尔公司 德国h e r a e u s 公司 研究论文 台式离心机( l a b o f u g e 4 0 0 ) 紫外可见分光光度计 c 0 2 恒温细胞培养箱 医用净化台 液氮生物容器3 5 升 血球计数板 2 4 及4 8 孔细胞培养板 一次性培养瓶 一次性1 5 m l ，5 0 m l 离心管 1 2 试剂 胎牛血清 r p m i 1 6 4 0 细胞培养基 青蒿琥酯 t r i z o l g o t a q g r e e nm a s t e rm i x ， a n n e x i nv - f i t c 凋亡检测试剂盒 d e p c 水 m m l v 逆转录酶 d n t p 随机引物 r n a s e r n a s i n 琼脂糖 g o l d v i e wi 型核酸染色剂 d n am a r k e r p v d f 膜 蛋白定量试剂盒 e c l 发光液 四甲基偶氮唑( m x t ) 二甲基亚砜( d m s o ) 细胞总蛋白提取试剂盒 德国h e r a e u s 公司 美国b i o r a d 公司 日本s a n y o 公司 北京半导体设备一厂 国产，上海 国产，上海 c o m i n gc o s t a r ，美国 c o m i n gc o s t a r ，美国 c o m i n gc o s t a r ，美国 杭州四季青公司 美国g i b c o 公司 桂林南药 北京赛百盛公司 美国p r o m e g a 公司 北京宝赛生物技术有限公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 北京赛百盛公司 北京赛百盛公司 华美生物工程公司 北京博奥森 美国m i l l i p o r e 公司 美国s o l a r b i o 公司 美国s i g m a 公司 北京普利莱 研究论文 丙烯酰胺美国s i g m a 公司 n ，n 甲叉双丙烯酰胺 美国s i g m a 公司 t w e e n 2 0北京赛百盛公司 e d t a 美国s i g m a 公司 t r i s 碱美国s i g m a 公司 十二烷基磺酸钠( s d s ) 德国s e r v a 公司 甘氨酸美国s i g m a 公司 t e m e d北京赛百盛公司 过硫酸铵( a p s ) 北京赛百盛公司 溴酚蓝北京赛百盛公司 蛋白预染m a r k e r北京赛百盛公司 小鼠抗人1 3 - c a t e n i n 单克隆抗体美国i n v i t r o g e n 公司 小鼠抗人g a p d h 单克隆抗体北京中衫金桥 h r p 标记山羊抗小鼠i g g 北京中山公司 其它试剂为国产分析纯产品 1 3 试剂配制方法 ( 1 ) 磷酸盐缓冲液( p b s ) 0 01 m o l ln a c l8 9 、k c l0 2 9 、n a 2 h p 0 4 。12 h 2 03 6 3 9 、k h 2 p 0 40 2 4 9 溶于双蒸水( d d h 2 0 ) 中，用l m o l lh c l 调p h 至7 4 加d d h 2 0 定容至1 l ， 高压灭菌2 0 m i n ，4 保存。 ( 2 ) m t t 液 用o 0 1 m o l lp b s 溶解m t t ，配制浓度5 m g m l ，抽滤灭菌，4 c 避光 保存。 ( 3 ) 1 0 s d s 液 1 0 9s d s 加于9 0 m ld d h 2 0 中，加热至6 84 c ，加d d h 2 0 定容至1 0 0 m l 。 ( 4 ) 10 a p s l ga p s 溶于1 0 m l 水中，4 c 避光保存。隔周新鲜配制。 f 5 ) 3 0 0 o 丙烯酰胺储存液 称取丙烯酰胺单体2 9 9 + n ，n 甲叉双丙烯酰胺1 9 ，溶于6 0 m l 水中， 加热至3 7 。c 溶解，再补加水至1 0 0 m l ，定性滤纸过滤后，棕色瓶4 c 保存 数月。 研究论文 ( 6 ) t e m e d 原液使用，4 。c 避光保存。