（分析化学专业论文）涂覆型整体离子色谱柱的研究.pdf

图目录 图2 2 1n 0 2 - 在不同浓度下，流速对塔板数的关系图 图2 2 2n 0 3 - 在不同浓度下，流速对塔板数的关系图 图2 2 32 5 m m n a c l 条件下，流速对保留时间关系图 图2 2 4 标准色谱图 图2 2 5 市售火腿色谱图 图2 3 1 六种阴离子的标准色谱图 图2 3 2 某电镀工厂废水色谱图( 稀释5 0 0 0 0 倍) 一一 图2 4 1 六个离子的塔板数流动相浓度关系图 图2 4 2 流动相浓度对相邻离子分辨率的关系图 图2 4 3 各个离子保留时间和流动相p h 值的关系图 图2 4 4 选定色谱条件下六种阴离子的标准色谱图 图2 4 5 某处实际水体样品图 图2 5 1 给定色谱条件下四种物质的标准色谱图 图2 5 2 实际样品色谱图 图2 6 1 六个常规阴离子标准色谱图 图2 6 2 六个常规阴离子标准色谱图 图2 6 3 六个常规阴离子标准色谱图 图2 6 4 六个常规阴离子标准色谱图 图2 6 5 六个常规阴离子标准色谱图 4 m 小 世 舶 街 劢 彤 剧 耶 娜 田 舰 脚 m 朋 肼 瑚 | | | | | | | | | i 一 ；| ；| | ； | | | | | | | 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 | | | | | | | | | | 表目录 表2 2 1 线性关系和检测限，4 5 表2 2 2 样品含量和回收率表4 6 表2 3 1 线性关系和检测限5 0 表2 3 2 样品含量和回收率表j 5 0 表2 4 1 线性关系和检测限 表2 4 2 样品含量和回收率表 表2 5 1 四种物质的线性关系和检测限 表2 5 2 样品中甜味剂和苯甲酸的含量以及回收率数据 表2 6 1t r i t o nx l o o 和氯代十六烷基毗啶( c p c ) 的结构图 5 6 5 7 6 1 6 2 6 5 中文摘要 通过在硅胶整体色谱柱表面动态涂覆阳离子表面活性剂的方法，制各得到可 在高流速下进行快速分离、分析的，具有阴离子交换功能的整体色谱柱。通过直 接紫外检测、间接紫外检测等手段，对多种常规阴离子以及饮料中的甜味剂、防 腐剂等进行快速分离、分析，并用于实际样品的测定。同时比较单层涂覆阳离子 表面活性剂和先涂覆非离子表面活性剂再涂覆阳离子表面活性剂，两种情况下得 到的整体色谱柱在阴离子分离时的差别，探讨形成这种差别的原因和机理。论文 分两部分：第一章主要综述了离子色谱和离子色谱固定相的发展状况，总结了采 用涂覆、化学键合等手段对常规离子色谱固定相以及整体色谱柱固定相的改性和 应用。第二章研究了本实验采用动态涂覆得到的整体色谱柱在阴离子分离、分析 中的应用以及比较两种涂覆情况下得到的整体色谱柱在阴离子分离上的差别，探 讨形成差别的机理。 第一章：综述了离子色谱和离子色谱固定相的发展状况，总结了采用涂覆等 手段对常规离子色谱固定相以及整体色谱柱固定相的改性和应用。离子色谱的应 用领域随着多种新型色谱固定相的发展而得到了快速发展，应用范围已经由测定 常规阴、阳离子发展到生物、医药分析等多个领域。通过对常规色谱固定相或者 整体色谱柱固定相表匝进行改性，可以有效的改善固定相对某些离子的选择性， 改善离子的分离，或者结合整体色谱柱可以快速分离的特点，对离子进行快速分 离、分析。 第二章：研究了采用动态涂覆的方式，在整体色谱柱固定相表面涂覆阳离子 表面活性剂，制备具有快速分离特点和具有阴离子交换功能的整体色谱柱。采用 直接紫外检测和间接紫外检测等手段，对常规的阴离子以及饮料中的甜味剂、防 腐剂等物质进行快速分离、分析，并且用于实际样品的测定中。同时通过比较单 层涂覆阳离子表面活性剂和先涂覆非离子表面活性剂，再涂覆阳离子表面活性 剂，两种情况下得到的整体色谱柱在阴离子保留上的差别，探讨形成差别的机理。 第一章离子色谱简介和色谱柱的发展 第一节离子色谱简介及其特点 1 1 离子色谱简介 离子色谱( i c ) 是高效液相色谱( h p l c ) 的一种，是分析离子的一种液相 色谱方法。现代i c 的开始起源于h s m a l l 及其合作者的工作，他们于1 9 5 年发 表了第一篇论文，同年商品仪器问世。通常所说的离子色谱是以离子交换树脂 为固定相，以电导检测器为检测手段，采用抑制器来提高灵敏度的一种色谱分析 方法。在分离柱和检测器之间增加了降低背景电导、提高检测灵敏度的抑制器， 使得利用电导检测的应用范围大大扩展，不仅可以用于常规含量离子的测定，也 可以用于痕量离子的定性、定量分析。1 9 7 9 年，j s f r i t z 等人提出了非抑制型 电导检测的离子色谱技术比1 ，他们采用低交换容量的离子交换树脂作为离子交换 柱，采用弱酸及其盐类作为淋洗液对不同的离子进行淋洗、分离，在控制一定 p h 值的条件下，背景电导比较低，可以不加抑制器进行直接电导检测。该方法 使用的仪器设备比较简单，但是这种不加抑制器的离子色谱方法，其应用范围和 灵敏度都不及抑制电导检测的离子色谱法。 