（动物营养与饲料科学专业论文）中国鲎鲎素Ⅰ抗肿瘤与免疫活性研究.pdf

中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究摘要中国鲎鲎素i ( t a c h y p l e s i n - l ，简称t - s s ) 是从古老的海洋生物中国鲎( t a c h y p i e u st r i d e n t a t u s ，c h i n e s eh o r s e s h o ec r a b ) 血细胞中分离纯化的一种小分子多肽。现已证实t - s s具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。在前人工作的基础上，对t - s s 体内外抗肿瘤活性进行了探讨，并对t - s s 体内抗肿瘤实验中的抗肿瘤免疫活性和t - s s 对正常小鼠与免疫抑制小鼠的免疫活性作了研究。1 、t - s s 体外对肿瘤细胞的生长抑制：选用人肝癌细胞系b e l - 7 4 0 2 和人宫颈癌细胞系h e l a 细胞，应用m t t 方法检测t - s s 对这两种细胞的体外生长抑制作用。t - s s 对b e l - 7 4 0 2 和h e l a 细胞的半数抑制浓度i c 5 0 分别为6 2 5 z g m l 和5 2 6 m g m l 。t - s s 对b e l - 7 4 0 2 和h e l a 细胞生长抑制率最高为6 2 7 6 和6 5 4 6 ，相应的t - s s 浓度分别为1 0 弘t g m l 和8 肛g m l 。说明t - s s 对b e l - 7 4 0 2 和h e l a 细胞体外生长具有一定的抑制作用。2 、t - s s 体内的抗肿瘤作用：分别建立小鼠移植肉瘤s l 鼬与小鼠移植腹水型肝癌h 2 2模型，对荷瘤小鼠的瘤重和生存时间作了研究。用免疫器官重量法、病理组织学方法、白细胞计数法、m t r 方法、碳粒廓清法对荷瘤小鼠胸腺指数、脾脏指数、免疫器官形态学变化、外周血白细胞数、脾脏t 淋巴细胞增殖反应、单核细胞吞噬活性等进行了测定。剂量为o 1 5 m g k g 的t - s s 对小鼠肉瘤s z s o 瘤重抑制率为6 7 8 ，对小鼠腹水型肝癌h 2 2 的生命延长率为6 2 9 6 ，其余t - s s 剂量组的相应指标低于o 1 5 m g k g 组。剂量为o 1 5 m g k g 或o 6 m g k g 的t - s s 抗肿瘤免疫指标整体上相对较好。从而说明，t - s s 对小鼠肉瘤s 1 踮和小鼠腹水型肝癌h 2 2 生长具有一定的抑制作用，t - s s 具有一定的体内抗肿瘤活性与抗肿瘤免疫活性。3 、t - s s 对小鼠免疫功能的调节：用c t x 建立小鼠免疫抑制模型，研究了t - s s 对正常小鼠与免疫抑制小鼠的免疫功能的调节作用。免疫指标的测定方法同体内抗肿瘤试验。剂量为0 1 5 m g k g 或0 6 m g k gt - s s 各种免疫指标整体上相对较好。剂量为0 6 m g 瓜g的t - s s 对免疫抑制小鼠具有一定的免疫调节作用，但不足以恢复至正常水平。说明t - s s对小鼠具有一定的免疫调节作用。上述结果表明t - s s 具有定的抗肿瘤活性、抗肿瘤免疫活性与免疫活性。关键词：中国鲎鲎素i ；肿瘤细胞；抑制；免疫活性a n t i t u m o ra c t i v i t ya n di m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t o ft a c h y p l e s i n if r o m c 日m p l e 【，st r i d e n t a t u s ( c h i n e s eh o r s e s h o ec r a b )m s c a n d i d a t e ：z h a op e n ga d v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gs h i c h a n gc o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , g u a n g x iu n i v e r s i t yn a n n i n g5 3 0 0 0 5 ，p r c h i n aa bs t r a c tt a c h y p l e s i n i ( t - s s ) ，ac a t i o n i cp e p t i d ec o n s i s t i n go f1 7r e s i d u e s ，w a si s o l a t e df r o ma c i de x t r a c t so fh o r s e s h o ec r a b ( t a c h y p l e u st r i d e n t a t u s ，c h i n e s eh o r s e s h o ec r a b ) h e m o c y t ed e b r i s t - s sa c t sa sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e i th a sas t r o n ga n t i m i