（高分子化学与物理专业论文）新型基因载体聚乙烯亚胺共聚物的研究.pdf

中山大学硕士论文新型基因载体一聚乙烯砸胺共聚物的研究 新型基因载体一聚乙烯亚胺共聚物的研究 高分子化学与物理 硕士研究生：肖中鹏 指导教师：帅心涛教授 摘要 安全高效的基因传输载体是实现基因治疗的关键之一。阳离子聚合物易于合 成和改性、无免疫原性等优点使其成为非病毒基因载体的一种重要类型；但由于 其对细胞有正电荷相关的毒性、转染效率较病毒载体低、缺乏传输特异性、尤其 在体内缺乏有效的手段检测靶向传输机制等缺点制约了其在临床上的应用。本论 文从提高基因靶向转染效率和确定靶向传输机制出发，合成了叶酸偶联聚7 , - - 醇 接枝支化聚乙烯亚胺( f a - p e g p e i ) 、单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺 ( p e g p e i ) 、聚己内酯接枝支化聚乙烯亚胺( p c l - g - b y p e i ) 、硬脂酸接枝聚7 , - - 醇 线性聚乙烯亚胺( s a - g p e g i p e i ) 以及单分散纳米f e a o a ( s p i o ) ；利用1 h n m r 、 f t - i r 、g p c 表征聚合物：t e m 、x r d 表征了s p i o ，磁学检测表明其呈现超顺 磁性。以f a p e g p e i 复合质粒d n a ( p d n a ) 在体外进行了靶向传输及转染实验。 p c l g h y - p e i 与s a - g - p e g i p e i 同时负载s p i o 和基因后，可作为潜在核磁共振 显像f m 砌) 可见的基因传输双功能载体。 f a - p e g p e i 与p e g p e i 复合p d n a 后进行电位、粒度分析表明其带正电， 粒径在2 0 0 3 0 0 n m ，琼脂糖凝胶电泳实验表明在n p 值为5 和l o 能够完全阻滞。 以i l y p e i ( 2 5 k d a ) 与l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 为对照，f a - p e g p e i 、p e g - p e i 复合编 码荧光光素酶的p g l 3 一p d n a 与编码绿色荧光蛋白的p a a v - e g f p - p d n a 对c 6 、 2 9 3 t 与h e p g 2 细胞进行了体外转染，分别利用荧光素酶报告基因检测和荧光显 微镜考察了其转染效果，m t t 实验考察了复合物的毒性，实验结果表明和另外 中山大学硕士论文 新型基因载体一聚乙烯砭胺共聚物的研究 三种复合物相比，f a p e g p e i p d n a 在表达叶酸受体的c 6 与2 9 3 t 细胞中转染 后表达的荧光素酶水平高，荧光显微镜下观测到的荧光强度也高；f a - p e g p e i 对c 6 与h e p g 2 细胞毒性较小，f a - p e g p e i 对2 9 3 t 细胞毒性比p e l 2 5 k d a 、 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 小而比p e g p e i 大，表明f a p e g p e i 能够作为c 6 细胞的叶 酸介导靶向载体且细胞毒性小。 不同组成的p c l g h y p e i 与s a g p e g i p e i 通过o w 乳化发分别包裹 s p i o ，t e m 观测p c l g - h y - p e i 包裹s p i o 样或者空白样形貌呈胶束状，而 s a - g p e g - i p e i 包裹s p i o 样与空白样都成囊泡状。动态光散射( d l s ) 粒度分析表 明两种聚合物自组装空白样与包裹$ p i o 样品粒径都在1 5 0 h m 左右，包裹s p i o 后粒径有所增大。p c l g h y - p e i 空白样z e t a 电位在+ 3 5 m v 左右，s a - g - p e g - 1 p e i 为+ 1 2 m v 左右，包裹s p i o 后都有一定的降低。磁学性质表明两种共聚物包裹 s p i o 后的纳米粒子仍呈现出超顺磁性。 f a - p e g p e i p d n a 对c 6 ，2 9 3 t 细胞的转染特性表明f a - p e g p e i 能够作为 两种细胞的靶向基因传输载体；p c l g - h y - p e i 与s a - g p e g - 1 p e i 包裹s p i o 后表 现出的超顺磁性和正电性使其能够作为潜在的m r i 可见的基因传输双功能载 体。 