（微生物学专业论文）微生物对麻疯树饼粕毒蛋白的降解研究.pdf

贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 麻疯树( 如t _ r o p h ac l l r c a s ) 属于多年生草本油料植物。为生产生物柴油、 生物农药、生物医药、生物饲料的主要原料。其籽仁榨油后的饼粕含有丰富的蛋 白质、氨基酸等营养成分，但同时也含有毒蛋白、籽油等毒性成分，毒性成分是 制约麻疯树饼粕综合利用的主要因素。 本课题论文主要是针对麻疯树饼粕中所含的毒蛋白等毒性成分进行微生物 脱毒研究。内容主要有：发酵菌株的分离、诱变筛选，获取目的菌株；目的菌株 的生理、生化特征及其对麻疯树籽油和毒蛋白( 沈阳勘) 的降解作用研究；发酵 菌株的发酵工艺研究；混菌浅盘发酵；发酵后饼粕的氨基酸态氮、总蛋白、氨基 酸含量及毒性测定。 通过马丁一孟加拉红培养基选择性分离培养，再利用查氏琼脂培养基进行紫 外诱变筛选和复筛，获得一株霉菌m j l 8 生理、生化实验结果表明，霉菌n j l 8 ，其最适生长温度为3 0 、最适p h 为6 0 ；初步鉴定m j l 8 为根霉属( r h i z o p u se h r e n b e r g ) 中的米根霉种( g h j z o p u s o r y z a e ) ：u j l 8 菌具有高耐麻疯树油性能，能水解淀粉、降解麻疯树油脂和降解 麻疯树饼粕中的毒蛋白白地霉( g i 抛6 9 ，g e o t r i c h u mc a n d j d u ml i n k ) 具有 降解麻疯树饼粕中的毒蛋白性能。 正交实验表明，m j l 8 对麻疯树饼粕进行微生物发酵脱毒的较适发酵工艺条 件为p h 5 5 、发酵温度2 8 、加水量7 5 卿接种量4 。参考白地霉( g i m 2 6 9 ) 菌株发酵特性，初步确定m j l 8 菌和白地霉( g i m 2 6 9 ，g e o t r i e h u mc a n d i d u ml i n k ) 混菌进行麻疯树饼粕发酵脱毒的工艺为：发酵起始温度2 8 ，发酵醅初始p h 5 5 ，发酵醅加水量7 5 ，接种比例m j l 8 ：自地霉( g i m 2 6 9 ，g e o t r i e h u mc a n d i d u m l i n k ) 为l ：l 。 混菌发酵实验结果表明，麻疯树饼粕发酵过程其氨基酸态氮含量升高明显； 发酵脱毒后饼粕的总蛋白含量提高2 2 8 7 ：氨基酸含量升高1 7 4 4 ；发酵前 后粗毒蛋白抑菌结果表明，采用m j l 8 和白地霉( g i m 2 6 9 ，g e o t r i c h u mc a 刀d i d u m l i n k ) 混菌发酵，可降低饼粕中的毒蛋白；小鼠急性经口毒性实验结果表明， 发酵后的饼粕无毒，l d 舳 5 0g k g b w 。 课题初步结论表明，m j l 8 和白地霉( g i 1 2 6 9 ，g e o t r j c h u mc a n d i d u 叨l i n k ) 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 混菌发酵，对麻疯树饼粕中毒蛋白及籽油等毒性充分的毒性具有降低作用，可降 低饼粕中的毒蛋白及其他毒性成分。 关键词：麻疯树；毒蛋白；微生物；发酵：脱毒 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a b s t r a c t j a t r o p h ao j , w a s ( j a t r o p h a 倒r c a $ l ) a r ep e r e n n i a lh e r bo i lp l a n t s f o rt h e p r o d u c t i o no f b i o - d i e s e l ，b i o - p e s t i c i d e s ，b i o - m e d i c i n e ，b i o f e e dt h em a i nt a wm a t e r i a l i t ss e e d - i t sz h a y o ua f t e rt h em e a li sr i c hi np r o t e i n ，a m i n oa c i d sa n do t h e rn u t r i e n t s ， b u ta l s oc o n t a i n i n gt o x i cp r o t e i n , o i la n do t h e rt o x i ci n g r e d i e n t s , t o x i cc o m p o n e n t si s r e s t r i c t e dj a t r o p h ac 叫脚m e a lc o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no ft h em a i nf a c t o r s t h ei s s u ep a p e ri sm a i n l yd i r e c t e da g a i n s tl e p r o s yt r e em e a lc o n t a i n e di nt h e t o x i cp r o t e i na n do t h e rt o x i cc o m p o n e n t so fm i c r o b i a ld e t o x i f i e a t i o ns t u d y m a i n ： f e r m e n t