c r o b i a le f f e c to nt h eg r o w t ho fg r a m n e g a t i v er t y p eb a c t e r i aa n ds h o w sa n t i v i m sa n da n t i t u m o ra c t i v i t y i nt h i ss t u d y , t h ec h a r a c t e ro fa n t i t u m o ra c t i v i t yo ft - s s nv i v oa n d nv i t r ow a sa n a l y z e d t h ea n t i t u m o ri m m u n i t ya c t i v i t ya g a i n s ts a r c o m a18 0i nm i c e ，i m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c ti nn o r m a la n di m m u n o s u p p r e s s i v em i c e w e r es t u d i e d 1 t h eg r o w t hi n h i b i t i o nr a t eo fb e l - 7 4 0 2c e l l sa n dh e l ac e l l s nv i t r oi nr e s p o n s et ot - s st r e a t m e n tf o r4 8 hw a sd e t e r m i n e du s i n gm t rm e t h o d t h ec e l lv i a b i l i t ya f t e rt r e a t m e n to ft - s sw a sd e c r e a s e d t h e5 0 i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n o fb e l - 7 4 0 2a n dh e l ac e l l st ot - s sw a s6 2 5 t g m l5 2 6 t g m lr e s p e c t i v e l y s i m i l a r l y , t h ec e l li n h i b i t i o nr a t eo fb e l 一7 4 0 2a n dc e l l si n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t hi n c r e m e n to ft - s sc o n c e n t r a t i o n ，f r o m1 7 6 2 a tt - s sc o n c e n t r a t i o no f 犁血t o6 2 7 6 a tl o 卫g m 1 t h ec e l li n h i b i t i o nr a t e so fh e l ac e l l sa l s oi n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t hi n c r e m e n to ft - s sc o n c e n t r a t i o nf r o m2 1 8 5 a tt - s sc o n c e n t r a t i o no f 犁幽 1 1 lt o6 5 4 6 c o n c e n t r a t i o na b o v e 跏g m l ，t h ei n h i b i t i o nr a t ed i dn o te x h i b i tf u r t h e ri n c r e a s e 2 t h ea n t i t u m o re f f e c ta n da n t i t u m o ri m m u n i t ya c t i v i t yo ft - s sw e r ee v a l u a t e di nk u n m i nm i c eb e a r i n gs a r c o m as - 18 0a n da s c i t i cf l u i d t y p eh e p a t o c a r c i n o m ah 一2 2i m p l a n t e dt u m o r t h et h y m u si n d e xa n ds p l e e ni n d e xw e r ec o u n t e db yi m m u n eo r g a nw e i g h t i n gm e t h o d t h em o r p h o l o g yo ft h y m u sa n ds p l e e nw e r ee x a m i n e du n d e rl i g h tm i c r o s c o p e t h es p l e e ntl y m p h o c y t er e p r o d u c t i v ea c t i v i t yi n d u c e db yc o naw a sd e t e c t e db ym t fm e t h o d c a r b o nc l