关键词：聚乙烯亚胺、接枝共聚物、基因传输、靶向、核磁共振显像剂 l l 中山大学硕士论文 新型基因载体一聚乙烯哑胺共聚物的研究 c o p o l y m e r w i t hp o l y ( e t h y l e n i m i n e ) s e g m e n ta sn o v e l n o n v i r a lg e n e d e l i v e r yv e c t o r s m a j o r ：p o l y m e rc h e m i s t r ya n dp h y s i c s m sc a n d i d a t e ：z h o n g p e n gx i a o s u p e r v i s o r ：p r o f x i n t a os h u a i a b s t r a c t o n eo f t h ek e y si ng e n et h e r a p yi st h es e c u r ea n de f f i c i e n tg e n ed e l i v e r yv e c t o r s d u et ot h ee a s es y n t h e s i sa n dm o d i f i c a t i o n , n oi m m u n o g e n e c i t ye t c ，c a t i o n i c p o l y m e r si s a l l i m p o r t a n tc l a s so fn o n - v i r a lg e n ed e l i v e r yv e c t o r s ，h o w e v e r , c y t o t o x i e i t yr e l a t e dt op o s i t i v ec h a r g e ，l o w e rt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yt h a nv i r a lv e c t o r s , l a c ko f s p e c i f i cd e l i v e r y , e s p e c i a l l yl a c ko f e f f e c t i v em e t h o dt om o n i t o rt a r g e td e l i v e r y h i n d e ri t sa p p l i c a t i o ni nc l i m e h e r e , i no r d e rt oi m p r o v et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n d c o n f i r mt a r g e td e l i v e r ym e c h a n i s m , f o l a t ec o n j u g a t e dp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) - g r 礁一 h y p e r b r a n c h e dp o l y ( e t h ) 7 l e n ei m i n e ) ( f a p e g - p e i ) ，m o n o m e t h o x y lp o l y ( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) 一g r a f t h y p e r b r a n c h e d - p o l y ( e t h y l e n ei m i n e ) ( p e g - p e o ，p o l y ( e - c a p r o l a c t o n e ) 一g r a f t h y p c r b r a n c h e d p o l y ( e t h y l e n ei m i n e ) ( p c l - g - h y - p e i ) a n ds t e a r i ca c i d g r a f t - p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) l i n e a rp o l y ( e t h y l e n ei m i n e ) ( s a g p e g - p e i ) c o p o l y m e r sw e r e s y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db y1 i - i n m r , f t - i ra n dg p c ；a l s of e 3 0 4n a n o p a r t i c l s ( s p i o ) w a ss y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e dw i t ht e m ，x r d ，a n di t s h o w ss u p e r - p a r a m a g c t i cp r o p e r t y f a - p e g p e lw a su s e da st h et a r g e td e l i v e r yv e c t o r si nv i t r o ， p c l g - h y p e ia n ds a - g - p e g p e lw e r eu s e da sc a ) - d e l i v e r yo fs p i oa n dg e n et o a c