（特种经济动物饲养专业论文）家蚕核rDNA的克隆及其分子系统发育分析.pdf

中文摘要 本研究以家蚕为材料，使用s e s 、s d s 、k i 、c t a b 法提取家蚕的基因组d n a ， 紫外和琼脂糖凝胶电泳表明：s e s 法提取家蚕丝腺d n a 简便、快捷，提取的d n a 质量较高。以其他昆虫的r d n a 的保守序列为参考设计了多对特异引物，分段克隆并 测序家蚕r d n a 的全序列和柞蚕1 8 sr d n a 。测序结果拼接后表明家蚕1 8 sr d n a 为 1 9 0 7b p 、i t s l 为7 6 2 b p 、5 8 s 为1 6 7b p 、i t s 2 为8 7 8b p 、2 8 sr d n a 则长达3 9 8 1b p ， 家蚕r d n a 总长度为7 6 9 5b p 。将家蚕1 8 sr d n a 、柞蚕1 8 sr d n a 与从g e n b a n k 中 检索出的1 4 个目1 8 种昆虫的1 8 sr d n a 用c l u s t a l l 8 3 软件进行多序列比对，表明昆 虫的1 8 sr d n a 有四段相对保守序列，在同源区各物种昆虫之阳j 碱基差别不是很大， 变异主要由转换和巅换引起，而在多变区则主要由插入、缺失引起。用系统发育软件 t p h y l i p3 6 3 最大简约法和距离法以1 8 sr d n a 全序列及不同的同源区构建系统发育 树，表明各种昆虫在分子系统发育树中的位置虽略有变化，但其关系基本一致：鳞翅 目昆虫和双翅目昆虫首先在内部聚类后再相聚，两目昆虫之间的亲缘关系较近；等翅 目与蜚蠊目关系较为接近；弹尾目、缨尾目关系较接近，与其他昆虫的亲缘关系较远： 膜翅目分类地位多变说明膜翅目的1 8 sr d n a 进化较快：通过对这些系统发育树的比 较，为形态分类学存在争论的将半翅目和同翅目并为一系、捻翅目自成一系提供了分 子水平的证据。用1 8 sr d n a 不同的同源区所构建的系统发育树大致相同，表明1 8 s r d n a 的不同同源区在进化上有协同进化的现象，且在5 端和3 端则在进化上更为保 守，同时结果表明1 8 sr d n a 是研究中等阶元以上的分子系统发育的有效标记分子。 在i t s l 序列内部存在明显的g 、t 结构：其中a 占2 5 4 0 ，t 为3 0 3 0 ：c 为1 9 9 3 ，g 为2 4 3 7 ，在进化过程中有碱基选择的偏好性；而i t s 2 的a 占2 8 3 5 ， t 为3 1 5 0 ；c 为1 8 1 1 ，g 为2 2 0 5 ，a 、t 碱基明显较多。通过用c l u s t a l1 8 3 的自举n j 法构建的系统发育树表明，i t s l 比i t s 2 在进化上相对保守，i t s 2 在进化 过程中变异较大，i t s l 适合于中等阶元的系统发育研究，而i t s 2 则可用于近缘种内 的系统发育研究：2 8 sr d n a 最长，碱基组成基本均衡，没有偏异现象j 通过对家蚕 r d n a 的克隆与序列分析，表明家蚕r d n a 不同区段进化速率明显不同，为r d n a 在 家蚕起源与进化、品种选育与鉴定等方顽的研究提供了一定的基础。 关键词：家蚕核r d n a 系统发育 a bs t r a c t s e q u e n c e o ft h en u c l e a rr i b o s o m a ld n ao ft h e s i l k w o r m ，b o m b y x m o r i a n dt h em o l e c u l a rp h y i ，o g e n y i n f e r r e df r o mr d n a s e q u e n c e d a i j u n j u n w ee x t r a c tt h eg e n o m i cd n af r o ms i l k w o r m ，b o m b y xm o r ib yt h em e t h o d so fs e s s d s ，c t a b ，k i ，t h er e s u l t a n td n a d e t e r m i n e db yu va n da r g r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s i n d i c a t e st h a tt h ed n ac a r l b e p r e p a r e ds i m p l ya n dr a p i d l yb ys e sm e t h o d t h e nw e d e s i g ns e v e r a lp a i r so fs p e c i f i cp r i m e r sb a s e d o nt h ea n a l y s i so ft h ec o n s e r v a t i v es e q u e n c e s o fr d n ao fo t h e ro r d e r s w ec l o n ea n d s e q u e n c e t h e c o m p l e