e a r a n c et e s tw a su s e dt oa n a l y s i st h ep h a g o c y t o s i so fm o n o c y t e s w h i t eb l o o dc e l lc o u n tw a sc a l c u l a t e dw i t hc y t o m e t r y t - s sg i v e nb yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h eg r o w t ho fs - 18 0s o l i dt u m o r , a n dt h ei n h i b i t i o nr a t er e a c h e dt o6 7 8 a to 1 5 m g k g h o w e v e r , t h ei n h i b i t i o nr a t ed e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e m e n to ft - s sc o n c e n t r a t i o n f u r t h e r m o r e i ts e e m st h a tt - s sm a yp r o m o t et h ei m m u n ef u n c t i o no ft h em i c eb e a r i n gs a r c o m a18 0 t o s sc a nm a r k e d l yp r o l o n gt h es u r v i v a lt i m eo fm i c eb e a r i n ga s c i t i cf l u i d - t y p eh e p a t o c a r c i n o m ah 一2 2 s i m i l a r l y , t h er a t eo fl i f ep r o l o n g a t i o nd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e m e n to ft - s sc o n c e n t r a t i o n 3 a ni m m u n o s u p p r e s s i v ea n i m a lm o d e li n d u c e db yc y c l o p h o s p h a m i d ei nm i c ew a se s t a b l i s h e dt oe s t i m a t et h ei m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c to ft o s s i nma d d i t i o n ，n o r m a lm i c ew e r eu s e dt oa n a l y s et h ee f f e c t t h em e t h o d su s e di nt h ee v a l u a t i o n o fa n t i t u m o ra n da n t i t u m o ri m m u n i t ya c t i v i t yo ft - s s nv i v oa n a l y z i n gt h ee f f e c tt h ea n t i t u m o ri m m u n i t ya c t i v i t yw e r eu s e dh e r e a l t h o u g ht - s sr e v e a l e di m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c to v e r a l la tt h ed o s eo fo 1 5 m g k ga n d0 6 m g k go nn o r m a la n di m m u n o s u p p r e s s i v em i c e ，t h ei m m u n ef u n c t i o nc o u l dn o tg e tb a c kt on o r m a ll e v e l sa tt h ed o s eo f0 6 m g k g a b o v ea l l ，t - s ss h o w e ds o m ei n h i b i t i v ee f f e c to nb e l - 7 4 0 2a n dh e l at u m o rc e l l s nv i t r o ，l i v i n gm u r i n es 一18 0a n dh 一2 2c e l l s nv i v o ，a n di t sm e c h a n i s mm a yb er e l a t e dt ot h ei n c r e a s eo fi m m u n ef u n c t i o na n dt ot h ec y t o t o x i ce f f e c t t h ei m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c to ft - s so nn o r m a la