h i v ep o t e n t i a lm a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ( m r j ) m o n i t o r e dg e n ed e l i v e r y c o m p l e x a t i o no fp l a s m i dd n a ( p d n a lw i t hf a - p e g p e ia n dp e g p e lw e r e i n v e s t i g a t e da s h gd y n a m i cl i g h ts c a t t e r ( d l s ) ，z e t a - p o t e n t i a la n dg e lr e t a r d a t i o n a s s a y , r e v e a l i n gc o m p l e x e so f2 0 0 3 0 0 n mi nd i a m e t e ra n dp o s i t i v ec k 峭a t i i i 中山大学硕士论文 新型基因载体一聚乙烯哑胺共聚物的研究 n p = 1 5 ，p d n a w a sc o m p i e t e l yc o m p l e x e da tn pr a t i o so f 5a n d1 0 h y p e r b r a n c h e d p o l y ( e t h ) 7 l e n ei m i n e ) ( p e l 2 5 k d a ) a n dl i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0w e r eu s e df o rc o m p a r i s o n , i nv i t r ot r a n s f e c t i o na s s a yw i t hf a - p e g p e i p d n aa n dp e g p e i p d n ac o m p l e x e s u s i n gc 6g l i o m a , 2 9 3 ta n dh e ：p 2c e l l s , d e m o n s t r a t e dt h a tf a - p e g p e i p d n ah a s h i g h e rh i c i f e r a s ee x p r e s s i o nc o m p a r e dt ot h eo t h e rt h r e ec o m p l e x e si nc 6g l i o m aa n d 2 9 3 tc e l l se x p r e s s i n gf o l a t er e c e p t o r f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yi m a g e sc o n s i s t e n t w i t ht h el u c i f e r a s ee x p r e s s i o nr e s u l t s ，f a - p e g - p e ic o m p l e x e ss h o wt h eh i g h e s tg r e e n f l u o r e s e n c e t h et o x i c i t yr e s u l td e t e r m i n e db ym t ta s s a y s u g g e s t s t h a tt h e f a - p e g - p e ih a sl o w e rc y t o x i c i t yc o m p a r e dt oo t h e r si nc 6a n dh e p 2c e l l s h o w e v e r , i n2 9 3 tc e l l s 。t h e c y t o x i c i t y o ff a - p e g - p e ii sl o w e rt h a np e l 2 5 k d a 、 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0b u th i g h e rt h a np e g - p e i a l lo ft h e s er e s u l t si n d i c a tt h a tt h e f a - p e g p e ic o p o l y m e rh a sf o l a t e m e d i a t e dt a r g e t i n ge f f e c ti nc 6g l i o m ac e l l sb u t a l s ol o w e rt o x i c i t y s p i oe n c a p s u l a t e dw i t hv a r i o u sc o m p o s i t i o n so fc o p o l y m e r so fp c l g - h y - p e i a n d s a - g p e g p e in a n o