a t i o ns t r a i n so fs e p a r a t i o n , m u t a t i o ns c r e e n i n g , t h ep u l p o s eo fo b t a i n i n g s t r a i n s ；p u r p o s eo f t h es t r a i n so f b i o l o g i c a l ，c h e m i c a la n db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t h ej a t r o p h aa l l r c a so i la n dt o x i cp r o t e i n ( c u m i n ) t h ed e g r a d a t i o no fr e s e a r c h ； f e r m e n t a t i o ns t r a i n so ft h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s d i s c u s s i o no fm i x e d - f e r m e n t a t i o n ； f e r m e n t e dm e a lo ft h ea m i n oa c i dn i t r o g e n , p r o t e i n , a m i n oa c i dc o n t e n ta n dt o x i c i t y d e t e r m i n a t i o n b ym a r t i n - b a n g l a d e s hr e dm e d i u ms e l e c t i v ei s o l a t i o na n dc u l t u r e , r i 潲ec h a a g a rt ou v - i n d u c e ds e l e c t i o na n ds c r e e n i n g , a c c e s st oaf u n g a lm j l 8 p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tm o l dm j i8 ，i t s o p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r eo f3 0 ，f o rt h eo p t i m u mp h 6 0 ；m j i8f o rt h e p r e l i m i n a r yi d e n t i f i c a t i o no fr h i z o p u s ( p , h z o p u se h r e n b e r g ) i nm e t e r sr h i z o p m s p e c i e s ( r h z o n so r y z a e ) ；m j i8b a c t e r i aj a t r o p h ac u 玎：鹤i sh i g h l yr e s i s t a n tt oo i l p r o p e r t i e s ，c a nb eh y d r o l y z e ds t a r c h , f a ta n dd e g r a d a t i o no fj a t r o p h aa c 舔t r e em e a l d e g r a d a t i o n o f l e p r o s y i nt h et o x i c p r o t e i n l a n dm y c o p h e n o l a t e ( g i m 2 6 9 , g e o m c h u mc a n d i d u ml i n k ) d e g r a d a t i o no fj a t r o p h aa 】r c a sm e a l 、机吐it h et o x i c p r o t e i ni nt h ep e r f o r m a n c e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s s h o wt h a t , m ji8o fj a t r o p h a ( x l r c a sm e a lf o r d e t o x i f i e a t i o nm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o no ft h em o r es u i t a b l ec o n d i t i o n sf o rt h e f e r m e n t a t i o np r o c e s sp h 5 5 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r eo f2 8 ，a n d7 5 w a t e ra n d v a c c i n a t i o no f4 r 舒e r e n c el a n dm y e o p h e n o l a t e ( g i m 2 6 9 ) s u r i no ff e r m e n t a t i o n , i n i t i a l l ys e tm i lsa n dt h el a n do fm y c o p h o n o l a t e ( o i m 2 6 9 ，g e o t r i c h u mc a n d i d u m l i n k ) o fam i x e df e r m e n t e dj a t r o p h ac 蛐r c ：勰m e a ld e t o x i f i c a t i o np r o c e s s ：s t a r t f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 ，f e r m e n t e dp i c k l e di n i t i a l p h 5 5 ，f e r m e n t e da n d p i c k l e d7 5 w a t e r , v a c c i n a t i o no f m j l8 ；l a n dm y c o p h e n o l a t e ( g 蹦2 6 9 , g e o t r i c h u m i 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 c a n d i d u ml i n k ) i s1 ：1 f e r m e n t a t i o nm i x e dr e s u l t ss h o w e dt h a tj a t r o p h ac u f c 豁m e a lf e r m e n t a t i o np r o c e s so f i t sa m i n oa c i dc o n t e n to fn i t r o g e ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ；, f e r m e n t a t i o na f t e rd e t o x i f i c a t i o n m e a lo ft h et o t a lp r o t e i nc o n t e n ti n c r e a s e d2 2 8 7 。1 7 4 4 h i g h e ra m i n oa c i dc o n t e n t ； f e r m e n t a t i o nb e f o r ea n da f t e rc r u d ep r o t e i nd r u gs u p p r e s s i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t b a c t e r i a ，m ji8a n di n d i s c r i m i n a t eu s eo fm y c o p h e n o l a t e ( g i m 2 6 9 ，g e o t r i c h u mc a n d i d u m l i n k ) m i xo ff e r m e n t a t i o n ，c a l lr e d u c et h et o x i cp r o t e i nm e a l ；m i c ea c u t eo r a lt o x i c i t yt e s t r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o na f t e rt h em e a ln o n - t o x i c ，l d s o 5 0g k g b w i s s u ep r e l i m i n a r yf i n d i n g ss h o wt h a t , m j i8a n dl a n dm y c o p h e n o l a t e ( g i m 2 6 9 ， g e o t r i c h u mc a n d i d u ml i n k ) m i xo ff e r m e n t a t i o n , t h ep o i s o n i n go fj a t r o p h ac u r c a 8 m e a la n do i l , a n do t h e rt o x i cf u l l y 、玩t l il o w e rt o x i c i t y , c a nr e d u c et h et o x i cp r o t e i n m e a la n do t h e rt o x i cc o m p o n e n t s k e yw o r d s ：j a t r o p h ae u r e a s ；t o x i cp r o t e i n ；m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n ；d e t o x i f i c a t i o n i v 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本文的研究在做出重要贡献的 个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律责 任由本人承担 论文作者签名 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名荔壶玉导师签名：论文作者签名：丝韭玉导师签名： 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 1 研究背景 第一章绪论 能源是现代社会赖以生存和发展的基础，安全、可靠的能源供应和高效、清洁的利用 能源是各国实现经济可持续发展的基本保证，也是各个国家战略安全保障之c 丘华兴， 1 9 9 6 ) 2 0 世纪，国际上的两次石油危机给世界经济带来巨大影响，世界局部范围内因石油 而频繁引起的矛盾冲突及石油价格的不断猛涨，使得对替代石化能源的生物燃料的研究倍 受关注为了提高能源安全，促进生物燃料的发展和环境保护，许多国家提出了生物燃料 发展目标。