（海洋生物学专业论文）抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响.pdf

抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 摘要 内容摘要：以坛紫菜为试材，在不同浓度抗生素存在的条件卜i ，通 过对配子体重量、叶绿素含量和脯氨酸含量的生理测定，研究了4 种抗生素对其配子体的生长和代谢的影响。结果表明，在非致死浓 度下，坛紫菜配子体对氨苄青霉素和硫酸庆大霉素表现出了很强的 耐受性，并且在低浓度情况下，硫酸庆大霉素对配子体的生长还表 现出了促进作用。因此，这两种抗生素可作为坛紫菜配子体无菌化 培养的除菌剂配合使用。而卡那霉素和壮观霉素对坛紫菜配了体表 现m 了很强的抑制和毒害作用，并且卡那霉素的毒性要大于壮观霉 素，在培养液中加入较高浓度的卡那霉素和壮观霉素后，配子体迅 速死产，褪色变绿，重昂减轻。由于坛紫菜配子体对卡那霉素和壮 观霉素= i # 常敏感，这两种抗生素可作为坛紫菜接因r 程实验r r i 有效 的选择压力。 本项研究在坛紫菜配于体培养的基础上，研究了抗生素对其配 了体生长和代谢的影响，找出厂它们的毒害浓度范围，为坛紫菜配 子体培养利无菌化处理过程中避免其毒害提供了依据。同时，为坛 紫菜配子体转基因研究中转化细胞的筛选找出了适宜的抗生素种 类及其浓度，为坛紫菜配子体发育调控的研究开阔了思路和提供了 方法。 关键词：抗生素，坛紫菜配子体，作用机制，无菌培养 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 a b s t r a c t c o n t e n t ：t h ep o r p h y r ah a i t a n e n s i si san u t r i t i o u sa n dd e l i c i o u sa l g a i nt h ee u r o p ea n du s ai ti sc a l l e dl a v e r ，a n di nt h ej a p a ni ti sn a m e d n o r i t h e r ea r ea b o u t7 0s p e c i e so ft h ep o r p h y r ai nt h ew o r l d n o w t h em a i n s p e c i e s o ft h ea r t i f i c i a lc u l t u r ea r ep ，y e z o e n s i sa n dp h a i t a n e n s i s t h ep h a i t a n e n s i si sa ni m p o r t a n te c o n o m i ca l g a s o t h e r ea r em a n yr e s e a r c h e st ol e a r nm o r ea b o u tt h ea l g a i nt h et h e s e s ， t h e s d u d yi s f o c uso nt h ee f f e c t so fa n t i b i o t i cso nt h eg r o w t ha n d p h y s i 0 1 0 9 i c a lp r o c e s s e so fp ，h a i t a n e n s i s t h es t u d yi n v e s t i g a t e dt h ed i f f e r e n c e so fg r o w t ha n dm e t a b o l is mo f t h eg a m e t o p h y t e so f 尸h a i t a n e n s i st r e a t e dw i t ht h ef o u rd i f f e r e n t a n t i b i o t i csu n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nsr e s p e c t i r e l yb ym e s s u r i n g t h e w e i g h t ，t h ec h l o r o p h y l l a n d p r o l i n e c o n t e n t s t h ec u l t u r e c o n d i t i o nf o rt h e g a m e t o p h y t e s w a s2 5 2 0 0 0 i x a n d12 ：l2 h l i g h t ：d a r kd u r a t i o n t h ee x p e r i m e n t a lr es u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o w t h a n dm e t a b o l is mo ft h eg a m e t o p h y t e sw e r en o to b v i o u s l ya f f e c t e db y t h ea m p p i c i l l i na n dg e n t a m i c i ns u l f a t e ，w h e nt h ec o n c e n