n di m m u n o s u p p r e s s i v em i c em a yt e s t i f yt h i s t - s ss h o w e da n t i t u m o ra c t i v i t y ,a n t i t u m o ri m m u n i t ya c t i v i t ya n di m m u o m o d u l a t o r ye f f e c t k e yw o r d s ：t a c h y p l e s i n i ，c a n c e rc e l l ，i n h i b i t i o n ，i m m u o m o d u l a t o r ye f f e c ti v广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：赵i 鸺赵i 鸺学位论文使用授权说明砷年i2 月多日本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：囱即时发布口解密后发布( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) ，论文作者签名：矗墨i j 陷导师签名：，- lq，年12 月乒日广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究文献综述2 1 世纪人类社会面临着“人口剧增、资源匮乏、环境恶化 三大问题的严峻挑战。随着陆地资源的日益减少，开发海洋资源变得日益迫切。海洋生物的生活环境与陆地生物有很大差异，海洋生物生活在高盐、高压、低温、低营养和有限光照等特殊的生态环境中，各种海洋生物依其特殊的结构和功能维持其生命活动。海洋生物的多样性、复杂性和特殊性使源于其中的海洋天然产物也具有多样性、复杂性和特殊性，这正为寻找海洋生物活性物质提供了丰富的物质来源【1 翻。海洋生物活性物质的研究与开发重点是具有抗病毒、抗肿瘤、抗心脑血管病、抗衰老和免疫调节等生理活性的物质。随着人类社会的发展、环境的变迁和科学技术的进步，人类疾病谱已发生明显变化，各种新老疑难病症正严重威胁着人类的生存和健康，而化学合成药物的副作用也日益成为人们关注的焦点。从天然产物中提取药物越来越受到大家的重视。2 0 世纪6 0 年代以来，从海洋动植物和微生物中已分离获得新型化合物1 0 0 0 0余种，其中1 2 以上具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血等药理活性【3 1 。这些新型化合物为新药设计提供了分子模型。7 0 年代末期，我国开始海洋生物活性物质和海洋药物的研究开发工作。近年来取得了一系列成果，发现数百种新化合物，并开发了数种海洋新药，有些已达到国际先进水平。我国第一个抗艾滋病一类新药是从海洋藻类提取分离后经分子修饰而得的海洋药物。海洋抗肿瘤天然产物在海洋药物研究中一直占据主导地位，不仅开展得最早而且具有扎实的研究基础。抗癌药物是将来新药研究开发的重点，现有的抗癌药物由于存在“敌我部分”、不良反应大的缺点，需要研究开发高效低毒的新型抗癌药物。许多学者预言，最有前途的抗癌药物将来自海洋。现已发现海洋生物提取物中至少有1 0 具有细胞毒活性，美国每年有1 5 0 0 个海洋化合物单体被分离出来，其中1 具抗肿瘤作用【4 】。随着海洋药物科学的发展，从海洋生物及其次级代谢产物中开发出高效、新颖的免疫调节剂。由于免疫调控十分复杂，一种药物在提高免疫功能的同时，有时也会抑制另一部分功能，目前将影响机体免疫功能的药物统称为免疫调节剂。海洋生物及其代谢产物中筛选免疫活性物质起步较晚。海洋生物中肽类是海洋生物中分离出的新型化合物中数量最庞大的一类化合物，达数万种之多【5 】o 天然海洋活性多肽是海洋生物活性物质研究的重要组成部分。生物活性多肽是具有特殊生理活性的肽类，按其来源可分为天然存在的活性肽、蛋白酶解活性肽广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究以及化学合成的活性肽【6 】o 这些海洋生物活性多肽作用有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗菌等。目前，国内外研究与开发的活性多肽主要来源于陆生动植物，如各种昆虫抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、两栖动物皮肤抗菌肽、牛乳中提取的具有免疫调节功能的活性肽、来自大豆的多肽等，而来源于海洋生物的活性肽非常少，但这决不意味着海洋生物活性肽资源缺乏，而是长久以来没有进行很好的开发。人体所必须的全部氨基酸都可以在海洋生物中提取到，而且含量极其丰富，因此海洋生物体内的各种活性物质，是开发研究海洋多肽药物与功能性保健食品的原料宝库【6 】。随着人们对海洋资源认识的提高，以及现代生物技术在海洋药物研究中的应用，使得人们对海洋活性肽的研究易于进行。相信在不久的将来，海洋生物活性多肽的开发将为人类战胜疾病，探索生命奥秘开辟新的道路。近年来，分离纯化和化合物结构分析鉴定技术的快速发展为海洋活性物质研究的发展提供了前提条件，而分子生物学、细胞生物学、生物信息学、功能基因组学、功能蛋白质组学等研究的介入，高效、方便、命中率高的活性筛选模型的应用，也极大地推动了海洋生物活性物质的研究。