如印度计划到2 0 1 1 - 2 0 1 2 年，实现生物柴油替代2 0 石油的发展目标；欧盟计 划到2 0 1 0 年，生物燃料占交通燃料的份额达到6 ：美国提出到2 0 2 0 年，生物燃料在交通燃 料中的比例达到2 0 ：瑞典提出2 0 2 0 年之后，利用生物燃料全部替代石油燃料，彻底摆脱 对石油的依赖等( 吴国江等，2 0 0 6 ) 由此看来，生物燃料将逐步成为替代石油的重要能源之 1 2 麻疯树资源 1 2 1 麻疯树分布概况 麻疯树( 庙t r o p h ac u 毋c s s 三) 属于多年生乔小灌木或草本植物，全世界约有2 0 0 种 麻疯树，又名小桐子、绿玉树、芙蓉树、臭油桐、青桐木、黄胂树、桐油树、假花生树等， 属大戟科( 尻弘幻而妇c 船e 麻疯树属落叶灌木 麻疯树( j t a t r o p h ac u c b s 上) 是一种抗旱耐瘠的速生树种，其原产于巴西，现主要分 布予热带和亚热带地区，绝大多数生长在美洲和亚洲热带地区，如美洲的巴西、菲济、洪 都拉斯、牙买加、巴拿马、波多黎哥、萨尔瓦多及美国的奥兰多地区、夏威夷群岛等，非 洲的莫桑比克、赞比亚等国，澳大利哑的昆士兰和北澳地区，以及亚洲的印度、巴基斯坦、 中国等国都有分布g i l s 噼g 等，2 2 ) 。我国的广东、广西、云南、四川、贵州、台湾、 福建、海南等省有栽培或半野生麻疯树( 丘华兴，1 9 9 6 ) 我国栽培种有4 种，为麻疯树 ( j a t r o p l u tc u m c a sl ) 、棉叶麻疯树ug o a s s y p i f o h ad 、佛肚树up o d a g r j c ah o o k ) 和珊瑚花um u l t i f i d al ) ，麻疯树种植面积大，资源较为丰富( 林娟等，2 0 0 4 ；j u l i a n e ，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 麻疯树生物柴油性能 研究表明，麻疯树是一种多用途的油料植物，可作为生产生物柴油、生物农药、生物 医药、生物饲料的主要原料，同时也可作为保水固土、防风固沙、防沙化、防治石漠化、 增加有机土质、建造防护林的主要树种( 贾良智等，1 9 8 7 ) 。近年来，联合国将麻疯树及其 提取物广泛应用于贫困地区的建设项目中，并作为扶贫的重大项目予以扶持。在能源短缺 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 越来越不堪重负的今天，“麻疯树”作为“绿色能源”无疑成为各地竟相引种推广的“摇 钱树”( c n i m m , 1 9 9 9 ) 麻疯树植株从种植第二年开始的超过3 0 年的时间里都能结果。麻疯树一年结果2 - - 一3 次，每次结果5 1 5k g 株，种子含油量4 0 6 0 据专家研究，野生麻疯树的干果产量 为3 0 0 8 0 0k g 亩，平均产量约6 6 0k g 亩，可提取加工生物柴油1 8 0 2 7 0k g 研究报道，麻疯树生物柴油适用于各种柴油发动机，且其燃点、凝固点、含硫量、一氧 化碳排放量、颗粒质等关键指标都均优于国内0 # 柴油，达到目前欧洲的二号柴油标准麻 疯树作为生产生物柴油最佳的原材料是正在被开发利用的重要能源植物之一，最有可能成为 未来替代石化能源的具有巨大开发潜力的树种( f o i mng ，1 9 9 6 ) 1 2 3 麻疯树果仁、饼粕营养性麓 资料报道可食用( 毒性很低) 的麻疯树果仁含水分4 4 4 7 ，粗蛋白含量2 7 3 0 ，脂质含量5 5 6 2 ，灰分3 7 - - 5 2 ，营养水平范围较宽( m a k k a r h p s , 2 0 0 2 ) 墨西哥研究文献报道：麻疯树果仁含粗蛋白3 l - 3 4 ，脂肪5 2 9 - 5 7 4 ，干 粉中含纤维素3 9n - - 4 5 淀粉和总糖小于6 ；干粗粉的总能量为3 1 1 - - 一3 1 6 | u k g 还富含必需氨基酸，如苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸等，除赖氨酸外均高于f a 0 哪o ( 粮农组织世界卫生组织) 对5 岁儿童的营养餐的要求 据我国昆明植物所分析，麻疯树油饼酸碱度7 o l ，有机质9 1 6 7 ，全氮3 0 4 6 全磷2 5 ，全钾1 2 4 5 ，水解氮他7 8 鸭1 0 0 9 ，速效磷8 1 3 0 m g 1 0 0 9 ，速效钾5 4 7 5 0 眍1 0 0 9 ( 李昌珠等，2 0 0 5 = a t r o p h ao r g y 0 0 1 ) 麻疯树果含有一定的毒素因子，具有一定的毒性其果仁榨油后的枯饼经脱毒处理后 可作为动物饲料源目前，对麻疯树饼粕资源开发前景较好的是将其脱毒，生产动物饲料 等产品，提高麻疯树产业及其关联产业链综合效益 1 2 4 麻疯树毒性成分研究 1 2 4 1 麻疯树毒素及其毒性 研究表明，麻风树种子中已发现毒性最强的物质有三种，一种是麻风树毒蛋白( c u r c i n ) ： 二是麻风树种子油；第三种是佛波脂，佛波脂是一种二帖类物质( d j t e r p e n ee s t e r s ) ( m a k k a r h 等，1 9 9 7 ) 其毒性因子存在的部位，种子最强，枝叶次之。 