（有机化学专业论文）脱氧核糖核酸（dna）与靶向药物分子相互作用的电化学研究.pdf

浙江大学理学博士学位论文 中文摘要 脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物的基本遗传物质，是遗传信息的载体。许多 分子能与d n a 结合，破坏d n a 的模板作用，影响基因调控和表达功能，从而 诱发很多生物效应。因此d n a 与靶向药物分子相互作用的研究是分子生物学和 生物化学的重要领域。d n a 与靶向药物分子相互作用的研究不仅可以从分子水 平阐明生命过程机理、疾病的致病机制，而且可以引导药物的设计与合成、药物 体外筛选以及探讨药物的治病机理。另外，对双链d n a ( 或单链d n a ) 具有选 择性结合或具有序列特异性结合的靶向药物分子可以作为d n a 分子杂交与否或 识别特定序列d n a 的指示剂，这是d n a 生物传感器研究的一个重要内容。 论文第一章分别从d n a 与靶向药物分子相互作用的意义、实质、研究方法、 研究现状、以及电化学研究d n a 与靶向药物分子相互作用的原理、特点、现状 及常用理论等方面对d n a 与靶向药物分子的相互作用进行了系统的综述。 在总结前人工作的基础上，论文第二章推导了适用于研究具有不可逆电活性 的靶向药物分子与d n a 相互作用的电化学理论公式，以该公式为模型函数，通 过简便的电化学实验获得数据及对数据基于最d , - 乘思想的非线性拟合，可以同 时获得靶向药物分子与d n a 结合前后的扩散系数及其与d n a 结合的碱基对数 和结合常数。运用该理论分别研究了与d n a 存在非嵌插结合的不可逆靶向药 物分子( h o e c h s t3 3 2 5 8 ) 与天然鱼精d n a ( f s d n a ) 之间的相互作用和与d n a 存在 嵌插结合的不可逆靶向药物分子( 米托蒽醌和放线菌素d ) 与天然小牛胸腺 d n a ( c t d n a ) 的相互作用，分别获得了各种靶向药物分子与d n a 结合前后的扩 散系数及其与相应天然d n a 相互作用的结合常数和结合位点数。实验表明，该 理论提供了一种研究d n a 与电活性靶向药物分子相互作用的快速、简便、灵敏 的方法。 论文第三章基于m c g h e e y o nh i p p e l 研究d n a 一蛋白质相互作用的理论假设， 运用概率统计学中的条件概率，引进了靶向药物分子间相互作用参数，综合考虑 影响d n a 与靶向药物分子相互作用的多种因素，根据d n a 与靶向药物分子作 用前后伏安特性的变化，推导了复杂体系d n a 与靶向药物分子相互作用的电化 学新方程，分别获得了靶向药物分子间不存在相互作用和存在相互作用时的两种 浙江大学理学博士学位论文 形式。 以该新方程为模型函数，通过简便的电化学实验获得数据及对数据基于 最小二乘思想的非线性拟合，可以直接获得d n a 与靶向药物分子的结合常数芷、 结合位点数s 以及靶向药物分子问相互作用参数等。该新方程不但适用于存在 单种靶向药物分子或单组结合部位的理想体系，而且可以被延伸用于更符合实际 情况的多种靶向药物分子或多组结合部位共存的复杂体系。运用该新方程分别 研究了染料亚甲基蓝( m b ) 和耐尔蓝( n b ) 与天然或变性后的c t d n a 的相互作用 以及种细胞活力指示剂红四氮哗( t t c ) - 与天然c t d n a 的相互作用，探讨了染 料x , t x x 链d n a ( 或单链d n a ) 的选择性结合。本研究为靶向药物分子的设计与 筛选，以及手性靶向药物分子与d n a 的立体选择性结合提供了相对全面、简便、 快捷而可靠的研究手段。 浙江人学理学博士学位论文 a b s t r a c t d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) c o n t a i n sg e n e t i ci n f o r m a t i o ni no r g a n i s m s t h e i n t e r a c t i o no f d n aa n dt a r g e t i n gd r u g sh a sb e e nt h es u b j e c to fi n t e n s ei n t e r e s t ，d u et o i t s i m p o r t a n tr o t ei nl i f es c i e n c e t h es t u d yo fd n a t a r g e t i n gd r u g si n t e r a c t i o nc a n n o to n l ye x p l a i nt h ep r i n c i p l eo f l i f e ，d i s e a s e s ，b u ta l s og u i d ed r u gs y n t h e s i s ，f i l t r a t i o n a n da c t i o n f u r t h e rm o r e ，t h e t a r g e t i n gd a a l g s ，w h i c h b i n dt od o u b l es t r a n d e d d n a ( d