离子色谱分离方式不仅包括离子交换分离，还包括了离子对、离子排斥等多 种分离方式；同时离子色谱的检测手段也有很多的选择，如电化学、紫外可见、 荧光等。离子色谱方法在分析常规阴、阳离子，尤其是分析无机离子方面，克服 了高效液相色谱( h p l c ) 无法很好分离常规无机离子的不足。作为近2 0 年来发 展最快的分析技术之一，离子色谱的应用已经渗透到了众多的领域，发展成为分 析无机阴、阳离子和有机离子的，选择性好，灵敏度高的分析方法。 近几年来，随着新型、高效的色谱分离柱、灵敏的电化学和光化学检测器、 梯度泵和耐腐蚀的全塑系统、微机处理控制仪器系统以及智能系统的发展，离子 色谱系统又得到了快速发展。离子色谱固定相的主要缺点硅质填料对p h 的 7 不稳定性以及高聚物离子交换填料对有机溶剂的不匹配性已经被一一克服。随着 具有反相性质的对有机溶剂可匹配的聚合物离子填料的引入，离子色谱的应用范 围出现了巨大的变化。现在的离子色谱可分析各种类型的离子型化合物，包括极 性有机物的分析，可以对含有大分子和有机溶剂的多种复杂样品直接进样分析。 应用范围也从分析水中的常见阴、阳离子和有机酸，发展到分析极性有机化合物 以及生物样品中的糖( 单糖、寡糖) 、氨基酸、多肽、蛋白质等。 同时，离子色谱联用技术的发展，也使得离子色谱这项分析技术的应用范围 和检测灵敏度有了很大的提高。已经有大量离子色谱与原子吸收( 发射) 光谱、 电感耦合等离子体、质谱联用的报道。离子色谱的应用范围和应用领域得到了进 一步的扩大。 1 2 离子色谱主要分离方式一 离子色谱的主要分离方式可以根据三种不同的分离机理，分为高效离子交换 色谱( h p i c ) 、离子排斥色谱( h p 砸c ) 和离子对色谱( m p i c ) 。用于三种分离 方式的柱填料的树脂骨架基本上是苯乙烯二乙烯基苯的共聚物。 吐上三种分离方式各基于不同的分离机理。h p i c 的分离机理主要是离子交 换分离原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子。所用的固定相填料通 常为以苯乙烯二乙烯基苯共聚体为骨架，通过磺化或者胺化得到的大孔薄壳 型或多孔表面层型的离子交换树脂，还有就是采用硅质键合离子交换填料来作为 交换树脂；h p i e c 的分离机理主要是离子排斥，采用高交换容量的磺化h 型阳 离子交换树脂为填料，以稀盐酸为淋洗液，根据d o n n o n 膜排斥效应，对电离组 分和弱酸进行分离；m p i c 的分离原理是基于吸附和离子对的形成，采用苯乙烯 二乙烯基苯树脂或者十八烷基硅胶( o d s ) ，也有用c 8 硅胶或者c n 固定相 作为分离树脂的，主要用于疏水性阴离子以及金属络合物的分离。 以上三种主要的分离方式所采用的固定相填料的类型，固定相的交换容量和 分离机理各不相同，因此可以基于不同的分离目的和分离机理，选用不同的离子 色谱柱来达到预期的分离目的。 1 3 离子色谱的特点 离子色谱具有以下的特点： 1 快速、方便 采用高效快速的离子色谱分离柱，可以对阴、阳离子或者有机酸离子进行快 速分离。随着离子色谱系统的进一步发展，在阴离子分析时，可以采用新型在线 淋洗液发生器 3 4 1 避免了淋洗液与空气接触，通过电脑控制泵，得到准确无污 染的k o h 淋洗液，用于分析常规的阴离子。对于阳离子的分析，同样可以采用 新型在线淋洗液发生器，得到所需浓度的磺酸盐淋洗液。抑制器的发展，也由化 学膜抑制器发展到通过电解水产生抑制反应所需要的h + 和o h 的自生再生抑制 器( s r s ) ，无需化学试剂和再生液。整个分离、分析过程简单、快捷，减少了 外界对淋洗液的污染，使得测定结果更加可靠。 2 灵敏度高 离子色谱的分析浓度范围为ug l m g l 。直接进样5 0 ug ，对常见阴离子的 检测限小于1 0ug 几。如果采用电感耦合等离子体( i c p - - m s ) 巧。6 1 等联用技术， 可以进一步提高检测灵敏度。 3 选择性好 离子色谱法分析无机和有机阴、阳离子的选择性主要通过选择合适的分离系 统和检测系统来达到。离子色谱系统中固定相对选择性的影响较大，现在已经有 很多不同选择性的商品化高效分离柱。同时，每年的匹兹堡会议上都有新型的分 离柱推出。结合离子色谱具有的多种检测手段，如最常用的电导检测，以及紫外 检测、安培检测等，可以方便的对不同性质的离子进行测定。同时，柱后衍生方 法的发展提高了金属离子、多价阴离子等的检测选择性。 4 可同时分析多种离子化合物 与光度法、原子吸收法相比，离子色谱的主要优点是可以同时检测样品中盼 多种成分，只需要很短的时间就可以得到阴、阳离子以及样品组成的全部信息。 对于浓度差别特别大的样品。可以通过不同的稀释或者不同的灵敏度来达到，也 可以采用有效的高容量色谱柱来解决问题。 5 分离柱的稳定性好、容量高 离子色谱系统中广泛采用的填料为苯乙烯二乙烯基苯聚合物。这种树脂 高的p h 稳定性允许用强酸或者强碱作为淋洗液，有利于扩大应用范围。新型的 高交联的树脂在有机溶剂中稳定，因此可以用有机溶剂清洗柱子以去除有机污染 物。