t r a t i o n so f t h et w oa n t i b i o t i c sw e r e1 0 w e rt h a n0 01m 0 1 l w i t hi n e r e as eo ft h e c o n c e n t r a t i o n ，i n t e r e s t i n g l y ，g e n t a m i c i ns u l f a t ep r o m o t e dt h eg r o w t h o ft h eg a m e t o p h y t e s a ta tc o n c e n t r a t i o no f0 0 1 m o l l l t h eo t h e rt w o a n t i b i o t i c s ，k a n a m y c i na n ds p e c t i n o m y c i n ，o b v i o us l yi n h i b i t e dt h e g r o w t h a n dm e t a b o l i s mo ft h e g a m e t o p h y t e s w h e nt h e ir c o n c e n t r a t i o i l sw e r eh i g h e rt h a n0 01m o l l ，t h ei n h i b i t e de f f e c to f k a n a m y c i nw a ss tr o n g e rt h e ns p e c t i n o m y c i n ，s ow em i g h tc o n c l u d e d t h a tt h e a m p p i c i l l i n a n d g e n t a m i c i n s u l f a t ec o u l db eus e df o r p r o d u c t i n g t h e a s e p t i cg a m e t o p h y t e s a n dt h e k a n a m y c i n a n d s p e c t i n o m y c i nm i g h t b e a p p l i e d a ss e l e c t i o n p r e s s u r e i nt h e p h a i t a n e n s i sg e n e t i ce n g i n e e r in g k e yw o r d s ：p h a i t a n e n s i s ，a n t i b i o t i c s ，g a m e t o p h y l es ，g r o w t h ， p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s ，a s e p t i cc u l t u r e 2 抗生素对坛紫菜配子体牛长和代谢的影响 学位论文独创性声明 本人承诺：所里交的学位论文是本人在导师指导r 所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写 或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助， 均l 在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名 。确 口 期 学位论文版权的使用授权书 阐。、乞 本1 学传论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校何权保留计向囤家有芙部门或机构送交复印件或磁盘，允许i _ 仑 文被查阅和借阅。本文授权辽r 师范_ 入学。，以将位沦文的全部或部分 内容编入有关数据库并进行睑索可咀采_ f j 影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位沧文。保密的学位论文存解密币使h = | 萃授权书。 学位论文作者签名：绛右为 指导教师签名： 日期： 厂b 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 第一章海藻遗传工程研究 海藻在生物学分类中的地位是低等的海洋隐花类植物，人们日 常所吃的海带、紫菜、海苔、羊栖菜以及石莼、石花菜等都是海藻。 由于海藻富含多种生命活性物质，如多糖、高不饱和脂肪酸、牛磺 酸、类胡萝b 素、甾淳及海带氨酸等，无论是作为日常食物，还是 提取活性物质作为药品，海藻对人类都有着极大的好处。 海藻具有独特的风味和营养价值。海藻可以作为肥胖病人的减 肥食品，因为它热量低，而且含有大量纤维素，食用少量后即有饱 胀感；海藻还可以作为糖尿病人的食品，因为它不含糖份；另外， 海藻作为高血压、心脏病患者的健康食品也有极好的保健效果。海 藻中含有多种微量元素，如铁、锌、硒、钙等，这些元素都与入的 生理活动有着密切联系，其中铁是人体造血功能必不可少的微量元 素，锌有助于儿童的智力发育，钙可以使人的骨骼强健，而近年来 的研究表明，硒可以防止癌症的产生，增强人体的免疫机能。因此， 不管是老年人。还是青年人，食用海藻都能够强身健体、防病治病。 海藻自古以来就是药用植物。在明代李时珍编写的本草纲目 中就已经列举了海藻的药用价值。