从海洋生物中获得的许多结构新颖、活性独特的生物活性物质，为获得全新结构的新药提供了宝贵的化合物来源；而各种技术如分子修饰技术、海洋生物技术在海洋药物开发方面的应用，为海洋药物的最终产业化提供了强有力的技术支持。我们有理由相信2 1 世纪我国海洋药物的研究与开发将有重大突破，海洋药业将成为我国国民经济中举足轻重的高新技术产业。1 海洋生物抗肿瘤多肽的研究由于海洋生物特定的生活环境，海洋生物抗肿瘤活性多肽与陆地动植物活性多肽在结构上有很大的不同，海洋抗肿瘤多肽多为小分子环肽。含有丰富的d 型氨基酸、羧基酸、新的q 一氨基酸与t 3 一氨基酸及噻酚，哑唑环。有的还含有烯键与炔键，这大大提高了多肽的生物稳定性及生物利用度用。1 1 来自海洋动植物的抗肿瘤多肽1 9 8 0 年美国学者c h r i si r e l a n d 等报道从海鞘l i s s o c l i n u m 即纪妇中分离得到第一个具有细胞毒活性的环肽u l i t h i a c y c l a m i d e ，它对白血病细胞l 1 2 1 0 的i c 5 0 为0 3 5 m g l 。从海参上皮组织中分离得到的由亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸组成的五肽( 其中个别氨基酸为d 一构型) ，相对分子量5 6 8 1 ，具有抗肿瘤活性。该多肽的人工合成品也证实了这一结果【8 】o r i n e h a r t 等从t r i d i d e m n u ms o l i d u m 中成功分离得到d i d e m n i n 系列环肽d i d e m n i n s ，2广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究并证实它们具有抗肿瘤、抗病毒活性。其良好的体外和体内生物活性使d i d e m n i n s 成为美国第一个进入抗肿瘤临床研究的海洋天然产物，其中d i d c m n i nb 的活性表现最强，它是一种由7 个氨基酸和2 个羧酸组成的带有分枝的环缩肽，它可快速完全介导h l - 6 0细胞凋亡。它既能抑制蛋白质的合成，也能抑制d n a 、r n a 的合成，对黑色素瘤b 1 6细胞周期作用的研究表明，它可杀伤各期细胞，尤以g l 至s 期细胞敏感。目前d i d e m i nb 已能够人工全合成，该药完成了临床i i 期实验，最有希望开发成治疗癌症的新药。此外，第二代d i d e m n i n s 脱氢d i d e m n i n sb ( a p l i d i n e ) 现也已进入临床实验1 9 1 。h a m a n n ，m t 1 0 j 1 】等从s a c o g l o s s a nm o l l u s ke l y s i ar u f e s c e n s 中分离得到6 种环状缩醛肽k a h a l a l i d e a f ，其中k a h a l a l i d ef 表现出极强的细胞毒性，它可以改变溶酶薄膜的作用，在体内可以导致癌细胞死亡，在体内可以区别肿瘤细胞与正常细胞，其杀死肿瘤细胞的作用，不是通过m r n a 或蛋白质结合，也不是通过蛋白酵素的活动。已经用于肝癌的治疗。从日本采集的蒂壳海绵( t h e o n e l l a 够) 中分离得到c y c l o t h e o na m i d e sa , c ，d ，e 、k o s h i k a m i d ea 1 、t h e o p e d e r i n sa e 。分别对凝血酶、胰蛋白酶有极强的抑制活性；对小鼠白血病p 3 8 8 有较强活性，i c 5 0 为2 犁g l ：对白血病细胞l 1 2 1 0 有强活性，i c 5 0 为1 3 2 4 g l 6 1 。从巴布亚新几内亚的海绵h a l i c l o n a n i g r a 提取物中含有两个环的六肽h a l i g r a m i d e sa - b ，在美国国家癌症研究所( n c i ) 进行的6 0 种肿瘤细胞系筛选实验中均表现出非同一般的敏感性【1 2 1 。e d l e r 等从d i d e m n u mc u c u l i f e r u m 和p o l y s y n c r a n t o nl i t h o s t r o t u m 中发现了一个含有1 3个氨基酸的双环肽v i t i l e v u a m i d e 。实验表明v i t i l e v u a m i d e 对人肿瘤细胞有细胞毒作用，l c 5 0 为6 - 3 1 1 n m o l l ，其微管蛋白聚合抑制剂的细胞筛选实验结果呈阳性。体内实验表明剂量为3 0 m g k g 时，v i t i l e v u a m i d e 对小鼠p 3 8 8 淋巴细胞白血病生命延长率可达7 0 。海鞘l i s s o c l i n u m p a t e l l a 中分离得到4 种新的环肽p a t e l l a m i d eg 和u l i t h i a c y c l a m i d e se g 。尽管海鞘中细胞毒性肽以环肽居多，但近年来也发现了有细胞毒活性的线性小肽，如：v i r e n a m i d e s a - c 等。