t e r d n ao ft h e s i l k w o r m ，b o m b y xm o r ia n d1 8 sr d n a o f a n t h e r a e a p e r y it h ec o m p l e t e ds e q u e n c eo f t h e r d n ai s c o m p r i s e d o f18 sr d n a ，i t s 1 ，5 8 sr d n ai t s 2a n d2 8 sr d n aa n dt h e i r m o l e c u l a rw e i g h t sa r eo f1 9 0 7 ，7 6 2 ，1 6 7 ，8 7 8a n d3 9 8 1b pr e s p e c t i v e l y ，i t sf u l lw e i i g h ti s 7 6 9 5b p t h ew e i g h to f t h e1 8 sr d n ao f a n t h e r a e a p e r y i i s1 9 0 8 b p t h em u l t i s e q u e n c e s o f1 8 sr d n aa r ea l i g n e dw i t ht h o s eo f o t h e r1 8k i n d so f i n s e c t sr e t r i e v e df r o mg e n b a n k b yt h ec l u s t a l 1 8 3 s o f t w a r e ，t h ea l i g n m e n ti n d i c a t e st h a t1 8 sr d n ah a sf o u rh i g h l y c o n s e r v a t i v er e g i o n s ，m o s to fv a r i a t i o n si n h o m o l o g o u ss e q u e n c e i n18 sr d n ao f s i l k w o r ma r et r a n s i t i o n sa n dt r a n s v e r s i o n sw h i l et h e r ea r ei n s e r t i o n sa n dd e l e t i o n si n v a r i a b l er e g i o n s t h ep h y l o g e n e t i ct r e e sa r eg e n e r a t e db yt h em e t h o d so fp a r s i m o n ya n d d i s t a n c ep r o v i d e db yp h y l i p3 6 3s o f t w a r e t h ec o n s e n s u sp h y l o g e n e t i ct r e e ss u g g e s t t h a tt h e ya r ev e r ys i m i l a ri nt h et o p o l o g i c a ls t r u c t u r ee x c e p taf e w d i f f e r e n c e s c o m p a r e d w i t hc o n s e r v a t i v eh o m o l o g o u ss e q u e n c e so fo t h e r18i n s e c t sf r o md i f f e r e n to r d e r s i th f o u n dt h a tt h e1 8 sr d n ao f t h ei n s e c t so f l e p i d o p t e r ai ss t r u c t u r a l l ym o r es i m i l a rt ot h o s e o ft h ei n s e c t so fd i p t e r a ，s u g g e s t i n gac l o s e rp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et v , o o r d e r s w ea l s of i n dt h a tt h ei n s e c t so fh o m o p l e r ai sc l o s e rt ot h o s eo fh e m o ，t e l 4 口a n d l s o p t e r ai sc l o s e rt ot h a to f b l a t t e l l i d a ei n f e r r e df r o mt h ep h y l o g e n e t i ct r e e s p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i pa n a l y s i s a l s or e v e a l st h a tt h e s t r e p s 把r 口i s c l o s e rt oc o l