人们日常生活中吃的紫菜，可治 脚气和咽喉肿痛；海带可治大脖子病，这是民间流传已久的方法。 海藻中的海藻多糖、多卤多萜物质等具有提高人体免疫力、抗癌、 抗病毒的活性。海藻多糖可以与h i v ( 人获得性免疫缺陷病毒) 结 合，使其失活，从而抑制病毒的复制，防治爱滋病；海藻多糖还可 以降低血管中导致动脉粥样硬化的脂质含量，以及治疗心脑血管疾 病。螺旋藻中的b 一胡萝h 素可以保护人的视力。从深海鱼油中提 取的高不饱和脂肪酸e p a ( 二十碳五烯酸) 和d h a ( 二十二碳六 烯酸) 具有提高大脑智力以及增强人体免疫力的功效，而在海藻中 也可以提取出这两种物质。因此，以海藻为原料，进行药品生产， 可以大大降低生产成本，从而提高经济效益。海藻不仅可以作为食 品、药物，还可以用于农业生产以及化妆品工业。海藻中含有吲跺 乙酸、植物生长激素、海藻酚等有机物质，用于种植业中作为肥料 可以起到抗旱、抗盐碱渗透、耐寒、杀菌和促生长作用。将海藻制 成肥料，不仅可降低成本、提高经济效益，还可以去除农药残留物 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 对人体造成危害。将海藻粉添加到牲畜饲料中。可以改善肉质、提 高产量，这主要是因为海藻的风昧独特，而且富含氨基酸和蛋白质。 海藻的表面有一层极为湿润的黏液，主要是用于退潮后保护海藻表 面，防止日晒过度而造成死亡。根据这个原理，人们对这层黏液进 行了研究，发现它是一种多糖类物质，具有极好的延展性能，将它 制成化妆品，具有保湿、防晒的功效。现在市场上销售的大宝s o d 蜜中主要的活性物质是s o d ，它的中文名称叫做超氧化物歧化酶， 可以防止由于过度日晒造成的皮肤表面氧化因子的活化，在海藻中 也能够提取出这种酶。 总之，海藻中含有多种与人类日常生活相关的活性物质。海藻 是海洋中的初级生产力的代表，在海洋中的数量极多，且种类丰富。 人类应该认识到海藻的价值，并充分加以利用，这样不仅可以保护 人类的健康，还可以保护地球上的生物资源，使得人类的生产生活 可以可持续发展。生命源于海洋，充分地利用海洋，才能使生命向 前发展。 1 1 海藻的组织培养 海藻的组织培养可以追溯到5 0 年代初期，但早期的海藻组织 培养遇到了很多问题，其中两个最主要的问题是：( i ) 难以实现海 藻组织的无菌培养；( 2 ) 对控制海藻生长发育的物质了解很少。在 富营养的培养基中，污染微生物生长迅速，很快抑制甚至杀死培养 的藻体组织和细胞。同时由于不了解控制海藻生长发育物质的性 质，要控制被培养组织和细胞的生长和分化几乎是不可能的。 1 1 1 无菌海藻组织的制备 与陆生植物相比，海藻表层很薄并且没有蜡质层，所以，制备 海藻的无菌组织相对困难。陆生植物表面污染物的去除一般只要将 组织块浸在杀菌剂如次氯酸钠或乙醇中一段时间。这种处理会杀死 表面的微生物也可能杀死外层保护细胞，但不会伤害分生组织细 胞。然而，大多数海藻的外部细胞对愈伤组织的形成是至关重要的， 过分的处理会破坏这些外部细胞，导致培养的失败。 早期的研究者在进行海藻组织培养的尝试中都曾面临着无菌 处理的困难，经过多年的研究和尝试，不同抗生素组合处理被广泛 2 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 采用1 1 - 6 1 。现在，很多获得无菌海藻材料的实验中，科学家们将抗 生素与其它一些方法结合使用，往往能得到比较满意的结果。1 9 8 9 年，t a t e w a k i 等使用孢子冲洗与抗生素处理结合的方式获得红藻 的无菌材料。1 9 9 3 年，c h e n f s 】采用原生质体分离和抗生素处理结 合获得紫菜的无菌材料，无菌率可达8 0 一1 0 0 。而完整的细胞尽管 经过同样的抗生素处理，则很难达到无菌。1 9 8 2 年s a g a 【9 1 采用一 步选择法进行大型海藻的无菌处理，可达9 5 无菌率。总结海藻无 菌处理的各种方法可以看出，在进行海藻无菌处理时应该注意以下 几点：( 1 ) 直接对海藻组织或外植体进行无菌处理，获得无菌材料 的比率比较低，许多这样的尝试都失败了；( 2 ) 以单细胞材料为处 理对象，如游孢子、孢子或原生质体等，则较易获得无菌材料；( 3 ) 抗生素处理与其它处理如超声波、杀菌剂等结合使用，效果较好； ( 4 ) 在进行无菌处理时，必须注意保持被处理材料的成活率。 p e d e r s e n 、f r i e s 、p r o v a s o l i 和p i n t n e r 、t a t e w a k i 等在从事无菌组织 培养工作时发现，自然产生的细菌污染物( c o n t a m i n a n t ) 可以为海 藻生长与分化提供活性物质。当附生在石莼、浒苔等海藻表面的细 菌完全被除去后，会造成组织发育迟缓并异常生长，发育为“针垫 子”、单条丝、叶状体等变异形态；当石莼、浒苔等海藻表面增加 某些特定细菌后，海藻叶状体均恢复正常形态。此外，当添加了培 养过细菌的培养液或者褐藻与红藻无菌培养液后海藻叶状体形态 均恢复原状。这些都清楚的表明，海藻本身或附着在海藻表面上的 细菌都能够提供多种与海藻生长与分化相关的物质，只可惜这些有 效物质还未被鉴别和分离出来( 虽然高等植物激素能够应用于某些 海藻中，但其在海藻上显示出的效果还很不明显) 。 在“非无菌”培养条件下，绿藻、红藻与褐藻的小叶状体己能 成功地分化为植株，同时海藻也可由极细小的组织切块或少数活细 胞成功地再生出新植株。