p a r t i c l s ( n p s ) w e r ep r o d u c e du s i n g e m u l s i o n s o l v e n t e v a p o r a t i o nt e c h n i q u e t h em o r p h o l o g yi n v e s t i g a t e db yt e m s h o w st h a tb l a n ka n d s p i o - l o a d e dp c l - g 1 1 y p e in p sa r em i c e l l a ra n ds a - g - p e g p e in p sa r ev e s i c l a r t h ed i a m e t e r so f a l lt h en p sa r ea b o u t1 5 0 n m , b u tt h eb l a n kn p sa r es m a l l e rt h a nt h e s p i o - l o a d e dn p s t h e z e t a - p o t e n t i a l o fb l a n kp c l g h y - p e in p sa n db l a n k s a - g - p e g p e in p s i sa b o u t + 3 5 m ya n d + 1 2 m v o f r e s p e c t i v e l y t h ev a l u e sd e c r e a s e d w h e n s p i ow a sl o a d e d t h es p i o l o a d e dn p so fp c l g h y p e ia n ds a - g - p e g p e i e x h i b i t e ds u p e r p a r a m a g e t i cp r o p e r t ya tr o o mt e m p r a t a r e o u rt r a n s f e c t i o nr e s u l t sp r o v et h a tf a - p e g p e ii sa ne f f e c t i v ef o l a t e - r e c p t o r m e d i a t e dt a r g e t i n gd e l i v e r yv e c t o rf o rc 6g l i o m aa n d2 9 3 tc e l l s a l s ot h e s p i o l o a d e dn p s o f p c l g - t i ) k p e ia n ds a - g - p e g p e ic a na c ta sc o - d e l i v e r yc a r r i e r s o f m r ic o n t r a s ta g e n ta n dp d n a , p r o v i d i n gm r i - v i s i b l ea n dg e n ed e l i v e r yf u n c t i o n s k e yw o r d s ：p o l y ( e t h y l e n ei m i n e ) ，g r a f t e d c o p o l y m e r s , g e n ed e l i v e r y , t a r g e t i n g ， m r ic o n t r a s ta g e n t i v 中山大学硕士论文 新型基因载体一聚乙烯哑胺共聚物的研究 第一章绪论 第一节基因载体的研究背景 基因治疗是指将外源性基因导入细胞内部，通过恢复或增添基因表达以纠正 人体自身基因的结构或功能上的错乱，抑制外源性病原体遗传物质的复制，杀灭 病变的细胞，阻止病变的发展，从而达到治疗的目的。基因治疗中最关键的是将 d n a 导入细胞中，而后进入细胞核：单纯质粒d n a 很难直接进入细胞，因此， 基因治疗的成功实施除了需要安全、有效的目的基因外，高效、安全的基因传输 载体也是关键因素。 基因载体可以分为两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体的转染效率比较 高，在临床实验的基因治疗载体中有6 9 是病毒载体，但仍存在以下缺点：( 1 ) 尽 管病毒载体已经不能再复制，没有致病性，但仍存在转化为致病病毒及在提纯的 时候带入一些具有复制能力的病毒的可能性；( 2 ) 具有免疫原性，有可能引起免 疫反应；( 3 ) 缺乏靶向性，成本高。 非病毒载体主要是合成的带有正电的阳离子基因载体，合成载体的优点是安 全性高、适应性好、易于制造。合成载体材料通过静电作用复合d n a 或r n a ， 形成直径为几十至几百纳米的复合体( p o l y p l e x e s ) ；保护基因并传输进入细胞。从 1 9 6 0 年以来，很多合成载体已经被广泛应用于体外基因传输研究，尤其是阳离 子聚合物载体现在被广泛研究。