l e m b o l a a n d n d i c a t e st h e i rb e i n ga n i n d e p e n d e n ta n c i e n tb r a n c h i n p h y l o g e n y t h et h i n gt h a t t h e p h y l o g e n e t i et r e e sg e n e r a t e db yd i f f e r e n tc o n s e r v a t i v er e g i o n si n 18 sr d n aa r es i m i l a r s u g g e s t s t h a tt h ec o n s e r v a t i v e r e g i o n s e v o l u t e c o n c e r t e d l y , f u r t h e r m o r e ，i t i sm o r e c o n s e r v a t i v ei nt h e5 t h a n3 r e g i o n si nt h e1 8 sr d n a ，t h e1 8 sr d n ac a nb eu s e da sa p o w e r f u lm a r k e r i nh i g hl e v e lm o l e c u l a r p h y l o g e n ya n a l y s i s g 、t b a s e s i n t h e i t s la n d a 、t b a s e s i n t h e i t s 2 a r ea b u n d a n t w h i c h i n d i c a t e t h a t t h ei t se v o l u t e sw i t hb a s eb i a s t h ep h y l o g e n e t i et r e e sb a s e do nt h es e q u e n c eo fi t s 1a n d i t s 2o fs e v e r a li n s e c t so f l e p i d t e r p t e r a ，g e n e r a t e db yt h em o t h o do fn e i g h b o rj o i n t i n g i n d i c a t et h a ti t s ii sm o r ec o n s e r v a t i v et h a ni t s 2 。m ei t s la n di t s 2c a nb eu s e da st h e m a k e ri nd i f f e r e n tl e v e lm o l e c u l a r p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s 2 8 sr d n a i st h el o n g e s ts e q e n c e i nt h er d n a r e p e a t ，t h e b a s e sc o m p o n e n to f b a s e si se q i l i b r i u m ，w ef i n ds e v e r a lr e g i o n s a r ch o m o l o g o u sa n ds e v e r a l r e g i o n s a r ev a r i a b l ei n2 8 sr d n ab y b e i n gb l a s t e d i n g e n b a n k k e yw o r d s ：b o m b y x m o r ir d n am o l e c u l a r p h y l o g e n y 独创性声明 本人声明所呈变的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究威 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名簦墨笸时间： 口r 年f 月加f = 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名；_ ￥7 班 时间：。譬年占月加曰 第一导师签名时间：西年名月f 移开 第一章绪论 1 分子系统发育研究进展 1 1 系统发育学研究简介 系统发育学研究的是生物进化关系，系统发育分析就是要推断或者评估这些进化 关系。通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表( 进化树) 来描述， 进化树所描述的同一谱系的进化关系，包括了分子进化( 基因树) 、物种进化以及分 子进化和物种进化的综合。