色谱填料高的p h 稳定性，有机溶剂可匹配性以及高交换容量，简化了样品 的前处理手续，使得样品前处理简单。 l o 第二节离子色谱固定相的发展及其特点 2 1 离子交换树脂简介 一般意义上所说的离子交换树脂是一种多孔性海绵状固体高分子物质，每个 树脂颗粒都是由交联的具有三维空间立体结构的网络骨架构成，在骨架上连接许 多可以活动的功能基团。这种功能基团能够离解出离子，可以与周围的外来离子 相互交换。功能基团固定在网络骨架上不能自由移动，但是功能基团所带的可以 离解的离子却能够自由移动，随着使用或者再生时，在不同的外界条件下，与周 围的同类型其他离子相互交换，所以叫做可交换离子。人们就是通过控制树脂上 的这种可交换离子，创造适宜的条件，如改变浓度差、利用亲和力差别等，使它 与接近的同类型离子进行反复交换，以达到不同的使用目的，如浓缩、分离、提 纯、净化等。 换言之，离子交换树脂的单元结构由三部分组成：不溶性的三维空间网状 骨架、连接在骨架上的功能基团以及功能基团所带的相反电荷的可交换离子。 2 ，2 离子色谱固定相及其发展 离子色谱中的离子交换树脂( 又称为离子色谱固定相) ，是离子色谱分离系 统的核心和基础，被称为离子色谱仪的“心脏”。它们是一类带有离子交换功能 基团的固体颗粒，其结构为在交联的高分子骨架上结合可以离解的无机基团。在 离子交换分离中，离子交换树脂的本体结构不发生明显的变化，仅由其带有的离 子和外界同电性离子发生等量的离子交换。 随着离子色谱应用的越来越广泛，在离子色谱固定相的研究上也出现了许多 新的思路。固定相的进展主要包括以下几个方面：1 、静电离子色谱固定相；2 、 大环类可变交换容量色谱固定相；3 、金属氧化物固定相；4 、有机高聚物固定相； 5 、多种类型、多种功能基和高交换容量的固定相；6 、高效涂覆型离子色谱固定 相。 1 、静电离子色谱固定相 静电离子色谱的概念是由h u 等首先提出的k 7 - 8 1 0 这类固定相一般是在反相 色谱固定相表面涂覆两性离子表面活性剂。表面活性荆含有长的烷基链，因疏水 作用附着在固定相表面。涂覆的表面活性剂在3 个月内的流失量可以控制在3 以内k 9 1 。其最初的原理是利用固定相同时具有阴、阳离子交换的功能，用纯水流 动相分离阴、阳离子 1 0 - 1 2 1 。虽然这种分离方法可以用纯水条件实现阴、阳离子 的同时分离。但是由于淋洗液中不含有抗衡离子，因此待测离子必须和样品中带 相反电荷的离子组成中性的离子对，当样品中存在多种阴离子和阳离子时，会形 成多种可能的组合。由于它们在固定相上受到的作用力不同，洗脱时间也不同， 检测器将检测到所有的离子对，因此对于一种离子，可能出现多个色谱峰。 但是这个缺陷可以通过使用电解质溶液作为流动相提供抗衡离子的方法来 得以解决。在此基础上形成了静电离子色谱的双电层理论，使得这一技术向实际 应用迈进了步| 1 3 - 1 4 | 。 2 、大环类可变交换容量色谱固定相 自从c r a m 5 1 等首次报道了将大环类化合物应用于离子色谱分离氨基酸以 来，大环类化合物色谱固定相已经广泛的应用于无机阴离子和阳离子 1 6 - 1 9 1 核 酸以及核苷酸、糖类、氨基酸的分离。大环类化合物主要包括冠醚、穴状配体、 球状配体等。它们都含有环状的碳骨架，碳骨架上含有杂原子，如氧、氮、硫原 子，为金属离子提供了负电性的环境，当金属离子嵌入大环中心空穴时，可以形 成配合物。 大环类化合物色谱固定相既可以用于阳离子的分离，又可以用于阴离子的分 离 1 9 , 2 4 ，用于分离阴离子时，大环阳离子配合物为阴离子提供活性位点。大 环与金属离子形成的配合物越稳定。为阴离子提供的活性位点越多，柱容量越大。 当采用金属的氢氧化物为淋洗液时，可以通过改变淋洗液中的金属离子种类来改 变大环类色谱柱的柱容量，进行“柱容量”梯度洗脱。该项技术已经用于分离多 种阴离子 2 0 1 。 3 、金属氧化物固定相 金属氧化物固定相具有硅胶填料的机械强度，又具有有机高聚物填料的化学 稳定性，在强酸和强碱介质中化学稳定性好。此外，当流动相的组成，如有机溶 剂含量、离子强度和p h 变化时，固定相不容易发生溶胀或者收缩。因此，应用 金属氧化物作为固定相有其独特的优点1 2 1 - 2 3 1 0 当采用两性金属氧化物作为固定 相时，其分离机理不仅有静电作用和疏水作用，而且还涉及到基于过渡金属与淋 洗液离子或者溶质形成配合物的配体交换机理。 4 、有机高聚物固定相 以有机高聚物和硅胶为基体的填料是离子色谱中最常用的填料。硅胶填料由 于溶质易于通过相对较大的孔与固定相上的活性位点接触，因此传质速率快，柱 效高，价格相对便宜，近年来对硅胶填料的研究较为活跃。离子交换剂可以通过 静电作用 2 4 - 2 5 1 疏水作用1 2 6 1 或者动态涂覆等方法吸附在硅胶基质上，也可以 通过键合等方法固定到硅胶基质上。在离子色谱中，最常用的是键合硅胶填料。 键合硅胶填料的优点是柱效高，交换平衡快，机械强度高。缺点是不能耐酸、耐 碱，使用受到p h 值的限制，一般只适宜在p h 2 8 范围内使用。此外，硅胶表 面的硅醇基团与许多生物分子之间存在静电作用力，常常需要对硅胶填料的表面 进行处理以屏蔽或者减轻这种静电作用力1 2 7 1 , 有机高聚物固定相对酸、碱有更好的稳定性。