阳离子聚合物具有以下优点：( 1 ) d n a 结合点( 一 级、二级、三级、四级胺以及其它带有正电荷的基团) 可以位于聚合物的骨架、 侧基，也可以位于接枝上的低聚物上；( 2 ) 聚合物性能的多样性，可以满足生物 相容性；( 3 ) 易于制备；( 4 ) 可以提供基因传输所需的多种功能。因此阳离子聚 合物在基因治疗方面具有重大的潜力。 阳离子聚合物作为基因载体的研究是近年来生物医用高分子的研究领域的 热点，常见文献报道的主要有聚乙烯亚胺、聚l 赖氨酸、聚酰胺一胺树状大分子、 壳聚糖等常用载体；此外还有在此基础上改性而得到的阳离子聚合物载体，下面 主要介绍一下几种研究比较多的聚合物。 中山大学硕士论文 新型基因载体一聚乙烯亚胺共聚物的研究 1 1 1 聚乙烯亚胺( p e i ) p e i 从结构上分，有线性p e i ( i p e i ) 和支化p e i ( h y p e i ) 两种，其结构如f i g 1 一i - 与f i g 1 2 所示，是目前研究表明最有效的基因传输聚合物，从1 9 9 5 年开始被用作 基因传输载体。由于p e i 具有很高的氨基密度，其中只有1 5 - 2 0 在生理p h 值中容 易被质予化，这个特性使p e i 成为格外强烈的质子海绵，被人为称为质子海绵机 理”【”，能够在内吞作用的路径中有效破坏溶酶体并快速释放所负载的核酸。 _ 纣e h 2 一c h 2 e h f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fh n e a rp e if i g 1 - 2t h es t r u c t u r eo fh y p e r b r a n c h e d p e i ( a ) h y - p e i 及其衍生物已经用作s i r n a 、p d n a 、寡核苷酸等的载体；b y - p e i 及其衍生物作为基因传输载体的转染效率和毒性取决于其分子量、分枝度、电荷 密度和它们的缓冲能力 2 1 。p e i 与d n a 复合后，将失去部分溶解性，在生理条件 下倾向于聚集，增力n p e i 的分子量是解决此问题的办法之一。此外在阳离子聚合 物上引入非离子的亲水性基团形成p e l 共聚物也能够有效解决此问题。亲水改性 聚合物与d n a 复合后，形成内部为水溶性较低的核，外部为水溶性较高的壳的 核壳结构的复合物颗粒，从而提高了复合物的稳定性与水溶性。p e g 是广泛运用 的亲水改性成分，p e g 具有降低免疫原性与抗原性、延长循环半衰期、增加溶解 性、增加热稳定性、减少毒性等作用，广泛修饰生物医药高分子应用于药物传输、 蛋白与药物的修饰中，文献报道的p e g 修饰p e i 作为基因载体增加溶解性的研究 也较多。t a n g 等【3 谰2 k d a 的p e g 对2 5 k d a 的h y p e i 进行接枝改性，得到了一系列 接枝p e g 数从1 1 4 5 的改性聚合物，有无血清存在条件下在体外和体内转染研究 表明p e g 接枝改性可以提高p e i 在血清存在条件下的转染效率。p e t e r s e n 等1 4 5 1 不 仅研究t p e g 接枝率对h y - p e i 转染特性的影响，还研究t p e g 分子量对转染特 性的影响，在2 5 k d a 的h y p e i 上适度接枝5 k d a 的p e g 后，发现复合物粒径减小， 在最佳接枝率以上，随着接枝率的进一步增加，复合物的形成受到了阻碍，且复 ，飞 弘，洲一l 一 一 拜、n乏 ；n ，、 义 中山大学硕士论文新型基因载体一聚乙烯亚胺共聚物的研究 合物不再是球形；p e i 上接枝1 个2 0 k d a 魄p e g 后可以与d n a 形成球形的紧密微 粒，而接枝3 5 个5 5 0 d a 的p e g 时，与d n a 形成粒径较大的离散微粒，不能有效屏 蔽p e i 的电荷，会导致明显的红血球聚集及溶血现象；p e g 分子量对毒性的研究 表明，随着p e g 分子量的增加，毒性降低；p e g 接枝数对毒性的研究表明，接枝 数在6 个以上时，即可得到无毒的载体。除了p e g 夕b ，聚- 羟丙基甲基丙烯酰胺 ( p h p m a ) 6 1 和聚- 乙烯吡咯烷酮【7 1 也被用于阳离子聚合物基因载体的亲水改性。 聚合物与d n a 的结合特性及聚合物的毒性都具有分子量依赖性。采用可降 解阳离子聚合物能具有较高的分子量，有效的复合d n a 后进入细胞又能变为分 子量较小电荷量较低的副产物，进而同时实现降低聚合物的毒性和提高转染效率 两个方面的作用。文献报道将不可降解的低分子量p e i 通过可降解部分交联起来 得到了一系列可降解的高分子量p e i ，这些交联p e l 保持了高分子量p e i 的转染效 率，同时大大降低其毒性【8 - lo 】。f o i r e m 等将0 8 k d a 的h y - p e i 用含有酯键的小分子 交联剂交联后得到了分子量1 4 - 3 0 k d a 的可降解p e i 。交联p e i 可以与d n a 形成 3 啦8 0 n m 左右的复合物颗粒，降解半衰期为4 l ，在中性及内涵体酸性环境下的降 解速率相差不大，交联p e i 因结构和细胞系的不同，可产生2 - - 1 6 倍于l l y - p e l 2 5 k d a 的转染效率，而且交联p e i 在基因治疗通常使用的载体浓度范围内，毒性较低， 聚合物降解越快，毒性越小。