早期生物系统学( s y s t e m a t i c s ) 是从林奈( l i n n a e u s ) 对 生物有正式命名分类系统开始，他最早将昆虫分成7 个目，但当时的分类和生物的进 化并没有任何联系，直到d a r w i n ( 1 8 5 9 ) 、h a e c k e le ( 1 8 6 6 ) 爿提出分类系统最好能符 合生物的进化关系【1 i ，大胆地推测并创立了系统树，就个体发生和系统发生的关系明 确提出生物发生规律，提出由子孙共有或可鉴别的形态特征( s y n a p o m o r p h i co r d i a g n o s t i cc h a r a c t e r s ) 所定义或进化来的单元体系( m o n o p h y l e t i cg r o u p ) 才是建立生物 分类系统或亲缘关系的正确方法。近几十年来，生命科学和相关学科不断发展和相互 渗透，尤其是遗传学、分子生物学以及生态学的飞速发展和广泛应用，为系统和进化 学研究带来工前所未有的发展，也大大拓宽了系统与进化领域的研究范围。从利用传 统的形态结构性状、化石证据来理解生物的亲缘关系以及理解生命的进化历史，到现 在的利用生物信息大分子( 核酸和蛋白质) 提供了大量进化信息，生物学家在重建类 群系统发育关系以及在揭示整个生物进化历史方面取得了很多成果，并且在遗传多样 性保护、生态的保护、疾病的控制等方面都取得了显著的进展。在现代系统发育学研 究中，研究的重点已经不再是生物的形态学特征或者其他特性，而是生物大分子尤其 是序列所提供的信息口3 j 。 2 昆虫分子系统发育的研究技术 系统发育的研究技术可分为：( 一) 主要利用形态为依据的传统或称经典分类 ( t r a d i t i o n a l ，c l a s s i c a lt a x o n o m y ) ：( 二) 根据染色体的数日或形态的细胞遗传学分类 ( c y t o t a x o n o m y ) ；( 三) 电泳或蛋白质、等位酶、代谢产物为依据的化学分类学 ( c h e m o t a x o n o m v ) ；( 四) 利用d n a 或r n a 或蛋白质的序列比较分子分类学 ( m o l e c u l a rt a x o n o m y ) 。利用上述四项方法所得到的形态特征、分子数据，予以整理 变成数值加以分析，即形成的数值分类学( n u m e r i c a lt a x o n o m y ) 。自从z u c k e r k a n d a l p a u i i n g ( 1 9 6 5 ) 提出可以用氨基酸序列推知“分子时钟”( m o l e c u l a r c l o c k ) 后t 4 t ， 分子资料可以量化来计算遗传距离，从而被广泛应用于推算生物种间分歧年代，分予 分类学能够获得过去无法得知的基因库的分子资料，探讨生物彼此问之血缘关系或分 类系统，的确是过去传统形态、生态、行为等形态特征所不易做到的。 由于分子生物技术的发展，从研究任何一个个体、种群或种的遗传基因、分子结 构或序列，到许多不同的种群、不同的种或种以上的分类阶层( c a t e g o r i e s ) 之后，就 可以用束比较这些不同生物群( t a x a ) 之间的相似性去推知其亲缘关系。分子生物技 术只是一种最现代化的尖端技术，可用来作为系统分类学研究的工具。它可以用来辅 助过去利用形态、细胞、生态、行为等形态特征去解决一些分类或进化的问题， 特别是对种群或种间判别或近似种( s i b l i n gs p e c i e s ) 间鉴别的有力工具m 】。 2 1 蛋白质的分子系统学方法 2 1 1 免疫学( 血清学) 方法： 血清系统学( s y s t e m a t i cs e r o l o g y ) 是应用抗体、抗原反应特征来研究蛋白质之间或 有机体之间进化关系的学科。n u t t a l l 等首先采用免疫沉淀实验方法比较动物界主要门 中科级阶元之间的亲缘关系；b r o w n 和l a r g l e y 采用免疫沉淀法对昆虫纲的部分昆虫 进行系统发育研究； b e e r l e y 和w i l l s o n 用微量补体固定技术对昆虫纲部分昆虫的亲 缘关系进行研究。 2 1 2 等位酶、同工酶电泳 等位酶是生物界广泛存在的一种酶形式，是生物体长期进化过程中对机体内复杂 代谢方式的一种适应，具有重要的生物学意义。在研究昆虫系统发育时曾被广泛地使 用。目前在昆虫分类学的研究中的应用有：鳞翅目蚕蛾科的家蚕( 吉武成美，1 9 6 6 ， 1 9 6 7 ) 1 9 1 0 l 、夜蛾科的昆虫( h u d s o n ，1 9 8 2 ) 川：双翅目的蚊子( m u n s t e r m a n n 1 9 8 8 ： c o l l i n s 等，1 9 8 8 ) ”2 ”j ：同翅目的各种蚜虫( c a s t a n e r a 等，1 9 8 3 ：l o x d a l e 等，1 9 8 3 ： p u n g e r l1 9 8 3 ，1 9 8 6 ：m e s c h e l o f f 等，1 9 9 0 ：w a l t o n 等1 9 9 0 ；p u t e r k a 等，1 9 9 3 ) ”圳。 2 1 3 蛋白质一级结构和立体结构的分析 蛋白质是d n a 分子中结构基因表达的产物，结构基因的变异会导致蛋白质分子 相应的变异。不同种属生物的功能相同的蛋白质分子的一级结构有种属问的差异，差 异的大小反映了种属之间的亲缘关系和蛋白质分子进化的规律( o x f o r dgse la 1 1 9 8 3 ) t 2 tj 。