高交联度的有机高聚物填料可 以1 0 0 兼容有机溶剂1 2 8 - 3 0 1 。目前，有机高聚物固定相是应用最为广泛的离子交 换填料。在离子色谱中，应用最为广泛的离子交换树脂是以苯乙烯二乙烯基 苯共聚体为骨架，在苯环上引入磺酸基团形成的强酸型阳离子交换树脂，或者引 入叔胺基团形成的季铵型强碱性阴离子交换树脂。这些交换树脂具有大孔薄壳型 或者多孔表面型的物理结构。这类离子交换树脂的优点是，可快速达到交换平衡， 离子交换树脂耐酸碱，可以在任何p h 范围内使用，容易再生处理，使用寿命长。 5 、多种类型、多种功能基和高交换容量的固定相 随着抑制器的发展，抑制容量的增加，高容量色谱柱成为离子色谱固定相的 一个发展方向。常用的薄壳型离子交换树脂的主要缺点之一是交换容量受到基核 直径和外层乳胶微粒性质的限制，交换容量较低，一般为5 1 0 0 u e q g ，这种容 量范围的填料对含有高盐浓度和某些固体样品的分析一般要求较为特殊的样品 前处理方法1 3 1 - 3 2 1 , 通常用碱熔或者氧瓶燃烧等方法分解样品，再用离子交换法 除去大量的基体，或者先用酸消解再用离子交换法处理。 高容量固定相的基础是固定相采用超孔材料基质，离子色谱柱能够提供更高 的分离度，可允许在高浓度基体存在下测定痕量的组分 3 3 - 3 5 1 其次，高容量分 离柱允许较大的进样体积，便于样品的富集，从而改善痕量组分的检测限。因此， 这种固定相可以同时分离高浓度和低浓度的离子，而不存在超载等问题。 6 、高效涂覆型离子色谱固定相 在反相色谱固定相上涂覆阳离子表面活性剂或阴离子表面活性剂，可以制成 阴离子或阳离子色谱柱；传统的涂覆型离子色谱柱，由于涂层无法控制，往往柱 效不高( 1 00 0 0 至2 00 0 0 p l a t s m ) ，而且交换容量也较难控制。改变涂覆方式和 涂覆条件，特别是采用多层涂覆的方式，可以使新型的涂覆型离子色谱柱柱效达 到7 00 0 0 塔板数米，尤其是采用先涂覆非离子表面活性剂，再涂覆阳离子表面 活性剂之后的离子色谱固定相，具有很高的柱效。这类色谱柱的柱效基本上与 h p l c 柱相似 3 6 19 比常规阴离子色谱的柱效提高了1 至2 倍，将是今后新一代离 子色谱固定相的发展方向。 此外，还有一些其他类型的色谱柱出现，也在很大程度上提高了离子色谱的 灵敏度，增加了它的使用范围。 采用4 , 7 l 径( 2 m m ) 玎7 1 的离子色谱柱。采用小孔径的离子色谱柱，在直接 进样测定时，相比在相同的条件下使用直径为4 m m 的色谱柱，灵敏度提高了4 倍，所需要的样品和化学试剂的用量减少，同时由于淋洗液的流量降低，相当于 抑制器的抑制容量扩大，因此可以采用较高浓度的淋洗液来分离高电荷的离子。 还有一些螯合树脂的制备和利用1 3 8 4 1 1 0 主要是制备一些具有可以和金属离 子络合或者螯合的功能基团的离子色谱填料。螯合树脂填料的引入可以进行在线 浓缩、富集和进行基体消除，使得离子色谱的的检测限降低了1 2 个数量级。 该类树脂已经成功的用于酸、碱和f e ”、a 1 3 + 、m 矿+ 、c d + 等基体中痕量金属杂 质的测定。 s t i l l i a njr 和p o h lca 4 2 1 还提出了一种新型的聚合物“多维”色谱柱固定 相。该固定相的薄壳层具有离子交换功能，中性高交联度大孑l 的疏水性基核又具 有吸附或者离子对保留性能。这种色谱柱在p h 0 1 4 以及与水混合从l 1 0 0 ( v v ) 的普通有机反相溶剂中是稳定的。在同一柱子上同时具有离子交换、反 相或者离子对的保留性能。因为离子交换和吸附的保留机理不同，因此可以在多 维柱上分别加以控制以得到最佳的选择性。可以用离子交换分离、离子对或者反 相的机理分别分离极性、离子型和中性化合物；也可以结合两种保留机理提高对 1 4 复杂基体分离的选择性。 多维柱对药物分析和生物样品的分析十分有利。药物分子通常带有弱酸或者 弱碱基团和疏水基团，用通常的o d s 反相柱进行h p l c 分析时，常缺乏足够的 选择性，而多维柱极大地增加了分析药物分子的选择性。s l i n g s b y 等分别采用 p a x 一5 0 0 和p c x 一5 0 0 型多维柱，以n a 2 c 0 3 l 氰和h c l 0 4 k , 氰为淋洗液，梯度 淋洗分离了5 0 余种药物分子。 离子色谱固定相和新型离子色谱柱的研究，无一例外是为了使离子色谱这种 分析手段能够更好的满足于越来越多，越来越复杂的实际样品分离、分析的需要。 它的最终目的是为了简化样品分析过程、提高分析测试的灵敏度、扩大离子色谱 的应用范围。 随着离子色谱应用领域的扩大，或者说是色谱这种分析方法的广泛应用，色 谱技术又面临了一个新的挑战，就是如何实现高流速下的快速分析，甚至是满足 在线分离、分析的需要。这就使得色谱柱的研究不仅向着如何扩大色谱应用范围 的方向努力，另一方面还要研究如何使色谱柱填料可以满足高流速分析的需要， 如何在高流速下保持较低的柱压和较高的柱效。