注意室温较低时t e m e d 量可加倍，最后 灌胶之前再用。 ( 7 ) 5 t b e 电泳缓冲液 t r i s 5 4 9 ，e d t a 3 7 2 9 ，硼酸2 7 5 9 ，以d d w 定容至1 0 0 0 m l ，常温保 存。 ( 8 ) t r i s h c l 缓冲液( 1m p h 6 8 8 8 ) 先以少量d d w ( 3 0 0 - 5 0 0 m 1 ) 溶解t r i s l 2 1 1 4 9 ，再用浓盐酸( 3 6 ) 调p h 至6 8 或8 8 ，最后加d d w 至10 0 m l 。 ( 9 ) 上样缓冲液( 5x l o a d i n gb u f f e r ) t r i s 0 5 6 9 ，甘油1 3 3 m l ，溴酚蓝6 6 6 m g ，s d s 2 9 溶于1 0 m l d d w 中 用h c l 调p h 至6 8 。取5 l o a d i n gb u f f e rl m l 入e p 管中，加3 0 0 “1 1 3 巯 基乙醇，4 保存。 ( 1 0 ) 5 电泳缓冲液 t r i s7 5 5 9 ，甘氨酸4 7 9 ，加水至5 0 0 m l 。 ( 1 1 ) 电泳工作液 5 电泳缓冲液1 9 0 m l ，1 0 s d s l o m l ，d d w 定容至1 0 0 0 m l ，4 。c 保存。 ( 1 2 ) 1 0 转膜缓冲液 甘氨酸1 4 5 9 ，t r i s 2 9 9 ，s d s1 8 5 9 ，加d d w 至5 0 0 m l 。 ( 1 3 ) 1 转膜工作液 1 0 转膜工作液1 0 0 m l ，甲醇2 0 0 m l ，加d d w 至1 0 0 0 m l 。 ( 1 4 ) t p b s 配制 p b s5 0 0 m l 中加入t w e e n 2 02 5 0 u l 。 ( 15 ) p i 液 以p b s 缓冲液配成5 0 u g m l 溶液，4 。c 避光保存。 ( 16 ) r n a 酶 用d d w 将1 0 x r n a s e a 溶解缓冲液按1 ：1 0 稀释后，将r n a s e a 粉末溶 于上述配置的1x r n a s e a 溶解缓冲液中，使其终浓度为10 m g m l ，在10 0 。c 中煮沸15 m i n ，室温冷却，保存于2 0 低温冰箱中备用。使用时最终浓度为 1 0 m e d m l ，4 保存。 1 4 细胞系人慢性粒细胞白血病急性红白血病细胞系：k 5 6 2 细胞系，为本 1 0 研究论文 实验室长期保存细胞系。 2 实验方法 2 1 细胞复苏 液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入3 7 。c 水浴箱中，并左右晃动， 使细胞尽快解冻。解冻后用7 5 酒精擦拭消毒冻存管后，在无菌净化台 上打开冻存管，吸出细胞悬液，移入离心管中，再补加1 0 m lr p m i1 6 4 0 培养液，吹打使细胞悬浮，低速离一l 二, ( 1 0 0 0 r p m ) 5 分钟，弃上清后将细胞沉 淀加入培养液，移入培养瓶中，置3 7 。c 温箱培养，第二天更换一次培养 液后继续培养。 2 2 细胞培养 细胞株培养对数生长期k 5 6 2 细胞采用含有1 0 胎牛血清、青霉素 1 0 0 u m l 、链霉素1 0 0 p g m l 的r p m i1 6 4 0 培养基，将k 5 6 2 细胞株置于3 7 ， 5 c 0 2 培养箱，饱和湿度环境下培养，待长满8 0 - - - 9 0 后传代。 2 3 m t t 法检测青蒿琥酯对k 5 6 2 细胞增殖抑制作用 ( 1 ) 试验分组：按青蒿琥酯的不同浓度将k 5 6 2 细胞分为五个组：0 p g m l 组( 对照组) 、4 p g m l 组、1 0 p g m l 组、2 0 p g m l 组、4 0 p g m l 组。实验重复 6 次。 ( 2 ) 取对数生长期k 5 6 2 细胞，用含1o 胎牛血清的1 6 4 0 培养液配成 单个细胞悬液，调整细胞密度为1x 1 0 5 m l ，接种于9 6 孔培养板中。