二聚小肽e u s y n s t y e l a m i d e 对人结肠癌细胞株h c t - 1 1 6 有微弱的细胞毒活性【9 1 。m a l a y s i a t i n 是一种从太平洋婆罗洲海绵p s e u d a x l n y s s as p 中分离得到的环肽，它是第一个h o m o d e t i c 型的环七肽，肽环全部由q 氨基酸组成，它对p 3 8 8 、k b 细胞的抑制率分别达到8 2 和7 0 。从海绵g e o d i as p 中分离得到的环肽g e o d i a m o l i d ea 和g e o d i a m o l i d eb 也具有非常强的细胞毒作用。易杨华等【1 3 】从我国西沙群岛永兴岛的棕色3广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗胂瘤与免疫活性研究扁海绵( p h a k e l l i a f u s c a t h i e l e ) 醇提取物中获得1 个新的p h a k e l l i s t a t i n s 类环肽化合物c y c l o h e p t a p e p t i d e ( p r 0 1 g l y p h e p r 0 2 - t r p l e u - t h r ) 。该化合物具有抗有丝分裂活性和抗肿瘤活性，这是首次从产于我国海域的p h a k e u i a 属海绵动物中分离获得此类化合物。自1 9 7 6 年p e t t i t 小组首次从海兔中分离发现了环肽类抗肿瘤活性成分以来，人们已从印度洋、太平洋等海域的海兔( d o l a b e l l aa u r i c u l a r i a ) r 扣分离到1 8 个抗肿瘤活性肽d o l a s t a t i n1 1 8 。其中d o l a s t a t i n3 具有细胞毒活性，对小鼠p 3 8 8 淋巴细胞白血病，其e d 5 0 l x l 0 4 - l x l o 7 m g l ，d o l a s t a t i n1 3 能强烈地抑制p s 细胞的生长，其e d 5 0 值为o 0 1 3 m g l 。d o l a s t a t i n1 0 对小鼠p 3 8 8 淋巴细胞白血病细胞的i c s o 为0 0 4 m g l ，具有很强的抗肿瘤生物活性【1 3 】。d o l a s t a t i n l 5 和d o l a s t a t i n l 0 已经完成全合成，并正在美国进行i 期和i i 期临床试验，主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。最近n o g l e 等从l y n g b y am a j u s c u l a 中分离得到4 种新的环肽a n t a n a p e p t i n sa - d 及d o l a s t a t i n1 6 ，其中d o l a s t a t i n l 6 有望成为一种新的抗肿瘤药物【9 】。1 2 来自海洋微生物的抗肿瘤多肽1 9 9 7 年，i s a b e l l eb o l l i l a r d 【1 5 】等从海洋丝状藻青菌( l y n g b y am a j u s c u l a ) 分离得到一系列具有细胞毒性的环状脂肽，其中最主要的2 种化合物l a x a p h y c i n sa 和b 都具有非同一般的抗真菌和细胞毒性的生物协同作用。2 0 0 1 年，l u e s c h 等【1 6 】从帕劳群岛的海洋藻青菌s y m p l o c as pv p 6 4 2 中分离得到了抗肿瘤活性很强的化合物d o l a s t a t i n1 0 ，它最初是从海兔d o l a b e u aa u r i c u l a r i a 中获得的。从夏威夷的& h y d n o i d e s 中分离得到了d o l a s t a t i n1 0 的化学类似物s y m p l o s t a t i n1 ，结构中的n ，n - 二甲基异亮氨酸基团为i ，型氨基酸，并确定了它的立体化学结构。l - d o l a s t a t i n1 和s y m p l o s t a t i n 加都是有效的微管抑制剂。科研人员用各种荷瘤小鼠进行体内抗肿瘤实验来评价s y m p l o s t a t i n1 的抗肿瘤活性。实验结果表明：s y m p l o s t a t i n1 能够有效地抑制一种药物不敏感型乳腺癌和一种药物不敏感型结肠癌，但对两种m d r 肿瘤的抑制效果不明显。从海洋真菌f u s a r i u ms p 中分离得到的s a n s a l va m i d ea 能抑制m c v 拓扑异构酶活性，i c 5 0 为1 2 钆m 0 1 l f l 刀。2 0 0 2 年，l u e s c h 1 8 】研究小组发现了从另一种夏威夷海洋藻青菌s y m p l o c as pv p 4 5 2中分离得到的化合物s y m p l o s t a t i n3 ，它与d o l a s t a t i n1 0 的区别在于c 一末端基团：d o l a p h e n i n e 片断被3 一苯基乳酸基团所取代。s y m p l o s t a t i n3 的人肿瘤细胞系体外毒性实验表明它也能够破坏微管组织，i c 5 0 范围为3 9 1 0 3nm o l l 。