现在使用的色谱柱填料一般都是 粒径为5 1 0 “m 的颗粒填料，它的一个最大的缺点是阻力相对比较大，对于流 速有一定的限制，不能在高流速下使用。这就直接影响到实际使用时，不能采用 较高的流速，否则将导致系统压力迅速增加，甚至出现管道接头渗漏、连管崩裂， 直接影响到分离、分析的效果。 目前一种新的色谱柱整体色谱柱的出现以其特有的填料特性正好满足 了快速分析的需求，它的最大的特点是可以在很高的流速下，保持相对较低的柱 压，同时还具有很高的柱效。这种新型的色谱柱从出现以来，就引起了广泛的重 视，对于新型整体柱的研究，改性和应用也在色谱领域引起了很大的关注。 第三节整体色谱柱的特点及其应用 3 1 整体色谱柱简介 3 1 1 整体色谱柱的发展背景 随着生命科学，新药开发和环境科学的需要，液相色谱，微柱液相色谱和毛 细管电色谱受到了越来越多的重视。但是商品化的h p l c 色谱柱，它的内部主要 是一些颗粒填料，在使用过程中柱压随着填料颗粒的减小而急剧上升，伺时，当 分析速度提高时，柱压也会急剧上升，因此不适合用于快速分析测定。近2 0 年 来，它的柱效一直都徘徊在1 0 ，0 0 0 3 0 ，0 0 0 p l m 之间。解决柱效低而发展的毛 细管电色谱( c e c ) 和超高压液相色谱( 呻l c ) 也存在一定的问题。就c e c 来说，虽然不存在柱压的问题，但是柱子的填充和封口制作十分繁琐，毛细管的 封口会引起气泡的形成，导致基线噪音增加，甚至出现电流中断等问题。c e c 开管柱虽然可以解决封口问题，但是其相比小、样品容量低、检测困难，限制了 它的发展。为了满足在不降低分离效率和柱效的前提下实现快速分离，人们把目 光转向了整体色谱柱这种特殊的分离柱。 3 1 2 整体色谱柱的概念 在柱管内采用原位聚合方法制作成的柱状整体棒型填料，叫做整体色谱柱 ( m o n o l i t h i cc o l u m n ) 。整体色谱柱也可以通过把颗粒填料填入色谱空柱固化在色 谱柱中得到。 整体色谱柱的制备一般是采用一种有机或者无机聚合的方法在色谱柱内进 行原位聚合。这种色谱柱的制作方法比较简单，只要把配好的单体、添加剂、致 孔剂和引发剂等混合物装入空的色谱柱中，经过一段时间的聚合反应就得到整体 色谱柱1 4 2 - 4 5 1 。 3 2 整体色谱柱的类型 整体色谱柱按照制备方法可以分成3 类，分别为：聚合物整体色谱柱、硅 胶整体色谱柱、以及以填充柱为基础的整体柱； 3 2 1 聚合物整体色谱柱 聚合物整体色谱柱在制备上选材广泛，具有不同的选择性和较宽的p h 范 围，近几年来得到了迅速发展。通常制备的方法是把单体混合物和致孔剂等注入 空的色谱柱，经过热引发、自由基引发或者紫外引发等方式在色谱柱内进行聚合， 然后用合适的溶剂，以机械泵或者电渗流的方式去除多余的致孔剂和色谱柱内残 留的单体，就得到最后的整体色谱柱。 聚合物整体色谱柱采用的单体主要是聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚乙 烯。 聚丙烯酰胺类整体色谱柱的单元单体一般为：丙烯酰胺、n 异丙基丙烯酰胺、 甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸丁酯、n 烯丙基二甲胺；交联剂多为：二丙烯酰哌嗪、 亚甲基二丙烯酰胺( b i s ) 。这类整体色谱柱的最大的优点是紫外透明，因此可以 进行柱内检测，但是它的基质比较软，不适宜在液相的模式下使用，一般都是用 在c e c 模式下。 聚合物整体色谱柱的特点： 聚合物整体色谱柱的优点是具有较好的重复性，化学选材范围广，易于制备， 可以在较广的p h 范围内使用。它的缺点主要表现在：整体柱容易受热变形，机 械性能差，并且存在孔径分布难以控制，紫外引发需要紫外透明的色谱柱管等。 3 2 2 硅胶整体色谱柱 硅胶整体柱和聚合物整体柱相比，在孔径控制，机械性能，耐溶剂等方面显 示出了一定的优越性。 硅胶整体柱的制备方法一般采用溶胶凝胶法。 溶胶凝胶法的基本过程为：易于水解的金属化合物( 无机盐或者金属醇 盐) 在某种溶剂中与水反应，发生水解和缩聚过程而逐渐胶化。其基本反应为水 解和缩合。事实上，醇盐的溶胶一凝胶化过程是在较低的温度下进行的，它是 一种通过溶液中的化学反应合成无定形网络结构的过程，区别于溶液的析晶过 程，该技术的关键在于获得高质量的溶胶和凝胶。 硅胶整体色谱柱的特点 硅胶整体色谱柱的优点是：硅胶整体柱孔径均匀，机械性能好，同时由于硅 胶紫外透明，因此可以直接用于柱内检测。它的缺点是有一定的p h 使用范围限 制，p h 使用范围一般是p h 4 9 。 3 2 3 分子烙印( 印记) 整体色谱柱 分子烙印是合成对烙印分子具有预定分子识别能力的聚合物的一种方法。近 年来，受到了越来越多的关注，可以在外消旋体的拆分，基底选择性催化，人工 抗体合成等方面获得应用。采用常规方法制备的分子烙印聚合物( m i p ) 通常是 块状的，在装柱前需要进行研磨，筛分，得到的颗粒均匀性和机械强度都不好， 柱效不高。在该技术发展早期，由于烙印物质的孔径过小，因此发展比较缓慢， 直到1 9 9 7 年大孔烙印整体色谱柱问世，才得到了较为快速的发展。 