a j e n s e n 和e d a s i l v a 教授将红藻、杉藻 切段( 大小为1 0 0 弘m ) ，培养于增强海水液中它们能够存活并且 再生。 1 1 2 海藻的组织培养 1 9 5 2 年美国加州大学从事海藻生物技术研究方面的a g i b o r 3 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 教授最早开始使用囊链藻( c y s t o s e i r a ) 进行海藻组织培养实验， 通过组织培养发现这种海藻的叶状体有两种形态：一种为较低平、 茂盛的叶状体，另一种为圆柱状的叶状体。从此，c y s t o s e i r a 的组 织培养成为海藻分化发育的一个研究系统。 1 9 7 8 年c h e n i 等以红藻角叉菜( c h o n d r u sc r i s p u s ) 将髓部 组织无菌立方体小块通过无菌培养，使无色素的髓部细胞分化成具 色素的表面细胞，再生成完全小植株。他们的研究，被认为是最早 的成功的海藻组织培养研究之一。随后，许多以经济海藻为对象的 组织培养和原生质体培养研究广泛开展了起来。另外，8 0 年代末 期开始，一些海藻的细胞培养也已有了报道j l “。 高等植物的组织、细胞与原生质体研究发展迅速，促进了海藻 单细胞和原生质体培养技术的发展，同时，高等植物原生质体融合 和体细胞杂交再生等重大成果促使海藻组织培养快速发展，从简单 的切段再生发展为器官培养、愈伤组织培养以及特别组织培养，以 后又发展到细胞培养、原生质体培养、细胞杂交等，研究水平不断 提高。到2 0 世纪7 0 年代，开始研究海带、紫菜等某些经济海藻的 单倍体或切段、愈伤组织培养；2 0 世纪8 0 年代，我国海藻切段离 体培养取得较大进展；2 0 世纪9 0 年代，开始在生产上应用海藻切 段离体培养技术，如海带、裙带菜、紫菜、石花菜等 1 2 1 。 1 2 藻类基因工程研究概况 由于海藻具有极其丰富的生物多样性、对环境适应方式的多样 性以及重要的进化地位，使其成为基因工程研究的理想材料。体现 在：多数藻类含有丰富的营养物质和生物活性物质，有些藻类具 有耐受极端环境条件的能力，使藻类成为丰富的基因库源；在部 分蓝藻、红藻及硅藻中发现了质粒，经改造后可以作为基因工程的 载体，藻类病毒也有希望成为新型载体；某些模式藻遗传背景清 晰，遗传转化技术成熟，可被其它藻类所借鉴；由于密码子的偏 向性和启动子的通用性。藻类可能成为植物基因表达的宿主，特别 是大型海藻，有希望成为廉价高效、规模宏大的生物反应器，生产 有用物质或清除海洋污染；多种经济藻类已具有相当的栽培或养 殖规模，转基因经济藻具备产业化基础。 4 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 藻类基因工程( g e n e t i ce n g i n e e r i n go fa l g a e ) 是指利用重组 d n a 技术定向获得藻类新品种、藻类基因表达产品或实现某种社 会服务的研究与开发行为，既包括对藻类自身特点的基因工程学方 法研究，也包括基因工程体系的产业化应用 13 1 。严格的讲，藻类 基因工程方法学主要研究藻类来源的目的基因的克隆、向藻类中转 移外源基因所需载体的构建、基因转移的方法和检测手段的建立 等。由于藻类处于微生物和高等植物之间这样一个特殊的进化地 位，使得藻类基因工程研究借鉴了微生物和高等植物基因工程的原 理和技术，包括载体元件。藻类基因工程的创新点在于具有藻类特 色的方法学和应用体系，即挖掘藻类基因、发展“全藻载体”、探 索向藻类中转移基因的新技术、建立藻类高效表达系统等。 国际上藻类基因工程研究的热点，从2 0 世纪7 0 年代的淡水蓝 藻，经2 0 世纪8 0 年代的淡水真核微藻，到2 0 世纪9 0 年代的大型 海藻，体现了从原核到真核、从淡水到海水、从模式藻到经济藻、 从单细胞微藻和丝状体微藻到多细胞的大型藻的发展趋势。研究内 容主要包括3 个方面；一是作为模式藻分子遗传学研究的一种手 段；二是以此为基础，向模式藻中转入目的基因，建立应用体系， 但模式藻由于缺乏大规模栽培或养殖的基础，转基因模式藻产业化 目前还存在许多的问题；三是建立经济藻类，如蓝藻中的螺旋藻、 真核微藻中的小球藻和盐藻、大型栽培海藻的遗传转化模型，培育 养殖或栽培新品种，利用转基因藻类反应器生产有用产品或清除污 染。 1 2 1 微藻 1 2 1 1 蓝藻门 蓝藻又称蓝细菌，是藻类中最原始的群类，是光合自养的原核 生物。蓝藻具有单细胞，丝状、中空球状和立方体等形状，但多数 蓝藻为不定型群体，并具有一定形态和颜色的胶被。 蓝藻分子遗传学研究开始于2 0 世纪6 0 年代，由于蓝藻遗传特 性和结果类似于革兰氏阴性细菌，部分种类具有天然转化系统和有 效重组系统，特别是在光合、固氮、细胞分化、叶绿体起源、逆境 胁迫等基础研究领域，以及光合色素生产、制氢、降解有机污染物 5 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 等应用领域具有重要地位，使得4 0 年来蓝藻分子遗传学研究取得 较大突破，发展了集胞藻( s y n e c h c y s t i s ) 、聚球藻( s y n e c h o c o c c u s ) 、 鱼腥藻( a n a b a e n a ) 等多个重要的模式蓝藻。