但当其浓度增加到与4广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究化合物d o l a s t a t i n1 0 的浓度相当时，体外细胞毒性则会降低。从海洋微生物l m a j u s c u l a中分离得到的化合物d o l a s t a t i n3 与从海兔d a r i c u l a r i a 中得到的具有细胞毒作用的代谢产物d o l a s t a t i n3 只相差一个甲基。2 海洋生物免疫活性多肽的研究目前海洋免疫调节剂的研究就其化学结构而言以多糖为主，尤其是藻类多糖，而对多糖以外的免疫活性物质研究较少【1 9 】。1 9 9 0 年，中山大学实验室首次合成了软珊瑚s i n u l a r i as p 中的一种环二肽，研究表明该环二肽具有免疫调节功能，是一种抗肿瘤新药f 9 】。h y m e n i s t a t i ni ( h s 1 ) 是一种环八肽，具有抑制体液免疫和细胞免疫的作用。据其抑制细胞因子的产生与环胞素a ( c s a ) 的差异，认为h s 1 与c s a 的免疫抑制机制不同1 2 0 。2 0 0 0 年，杜卫等【2 1 j 从栉孔扇贝中分离得到4 个分子量8 0 0 10 0 0d a 的小分子多肽( p c f ) ，采用地塞米松( d e x ) 与脾脏和胸腺淋巴细胞共培养，建立了淋巴细胞免疫抑制实验模型。结果表明：扇贝多肽不仅能显著减轻地塞米松对免疫细胞的抑制作用，同时还可以促进免疫细胞活性。说明扇贝多肽对d e x 引起的淋巴细胞抑制具有保护作用。2 0 0 1 年，刘晓萍等【2 2 】研究表明扇贝多肽可以促进免疫细胞增殖，提高免疫细胞活性，并与剂量呈正相关，同一浓度的扇贝多肽对胸腺细胞在c o n a 作用下，其促进细胞增殖的作用较无c o n a 刺激时的作用强，提示扇贝多肽可能对t 淋巴细胞的影响更显著。此外，扇贝多肽可在体外阻断e 2 对免疫细胞的抑制作用，达说明扇贝多肽可能是一种作用广泛的免疫促进剂。2 0 0 5 年张彩梅等【2 3 】应用地塞米松建立小鼠免疫抑制模型，研究显示扇贝多肽可明显对抗d e x 引起的小鼠脾脏白链萎缩，并提高d e x 处理小鼠外周血t 淋巴细胞数量，表明p c f 能够提高免疫低下小鼠的免疫反应能力。同时证实p c f 腹腔注射能明显增强d e x处理小鼠脾脏淋巴细胞对c o n a 诱导的转化能力，提高t 细胞免疫。研究发现p c f 对小鼠胸腺的影响并不明显，推测p c f 可能主要是通过影响小鼠外周成熟的免疫细胞而发挥免疫调节作用。2 0 0 6 年，张彩梅等【2 4 】同样应用地塞米松建立小鼠免疫抑制模型，采用乳酸脱氢酶( l d h ) 法和吞噬鸡红细胞法研究表明p c f 腹腔注射能够明显提高小鼠n k 细胞杀伤活性( p 0 0 5 ) ，增强腹腔巨噬细胞吞噬功能( p 1 0 m g k g 。2 3t - s s 体外对人肝癌细胞系b e l 7 4 0 2 细胞生长抑制结果实验结果表明，较低浓度t - s s 各组( 1 、2 、3 、4 、5 t g m 1 ) 除浓度为l g g m l 组吸光值显著高于对照组( p 0 0 5 ) ，其余组吸光值极显著低于对照组( p o 0 1 ) ，且吸光值与t - s s 浓度呈浓度依赖关系，即随着t - s s 浓度的增加，吸光值逐渐减小。相应地，t - s s对b e l - 7 4 0 2 细胞生长抑制率也随着浓度的增加而增大，最高抑制率4 5 9 1 ，没有超过5 0 。t - s s 为4 比g m l 和5 比g m l 两组吸光值极显著地低于其余较低浓度t - s s 各组( 尸 o 0 5 ) 。详见表1 - 1 。广西大学硕士学位论文中国鲎鲎索i 抗肿瘤与免疫活性研究表1 - 1 较低浓度t - s s 体外对人肝癌细胞系b e l - 7 4 0 2 细胞的生长抑制作用( x 5 )注：不同大写字母表示差异极显著( p 0 0 1 ) ，不同小写字母表示差异显著( 尸 0 0 5 ) 。较高浓度t - s s 各组( 2 、4 、6 、8 、l o 弘g m 1 ) 与较低浓度t - s s 各组吸光值与浓度变化的趋势一致。较高浓度各组的吸光值除浓度为2 牡g m l 组显著低于对照组( 尸 o 0 5 ) ，其余组吸光值极显著低于对照组( 尸 0 0 1 ) ，吸光值也与t - s s 呈浓度依赖关系，随着t - s s浓度增加，吸光值逐渐减少。吸光值最小的t - s s 浓度为l o t g m l 的组吸光值，显著低于其余较高浓度t o s s 各组( p o 0 5 ) ，但与t - s s 浓度为8 z g m l 组差异不显著( a ，o 0 5 ) 。具体情况见表1 2 。注i 不同大写字母表示差异极显著( p o 0 1 ) ，不同小写字母表示差异显著( p o 0 5 ) 。由较高浓度t - s s 试验中b e l - 7 4 0 2 细胞生长抑制率与t - s s 对数浓度进行概率单位转换，对回归模型进行拟合求出i c 5 0 = 6 2 5 z g , m l ( p = 0 0 0 2 6 ) 。