在这些蛋白质的一级结构中，有一些位置上的氨基酸残基不因种属来源的 不同而改变。即在进化过程中始终保持不变。由此可见，利用蛋白质一级结构进行分 子系统学的研究极有意义，而且利用其序列建树有两大优点即蛋白质中位点变化的 规律可用经验模型描述( 如最著名的d a y h o f f 模型) ，物种问无明显的氨基酸偏爱性。 蛋白质的立体结构是指蛋白质在一绒结构基础上，经过空白j 盘旋折叠成为具有生物活 性和功能的大分子。我们知道生物大分子的功能主要是在其三维构象上体现的，分子 问的相互作用，也精确地依赖于分子的三维结构及其附近的环境。而且出于同源生物 大分子的三维结构比其一维结构更具保守性，例如来自不同种属的细胞色素c ，它们 有的可能在一级结构上差异很大，但在三维结构上其主链构象却是相同的。通过比较 生物大分子的立体结构特征来推断分子之间和生物类群之间的系统发育，可以得到一 些在仅用一级结构来进行研究时所不可能得到的有意义的信息和结果。b a j a j 等( 1 9 8 4 ) 通过对蛋白质三级结构的比较研究表明m 1 。在细菌和哺乳动物的丝氨酸蛋白酶中，除 s e r1 9 5 ，s e r 2 1 4 ，h i s 5 7 ，a s p1 0 2 和a s p1 9 4 这几个位点上的氨基酸外。其余位 于活性部位的所有氨基酸都是保守的，且其中有5 个甘氨酸残基和2 个半胱氨酸残基 是不变的。 2 2 d n a 分子标记 d n a 分子标记是d n a 水平上的遗传多态性的直接反映，是继形态学标记、细胞 学标记、生化标记之后，在近二十年来广泛应用的一种新的遗传标记。与阻往的遗传 标记相比，分子标记有许多特殊的优点，如无表型效应、不受环境限制和影响等。目 前应用于昆虫分子系统发育研究的分子生物学技术主要有r a p d 、r f l p 、a f l p 、 s s r 、i s s r 、s n p 、d n a 条形编码、d n a 序列测序等( 谢寿安等，2 0 0 1 ：王心丽，2 0 0 l ： 查玉平等，2 0 0 5 ) 口”。 2 2lr a p d r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a 随机扩增的多态性d n a ) 技术是由 w i l l i a m s ( w i l l i a m se t a l ，1 9 9 0 ) 和w e l s h ( w e l s hj ，1 9 9 0 ) 两个研究小组同时发 展起来的一项基于p c r 技术上的d n a 分子水平上的大分子多态检测技术m 2 7 j ，它的 原理是不同物种的基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数目都有可能不 同，所以扩增产物的大小和数量也有可能不同，这些差异可以通过凝胶电泳显示出来。 这种扩增产物的多态性可以用于相似种鉴定和系统发育分析。因为它的简便、快捷、 需样量少、扩增条带多等特点，它迅速被用于基因的多态分析上。b l a c kiv ( 1 9 9 2 ) 等首先将r a p d 技术用于四种蚜虫的鉴别比较 2 s l ，他们用了l o 个碱基的随机引物对 四种蚜虫进行了r a p d 反应，检测它们扩增产物的多态性，结果表明，根据电泳图 谱能明确地区分四个种。同时他们还检测了种内不同生物型间以及同一生物型内不同 个体扩增产物的多态性、种群内不同个体问扩增产物的多态性。另外，他们还用r a p d 技术检测和鉴定了蚜虫体内的两种寄生蜂，随后r a p d 技术在按蚊、寄生蜂、舞毒 蛾、粉虱、蚜虫、家蚕等昆虫中均有应用。在这些研究中r a p d 大多用于近缘种、 复合种和种内生物型的识别和鉴定，以及地理种群的遗传进化研究中( 鲁亮归鸿 1 9 9 5 ：杨效文等1 9 9 9 ；b a l l i n g e r - c r a b t r e eme ，e ta 1 1 9 9 2 ：w i l k e r s o nr ce la 1 1 9 9 3 ： g a r n e rkje la 1 1 9 9 6 ；g a w e lnj 1 9 9 3 ：p u t e r k ag j ，1 9 9 3 ；c h a p c gw 1 9 9 2 ) ”1 。 r a p d 在系统发育分析上的应用，还有一定的争论，因为r a p d 无法得到可靠的遗传 距离，一般认为r a p d 不能用于高级阶元的系统发育分析，r a p d 技术也有非常明显 的缺点。在琼脂糖凝胶电泳图谱上很难判断一些条带间的同源性对实验条件要求严 格，一些细微的条件变化就可能导致实验结果不能重复。标本保存中的些不可预料 的变化都可能引起结果的变化，应用r a p d 技术时要从标本的采集、保存、d n a 提取、扩增、实验操作等方面保证实验的可重复性( s m i t h eje ta l1 9 9 6 ) 1 3 7 o 2 2 2r f l p r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m ) ，限制性片段长度多态性技术吐| g r o d z i c k e r ( g r o d z i c k e rt je ta l1 9 7 4 ) 于1 9 7 4 年首先提出1 3 。