除了酯键之外，含有可降解双硫键的d t b p 、d s p i l l , j 2 也用来交联p e i 作为可降解基因载体的研究。 ( b ) l p e i 一般由聚( 2 一烷基唑啉) 水解后得到，i p e i 与其衍生物报道作为基因载 体的研究比l l y - p e i 要早一些。文献报道【1 3 】p e i 不仅细胞毒性比h y p e i 的小，而且 转染效率比其高：分子量2 2 k d a 的i p e i 被证明是真核细胞最有效的d n a 转染载体 1 1 4 。但i p e i 和h y - p e i 在不同条件下转染效率是不同的，w i g h t m a n 等t ”l 研究表明， 在含有盐的缓冲溶液中i p e i d n a 的复合物转染效率在体外实验中比l l y - p e i 要高， 而在不含盐的条件下出现相反的结果。此外在体内实验中，不含盐条件下复合的 纳米复合体的转染效率比h y p e i d n a 和含盐的i p e i d n a 纳米粒子转染效果都 好，这有可能同1 p e i 在有盐作用下的动力学不稳定相关。近年来也有p e g i p e i 的报道 1 6 1 来提高体内循环时间，且其转染效率相对于不含p e g 的聚合物并没有下 降。 中山大学硕士论文新型基因载体一聚乙烯皿胺共聚物的研究 1 1 2 聚l 广赖氨酸( p l l ) 聚l 一赖氨酸的结构如图f i g 1 3 所示，是 现代基因传输研究最早采用的的阳离子聚合物 fh h l 一由于p l l 锆构是可以降解的多肽坌占丰勾，t n _ 辱- c o - t ，- 尤其适合于体内应用，但p l l 本身作为基因载 e i h 2 - 体效果并不好，为了得到适当的转染活性必须c h 2 加入氯喹、膜破坏性肽及聚丙基丙烯酸等来破譬h t 坏内酶体释放核酸。p l l 因为其结构上利于修 n h 2 饰，所以经常引入靶向配体修饰。p l l 和p e i 一样，同d n a 结合后容易使复合体的溶解性变f i g 1 3t h es t r u c t u r eo f p l l 差，所以也有用p e g 接技p l l 来改善其溶解性。c h o i 掣7 1 8 1 用p e g 和p l l 形成不 同形状的聚合物，用端基为氨基的p e g 和p l l 合成了哑铃形的树枝状三嵌段共聚 物。由于结合d n a 后的复合物表面的p e g 的屏蔽作用，细胞毒性几乎不存在，且 能溶于水。p l l 的一级胺的p k a 比溶酶体酸性环境的p h 值要大，p u ，与d n a 的复 合物通过内吞作用进入细胞后，被限制在内涵体中，在内涵体的生命周期后期， p l l 及其所携带的d n a 可被其中的水解酶降解破坏。在p l l 结构中引入能使在内 涵体p h 值条件下继续质子化的阳离子聚合物可以提高复合物的逃逸性能，从而 提高转染效率；如引入三级胺或者咪唑环等具有类似于p e i 中具有质子海绵效应 的三级胺基团。b e n n s 等【1 9 】为提高p l l 的转染效率，将聚组氨酸接枝聚l 赖氨酸 ( p l h ，g p l l ) ，在聚合物与d n a 的质量比相同的条件t p l h g p l l 在2 9 3 t 细胞中 的转染效率较p l l 高，且在相同条件下其毒性较p l l d 、。b i k r a m 等1 2 0 1 合成了含有 不同接枝率的内涵体破坏侧基( n , n - - 甲基组氨酸基，h i s ) 、p e g 改性的可降解聚 共聚物p e g p l l g h i s 。经过筛选后得出组氨酸侧基含量为1 6 m 0 1 时复合d n a 后对a 7 r 5 细胞的生长能力没有明显像响，在a 7 r 5 细胞中的转染效率是p l l 的3 - - 4 倍。 早期的研究认为p l l 作为基因载体很有前途，但是最近的研究表明p l l 复合 体从内吞作用的路径中逃逸出来的能力太差而导致传输效率相对较低，很难应用 于i 临床，已被转入到机理研究的角色或者作为更有前途的聚合物的参照。 4 中山大学硕士论文新型摹冈载体一聚乙烯哑胺共聚物的研究 1 1 3 聚酰胺- 胺树状大分子( p a m a m ) 聚酰胺胺( p a m a m ) 树状大分子是一类由中心向外对称发散而高度分枝的 新型纳米大分子化合物，其结构如f i g 1 4 所示。p a m a m 树状大分子一般具有三 个明显结构特征：初始核、枝( 代) 、末端基团。树状大分子的大小随代数增加而 增加，粒径范围为l 1 0 r i m 。 p a m a md e n d r i m e r 的表面氨基能够使其携带正电荷，可以和d n a 通过静电 作用结合。由于p a m a m 中含有大量的二级和三级胺，p a m a m 树状聚合物也被 认为是“质子海绵”，具有其较好的基因传输效率和生物相容性。转染效率主要取 决于树状大分子的大小。h a e n s l e r 和s z o k a l 2 1 l 最初报道了p a m a m 树状聚合物用于 基因传输，发现六代的树状聚合物转染效率比代数更高或更低的高l o 倍左右。