2 4t - s s 体外对人宫颈癌细胞系h e l a - 幺$ r f i 生长抑制结果1 9广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究实验结果表明，较低浓度t - s s 各组吸光值极显著低于对照组( p o 0 1 ) ，且呈浓度依赖关系。t - s s 浓度为5 a e , m l 组吸光值最低，与其余组相比差异极显著( r o 0 1 ) ，生长抑制率超过5 0 。详见表1 3 。表l - 3 较低浓度t - s s 体外对人宫颈癌细胞系h e l a 细胞的生长抑制作用( x s )注：不同大写字母表示差异极显著( p o 0 1 ) ，不同小写字母表示差异显著( p o 0 5 ) ，相同小写字母表示差异不显著( 办0 0 5 ) 。较高浓度t - s s 各组吸光值明显低于对照组，差异极显著( p o 0 5 ) 。8 f l g m l 显著低于舡咖l 组和2 b t g m l组。结果提示，当t - s s 浓度为8 9 m l 时，体外对h e l a 细胞的生长抑制效果最好。具体情况见表1 - 4 。表l - 4 较高浓度t - s s 体外对人宫颈癌细胞系h e l a 细胞的生长抑制作用( x s )注：不同大写字母表示差异极显著( p c o 0 1 ) ，不同小写字母表示差异显著( p ( o 0 5 ) ，相同小写字母表示差异不显著( d - 0 0 5 ) 。由较高浓度t - s s 试验h e l a 细胞生长抑制率与t - s s 对数浓度进行概率单位转换，对2 0广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究回归模型进行拟合求出i c 5 0 = 5 2 6 肛g m l ( 尸= 0 0 1 7 7 ) 。3 讨论3 1t - s s 提取分离纯化过程中的问题t - s s 在提取、分离纯化过程中最关键的是要保证操作过程中的严格无菌及低温条件【1 1 l 】。本实验中鲎采血在净化车间进行，t - s s 提取分离纯化过程中用到的所有玻璃器皿用热原灭活剂处理，然后再湿热和干热灭菌处理。t - s s 提取在净化实验室进行，把培养皿置于该实验室不会产生杂菌。由于高速组织捣碎机工作时会产生大量的热，操作时让捣碎机工作3 0 秒间歇3 0 秒，并使用冰浴。纯化时，层析柜设定温度为1 0 ，事先打开紫外灯消毒，尽量创造一个洁净无菌的环境。鲎血采集时，陈菲加入茶碱作为抗凝剂【1 1 1 】，考虑到离心后要多次洗涤以除去抗凝剂，增加了操作步骤，我们没有加入任何抗凝剂成分，采血后3 0 r a i n 之内离心完毕，离心得到的血细胞的量与加抗凝剂相比没有差别( 数据未给出) 。田长海分离纯化t - s s 时最后用s e p h a d e xg 2 5 脱盐，获得了较纯的t - s s n 2 1 。鉴于我们下面的抗肿瘤和免疫活性实验使用t - s s 的途径为腹腔注射( 急性毒性试验时部分为皮下注射) ，提纯组分中含有一定的n a c l 对实验影响不大，并且n a k a m u r a1 9 8 8 年首次提取t - s s 时也没有脱盐，为了尽可能得到与之相同的组分，另外考虑到提取成本，本实验未对t - s s 采取进一步的脱盐处理。3 2t - s s 的急性毒性筛选中的问题本实验结果表明，在最高剂量达1 0 m g k g 的情况下，小鼠未出现死亡和明显的中毒症状，可见t - s s 的m t d 1 0 m g k g 。从海洋生物中提取的活性物质一般数量很少，如测定经典的l d 5 0 ，需要大量的实验动物，消耗样品的数量很多【1 1 3 1 。s h a y n ec g a d 1 1 0 】认为，从安全性的角度，杀死5 0 动物的剂量不如开始出现致死性的剂量重要。国家有关部门的技术指导原则急性毒性试验要求测定的指标为最大耐受量( m t d ) 。陈菲的实验结果表明t - s s 皮下注射浓度为8 0 b g m l ( 换算成剂量大约为0 8 m g k g )发现在注射药物部位皮毛脱落，皮肤红肿f 1 叼。实验中小鼠并未出现死亡，我们推测陈菲实验中的m t d 应该大于0 8 m g & g 。由此看来，陈菲的实验结果与本实验结果相差大约1 0 倍。主要原因可能是观察指标不尽一致，把剂量从0 8 m g k g 的基础上再增加直至出现死亡或明显的中毒症状，可能有很大的剂量空间。此外可能与分离纯化的条件继而2 1广西大学硕士学位论文中国鲎鲎素i 抗肿瘤与免疫活性研究与t - s s 的纯度有关。众所周知，即便同一试验人员，在相同的分离纯化条件下，不同批次提取分离纯化的样品的纯度可能有差别，况且本实验与陈菲提取分离纯化条件如仪器类型( 匀浆器v s 高速组织捣碎机) 等存在差别，并不完全一致。考虑到继续做m t d 需消耗更多的样品，而分离纯化样品的成本较高且样品的得率很低，我们没有再继续增加剂量直至小鼠开始出现死亡，以获得准确的m t d 。接下来的t - s s 抗肿瘤与免疫活性实验中设计的小鼠给药最高剂量2 4 m g k g 和3 0 m g k g 均低于1 0 m g k g ，显然也低于小鼠对t - s s 的m t d 。3 3t - s s 体外抑瘤试验本试验结果表明，t - s s 体外对人肝癌细胞系b e l - 7 4 0 2 细胞和人宫颈癌细胞系h e l a细胞生长有一定的抑制作用，i c s o 分别为6 2 5 , u g