特别是近年来，蓝藻 在海洋生态系统中的作用被重新认识，蓝藻基因组研究也得以广泛 开展，继1 9 9 6 年日本完成淡水模式蓝藻一集胞藻s p c c6 8 0 3 的基 因组测序之后【l4 1 美国能源部下属的联合基因组研究所( j o i n t g e n o m ei n s i t u t e ) 、麻省理工学院( m a s s a c h u s e t t si n s t i t u t eo f t e c h n o l o g y ) ，法国巴斯德研究所( i n s t i t u t ep a s t e u r ) 以及北京基因组 研究所也相继启动了蓝藻基因组研究计划( 见表1 ) ，研究对象除 了模式藻外还包括重要的经济藻一螺旋藻( 印i r u l i n a ) ，以及近来备 受关注的海洋蓝藻一原绿球藻( p r o c h l o r o c o c c u s ) 。蓝藻遗传转化 技术将为新基因的功能验证提供必不可少的工具，同时伴随着大量 有价值的功能基因被解读和发现，也为蓝藻基因的应用奠定了坚实 基础。 表1 蓝藻基因组研究概况 t a b l e1 g e n e r a ls i t u a t i o no fb l u e - g r e e na l g a eg e n o m e 6 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 1 2 1 2 绿藻门 绿藻门中约有3 5 0 个属、5 0 0 0 8 0 0 0 个种，其中绝大多数为微 型藻类，也包括少量大型藻。绿藻藻体有单细胞、群体、丝状体和 叶状体等形式。绿藻的繁殖方式多种多样，不少种类有世代交替现 象。 绿藻和高等植物之间有许多相似之处，它们的鞭毛类型都是尾 鞭型，主要的光合色素都是叶绿素a 和b ，还有q 一胡萝h 素、b - 胡萝卜素以及叶黄素等，光合作用产物都是淀粉。普遍认为，世界 上占优势的高等植物是从绿藻进化而来的，因此，绿藻门在植物界 的系统进化处于主干地位，单细胞绿藻中的一些种类( 如衣藻) 已 经发展成为重要的模式藻，应用于植物进化等研究。 遗传转化研究在单细胞绿藻中得以广泛开展是模式藻基础研 究的有力手段，也为经济藻的遗传育种提供了新的方法。 。 衣藻衣藻属( c f n m y d d m d h 4 j ) 属于绿藻门( c h l o r o p h y t a ) 、 团藻目( v o l v o c a l e s ) 、衣藻科( c h l a m y d o m o n a d a c e a e ) ，藻体单细 胞，细胞质膜紧贴细胞壁，具有两条顶生鞭毛，基部的一个大型杯 状叶绿体约占整个细胞体积的4 0 ，叶绿体包围着细胞核，叶绿体 有一个或多个蛋白核，在叶绿体的周围常可看到淀粉颗粒，细胞侧 面具眼点，细胞中有一个或多个液泡，细胞壁明显。 衣藻生活史简单，生长快，易于培养，既可通过固体平板培养 形成单克隆，也能进行液体大规模培养，可在实验室条件下控制其 生活周期。1 9 1 6 年，p a s c h e r 发现衣藻有性生殖经历单倍体与二倍 体两种生长阶段，减数分裂产生的配子可以进行四分子分析，因此， 认为衣藻是理想的遗传分析实验材料。 自2 0 世纪3 0 年代开始，大量有重要研究价值的突变体被分离 和鉴定；2 0 世纪4 0 5 0 年代，藻类遗传学家将研究重点转向莱茵衣 藻( c r e i n h a r d t i i ) 、真配衣藻( c e u g a m e t o s ) 等少数衣藻物种，从 而开始了多领域、深层次的衣藻遗传学研究阶段。1 9 8 2 年，r o c h a i x 与v d i l l e w i j n 报道选用壁缺失突变和精氨酸依赖突变，使来自酵 母的精氨酸基因在莱茵衣藻中获得整合表达，这也是关于真核藻遗 传转化的首次报道【1 6 1 。 7 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 表2 莱菌衣藻转化系统的应用 t a b l e2 a d h i b i t i o no ft r a n s l a t i o ns y s t e mo fc r e i n h a r d t i i 经过多年研究积累，莱茵衣藻己成为当代细胞和分子生物学不 同研究领域的首选模式物种之一，是真核微藻首个基因测序对象 17 1 ，遗传转化技术发展得十分完善。也得以广泛应用( 见表2 ) ， 其突出特点是已成功实现了细胞核、叶绿体d 8 、线粒体1 9 1 的基因 组遗传转化，成为目前唯一能对细胞中3 个基因组进行遗传转化的 8 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 物种；依靠对遗传背景的深入了解，大量采用自身来源的启动子元 件以及同源整合平台：利用己建立的稳定突变实验株系，发展了多 种有效的转化方法，建立了恢复突变的筛选技术。 近年来，我国学者在利用衣藻模型探索叶绿体表达模式方面进 行了大量研究。2 0 0 3 年q i a n 等构建了携带叶绿体同源整合片段、 a a d a 基因( 表达壮观霉素或链霉素抗性) 以及乙肝病毒a c 嵌合 抗原基因的载体，利用基因枪法转化野生型衣藻细胞，经壮观霉素 筛选得到抗性藻株，检测结果显示嵌合蛋白v p 3 p i c e l 表达量占 细胞可溶性蛋白量的5 3 l ；w e s t e r n 分析表明，表达的嵌合抗原 可以被相应抗体识别，因此利用真核微藻叶绿体生产基因工程疫苗 具有可行性”“。 