在 p a m a m 表面氨基接上一种具有水溶性且具有破坏膜的g a l a 短肽时，转染效率 提高了2 3 个数量级。研究还表明树状大分子的转染效率还与其酸性解离常数 ( p k a ) 有关，在生理p h 值条件下，树状大分子与寡核苷酸以静电作用结合显示出 很强的转运活性，并且在不同的p h 条件和离子强度下都非常稳定，只有十二烷 基硫酸钠( s d s ) 才能解离d n a 树状大分子复合物【2 2 1 。当d n a 与d e n d r i m e r 结合 后，可以抵御酶的降解，d e n d r i m c r d n a 的电荷比小于1 ：1 时，d n a 还不能完全 抵御酶的降解，但电荷比在1 ：1 至1 1 5 ：1 之问时，核酸酶活性被抑制而d n a 聚合酶i i 活性保留，当这个比率大于5 ：1 时，虽然对于培养细胞的转染最有效，但此复合 物似乎也显著抑制了体外的转录活性1 2 3 1 。在p a m p a m 表面引入亲脂性物质能够 提高转染效率。四代p a m a md e n d r i m e r s 外周以亲油性苯丙氨酸或亮氨酸改性， 随着氨基酸数目增加，转染活性也随之增加【2 4 】；l l t # b h a r a d a 等【2 5 】合成了 h f i g 1 - 4t h es t r u c t u r eo fp a m a m 5 中山大学硕士论文 新型基因载体一聚乙烯噩胺共聚物的研究 p a m a m b - p l l 的夹- j 皂状阳离子嵌段共聚物，该聚合物中具有不同p k a 的段，通 过分析标明，p d n a , 选_ 择性的和p l l 段结合，而且此嵌段共聚物在h e l a 细胞中的 转染效率l t p l l 高两个数量级，这有可能是p a m a m 的质子缓冲效应以及抵御了 酶的降解的原因。由于p a m a m 表面大量的氨基，易于在化学结构上改进，且也 有质子缓冲能力，是其作为基因载体的应用的优势。 1 1 4 含有咪唑的聚合物 咪唑环的p k a 在6 左右，缓冲能力恰好在内涵体的p h 值范围内，其接在聚合 物上后负载d n a 的复合物的可以增强内涵体逃逸能力，从而提高含有杂环咪唑 的聚合物的转染效率。用组氨酸和其它含有咪唑结构的的物质接在赖氨酸氨基 上，复合基因后的转染效率相对p l l 有所提高，优化p l l 链上唑啉环和氨基比例， 使其既能有效的负载基因，又能够调节溶酶体内的p h 值，因为其电荷密度更佳， 这种聚合物的基因转染效率能够达到p e i 的水平同时细胞毒性更d 4 2 0 。l a n g e r 等 1 2 6 在p l l 的侧氨基上接7 3 5 m o i ，8 2 5t 0 0 1 ，8 6 5m 0 1 含量不等的咪唑基，没 有接上咪唑基的氨基作为阳离子中心，而咪唑基作为缓冲逃脱溶酶体内酶体部 分，转染效率随咪唑基含量成非线性增长关系，当咪唑基含量在8 6 5t 0 0 1 时有 最高的转染效率，水平基本和p e i 相当，但毒性比p e i t j , 。k i l n 等【2 7 佣含有咪唑基 的尿刊酸改性壳聚糖( u a c ) ，在实验的n p 值范围内，接枝率不同的u a c 均可以 与d n a 形成1 0 0 m 以下的复合物颗粒，引入尿刊酸可以提高细胞的存活率。u a c 的转染效率均高于相同条件下的壳聚糖的转染效率，尤其是在n i p 比为2 0 时其转 染效率大约是壳聚糖的4 0 0 倍。除了在聚合物主链上改性接上咪唑基外，还可以 直接在聚合物链上引入眯唑基，i b m 等【2 8 1 合成了聚( 4 乙烯基咪唑) ( p 4 、，) ，和d n a 结合形成的复合物在h e l a 细胞中转染效率l l p e i 还好，同时细胞毒性也有一定的 下降。在聚合物上引入咪唑基团是一种可以破坏溶酶体提高转染效率而且保持细 胞存活率的载体。 1 1 5 壳聚糖 壳聚糖学名几丁聚糖，俗称甲壳素、甲壳胺、壳聚糖，结构如f i g 1 5 所示。 学名为p - l ，4 聚葡萄糖胺，由甲壳质经脱乙酰反应后的产品，脱乙酰基程度决 6 中山大学硕士论文新型基因载体一聚乙烯亚胺共聚物的研究 f i g 1 。5t h e s t r u c t u r eo fc h i t o s a n 定了大分子链上氨基( n h 2 ) 含量的多少。由于壳聚糖 = l p e i 具有更好的生物相容 性，近年来壳聚糖聚合物或者其解聚壳聚糖常被报道用来作为基因载体的研究。 壳聚糖的转染效率取决于其分子量和脱乙酰程度，只有当脱乙酰程度达到6 5 以 上才能够得到稳定的复合体，分子量在3 0 - - 1 7 0 k d a 时能够和p e i 的基因表达水平 相当，在体外实验的转染效果也比较好。相对于p e i ，壳聚糖复合物能够更好的 防止d n a s e 酶的降解。研究表明逃脱内溶酶体是壳聚糖作为基因载体的最大障 碍，它的p h 值在5 5 左右，致使其缓冲能力比较差。s a t o 等 2 9 1 用壳聚糖和荧光素 酶报告基因复合后在癌细胞中转染表明，其转染效率和培养液的p h 值有很大相 关，在p h 值= 6 9 0 9 培养液中比在p h 值= 7 6 培养液中效果更好。