它是指限制性酶切位点 问的插入、缺失、重排或点突变导致酶切位点的增减所引起的基因型间限制性片段长 度的差异。其基本原理是利用限制性内切酶对样品d n a 进行酶切，不同的酶识别不 同的序列，如果变异位点是在某一酶的识别序列之中。则该位点就不被切丌，使d n a 片段的长度比原亲本长，如果碱基发生变化后成为该酶的酶切位点，则d n a 片段变 短，经过电泳，可将大小不同的d n a 片段分开。对于分子量较小的质粒d n a 等 就可直接观察到d n a 长度的差异：但对于核d n a 而言，d n a 大小片段呈连续分御， 无法分辨差异，需转移至支持膜上，用单拷贝或低拷贝的d n a 克隆做探针，与膜上 的酶切片段进行s o u t h e r n 杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术，发生变异的材 料所显示的谱带就有可能与原亲本的带处于不同的位置，从膜上揭示d n a 的多态性， 多细胞动物核基因很大，产生的r f l p 片段很多，难以确定其同源性，所以研究核基 因的r f l p 一般要将选择的目标d n a 片段克隆提纯后再用限制性内切酶消化。目前 典型的r f l p 研究都选择m td n a 进行，m td n a 一般1 5 k b 大小，不需杂交。大多数 m td n a 的i 心l p 研究都是在种内或近缘种间进行，用于高级阶元分析的较少。r f k p 产生的条带稳定可靠，重复性好，特别适合于建立连锁图。但是r f l p 对d n a 多态 性检出的灵敏度不高，需大量的d n a 模板，检测步骤多可能需要同位素标记。 p c r r f l p 是对靶基因进行扩增后的产物进行酶切，由于大多数p c r 扩增产物不超 过2k b ，从而产生很少的酶切片段，经电泳后就可区分不同的片段。p c r r f l p 同时 具有p c r 的灵敏性和r f l p 的稳定性，只要少量的样品就可以得到满意的结果，因 此p c r - r f l p 广泛应用在分子系统学研究中。 2 2 3a f l p a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t sl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) ，扩增的限制性内切酶片段长 度多态性是荷兰科学家z a b e a u 和v o s ( z a b e a um a n dpv o s ，1 9 9 3 ) 建立的一种检测 d n a 多态性的分子标记技术【3 9 】，它的基本反应程序主要包括模板d n a 制备，酶切 片段扩增及凝胶电泳分析三个步骤。基本原理是对基因组d n a 限制性酶切片段的选 择性扩增，使用双链人工接头与基因组d n a 的酶切片段相连接作为扩增反应的模板 接头与接头相邻的酶切片段的1 2 个碱基序列作为引物的结合位点，选择碱基延伸到 酶切片段区，这样只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增，扩 增片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。专用引物与人工接头互补的核心碱基序 列、限制性内切酶识别序列和引物3 端的选择碱基三部分组成。选择碱基包括1 1 0 个数量不等的随机核苷酸序列，由此可以调节a f l p 产物的条带特异性核数量，提供 较多的基因组多态性信息，也克服了r a p d 重复性差的问题。a f l p 技术适用于所有 不同大小的基因组，扩增片段的数目可以通过选择不同的内切酶以及改变选择性延伸 碱基的数目来控制。在复杂的基因组中，a f l p 能产生的限制性酶切片段的数目几乎 是无限的。a f l p 是r f l p 和p c r 有机结合产生的一种分子标记，它既有r f l p 的可 靠性，也具有p c r 的灵敏性，多态丰富，快速高效，被认为是迄今为止最有效的分 子标记。理论上讲不论所研究的基因组d n a 有多么复杂，用a f l p 方法都可以检测 出任何d n a 之间的多态性。但是a f l p 操作较为复杂，操作要求严格，费用较高， 对d n a 模板质量要求很高( v a nh a e f i n g e nwa ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 1 4 0 。r e i n e k e 等评价了 进行a f l p 前的各种昆虫d n a 提取技术，但目前a f l p 技术并没有普遍应用在昆虫 分子系统学研究中( r e i n e k ea ，1 9 9 8 ；v a n l e r b e r g h i c m e s u t t ie1 9 9 4 ) 【4 1 , 4 2 1 。 