s d n a ) o rs i n g l e s t r a n d e d d n a ( s s d n a ) s p e c i a l l y , c a n b eu s e da s h y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o r sf o rd n a b i o s e n s o r i nc h a p t e ro n e ，t h es y s t e m i ca s p e c t s ，i n c l u d i n gt h es i g n i f i c a n c e ，p r i n c i p l e ，s t u d y m e t h o d sa n dr e c e n ta d v a n c e so ft h ei n t e r a c t i o no fd n aa n dt a r g e t i n gd r u g sw e r e r e v i e w e d t h ep r i n c i p l e ，c h a r a c t e r i s t i c ，r e c e n ta d v a n c e sa n dg e n e r a lt h e o r i e so f e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o da r ee s p e c i a l l yd i s c u s s e d ， o nt h eb a s i so ft h ef o r m e rw o r k w ed e d u c e dan e we l e c t r o c h e m i c a le q u a t i o nt o e x a m i n et h ei n t e r a c t i o no fd n aa n d t a r g e t i n gd r u g s i ni r r e v e r s i b l ee l e c t r o d e p r o c e s s e s i n c h a p t e r t w o t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n t s o f t a r g e t i n gd r u g a n d d n a t a r g e t i n gd r u gc o m p l e x ( d d b ) ，t h eb i n d i n gc o n s t a n t a n db i n d i n g s i t es i z e ( s ) o fd n a t a r g e t i n gd r u gc o m p l e xc o u l db eo b t a i n e db y n o n l i n e a rf i ta n a l y s i so ft h e e x p e r i m e n t a l d a t aa c c o r d i n gt ot h e e q u a t i o n t h em e t h o dw a su s e d t o s t a d yt h e n o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o n so f t w o g r o u p so f m o d e l d n aa n dt h r e e t a r g e t i n gd r u g s f i s h s p e r md n a ( f s d n a ) a n d c a l ft h y m u sd n a ( c t d n a ) w e r es e l e c t e da sm o d e ld n a h o e c h s t3 3 2 5 8 ( h o c c h s t ) i san o n i n t e r c a l a t i v e t a r g e t i n gd r u g ，a n d m i t o x a n t r o n e ( m x t ) a n da c t i n o m y c i nd ( a m d ) ，a r ei n t e r c a l a t o r s d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t so ff l e e a n dd n a b i n d i n gd r u g s ，t h eb i n d i n gc o n s t a n t ( 固a n dt h es i z eo fb i n ds i t e0 ) f o rt h e i n t e r a c t i o nw e r eo b t a i n e df r o mt h ed e p e n d e n c eo f d r u gc u r r e n to nd n aa m o u n tb a s e d o nt h ed e d u c e de q u a t i o n t h es t u d yp r o v i d e sac