分子烙印整体柱的柱效一般不高，寻找新型交联剂，提高分子烙印聚合物孔 径的均匀性，以获得高的色谱柱效，是今后研究的主要方向。 3 3 整体色谱柱的主要特点 整体色谱柱相比常规的颗粒填料色谱柱，具有其特有的优点和性能，这些优。 点和性能使得整体色谱柱的应用范围越来越广，尤其是在快速分离、分析中的应 用正在不断地增加。整体色谱柱的优点表现为以下几个方面： 整体色谱柱可以在高流速下进行快速的分离、分析。采用原位聚合得到的整 体色谱柱比填料色谱柱具有更好的多孔性和渗透性，柱空间利用效率高。色谱柱 中既有流动相的流通孔( 接近1 口m ) ，又有便于溶质进行快速传质的中孔( 几十 个纳米) 。流动相的流通孔贯穿整个整体柱，可以提供足够的渗透性，由于对流 性能好还可以加速分离物质的传质过程，这样在分析过程中可以大大提高分离速 度。而且既使是在很高的流速下，整体色谱柱仍然可以使被分离物质保持良好的 峰形和具有很高的柱效。 整体色谱柱可以使所有的流动相通过各个流通孔，因此可以进行快速分离测 定，而不至于引起柱压升高、柱效降低等常规填料色谱柱通常出现的问题，尤其 适用于生物大分子的快速分离，可以大大减少分析测试的时间1 4 5 1 由于使用了聚合的方法来制各整体色谱柱，在制备过程中，可以在固定相中 引入多种可能的功能基团，使得整体柱具有十分多变的灵活性，选用的原料具有 广泛的选择性。 整体色谱柱内部结构均匀，重复性好，具有很高的柱效和稳定性 在毛细管电色谱中使用整体色谱柱可以避免塞子制作的难题，还可以排除由 于塞子制作而产生的气泡等问题。 3 4 整体色谱柱的主要应用 3 4 1 快速分析 整体柱具有多孔性的特点，因此具有极好的通透性。塔板高度( h ) 和柱压 升高( a p ) 对流速( u ) 曲线表明h 与a p 随u 的增加而增幅不明显，说明在较 大的流速下整体柱仍然具有较高的柱效。普通填充柱无法实现这一点，通常只有 通过减小填料粒径来提高柱效，但是填料粒径的减小又不可避免的引起柱压升 高。l u b d a h 印利用1 0 0 4 6 r a m 硅胶整体色谱柱，在流速为9 m l m i n 的条件下， o 6 r a i n 内基线分离了5 种1 3 1 0 0 c k i n g 药物，可见整体色谱柱在快速分析中具有 不可代替的优势。 3 4 2 流速梯度的实现 由于受柱压升高的限制，在普通填充柱上进行流速梯度洗脱不具有实际意义。 整体柱由于具有优异的渗透性，在较高的流速下仍然能够保持较高的柱效，适于 实现流速梯度。溶剂的洗脱能力随着有机组分含量的增加而发生变化，采用溶剂 梯度洗脱可以使吸附能力、或者离子交换能力差别较大的组分在合适的时间内流 出。但是在进行第二次同类实验时，需要用初始浓度的流动相平衡色谱柱，平衡 时间的长短和采用的浓度梯度的浓度差有关，增加了实验的时间。而采用流速梯 度在进行同类实验时，则无需平衡柱子，不仅节约了溶剂，还大大缩短了实验时 间。l u b d a “6 1 等采用分段流速梯度在6 m i n 内分离了9 种b 1 0 0 c k i n g 药物，使流 动相的流速成为优化分离的变量。 3 4 3 流速梯度与溶剂梯度相结合 尽管流速梯度比溶剂梯度具有更大的优势，但是有时候需要将两者结合起来 才能获得最佳的分离选择性。l u b d a 1 等采用流速梯度与溶剂梯度相结合的方 法在5 m i n 内分离了6 种酚类化合物。 整体色谱柱具有通透性好、制备简单、无需柱子填充和塞子制作等优点，作 为一种新型的分离介质，必将在分离、分析领域中扮演越来越重要的角色。整体 色谱柱已经在反相色谱，离子交换色谱，疏水作用色谱，亲和色谱，体积排阻色 1 9 谱等色谱分离系统中得到了广泛的应用。尤其适用于分离多肽“7 却1 、蛋白质 5 0 - 5 3 】、 类固醇1 5 4 芳烃口 刁、聚合物跚枷1 、低聚核苷酸吲砣、氨基酸1 等多种物质。 第四节对填充色谱柱的改性及其在离子色谱中的应用 在离子色谱固定相发展的过程中，伴随着出现了一类涂覆型的色谱柱固定 相，它和我们通常所说的色谱柱固定相有所差别，这些涂覆型的色谱柱固定相， 它所具有的离子交换功能基团不是通过化学键键合到固定相小球表面，而是通过 静电吸引、吸附等作用以一种动态的或者静态的方式涂覆到固定相表面。它的制 备过程可以在泵的作用下使一些表面活性剂或者其他具有离子交换功能基团的 物质的溶液流经色谱柱，也可以是在固定相填料未装柱之前，通过超声等手段以 静态涂覆的方式将这些物质涂覆到填料表面，然后装柱得到所需要的色谱柱。 选择合适的具有离子交换功能基团，同时又可以和固定相填料相互作用的物 质，在实际使用过程中可以起到意想不到的效果。这样得到的离子色谱固定相， 操作简单，对仪器没有特殊的要求，有时候甚至表现出比常规色谱固定相更好的 性能。 h u 等提出的静电离子色谱，实际上也是一种涂覆型的色谱固定相。他们在 反相的o d s 固定相表面涂覆两性离子表面活性剂，两性离子表面活性剂上长的 烷基链因疏水作用附着在o d s 表面，它所带的电荷端起到离子交换功能基团的 作用。