2 0 0 5 年，s u 等构建了同时携带蓝藻别藻蓝蛋白( a p c ) q 与 b 两个亚基的叶绿体表达载体，利用基因枪法转化并经壮观霉素筛 选，成功检测到双亚基的表达，表达蛋白占可溶性总蛋白的2 - 3 ， s o u t h e r n 杂交显示为叶绿体基因组同源整合，这是首次在衣藻叶绿 体中表达一个蛋白的两个亚基；另外，单独转化1 3 亚基也获得成功 1 33 1 。 1 2 1 3 硅藻门 硅藻门的藻体是海洋浮游植物的重要组成部分，种类繁多，分 布广泛。现存的硅藻超过2 5 0 个属，多达1 0 万余种，是除被子植 物之外生物多样性最为丰富的光合作用群类。硅藻的生物量巨大， 据测算，全球初级生产力的5 0 以上来源于海洋，而海洋硅藻贡献 的初级生产力占整个海洋总初级生产力的4 0 ，因此，处于海洋食 物链最底层的硅藻对维持地球生态系统的正常机能具有重要作用。 另外，由于硅藻细胞壁的生物合成需要硅元素，因此硅藻在碳、硅 元素的生物地化循环中还扮演着重要角色，具有不可代替的生态学 意义。 硅藻的遗传转化自1 9 9 5 年报道以来，目前已在至少5 个种中 通过基因枪方法实现核转化( 见表3 ) 且全为海洋硅藻，转基因硅 藻既可作为基础研究的模式，也具备应用潜力，建立海洋微藻生物 反应器有望高效表达外源蛋白或通过代谢工程提高内源物质的含 9 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 量。 裹3 基因枪成功实现核转化的硅藻 t a b l e3 s u c c e s s f u ln u c l e o l u st r a n s f o r m e db a c i l l a r i o p h y t ab yg e n eg u n t e c h n o l o g y 近年来，海洋硅藻遗传转化的突破性进展可归功于下列因素： 基因枪法可使d n a 顺利穿透硅藻的细胞壁：找到了适合硅藻 的选择标记( a p t 等，1 9 9 6 ) ；广泛使用了硅藻自身启动子 ( d u n a h a y 等，1 9 9 5 ；f a l c i a o r e 等，1 9 9 9 ；z a s l a v s k a i a 等，2 0 0 0 ， 2 0 0 1 ) 。随着伪矮海硅藻( t p s e u d o n a n a ) 基因组已完成测序【4 引， 海洋硅藻遗传转化技术有望为功能基因组学研究提供有力的技术 平台。 1 2 1 4 甲藻门 甲藻是海洋浮游植物的重要组成部分，甲藻的细胞质具有典型 的真核生物特征，但细胞核却既具真核特征( 如核内具核仁，基因 内部有内含子序列) 同时又具典型的原核特征( 如核内缺乏组蛋白， 具有永久性浓缩状的染色体) ，因此，甲藻是研究核进化的理想材 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 料。 目前甲藻门中前沟藻( a m p h i d i n i u ms p ) 和共生甲藻 ( s y m b i o d i n i u m m i c r o a d r i a t i c u m ) 两个物种己实现核转化。采用 在莱茵衣藻中发展的特殊转化方法一碳化硅丝( s i c ) 法，通过搅 拌向完整带壁细胞中有效导入了外源基因，c a m v 3 5 s 启动子可实 现g u s 报告基因的表达。发现由两种农杆菌启动：子分别驱动两种 选择标记基因，均可有效完成对转化子的筛选( n o s 启动子+ n p t i i + g 4 1 8 筛选；或双向p l 2 启动子+ h p t + 潮霉素筛选) 1 4 3 1 。 1 2 1 5 红藻门 红藻门中的紫球藻( p o r p h y r i d i u m ) 为单细胞，最近利用基因 枪法实现了叶绿体转化的稳定表达t 4 4 1 。除草剂甲嘧磺隆 ( s u l f o m e t u r o nm e t h y l ) 的靶向作用位点是乙酰乳酸合成酶 ( a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ，a h a s ) ，野生型紫球藻对它非常敏感， 该研究通过转入a h a s 基因的耐性突变体作为选择标记，经除草剂 甲嘧磺隆筛选得到阳性转化子，这也是红藻中实现稳定表达的首次 报道。 1 2 2 大型藻 1 2 2 1 褐藻门 褐藻门约有2 5 0 个属，1 5 0 0 个种，除少数物种外，全部为海 水种。褐藻主要分布于温带和寒带水域，在南极和北极海岸占优势 地位，但也有个别暖海性种类。 褐藻中没有单细胞种类，均为多细胞藻体。褐藻的细胞壁内层 为纤维素，外层为藻胶质，藻胶质含有几种不同的藻胶，存在最广 泛的盐藻多糖，在海带( l a m i n a r i a ) 、墨角藻( s a r g a s s u m ) 中含量 较高。褐藻细胞内有一个或多个色素体，蛋白核与色素体相连，其 外围有色素体内质网膜与核膜连接。褐藻的游孢子呈梨形，具有两 条不等长的侧生鞭毛。精子长形，也有两条不等长的鞭毛。褐藻与 硅藻同属杂色藻类，细胞中的色素除叶绿素a 、叶绿素c 和胡萝h 素外，还有叶黄素和墨角藻黄素，光合作用产物为褐藻淀粉和甘露 醇。 