o n v e n i e n tm a ds e n s i t i v ea p p r o a c hf o r e s t i m a t i n ga f f i n i t yp a r a m e t e r s a n d o u t l i n i n g t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n d e l e c t r o a c t i v et a r g e t i n gd r u g s t h ei n t e r a c t i o np r o f i l ec o u l db ed r a w nq u i c k l yb yt h i s w a y t h em e t h o do f f e r sg r e a tp r o m i s ef o rf u r t h e rs t u d yo f i n t e r a c t i o no fd n aa n d 3 浙江大学理学博士学位论文 e l e c t r o a c t i v ed r u g s w ed e r i v e dn e we l e c t r o c h e m i c a l e q u a t i o n s b a s e do ns t a t i s t i c a l a r g u m e n t s t o d e s c r i b eb o t hr l o n - c o o p e r a t i v ea n d c o o p e r a t i v eb i n d i n go fa n ys i z et a r g e t i n gd r u g st o d n ai nc h a p t e rt h r e e t h eb i n d i n gc o n s t a n t ( 固，t h ec o o p e r a t i v ep a r a m e t e rb e t w e e n t a r g e t i n gd r u g s ( c o ) a n db i n d i n g s i t es i z e ( s ) o f d n a t a r g e t i n gd r u gc o m p l e x c o u l db e o b t a i n e db yn o n l i n e a rf i t a n a l y s i s o ft h ee x p e r i m e n t a ld a t aa c c o r d i n gt ot h en e w e q u a t i o n t h ee q u a t i o nc a r lb ew i d e l yu s e dt oa n a l y z ee x p e r i m e n t a ld a t a t h em e t h o d c a nb ee x t e n d e dt os y s t e m si n v o l v i n gs e v e r a ld i f f e r e n tt a r g e t i n gd r u g sa n ds o m e t y p e s o fd n a ，i tc a r la l s os t i m u l a t et h e o r e t i c a la n dc o m p u t a t i o n a li n v e s t i g a t i o n st of u r t h e r e x p l o r et h eq u a n t i t a t i v ep r o p e r i t i e so f t h em o d e l t h em e t h o dw a su s e dt os t u d yt h e n o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o n so fs i n g l e s t r a n d e d ( s s e t d n a ) o rd o u b l es t r a n d e dc a l f t h y m u sd n a ( c t d n a ) a n d t h r e ed i f f e r e n tt a r g e t i n gd r u g s ，i n c l u d i n gm e t h y l e n eb l u e ( m b ) ，n i l eb l u e ( n b ) a n dt e t r a z o l i u mc h l o r i d e ( t t c ) t h es t u d yp r o v i d e s a c o n v e n i e n ta n ds e n s i t i v ea p p r o a c hf o rd r u gf i l t r a t i o na n ds e l e c t i v i t yb e t w e e nd n a a n de l e c t r o a c t i v et a r g e t i n gd r u g s 4 浙江大学理学博士学位论文 第一章：d n a 与靶向药物分子相互作用的研究进展 脱氧核糖核酸( d n a ) 是重要的遗传物质，在生命起源、进化过程中起着决定 性的作用。