m a c l a u g h l i n 冬i # o 】 在壳聚糖上引入了具有酸响应性的内溶酶体肽，在c o s 1 细胞中提高了报告基因 表达水平达到4 倍以上。p e i 复合物在转染后2 4 7 2 h 后达到最高的表达水平，而壳 聚糖的则比较晚，这有可能是壳聚糖复合物需在溶酶体酶降解聚合物成小分子后 才能够逃脱。j i a n 等【3 1 1 结合了壳聚糖和p e i 的优点，在壳聚糖上接p e i ( c h i 争p e l ) ， c h i g p e i 能够很好的保护d n a 不被d n a s e l 内切酶降解，当n p 比上升，c h i g - p e i d n a 复合物的粒径下降，z e t a 电位上升，同2 5 l ( d a p e i 相比，其细胞毒性比较低， 在高的n p 比时，在h e l a ，2 9 3 t 和h e p g 2 - - - 种细胞中，比2 5 k d a p e i 具有更高的 转染效率。壳聚塘由于是天然产物，来源比较广泛，是其作为基因载体的一大优 势。 1 1 6 其它含氮阳离子聚合物 除了以上介绍的几种研究比较多的阳离予聚合物作为基因载体之外，最近还 7 中山大学硕士论文新型孽因载体一聚乙烯哑胺共聚物的研究 ( a ) f i g 1 - 6t h e s t r u c t u r e so fp p e e a ( a ) ，c o p o l y m e r so f c la n db r c l ( b ) ， p e g - d 啊c ) ( b ) 洲矿和聃弩一于呵一+ 昙澍 0 2 c 。 ； j 有许多阳离子侧基改性聚合物，在常见可降解聚合物的主链或者侧基上引入含有 氮原子物质改性，例如：氨乙基接在聚磷酸酯的侧基上( p p e e a ) 1 3 2 1 ，吡碇侧基 改性聚己内酯 3 3 1 ，二丙基三胺侧基改性聚乙二醇一聚天冬氨酸( p e g d p n m 】等， 都作为基因载体研究中取得不错的效果。 为了改善已有阳离子聚合物的转染特性，除了在1 1 1 中介绍的引入亲水基团 之外，还有以下几种改性方法提高转染效率：( 1 ) 在阳离子聚合物中引入靶向基 团，( 2 ) 在阳离子聚合物中引入赋予阳离子聚合物以脂质特性的基团或成分，( 3 ) 在阳离子聚合物中引入潜在酸性基团或直接引入阴离子成分，( 4 ) 控制聚合物的n 类型等方法，此处就不在一一介绍了。 阳离子聚合物负载基因后的复合物的传输尤其是进入细胞核基表达机制还 不是很明确。目前有多种方法用于研究基因传输的方法，包括光学显像方法和核 医学显像方法，但受到分辨率等的限制，进展较缓慢，近年来核磁共振显像 ( m r i ) t 3 5 j 6 】技术作为检测基因表达的新技术，虽然其处于早期研究阶段，但其优 势必将使其成为将来研究基因传输机制的方法之一。下面简单介绍下m r j 对比剂 的研究进展。 岭 弗碍讲 中山大学硕士论文新型基冈载体一聚乙烯观眩共聚物的研究 第二节核磁共振显像( m r d 对比剂的研究进展 磁振共振显像( m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ，m r ) 不具侵袭性，也不会产生 游离辅射，将放射诊断医学带入了另一个崭新的领域。m r i 是依据核磁共振的基 本原理，利用外界仪器改变体内氢原子的旋转排列方向，此时原子核会释放吸收 的能量，能量激发后会放出电磁波信号，再经由电脑分析组合成影像，就是一般 看到的m r i 影像。m l u 具有高组织分辨力、空间分辨力、无硬性伪讯号及游离辐 射的优点【3 7 l ；同时使用不同的显像剂，可测量血管及心脏的血流变化、辨别肿 瘤与周围正常组织，广泛应用于临床，但其检验费用目前仍十分昂贵。随着核磁 技术的不断进步，国内外科学家已经开始对m r j 作为其他诊断技术的研究，如跟 踪细胞调亡【3 甜，细胞迁移【3 9 1 ，细胞标记和显示转基因的表达等，为许多未知 发病机理的提供了又一个可靠的检测工具。 m r 技术的发展，除了扫描仪器设备的改善进步外，另一个重要发展方向就 是显像剂的开发。目前i 临床使用的显像剂主要是含钆( g d ) 化合物( g d d t p a ) 与超 顺磁性氧化铁( s p i o ) 两种显像剂。含钆化合物显像剂一般用来做肾、脾、肝、胃、 肺等的血池显像剂。但g d d t p a 在l 临床应用中存在一些明显的不足之处，如： 体内清除太快，并迅速集聚于肝脏；体内分布没有特异性，使m r 图象对比不能 明显改善，同时还需配置价格较贵、能够快速扫描的设备；钆离子配合物在体内 代谢后具有高毒性，合成无毒性的钆有机金属化合物显像剂比较困难，其只能在 毫摩尔级别才有效。随着现代医学检测手段的进步，需要更加精密的检测显像剂。 现在超顺磁性氧化铁显像剂的发展比较突出，这是由于其超顺磁性的磁性仅存在 于外界具有磁场时，外界磁场消失时不具有磁性，且一般的氧化铁纳米粒子，毒 性较小，其检测水平在1 0 4 摩尔浓度，有较好的灵敏性，是一种比较理想的核磁 显像剂；氧化铁纳米粒子一般有f e 3 0 4 ，) , - 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