2 2 4s s r s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简单序列重复) 又称微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 、短序列 串联重复( s h o r tt a n d o mr e p e a t ) 或简单序列长度多念性( s i m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m ，s s l p ) 是指由少数几个( 1 - 5 个) 碱基对构成基本单位的短串联重复 d n a 序列，女d ( g a ) n 。( a t ) n ，( g a a ) n 等。这类序列数量丰富，广泛地散布于真核生 物基因组中，每类微卫星d n a 两端的序列多是相对保守的单拷贝序列1 4 3 粥可以根 据两端序列设计一对特异引物，扩增s s r 序列。s s r 己经广泛应用于遗传图谱的构 建、比较基因组研究【4 5 】、遗传多样性分析和系统发育研究等脚】。s s r 的优点是，多 态性高，缺点是必须测定每类s s r 两端序列来设计引物，而不象r a p d 引物那样可 以随机合成，这给s s r 标记在基因组研究中的广泛应用带来了不便【4 7 4 8 1 。 2 2 5i s s r 简单序列重复间区 i s s r 简单序列重复间区( i n t e r s i m p l es e q u e n c er e a p e a t sp o l y m o r p h i s m ) 是由 z i e t k i e w i c ze ta l 提出的 4 9 j ，是一种利用p c r 扩增进行检测的d n a 标记，所用的引 物是基于简单序列重复而设计的寡核苷酸引物，用来检测两个s s r 之间的一段短 d n a 序列的差异。一般在引物的5 或3 端接上2 - 4 个碱基，以对具有相同重复形 式的许多s s r 座位进行筛选使得最终扩增出的i s s r 片段不致太多。如果基因组存 这些扩增区域内发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变以及其它结构变异，就可能导 致这些区域与引物结合的数量和位置的改变，从而使p c r 扩增片段数量及长度改变， 通过电泳即可检测出基因组在这些s s r 位点的多态性。由于在真核生物基因组中敞 布有大量的s s r 序列1 5 0 1 ，因此基因组也就可能含有丰富的i s s r 多态信息。i s s r 技 术利用基因组中有关s s r 序列信息，结合r a p d 技术优点，克服了s s r 及r a p d 标 记技术的某些缺点。近年来i s s r 应用于植物遗传分析的各个方面，如品种鉴定、遗 传关系及遗传多样性分析，基因标签、植物基因组作图等研究。k o j i m af 1 9 9 8 ) f l - j 研究 表明，( a c ) n 双核苷酸重复序列非常适合小麦的染色体作图，并成功地定位了一系列 i s s r 标记。t s u m u r a ( 1 9 9 8 ) 删e 【5 “，基于( a g ) n 和( c t ) n 序列的i s s r 标记在柏 树和松树中是最有用的。总的来说，i s s r 标记揭示多态性的效率是较高的，因此逐 渐得到较多的应用。 2 3 6s c a r 序列特异性扩增区( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) s c a r 标已是 在r a p d 技术的基础上发展起来的【5 甜，其基本步骤是：先作r a p d 分析，然后把目 标r a p d 片段( 如与某目的基因连锁的r a p d 片段) 进行克隆和测序，根据原r a p d 片段两末端的序列设计特定引物( 一般比r a p d 引物长，通常2 4 个碱基) ，再进行 p c r 特异扩增。这样就可把与原r a p d 片段相对应的单一位点鉴定出来，这样的位 点就称为s c a r 。s c a r 比r a p d 和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的 应用更好，因为它有更高的可重复性( 原因是使用的引物长) 。s c a r 标记一般表现 为扩增片段的有无，为一种显性标记，但有时也表现为长度的多态性，为共显性标记， 相对于r a p d 标记，s c a r 标记由于所用引物较长及引物序列与d n a 摸板完全互补， 因此结果稳定性好、重复性强。 2 3 7s n p s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，单一核苷酸多态性) 是新近发展起来的种 基于测序的分子标记，可以检测出基因组中因一个碱基的不同而产生的d n a 多念性旧。 s n p 利用不同碱基在测序过程中峰值不同来检出d n a 中因一个碱基的替换引起的 d n a 多态性。其多态性更为丰富，现在s n p 标记技术一般采用d n a 芯片技术进行 分析。利用s n p 标记已发现与人类一些重要疾病( 哮喘病、搪尿病、精神分裂症等) 相连锁的标记座位1 5 4 , 作为一种遗传多念，s n p 具有分布广泛、数量众多、易于批 量检测等优点，并已用于人类第三代基因图的绘制。 