许多靶向药物分子能与d n a 发生相互作用，改变d n a 的正常结构， 影响d n a 的生理和物理化学性质，改变d n a 的转译和复制，破坏其模板作用， 进而影响基因调控和表达功能【i _ “。因此，研究d n a 与靶向药物分子的相互作用 有助于人们对d n a 与蛋白质相互作用方式的了解，不仅可以从分子水平阐明生 命过程机理、疾病的致病机制，而且可以引导药物的设计与合成、药物体外筛选 以及探讨药物的治病机理。目前，将d n a 靶向药物分子作为d n a 生物传感器 的各类探针标记，用于疾病诊断、遗传鉴定、环境监测、基因疗法等，研究该类 分子与d n a 的相互作用在探针标记分子的设计与筛选方面具有直接而有效的指 导意义。 第一节研究d n a 与靶向药物分子相互作用的意义 d n a 与靶向药物分子相互作用其实质为靶向药物分子( 主体) 对生物大分子 d n a ( 客体) 特定部位的识别作用及其对整个大分子构象产生的影响，其内容包括 靶向药物分子对d n a 作用位点、作用方式及作用强度的研究。d n a 平行堆积的 碱基、聚合的阴离子磷酸骨架，以及两条核苷酸链螺旋形成的大沟( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 构成了靶向药物分子的作用位点。因此要充分了解研究 d n a 与靶向药物分子相互作用的意义，我们必须从d n a 的组成与结构、d n a 的某些重要特性以及d n a 的生物学功能等方面阐明。 一、d n a 的组成与结构 脱氧核糖核酸( d n a ) 是由数量极其庞大的四种脱氧核糖核昔酸即：脱氧 腺嘌呤核苷酸、脱氧鸟嘌呤核苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧嚏核苷酸， 通过3 ，5 一磷酸二酯键连接起来的多聚体。由于这些聚核苷酸的磷酸基团 呈酸性，因此在生理p h 下，d n a 为聚阴离子。 j a m e sw a t s o n 和f r a n c i sc r i c k 两人在1 9 5 3 年提出的d n a 分子双螺旋结构 模型( b d n a ) 在分子生物学发展上具有划时代的贡献，为分子生物学和分子 遗传学的发展奠定了基础。w a t s o n 和c r i c k 所提出的d n a 模型具有以下特性： 浙江人学理学博士学位论文 1 两条反向平行多核苷酸链围绕同一中心轴以右手螺旋方式相互缠绕，形 成直径约为2n n l 的双螺旋 图1 1 1b d n a 结构模型 f i g 1 1 1 t h es t r u c t u r em o d e lo f b d n a 2 碱基位于双螺旋的内侧，磷酸基团一核糖链形成骨架处在外侧，从而使 荷电磷酸基团问排斥力最小。双螺旋结构上有二条宽度不等的螺形凹沟：即大沟 f m a j o rg r o o v e ) 和d 沟( m i n o rg r o o v e ) ( 如图1 1 1 ) 。 3 每个碱基通过氢键与另一条反向链的一个碱基形成平面的碱基对，并且 碱基对平面与螺旋轴几乎垂直。w a t s o n c r i c k 模型只允许两类碱基对，即腺嘌呤 残基( a ) 只能与胸腺嘧啶残基( t ) 相配对，鸟嘌呤残基( g ) 只能与胞嘧啶残 暴( c ) 相配对。上述碱基之间的氢键相互作用称为碱基互补。碱基互补配对是 d n a 双螺旋的主要特征。只要一条链上的碱基序列确定后，另一条互补链的碱 6 浙江大学理学博士学位论文 基序列也就随之被决定了。这种互补关系在d n a 分子复制过程中具有极大的重 要性，它构成了分子生物学中心法则的基础。 4 理想的b d n a 螺旋两个相邻碱基对沿轴旋转3 6 。并上升o 3 4n m ，即 碱基堆积距离为o 3 4 i n i l 。所以，每1 0 个碱基对旋转一圈成一个螺旋结构，螺距 34n m 。 在生物体内，绝大部分d n a 是以b d 1 呵a 形式存在的。 二、b d n a 的某些重要特性 1 d n a 分子的长度。天然d n a 分子的长度往往是很长的。如大肠杆菌染 色体d n a 长度为1 4 1 0 6n i n ，远远大于它的直径。 2 d n a 的稳定性。d n a 双螺旋结构在生理状态下是很稳定的。维持这种 稳定性的主要因素是碱基堆积力( b a s es t a c k i n gf o r c e ) 矛l a 疏水作用。嘌呤与嘧啶碱 形状扁平，呈疏水性，分布于双螺旋结构内侧。大量碱基层层堆积，两相邻碱基 的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的水 分子隔开。研究表明带电荷的嘧啶碱基间倾向于不堆积，而在嘌呤碱基间存在明 显的碱基堆积作用。碱基堆积相互作用的强度与堆积碱基之间环的大小成正比。 嘌呤碱基和嘧啶碱基之间堆积作用表现出嘌呤一嘌呤 嘌呤一嘧啶 嘧啶嘧 啶的趋势。而垂直方向的堆积强度不仅与组份有关，而且受顺序影响。同为g c 碱基对比a t 碱基对更稳定，所以富含g c 的堆积二聚体比富含a t 的 堆积二聚体在能量上更有利。