这样得到的离子交换树脂同时具有正、负电荷端，在分离阴离子时，阴离 子同时受到正电荷的静电引力和负电荷的静电排斥作用，在实际的分离中，可以 使用纯水为流动相，而不需要加上其他的洗脱物质n 81 0 m 1 。 如6 3 。6 6 1 等采用p c - z s 两性离子表面活性剂，用水为流动相，成功的分离了钙、镁、钡等阳离子。但是 这种仅仅用纯水作为流动相的分离方法又有一定的缺陷。因为纯水中不含有抗衡 离子，因此待测离子必须和样品中带相反电荷的离子组成中性的离子对，当样品 中存在多种阴离子和阳离子时，会形成多种可能的组合，由于它们在固定相上受 到的作用力不同，洗脱时间也不同，检测器将检测到所有的离子对，因此对于一 种离子，可能出现多个色谱峰。 针对以上的问题，u m e m u r a 等哺7 1 首先提出了在样品溶液中加入高浓度的， 易于与阴离子形成离子对的阳离子，如镁离子等来阻止形成多种离子对的可能。 因为在镁离子浓度足够高的情况下，样品溶液中的阴离子都会和镁离子结合以镁 盐的形式存在，从而避免了多峰现象的发生，易于定量。之后h u 6 8 】和u m e m u r a 等m 9 又提出使用阳离子交换柱对样品溶液进行前处理，使得样品中只存在一种 2 1 阳离子。分析样品溶液中的阴离子时，每种阴离子就只形成一种离予对，可以方 便的用电导检测器或者紫外检测器进行定性和定量。 这种把两性离子动态涂覆到固定相表面的方法，主要是依靠两性离子和固定 相表面的疏水作用。采用的涂覆物不仅局限于表面活性剂，还可以是冠醚等物质。 k i m u r a 0 1 等将十二烷基取代的1 2 冠- 4 、5 一冠。5 和1 8 冠6 以及穴状配体等物质 动态涂覆在o d s 固定相上，分离了无机阳离子。 l a m b 等将穴位配体涂覆在几种反相填料上，用于分离阴、阳离子及糖、核 酸等。这样得到的固定相分离糖类具有优越性：二是采用的淋洗液离子强度较低， 可以与质谱检测器联用；二是采用的淋洗液的p h 值较低，可以避免寡糖的降解。 缺点是仅仅靠疏水性相互作用，太环化合物在固定相表面容易流失。 除了依靠疏水性相互作用以外，还可以通过静电引力的作用，使具有离子交 换功能基团的物质涂覆到色谱固定相表面。 t a k e u c h i “+ 等将多糖类物质动态涂覆在阴离子交换剂表面，用于分离阴 离子。由于这些多糖类物质含有羟基、磺酸基等带有负电荷的基圃，与阴离子交 换剂上的阴离子交换功能基之间存在强烈的静电引力，因此能够通过静电吸引作 用固定在阴离子交换树脂表面。未与阴离子交换树脂作用的剩余羟基、磺酸基等 负电荷基团在树脂表面形成负电荷层，当样品流经色谱柱时，样品中的阴离子因 树脂表面的负电荷层而受到排斥，影响它们在色谱柱上的保留。阴离子在色谱柱 上的保留是负电荷层之间的排斥力和离子交换功能基团之间的静电引力共同作 用的结果。他们用这样得到的色谱柱分离了无机阴离子，并采用硫酸铜淋洗液同 时分离了阴离子和阳离子。 和依靠疏水性相互作用吸附表面活性剂得到的色谱固定相相比，依靠静电引 力作用得到的固定相在使用过程中，涂覆物质的流失现象较少，因此色谱柱具有 更好的稳定性。 p a u l l 等还提出了永久涂覆螯合固定相和动态涂覆螯合固定相的概念。这些 概念不同于我们通常所说的静态涂覆和动态涂覆。 将疏水性螯合剂涂覆( 或者浸渍) 在合适的固定相上，可以得到用于分离金 属离子的固定相，仅以简单的水溶性的0 5 m o l l 1 0 m o l lk _ n 0 3 为淋洗液，就 可以分离海水，盐水等复杂基体中的碱土金属、部分过渡金属和重金属离子。p a u l l 和h a d d a d 竹5 1 把螯合剂已经涂覆在固定相上而不需要再向淋洗液中加入螯合剂的 涂覆方式，称为螯合剂在固定相上的永久涂覆。这种永久涂覆的螯合固定相，对 金属离子分离的选择性主要取决于金属离子与螯合剂间形成的条件稳定常数，因 此，淋洗液的p h 值对金属离子的保留行为有很大的影响，而离子强度对保留行 为几乎没有影响。 这方面的研究工作主要包括将选择性很高的疏水性金属显色配体永久涂覆 在疏水性的中性聚苯乙烯二乙烯基苯树脂或者反相硅胶固定相表面。常用的 金属显色配体是一些含有亚氨基二乙酸基的三苯甲烷和偶氮类螯合离子。如二甲 酚橙( x 0 ) 、甲基百里酚蓝( m t b ) 、邻甲酚酞( c p c ) 等。 j o n e s 和s c h w e d t 6 1 等将铬天青s ( c a s ) 螯合染料涂覆在粒径较大的 a m b e r l i t ex a d 4 树脂表面，制各成离子交换柱，该柱对二价和三价金属离子有 很好的富集与分离作用。之后他们发现大粒径的树脂对浓缩金属离子有很好的效 果，但是分离能力不强t 7 7 1 因此他们采用小粒径的h p l c 固定相，将x o 涂覆 在8 “n l 的p l r p s 树脂表面，以l m o l l 的k n 0 3 为淋洗液，实现了碱土金属离 子a a 2 + 、s p 、m 9 2 + 和c a 2 + 的分离。将x o 涂覆在粒径为1 0 u m 苯乙烯二乙 烯基苯表面，可以分离过渡金属离子1 7 8 1 此固定相在p h 0 5 1 1 5 范围内稳定。