褐藻中的很多种类已实现人工栽培，如海带、裙带菜、羊栖菜 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 等，产量巨大。既是褐藻胶等化工原料来源生物，也是传统的保健 食品，并己用于海洋药物的开发。在北美海岸，野生的巨藻 ( m a c r o c y s t i s ) 可生长至6 0 7 0 m ，可形成海底森林，因此，褐藻 在积累生物量方面具有显著优势，利用栽培褐藻可以发展廉价高 效、规模宏大的海洋生物反应器，生产高附加值产品或用于清除海 洋污染。 ( 1 ) 海带海带( l a m i n a r i aj a p o n i c aa r e s c h ) 属褐藻门 ( p h a e o p h y t a ) 、褐藻纲( p h a e o p h y c e a e ) 、海带目( l a m i n a r i a l e s ) 、 海带科( l a m i n a r i a c e a e ) 、海带属( l a m i n a r i a ) 、原产于日本、朝鲜 半岛和俄罗斯的太平洋海域，于2 0 世纪3 0 年代引入我国。海带生 活史存在宏观的叶状体( 孢子体，染色体倍性2 n ) 与微观的丝状 体( 配子体，染色体倍性n ) 之间的世代交替，在自然界中以配子 体度夏，以叶状孢子体形态生长。2 0 世纪5 0 一6 0 年代，中国科学家 通过连续自交、定向筛选、x 射线诱变、杂交等常规育种技术，培 育出一系列高产、高碘、早熟、耐高温的海带新品种，使我国的海 带年产量从1 9 5 2 年的6 0 t 鲜品( 干：鲜= l ：6 ) 发展到现在的约3 0 多万吨干品，产量约占世界海藻总产量一半，是一种稳定、高产的 优良经济海藻 4 5 1 ，主要用于褐藻胶、碘、甘露醇的提取。 海带相对于其它海水养殖生物病害少、栽培成本低、技术便于 掌握，这为利用基因工程定向育种手段将海带开发成为廉价高效的 生物反应器、大量生产高附加值产品奠定了基础。2 0 世纪9 0 年代 以来，以海带为代表的大型经济海藻基因工程研究进入起步阶段， 并得到迅速发展，有关技术也日益成熟。 海带基因工程研究的总体思路是借鉴高等植物基因工程的原 理与技术，根据海藻自身特点进行创新，研究内容包括建立有效的 转化方法、寻找海带适用的载体元件、选择合适的转化受体以及植 株再生的途径、发展对转化子的筛选机制，即建立海带遗传转化模 型，这也是大型海藻中首个可操作的模式系统。 与微生物、高等植物基因工程模式系统相比，海带模型的创新 点在于：以遗传背景单、克隆化的海带配子体作为转化受体， 通过受精发育、孤雌生殖等自然或诱导发育途径，获得转基因孢子 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 体；制定并采取了生物安全性措施，在转基因海洋生物安全性控 制方面进行了有益的探索。海带模型也将为其它大型褐藻、红藻以 及绿藻转化模型的建立提供原理和方法学上的借鉴。 目前，依靠模型系统，海带基因工程己相继实现下列外源基因 的稳定表达( 见表4 ) ，现己进入构建表达系统的研究阶段。 表4 海带中已实现稳定表达的外源基因。 t a b l e4 s t e a d ye x p r e s s i v ee x t e r i o rg e n eo fl a m i n a r i aj a p o n i c a ( 2 ) 裙带菜裙带菜( u n d a r i ap i n n a t d a ) 属褐藻门 ( p h a e o p h y t a ) 、褐藻纲( p h a e o p h y c e a e ) 、海带目( l a m i n a r i a l e s ) 、 翅藻科( a l a r i a c e a e ) 、裙带莱属( u n d a r i a ) ，在我国有原生种。 裙带菜的生活史类型与海带相同，也存在孢子体与配子体的世 代交替，在自然界以配子体度夏，且比海带配子体能耐受较高的温 度。裙带菜孢子体幼期叶片成卵形或长形，单条，在生长过程中逐 渐出现羽状分裂，叶片中部具明显中肋，黑色小点为黏液膜。藻体 成熟时，孢子体在固着器和叶片之间延伸生长，成折叠状，孢子囊 即发育其中。 裙带菜与海带、紫菜并列我国3 大经济栽培海藻，世界上每年 的栽培产量有2 2 0 万吨鲜品，市场需求很大，裙带菜蛋白质含量较 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 高，营养丰富。具有明显的降低胆固醇、增强血管弹性和止血功能， 是一种理想的保健食品。 近几年，裙带菜在我国的栽培面积增长很快，开展基因工程研 究对于改良遗传品质具有重要意义。由于其分类地位和生活史过程 同海带类似。相关工作全面借鉴了海带基因工程的原理和技术，结 果显示，海带模型的大部分结果在裙带菜中可重复 5 2 1 ，其参照性 得到了很好的验证。 1 2 2 2 红藻门 红藻门( r h o d o p h y t a ) 约有5 5 8 属，3 7 0 0 多种，其中约2 0 0 种生于淡水环境，其余均为海产，是大型海藻中的主要种类。红藻 的植物体多为丝状体、叶状体或枝状体，少数为单细胞或群体。红 藻藻体常有一定的组织分化，如某些种类分化有。皮层”和髓部。 色素体l 枚，呈星芒状、带状、纽带状或双凸状等。除了含叶绿素 a 和叶绿素d 、胡萝h 素和叶黄素外，还含有藻红素和藻蓝素。