其次，大量存在于d n a 分子中的其他弱键在维持 双螺旋结构的稳定上也起一定作用。这些弱键包括：互补碱基对之间的氢键；磷 酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成离子键( 静电作用力) ；范德华引 力( v a nd e r w a a l sf o r c e ) 。 3 d n a 的变性、复性和杂交。d n a 的变性指d n a 双螺旋区的氢键断裂， 变成单链，而并不涉及共价键断裂的情况。变性d n a 在适当条件下，又可使两 彼此分开的链重新缔合( r e a s s o c i a t i o n ) 成为双螺旋结构，这过程称复性。d n a 复 性后，许多物化性质又得到恢复。生物活性也得到部分恢复。将不同来源的d n a 经热变性后，慢慢冷却，让其复性。这些异源的d n a 之间在某些区域有相同的 序列，在复性时则会形成杂交d n a 分子。d n a 的杂交在分子生物学和分子遗传 学的研究中应用极广，因此具有重要的意义。 7 浙江大学理学博士学位论文 三、d n a 的生物学功能 1 d n a 是遗传物质，是所有细胞和大多数病毒的遗传信息的载体。生物机 体的遗传信息以密码的形式编码在d n a 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序， 并通过d n a 的复市1 ( r e p l i c a t i o n ) 由亲代传递给子代。 2 基因指导蛋白质的合成。所谓基因是指一段编码蛋白质多肽链的d n a 。 在后代的生长发育过程中，遗传信息自d n a 转录( t r a n s c r i p t i o n ) 给r n a ，然后翻 译( t r a n s l a t i o n ) 成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似 的遗传性状。 因此d n a 是生物体的重要组成物质，在它的碱基对中储存着与生物的生长、 发育等正常生命活动以及癌变、突变等异常生命活动相关的遗传信息。 四、靶向药物分子与d n a 相互作用的生物学意义 基于机理研究通常考虑三个生命过程中非常重要的生物靶，它们是酶、狭义 受体和核酸。理论上来看，核酸是最重要的生物靶，因为所有的酶和受体都是蛋 白质，都是从d n a 经转录、翻译等过程产生的。阻断与疾病有关的早期阶段之 一，就是关闭或调整合成这些不正常的酶和受体的途径。b d n a 通常认为是主 要的有生物活性的d n a ，二条右手螺旋单链组成的双螺旋在其外表面组成有区 别的槽沟，这些槽沟分别称为大沟( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) ，这 些槽沟提供的结构信息，可以使我们了解靶向药物分子与天然d n a 相互作用的 情况。按一定序列编码的碱基处于双螺旋结构中，从外面可以读出，靶向药物分 子从槽沟可以接近碱基。这里的靶向药物分子是指以d n a 为作用靶的所有分子， 包括d n a 本身、蛋白质、r n a 和一般的小分子等。 靶向药物分子与d n a 的相互作用将直接影响到基因的表达。所谓基因表达 即遗传信息的转录和翻译过程。基因表达的调节和控制已成为最引人注目的研究 课题之一。通过对基因表达调节机制的认识将使我们更有效地控制生物的生长发 育。靶向药物分子与d n a 的结合常常诱发很多生物效应。而以d n a 的空间结 构的运动性为基础研究靶向药物分子与d n a 的相互结合，是以d n a 为靶分子 进行药物设汁的分子基础。目前几乎所有抗肿瘤药物都是以d n a 作为作用靶点， 通过直接损伤d n a 或抑制d n a 的合成而达到目的。因此研究d n a 与靶向药物 分子的相互作用，将有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质，并从基因水 浙江大学理学博士学位论文 平上理解某些疾病( 如癌症、爱滋病) 的发病机理，从而使通过分子设计寻找有 效的治疗和诊断药物成为可能。 此外，d n a 靶向药物分子的另一重大用途是作为d n a 生物传感器的杂交指 示剂。d n a 生物传感器是9 0 年代的一个新的研究热点。它是将有反应活性的已 知序列的单链d n a 固定在某种支持物( 感受器) 上作为探针，它可以在含有复 杂成分的环境下特异地识别与之互补的目标d n a ，并通过换能装置转换为可记 录信号。换能装置即信号转换装置是d n a 生物传感器的重要组成部分，而d n a 靶向药物分子则是标识型换能器的杂交指示剂。 第二节d n a 与靶向药物分子相互作用的实质 从化学键角度讲，d n a 与靶向药物分子相互作用的实质为氢键、离子键、 范德华力、疏水键等分子问作用力共同作用的结果。由这些分子间作用力决定了 d n a 与靶向药物分子之间主要存在三种作用方式：静电结合( e l e c t r o s t a t i c b i n d i n g ) 、沟区结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌插结合( h l t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) 吲。 