一 m t b 由于与x o 具有相似的物理结构而引起人们的注意。在最新的研究中，p a u l l 订9 1 等将m t b 涂覆在5u m 的苯乙烯二乙烯基苯表面，以o 5 m o l l 的k n 0 3 为淋洗液( p h 为1 4 ) ，铀离子可以在4 5 m i n 处被洗脱。调节p h 为1 2 5 时，c d + 在1 0 r a i n 处被洗脱，这两种离子的色谱峰很尖锐，甚至在浓度高达l m o l l 的n a c i 基体中，几乎没有拖尾，因此，该固定相可以用于测定盐水中的u 0 2 2 + 和c u ”。 虽然永久涂覆螯合固定相在应用中具有一定的优点，但是随着对此类固定相 研究的深入，一些不足之处也表现出来。将螯合剂永久涂覆在固定相上的不足之 处是：l 、当淋洗液中离子强度改变时，将影响螯合剂在固定相表面的浓度，可 能导致螯合剂从固定相表面析出，引起柱容量逐渐减少；2 、与共价键键合的高 效螯合柱相比，柱效相对较低1 8 0 - 8 1j 以等梯度洗脱方式及无机盐为淋洗液，仅 能实现三、四种金属离子的分离，而且保留时间超过5 m i n 的色谱峰迅速变宽。 解决上述问题的方法之一是在永久涂覆固定相( 即将疏水性的螫合剂通过疏 水作用涂覆在固定相上) 的基础上，在淋洗液中加入同样的螯合剂，这样，淋洗 液中的螯合剂与固定相上的螯合剂可以形成动态平衡。由于螯合剂既存在于流动 相中，又存在于固定相中，所以它实际上起到了络合淋洗液的作用，可以用来控 制动态涂覆的螫合固定相的选择性和金属离子的保留时间。 动态涂覆螯合固定相是由p a u u 和h a d d a d n 2 等首先提出的。他们采用多孔 石墨碳( g p c ) 为固定相，以含有o 4 m m o l l 的氯代十六烷基吡啶( c p c ) 的甲 醇水溶液为流动相( p h = 1 0 ) ，用于海水啦! 和湖水哺3 1 中m 9 2 + 和c a 2 + 的测定。 由于g p c 有很强的疏水性，导致动态涂覆的色谱柱的柱容量很高，以上两种离 子的保留时间很长。之后，他们又用苯乙烯二乙烯基苯反相柱代替g p c 柱 研究影响g p c 动态涂覆的螯合固定相对碱土金属离子选择性的影响因素1 8 4 1 结 果表明，碱土金属离子在动态涂覆的苯乙烯二乙烯基苯反相柱中的保留时间 与g p c 柱中的保留时间相比明显缩短，这主要是由于这两种固定相的疏水性不 同，而固定相的疏水性会直接影响动态涂覆的色谱柱的容量。苯乙烯二乙烯 基苯反相柱的疏水性比g p c 柱的疏水性低，因此动态涂覆的色谱柱的柱容量小， 分离m 9 2 + 和c a 2 + 所需要的甲醇水溶液中甲醇的体积分数减少。之后，他们将m t b 动态涂覆在上述反相聚合物固定相上，以o 5 m o u l 的k n 0 3 和0 2 m m o l l 的m t b 为淋洗液( p h = 2 1 ) ，1 5 m i n 内实现了m 矿+ ( 不被保留) 、m n 2 + 、z n 2 + 、c d 2 + 和p b 2 + 的分离。他们又用反相o d s 柱代替反相聚合物柱1 8 5 1 发现在反相o d s 固定相 上m t b 涂覆量比在反相聚合物固定相上多，只有用酸性更强的淋洗液( p h 一1 9 ) 才能将上述金属离子分离。 从我们对动态涂覆和静态涂覆的定义可以看出，永久涂覆螫合固定相和动态 涂覆螯合固定相本质上都属于动态涂覆。 我们所说的动态涂覆通常是指通过泵等手段让具有离子交换功能的物质以 一定的流速流经色谱柱固定相，通过和固定相表面的相互作用，对固定相进行改 性和修饰；所说的静态涂覆通常是指用超声等方法，在固定相颗粒的表面进行改 性和修饰，然后通过匀浆装柱等手段，把得到的固定相填料颗粒装到空的色谱柱 管中，得到色谱柱。 向丽娟嵋5 1 等采用静态涂覆的方法，在国产n g w - 0 4 苯乙烯二乙烯基苯 共聚体小球上涂覆具有较大疏水性的氮杂三芳稠环结构的季铵化合物，n 十六烷 基一b 萘喹啉溴化铵盐，将涂覆得到的小球通过匀浆装柱的方式填充到空的色谱 柱管中，得到离子交换色谱柱( 3 5 0 x 3 m m ) 。通过分离f 、c i 、b f 、n 0 3 。、c 1 0 2 。、 i 、5 0 4 2 和b f 4 等常规阴离子来考察九种不同淋洗液体系与涂覆上的表面活性剂 的相互作用以及它们对这些离子的分离效率。 接下来，他们婚6 1 同样采用静态涂覆的方法，在国产n g w - 0 4 苯乙烯二 乙烯基苯共聚体小球上涂覆n 十六烷基吡啶溴化铵盐，通过匀浆装柱得到具有 离子交换功能的离子色谱柱( 3 5 0 x 3 m m ) 。这样得到的色谱柱对各种常规阴离子 的分离能力很好，不仅可以同时分离4 个卤素阴离子，而且对一些大阴离子如 b r 0 3 。、c 1 0 2 。、i 和b f 4 等也可以得到很好的分离以及很尖锐的色谱峰。 在总结以上涂覆经验以及考察到毗啶季铵盐阳离子的电性和空间结构效应 对阴离子色谱性能产生不同影响的前提下，他们进一步讨论了不同结构的氮杂环 芳环的n 烷基季铵盐改性共聚体小球得到的阴离子交换色谱