2 2 8d n a 条形编码 d n a 条形编码( d n a b a r c o d i n g ) 是最近才出来的提出来的分子生物技术，可用 于物种的鉴定和分类 5 5 1 。d n a 条形编码根据对一个统一的目标基因d n a 序列的分 析，达到物种鉴定的目的，这种新检测法主要用线粒体d n a 上，因为与细胞核的 d n a 相比，线粒体d n a 进化的更快。这项技术为生物多样性研究人员提供了一种相 对快捷的检测工具，d a n i e lj a n z e n 等利用d n a 条形编码发现一种哥斯达黎加普通蝴 蝶a s t r a p t e sf u l g e r a t o r 实际上有1 0 个种属，研究者认为可以按照颜色和食物偏好的 不同将这野外捕捉的2 ，5 0 0 多种普通蝴蝶分成不同的类群。 2 2 9 d n a 测序 d n a 序列分析是进行分子发育研究的最有效、最可靠的方法。比较不同类群个 体的同源区段的核苷酸排列顺序，建立分子系统发育树，并推断类群间的演化关系是 目前分子进化和系统发育研究的热点。g e n b a n k 中现在已有大量昆虫核酸序列，而且 每天都有很多新序列登录。当然相对于昆虫种类的数目和多样性来讲，这显得有些微 不足道，其中大多数的序列是有关果蝇等模式昆虫的，其它的序列多是一些经济昆虫 和其他模式昆虫。对一些序列的分析，有力地促进了我们对一些类群的系统发育的认 识。但目前测序成本仍比较昂贵这限制了测序技术的更广泛的应用。随着测序技术 的不断发展，测序成本不断降低，序列分析将是分子系统学的主要研究方法。 现在分子系统发育研究方法众多，每种方法都有自己的优缺点。多数情况下， d n a 测序成为系统发育研究的首选方法，但对一些研究，其他的方法可能更适合、 更有效，这需要根据研究目的而定，一种或几种分子标记方法与测序联合使用可能是 最好的策略。基因组一般较大，难以进行全面的序列分析。现有的序列分析结果表明： 每个基因均能以其特有的平均进化速率用于不同水平的系统发育研究：不同基因削的 进化速率不同；同基因不同区段的核苷酸的保守程度不同。快速进化的基因或核苷 酸区段适合种内或近缘种的系统发育分析：慢速进化的基因或核酸区段适合远缘种类 或高级阶元豹系统发育研究。就所研究的类群而言，寻找合适的枷记基因才是进行分 子发育分析的关键。 3 用于昆虫分子系统学研究的常用的分子标记 昆虫的d n a 序列数据迅速增加，大部分序列已用于系统发育关系分析。用于昆 虫分予系统学研究的基因主要有：蛋白质编码基因、r r n a 基因( 线粒体和细胞核内) 以 及许多非编码基因等。核r d n a 和线粒体d n a ( m td n a ) 是探讨昆虫分子系统发育关 系最常用的基因。在m t d n a 基因中，最常用的是细胞色素氧化酶c o l ，c o i l ，1 6 s r d n a 和1 2 sr d n a 等基因口3 l ：其中c o i l 用得最为广泛几乎遍及所有目的昆虫： c o l 基因用得也比较多，1 6 sr d n a 己被广泛地用于系统发育关系分析，c o i i i ，n d 5 和c y t b 用得也很多，而n d 2 ，n d 4 和n d i 等是目前用得比较少的几个基因。至于其 它的几个线粒体基因几乎没有被涉及。对于核r d n a 来说，1 8 sr r n a 基因已经成为 探讨昆虫高级阶元系统发育关系的标准标记。1 8 sr d n a 的核心序列进化缓慢使得它 可以被用来进行界和门一绂的系统发育重建。对动物界1 0 个门2 2 个纲的某些种类的 1 8 sr d n a 序列的比较表明，与基于形态、胚胎、化石研究建立的系统树的区别在于 它显示节肢动物门并不与环节动物门构成姊妹群。来自于r d n a 的一些结果自相矛盾 的原因可能是由于已有的序列数据太少的问题、对快速进化阶元的人为组合、混淆碱 基组成与替换偏好的影响、核酸片段选择不当以及在许多位点发生的多重替换等造成 的。由1 8 sr d n a 序列分析所得到的结果的可靠性受到越来越多证据的支持。g i r i b e t 指出要利用1 8 sr d n a 进行可靠的支序分析的话陋，一方面对于采样来晓，要有足够 多的阶元，且所选片段要足够长：另一方面要通过改进分析方法来提高选树效率。山 于1 8 sr d n a 已经存在的大量序列。并且在探讨高级阶元系统发育关系时获得比较令 人满意的结果，c a t e r i n o 等建议高级阶元的研究应首选这个基因。在双翅目( d i p t e m ) 和膜翅目( h y m e n o p t e r a ) d p ，i t s ( i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r ) $ 2 8 sr r n a 基因应用得比 较多。通常情况下与基于1 8 sr r n a 基因的系统发育关系结果与形态的比较一致，上j m td n a 或核r d n a 相比，核内蛋白质编码基因在推断系统发育关系方面用得比较少。 e f 。1 a 是用得最多的蛋白质编码基因，研究表明，这个基因在探讨种群和属级的系统 发育关系比较有用，e f - i a 基因在氨基酸水平上是比较保守的