一、d n a 与靶向药物分子相互作用存在的主要作用力 d n a 与靶向药物分子之间的相互作用按化学键来划分主要有共价键作用和 非共价键作_ 耳j 两种。共价键结合主要表现为d n a 的烷基化及d n a 的链间交联、 链内交联等。大多数靶向药物分子与d n a 作用都是非共价键作用。非共价键一 般称作次级键，d n a 与靶向药物分子间的非共价结合一般与下列次级键有关： 1 三维空矧排列的相互匹配性； 2 范德华引力： 3 偶极一偶极相互作用： 4 离子键( 静电作用) ； 5 氢键； 6 疏水作用。 其中最主要的是氢键、离子键、范德华力和疏水键。d n a 与靶向药物分子的结 合往往是多种因素共同作用的结果。 偶极键分偶极一偶极键和离子一偶极键。氢键其实也是一种偶极一偶极键。 在氢键中，氢原子像座桥处于两个电负性原子之间，一边是共价键原子，另一边 浙江火学理学博士学位论文 是与之发生静电力的原子。电负性原予除羰基氧外，还可以是氧和氮原子等。出 于氢键的形成有它严格的空间方向的要求，它在d n a 和靶向药物分子互相识剐 上起特别重要的作用。 靶向药物分子的非极性基团与极性的体液形成界面，d n a 的非极性基团( 如 碱基) 也与极性的体液形成界面。体系的能量与界面的大小成正比，由体液包围 朐非极性界面越大，则能量越高。当两个基团互相靠拢，将界面的极性体液排开， 即发生缔合，此时界面减小，能量释放，这种缔合即为疏水作用。 可以用实验方法测得d n a 与靶向药物分子之间的亲和力，即平衡常数k 。 并且根据相互作用的键的类型来评估亲和力的强弱( 表1 2 ，1 ) 。 表1 2 1d n a 一靶向药物分子相互作用的类型和强度 t a b l e1 2 。1 c a t e g o r i e s a n d i n t e n s i t yo f d n a t a r g e t i n gd r u g s i n t e r a c t i o n i 键的类型a g o k j m o i键的类型 x g o k j m 0 1 l 共价键 一( 1 7 0 4 2 0 ) 氢键一f 4 2 9 ) i 离子键 一陀1 4 2 ) 疏水作用 一4 】偶极键一( 4 2 9 )范德华力- ( 2 4 ) 二、d n a 与靶向药物分子非共价相互作用的方式 大多数靶向药物分子与d n a 的作用都是非共价结合。非共价键一般称作次 级键，属于弱作用键，而在分子水平的生命现象中，上述弱作用键是一种决定性 因素，形成了各种大分子生物功能所要求的空间结构，因而主导着靶向药物分子 与d n a 作用的特异性。靶向药物分子与d n a 结合的部位是d n a 的碱基、磷酸 骨架和戊糖环。d n a 由平行的碱基、聚阴离子磷酸骨架以及大沟和小沟组成了 靶向药物分子识别的位点。非共价键相互作用的方式主要有： 1 - 外部静电结合。d n a 是一个高度带电的聚合电解质，它的阴离子磷酸骨 架强烈地影响d n a 的构象及其反应。这种带电的高聚物的构象需要在以靶向药 物分子作为抗衡离子的协同作用中达到完全稳定。这种沿着螺旋外部静电相互作 用都是非特异性的。因此认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架。 2 沟区( 大沟区、小沟区) 结合。靶向药物分子与d n a 的大沟或小沟的碱基 浙江人学理学博士学位论文 对边缘直接作用。大沟区、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上 都有很大差别。很多大分子蛋白质与d n a 特异性的结合是通过d n a 大沟区作 用。而分子量小的靶向药物分子则是在小沟区作用。典型的小沟区结合的靶向药 物分子多含有几种简单的芳香杂环结构如呋喃、毗咯或苯环，这些芳环由扭转自 由的键来连接，由此产生合适的扭转力来配合小沟区内的螺旋曲线，取代沟区中 的水分子并与d n a 双螺旋链中沟区的碱基对边缘通过范德华引力形成接触，从 而导致靶向药物分子在小沟区结合的特异性。小沟区是a t 富集区，不像g c 富 集区比较宽，在宽的区域靶向药物分子需要拒绝明显的结合部位，比较松散，特 异性不明显。而在a t 富集区，靶向药物分子通过与胸腺嘧啶碱基c ，2 上的羰基 氧( c o ) 或腺嘌呤碱基n 一3 上的氮形成氢键与a t 碱基结合。虽然同样的基 团在g c 碱基对上也存在，但是鸟嘌呤上的氨基在氢键形成时有立体障碍，对于 靶向药物分子进入g c 富集区有一定的抑制。同时p u l l m a n i 4 l 等已经说明了d n a 的a t 小沟区的负的静电势要大于g c 富集区，这是形成d n a 沟区特异性作用 的一个静电因素。总之，小沟区结合的靶向药物分子就这样选择性地作用于d n a 双螺旋结构中a t 较丰富的片段，通过氢键、范德华引力等作用，非嵌入性地捆 缚住d n a ，从而阻止d n a 的模板复制，起到抗病毒、抗肿瘤的作用。 3 嵌插结合。靶向药物分子的平面或几乎平面的芳香稠环结构嵌入碱基对 之间。这是芳香稠环与碱基间的n n 体系、偶极一偶极相互作用及疏水作用的 结果。在经典的嵌插模型中，由于嵌插部位的形成引起了碱基对的分丌，螺旋伸 长0 3 4r l n 3 ，这正是典型的芳环系统的厚度。实际上这是一个最大值，一般观察 到的螺旋的伸长均小于0 3 4 n m 。