因 藻红素一般占优势，故藻体呈红色或紫红色。红藻的储藏养分为红 藻淀粉( f l o r i d e a ns t a r c h ) 或红藻糖( f l o r i d o s e ) 。红藻不同于其它 藻类的一个明显特点在于：红藻的生活史中没有游动细胞的出现， 不论是无性繁殖的孢子或是有性繁殖的配子都没有鞭毛，不能游 动。 红藻的细胞壁分两层，内层由纤维素组成，外层由果胶质组成， 含琼胶、海箩胶等红藻所特有的藻胶成分，多种红藻是重要的藻胶 提取原料，如石花菜( g e l i d i u m ) 、江蓠( g r a c i l a r i a ) 、麒麟菜 ( e u c h e u m a ) 等属的种类。琼胶是一种具有优良凝固性能的高分 子多糖，可供食用，但主要用于医药及科研上所需的培养基。从角 叉莱( c h o n d r u s ) 中提取的卡拉胶，可用于食品工业中作为乳化剂 和稳定剂。红藻中提取的藻红蛋白也广泛应用在医药、食品、化妆 品等领域。另外，红藻中的紫菜( p o r p h y r a ) 是东南亚国家的传统 食品，已发展形成规模庞大的育苗、栽培及加工产业，以满足世界 范围内不断增长的巨大需求。 由于红藻门植物具有突出的经济价值，部分种类( 如紫菜、江 蓠、麒麟菜) 已实现人工栽培，针对红藻的组织培养与细胞工程始 1 4 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 终是一个热点，紫菜与江蓠属植物的遗传学研究也比较深入，这些 都为红藻基因工程研究的开展奠定了很好的基础。1 9 9 1 年，k u r t z a n 与c h e n e y 用基因枪法转化质粒p b l 2 2 l ，在红藻长心卡帕藻 ( k a p p a p h y c u sa l v a r e z n ) 组织切块中实现瞬间表达，这是外源基 因在大型海藻中瞬间表达的第一次报道 5 3 1 。红藻基因工程研究的 目标是改良藻种，提高抗性，改善藻胶的特性。 ( 1 ) 紫菜紫菜属( p o r p h y r a ) 属于红藻门( r h o d o p h y t a ) 、原红 藻纲( p r o t o f l o r i d e o p h y c e a e ) 、红毛菜目( b a n g i a l e s ) 、红毛菜科 ( b a n g i a c e a e ) 。紫菜属的种类大多发现于北半球，分布很广，记载 的种类超过1 3 0 种，我国已发现2 2 个物种或变种【54 1 。 紫菜的生活史包括宏观的叶状体阶段与微观的丝状体阶段的 世代交替，丝状体在碳酸钙的贝壳基质中生长发育【55 1 。紫菜完整 生活史的揭示为大规模人工育苗、栽培奠定了坚实基础。紫菜是世 界上产值最高的栽培海藻，仅中、日、韩3 国的紫菜初级加工品年 产值就超过2 0 亿美元，占世界海藻年产值的2 3 6 1 ，其中，我国 的产值居世界首位，主要的栽培对象在长江以北地区是条斑紫菜 ( p y e z o e n s i s ) ，长江以南地区是坛紫菜( p h a i t a n e n s i s ) 。 由于紫菜只有1 层或2 层细胞，结构简单，染色体数目少( 条 斑紫菜叶状体营养细胞n = 3 ) ，容易获得丰富的色素突变体，因此， 紫菜成为海藻遗传学研究的重要对象，研究表明，紫菜的生活史类 型以及分化发育模式表现出极大的多样性。近年来，紫菜基因组计 划在日本已经开展，大量的e s t 序列已经公开，紫菜的遗传转化 研究在中、日、美等国家也一直是热点，不难想象，随着研究的不 断深入，紫菜有望成为红藻中的模式研究材料。 目前，紫菜基因工程研究已取得一些进展，主要包括：已启用 紫菜自身的启动子元件【5 ，以及利用内源序列构建同源整合平台 5 8 】；发现氯霉素是有效的筛选剂5 9 】；基因枪法和电击法可作为外 源基因的导入方法【6 m ”】。另外，c h e n e y 曾在美国藻类年会中介 绍利用农杆菌介导瞬间表达，但一直未见真实报道【62 1 。目前，紫 菜遗传转化研究存在最大的问题是至今尚未得到外源基因的稳定 表达。 抗生素对坛紫菜配子体生长和代谢的影响 ( 2 ) 江蓠江蓠属( g r a c i l a r i ag r e v i l l e ) 属于红藻门 ( r h o d o p h y t a ) 、红藻纲( r h o d o p h y c e a e ) 、真红藻亚纲( f l o r i d e a e ) 、 衫藻目( g i g a r t i n a l e s ) 、江蓠科( g r a c i l a r i a c e a e ) 。目前，江蓠属中 记载了l o o 多个物种，分布于热带、亚热带和温带海域。江蓠生活 史中有两个孢子体世代( 四分孢子体世代与果孢子体世代) 与一个 配子体世代，二倍的四分孢子体( t e ”a s p o r o p h y t e ) 与单倍的配子 体( g a m e t o p h y t e ) 具有相同的形态。 江蓠是琼胶工业的主要资源生物，经济价值很高，在世界范围 内得到广泛栽培，近年来，江蓠栽培被引入海洋动物养殖区进行整 合养殖，在清除海洋污染方面也正在逐步发挥重要作用 6 3 1 。 江蓠属的种类具有较好的海藻遗传学研究背景，已分离大量的 色素突变体用于杂交遗传分析、基因定位以及光合进化研究1 6 4 1 ， 今年来已深入到分子遗传学研究领域1 6 5 j