每孔 加细胞悬液及不同浓度的a r t 共2 0 0 1 ，使青蒿琥酯终浓度分别为 o g m l 、4 p g m l 、1 0 p g m l 、2 0 p m l 、4 0 p g m l 。每组设3 个复孔，并设与 试验孔平行的不加细胞只加培养液的空白孔。将培养板放入3 70 c ，5 c 0 2 培养箱中培养不同时间。 ( 3 ) 分别在不同浓度组各孔中加入2 0 p lm t t 溶液( 5 m g m 1 ) ，3 7 继 续培养4 h 后终止培养。1 0 0 0 r p m ，离心10 m i n ，然后弃去孔内培养液，每 孔加入2 0 0 p ld m s o ，振荡仪振荡1 0 m i n ，充分溶解结晶物。以空白孔调 零，酶标仪测5 4 0 n m 处吸光度a 值，计算增殖抑制率。 ( 4 ) 抑制率公式：抑制率( ) = ( 1 试验孔a 5 4 0 对照孔a 5 4 0 ) x 1 0 0 。 2 4 a n n e x i n v p i 双染及流式细胞仪检测细胞凋亡率 ( 1 ) 取对数生长期k 5 6 2 细胞，用含1 0 胎牛血清的1 6 4 0 培养液调细胞 浓度为l x l 0 5 m l 。将细胞接种于1 2 孔培养板中，每孔加细胞悬液及不同浓 研究论文 度的a r t 共2 m l 。同时设5 个组，每组a r t 浓度分别为0 、4 、1 0 、2 0 、4 0 9 9 m l 。 将培养板置于3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱中培养4 8 h 。 ( 2 ) 1 0 0 0 r m p ，离心1 0m i n 收集细胞，再用4 。c 预冷的p b s 洗2 次， 每次1 0 0 0 r m p ，离心1 0 m i n 。 ( 3 ) 加入2 0 0 p , 1 的b i n d i n gb u f f e r 悬浮细胞。 ( 4 ) 加入1 0 1 a la n n e x i nv f i t c 混匀后，避光室温反应1 5 m i n ；再加入 3 0 0 i _ t l 的b i n d i n gb u f f e r 和5 “lp i ，混匀。 ( 5 ) 在l 小时内，用流式细胞仪检测，计数1 0 4 个细胞，分析细胞凋亡率。 2 5p i 染色流式细胞仪检测细胞周期分布 ( 1 ) 取对数生长期的k 5 6 2 细胞以1 1 0 5 m l 的密度接种于1 2 孔板上，每 孔加入细胞悬液及不同浓度的青蒿琥酯共2 m l ，共设4 个组( o 、1 0 、2 0 、 4 0 i - t g m 1 ) ，每组设3 个复孔。 ( 2 ) 在3 7 。c 、5 c 0 2 培养箱中培养4 8 h 后用p b s 离心收集细胞，用4 c 预 冷的7 0 乙醇固定1 h 。 ( 3 ) 离心弃固定液，用p b s 洗涤细胞2 次后用p b s 将细胞悬浮，加入5 p l r n a 酶3 7 水浴3 0 m i n ，之后加入8 0 0 1 a lp i 液混匀，40 c 放置3 0 m i n 。 ( 4 ) 流式细胞仪检测不同细胞周期( g o g i 期、s 期、g 2 m 期) 细胞分布。 2 6 反转录p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r ，r t - p c r ) 检测 2 6 1 细胞收集 分别收集a r t0 、4 、1 0 、2 0 、4 0 i ，t g m l 作用4 8 h 后的k 5 6 2 细胞，以a r t 0 t g m l 组作空白对照。 2 6 2 细胞总r n a 的提取和质量检测 ( 1 ) 用t r i z o l 提取细胞总r n a 。在约有5 1 0 x 10 6 个单个核细胞的 e p p e n d o r 借中加入l m lt r i z o l ，反复抽提，使细胞充分裂解。冰浴静置5 1 0 分钟。 ( 2 ) 加入2 0 0 i - d - - 氯甲烷( 1 4 8 9 m 1 ) ，剧烈震荡1 5 秒，冰浴静置5