碱基对之间正常的旋转角为3 6 。，由于嵌插， 螺旋解链，造成螺旋扭转角的减小，不同的嵌插结构及不同的d n a 序列所造成 的解链程度是不同的，乙锭及丙基哌啶与d n a 嵌插时解链角是2 6 。，吖啶及吖 啶橙的解链角是1 7 。，而柔红霉素及阿霉素则是每个结合分子令d n a 解链1 1 。，一些靶向药物分子f 是通过嵌入d n a 令d n a 构象发生改变，使其不能或 不易复制，而显现出抗肿瘤、抗病毒的活性的【5 。出于嵌插造成的d n a 双螺旋 的解链和伸长是嵌插结合方式的一个重要特征。另外，由嵌插引起的靶向药物分 子方面的变化特征也是非常明显的。这是由嵌插剂与d n a 双螺旋内碱基对之间 的次级键作用造成的。嵌插入d n a 的靶向药物分子与碱基对形成有序的堆积， 浙江大学理学博士学位论文 嵌插化合物表面紧紧地挨着d n a 碱基的芳香杂环，在双螺旋中以n n 共轭，偶 极偶极相互作用从电性上达到稳定。 热力学和动力学分析表明，嵌入剂分子与d n a 的相互作用是一个两步非协 同性的结合过程，即首先是一个快的、扩散控制的结合在双螺旋外侧磷酸基团的 过程，接着是一个嵌入到d n a 内部的过程。 将沟区结合的分子和嵌插剂比较，则沟区结合分子有更明显的结合特异性， 就平面芳环系统来说，在a t 、g c 产生的嵌插腔却是很小的，静电、范德华引力、 氢键、疏水键等对结合所作出的贡献，就两种部位而言是相同的。但是，当沟区 结合的分子伸向d n a 络合物的沟区中时能够接触更多的碱基对，这就决定了它 内在的较强的识别倾向。而且正如前面所论述的，沟区在a t 区域及g c 区域中 无论是电势能、氢键特征还是立体效应，水合作用上都有很大的不同，这就更增 加了沟区结合试剂反应专一j 生的倾向。而对那些带有与非邻近碱基接触的取代基 的嵌插剂或者能够引起邻近结合部位d n a 序列扭曲的嵌插剂，特异性结合的可 能性更大一些。对照沟区结合分子的a 1 、碱基对的倾向性，d n a 嵌插剂或许有 轻度的g c 碱基对的倾向性，并旦这一结合特异性不仅与可极化的嵌插剂的偶极 反应有关，也与氢键特征、立体效应、水合程度及沟区的静电势等一系列因素有 关。 三、靶向药物分子的选择性 作为以d n a 为作用靶的药物分子，必须与d n a 有选择性的强结合，损伤 d n a 分子或改变d n a 构象，从而影响d n a 的复制功能。因此，靶向药物分子 与d n a 的特异性、选择性结合的研究在药物设计中非常重要。特别是以d n a 的分子识别为出发点，以序列选择性识别( s e q u e n c es e l e c t i v i t y ) ，位点专一性识别 ( s i t es p e c i f i c i t y ) 及形状选择性识别( s h 印es e l e c t i v i t y ) 为导向，进行靶向药物分子的 理性设计，是生命科学领域的重大课题。 氢键使得分子间具有选择性，疏水作用增强了这一分子识别。作用于生物靶 的分子特异性是减低毒副反应的必要条件。各种不问蛋白质只通过2 0 个氨基酸 的序列产生差异，而不同的d n a 只通过4 个碱基的不同序列来产生差异。这意 味着在人类的基因中必须具有1 5 - - 1 6 个以上碱基组成的片段才有专一性。完整 的d n a 必须从螺旋结构的外部来识别。从每一个大沟只能识别4 个碱基，小沟 2 浙江火学理学博士学位论文 只能识别2 个碱基。因此对于一个有高度特异性的识别分子必须非常大，并有单 一的形状可以识剐很多碱基。这就是为什么有高度特异性的识别d n a 的分子是 蛋白质和与被识别链互补的d n a 或r n a 。很多靶向药物小分子没有复杂的形状 可以与d n a 相互作用，虽然某些结合表现出了一定的碱基选择性，但是这种识 别的碱基对数相当有限，而不能识别基因的序列信息，因而不能特异地与特殊基 因作用，缺少专一性和选择性，作为药物，则表现为毒副作用。 为了了解通过d n a 结合蛋白的基因调控机理或抗癌药物与d n a 相互作用的 本质，双螺旋d n a 的选择性识别一直是一个活跃的研究领域。d n a 识别系统包 括所有天然或人工合成的能识别特定核苷酸序列的生物大分子和小分子。 另外，对双链d n a ( 或单链d n a ) 具有选择性结合或具有序列特异性结合 的靶向药物分子可以作为d n a 分子杂交与否或识别特定序列d n a 的探针标记， 这是d n a 生物传感器研究的一个重要内容。 第三节：研究d n a 与靶向药物分子相互作用的方法 d n a 一靶向药物分子相互作用一直是一个比较活跃的研究领域。抗癌药物 与致癌物、致突变物一样，能与d n a 相互作用而表现抗癌活性。d n a 测序技术 的发展大大推动了d n a 一靶向药物分子相互作用的研究。本节总结了研究d n a 与靶向药物分子相互作用的各种方法。 研究d n a 与靶向药物分子相互作用的常用方法有凝胶电泳法、足迹法、光 谱法及x 一射线衍射等。随着化学与生命科学的不断相互渗入，最近又发展了电 化学方法、质谱法( m s l 、核磁共振法( n m r ) 、粘度法及微量热法等。 凝胶电泳是生物学中用来研究d n a 与靶向药物分子相互作用最基本的手 段，是分离、纯化、鉴定、制各d n a 片段最常用的方法。它可以考察d n a 剪 切或靶向药物分子与d n a 螺旋共价结合留下的永久性“痕逊”，研究靶向药物 分子与d n a 作用的序列特异性。研究靶向药物分子对d n a 的剪切作用要用高 分辨聚丙烯酰胺凝胶电泳。 d n a 足迹法的基本原理是用一种化学合成酶学切割试剂对单末端标记的结 合有药物的d n a 限制性片段进行切割。在热变性后，用标准d n a 序列胶对寡 核苷酸产物进行分析，通过还原由足印迹放射自显影图所显示的终止在药物结台 浙江大学理学博士学位论文 位点的寡聚体量来证实药物的结合位点。它主要用于分析非共价结合的d n a 一 靶向药物分子复合物。 d n a 与靶向药物分子相互作用后d n a 引p n m r 谱化学位移向低场方向移动 或嵌插剂分子上芳环质子的1 h n m r 谱的化学位移向高场方向移动，同时由于弛 豫时间的改变，谱峰明显拓宽。根据这一改变，可以运用核磁共振法研究d n a 与靶向药物分子之间的嵌插作用。 根据d n a 溶液的粘度在加入靶向药物分子后产生变化这一性质，可以用粘 度法测量d n a 与靶向药物分子之间的相互作用。 x 一射线晶体衍射法能提供直接结构信息，但需要提供d n a 靶向药物分子 结合物的晶体。 一、光谱法 d n a 分子中的碱基具有光学活性，在2 6 01 1 1 t i 左右有最大吸收。许多靶向药 物分子与d n a 结合后，d n a 或靶向药物分子的吸收光谱都会发生变化，因此用 光谱法来研究d n a 与靶向药物分子的结合机理，是非常有效和应用广泛的方法。 在紫外、司见光的测定中，通常靶向药物分子与d n a 结合后会导致吸收谱带变 宽、吸收峰红移及减色效应。尤其是当靶向药物分子以嵌插方式结合在双螺旋碱 基对之问时，变化会更加明显。 有些靶向药物分子与d n a 结合后，会产生荧光增强或荧光淬灭效应，根据 所得的光谱滴定数据，可以测定结合物表观稳定常数、结合位点数等。 除此2 _ 9 1 - ，还可以运用二向色性技术，利用偏振光、圆二色谱可获得与d n a 发生作用后，旋光性发生变化的那些光学活性靶向药物分子的立体选择性，获得 一定的结构信息以及其对d n a 构型的影响。线二色光谱可快速区分非共价结合 的三种作用方式( 静电结合、沟区结合和嵌插结合) ，并且能得到作用的准确方向 和动力学数据。 红外光谱法、共振拉曼光谱可以用于确定靶向药物分子与d n a 作用的精确 位置，同时也可以用于区分嵌插结合和沟区结合。 二、质谱法 质谱法( m s ) 是一种灵敏、准确而快速的分析方法。近年来由于一系列新的电 离技术的问世和测量质量范围的不断拓宽，使它在分析生物体重要物质的一级结 浙江大学理学博士学位论文 构上起着越来越重要的作用。在现代发展的研究d n a 与靶向药物分子相互作用 的各种分析技术中，质谱法在定性鉴别方面起着独一无二的重要作用。它的强有 力的定性能力和极高的灵敏度使它成为当前唯一能在最少样品量情况下获得重 要分子量和结构信息的工具，在这一点上它是其它任何方法所无法比的。m s 和 m s m s 能灵敏、快速地获得靶向药物分子与d n a 结合位点数，结合区域以及 非共价结合方式。当它与诸如气相色谱、高效液相色谱及毛细管电泳这些分离技 术结合在一起时，就能给出非常有价值的异构体组份可靠信息。 三、微量热法 8 0 年代以来，以微量热技术对靶向药物分子与d n a 结合的研究日趋增多。 如嵌插结合中，靶向药物分子与d n a 碱基对发生作用，或是破坏原有的氢键使 极性药物分子的两极分别与碱基对相结合，或是原有的氢键不被破坏，极性药物 分子直接与碱基对作用，其中破坏氢键表现为吸热，药物分子与碱基对结合则表 现为放热。在中性水溶液中，d n a 分子以水分子包围的双螺旋结构存在，靶向 的分子与d n a 结合的热效应应为水分子脱离磷酸根的吸热及药物分子重新与 d n a 结合的热效应的总和。由于此种作用只是极性分子的取代，其作用力属弱 键力，焓变数值应在5 0k j m o l 之内。依据表观稳定常数及所计算的标准自由能 和标准结合熵变、焓变等热力学参数，可以分析靶向药物分子的结构因素对d n a 亲合力的影响。 第四节d n a 与靶向药物分子相互作用研究现状 d n a 靶向药物分子由于能够直接作用于遗传物质而成为一些疑难病症，如 癌症的特效药物，因此d n a 与靶向药物分子相互作用的研究对于尽快攻克疑难 病症具有直接的指导意义。 一、金属配合物类靶向药物分子 金属配合物包括金属卟啉配合物、铂配合物及其它过渡金属配合物等。 金属卟啉配合物是一类广泛存在于自然界中的生物活性物质。由于带正电荷 的卟啉可以作为抗癌和抗菌药，它们的金属配合物可以作为d n a 的选择性切割 试剂，因此难电荷性的水溶性卟啉与d n a 的作用研究，已引起人们极大兴趣。 在u 啉类光敏剂对癌症的定位和光动力疗法作用机理研究中，水溶卟啉及其金属 浙江大学理学博士学位论文 配合物是倍受重视的模型化合物，金属卟啉被当作d n a 靶向模型化合物而广泛 研究“”1 。研究表明，这类正电荷性卟啉不仅在肿瘤的光动力疗法中有诱人的前 景，而且具有抗逆转录病毒作用。带正电荷的卟啉及金属卟啉配合物与d n a 作 用有以下几种模式：( 1 ) 混合作用模式，既有插入作用又有外部作用模式，插入 作用发生在57 一c g 一3 ( c = 胞嘧啶：g = 鸟嘌呤) 碱基对，外部作用在a