动物实验证明，麻疯树毒素除可以引起严重的胃肠炎、黏膜糜烂、充血外；还可引起肾 间质炎性浸润、心肌退行性变及心包及胸膜下出血；引起溶血，抑制心肌，严重者可引起呼 吸循环衰竭、肾功能衰竭死亡( s a r d a n a j ，1 9 9 8 ；高永莉，1 9 9 6 ) 饲喂试验也表明，麻疯 树种子对大鼠、小鼠、山羊、小牛和鸡均有毒( a d a ms e i 等，1 9 5 ；a h m e d 等，1 9 7 9 ) 麻疯树籽中的毒性成分对大鼠、淡水螺、海虾都具有毒性。其甲醇提取物可导致大鼠红 细胞低色素平血。主要表现在，随给药时间的延长，各项血液学指标( 红细胞数、红细胞压 2 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 积、红血蛋白浓度) 持续下降，在给药8 , - - 1 0d 下降最显著，小鼠急毒实验l d 。o 值为2 5 1 9m g 。 麻疯树种子油也有毒，口服麻疯树种子油对大鼠的半致死剂量l 陆为6m l k g 。其原因主要是 因为油中含有佛波脂，用油作用于兔子和小鼠的皮肤，可产生刺激反应，使皮肤发生坏死和 枯斑。麻疯树果实的甲醇、石油醚提取物还可使大鼠产主妊娠终止反应，终止反应多发生在 妊娠早期，有的甚至发生在妊娠6 - - 8d ，在给药期间还出现体重明显减轻的症状( 高永莉， 1 9 9 6 ：孙备，1 9 9 8 ) 。 麻疯树毒性物质除了对动物有毒外，对人也有毒害作用。误食麻疯树果后很快会出现中 毒现象，轻症者仅出现胃肠道症状，出现急性胃肠炎，重症可出现血性肠炎、损害肝和肾等 实质脏器，并有凝集红细胞和溶血作用，产生多系统、多脏器功能损害，甚至死亡 宋维、陈实研究报道( 宋维等，2 0 0 2 ) ，海南海1 ：3 2 0 0 2 年7 月3 日发生8 6 名集体误食麻疯 果中毒患者的临床症状。全部病人都有程度不同的头晕、头痛、腹痛、恶心呕吐等症状，严 重患者出现瞳孔扩大、皮肤干燥、心率增快，双足底出现中毒性红斑。血常规检查表明，中 毒患者白细胞普遍升高；血生化检测肝功能出现a s t 升高、心肌酶l d 趿c k - b i b 及其同功酶均 升高、血脂改变、甘油三脂升高、胆固醇升高；心电图检查心电图平均心率9 6 次s i n ，出 现窦性心动过速、心律不齐、p - r 时限延长、s _ t 段改变等症状这与a p l i n ( a p l mt h e ，1 9 7 6 ) 报导的结果一致。l l or i c h a r dk b 报道( h o r i c h a r dk b ，1 9 6 0 ) ，夏威夷一名3 岁男孩误食几 粒麻疯树果后出现中毒，产生严重的呕吐腹泻及重度失水征谭逢枚报道( i t 逢枚，1 9 9 8 ) ， 4 例误服了几粒麻疯树果患者在中毒后2h 即出现严重的失水、心悸、大汗紫绀、瞳孔缩小、 呼吸衰竭及抽搐，l 例死亡 1 2 4 2 麻疯树毒蛋白 麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 是种子毒性成分最强之一( 陈钰等，2 0 0 3 ) ，其在种子中含量最 高对麻疯树蛋白质的研究，早在1 9 1 3 年，f e l k e ( f e l k ej ，1 9 1 3 ) 就首先从麻疯树种子中 分离到了毒蛋白( 6 轫r c i n ) s t i r p e ( s t r i p ef 等，1 9 7 6 ) 对麻疯树毒蛋白进行了分离，认 为麻疯树毒蛋白( c u m i n ) 与蓖麻籽毒蛋白( r j c i n ) 和巴豆毒蛋白( c r o t i n ) 的毒性相似，也具 有抑制真核细胞无细胞系统蛋白质合成的作用。黄德如对厦门麻疯树种子毒蛋白进行了分离 纯化( 黄德如等，1 9 9 1 ) ，并对其相关性质进行了初步研究 麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 类似于蓖麻毒蛋白( r i c i n ) ，纯化后的麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 是植物界中毒性最强的毒素( 黄德如等，1 9 9 1 ；h e l l e r j ，1 9 9 6 ) b a r b i e r i l ( b a r b i e dl 等， 1 9 9 3 ) 研究报道麻疯树毒蛋白属单链核糖体失活蛋白。麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 为核糖体失 活蛋白( r i b o s o m ei n a c t i v a t i n g p r o t e i n ，简称r i p ) ( 郑硕，1 9 9 3 ) 核糖体失活蛋白是一 类作用于r 烈a 而抑制核糖体功能的毒蛋白，破坏核糖体大亚基r n a 的结构而导致核糖体失活， 结果蛋白质合成受抑制，这种蛋白广泛存在于高等植物中( 李建国，2 0 0 5 ；王玉露，2 0 0 3 ) 植物r i p 对细菌和真菌有广谱抗性( 王小娟，2 0 0 4 ；l i nj 等，2 0 0 3 ；w e iq 等，2 0 0 5 ) ，对 真核细胞蛋白质生物合成的抑制作用机制，主要是使核糖体失活 林娟等( 林娟等，2 0 0 2 ) ，从麻疯树种子中分离纯化的麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) ，其分 子量为2 8 2k d ，其等电点为8 5 4 ，其为一种n 一糖苷酶型核糖体失活蛋白。陈钰等( 陈钰等， 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2 0 0 3 ) ，对麻疯树种子进行活性蛋白质筛选，得到两种蛋白质，一种是分子量为2 8k d 的毒 蛋白，该毒蛋白为核糖体失活蛋白：另一种是2 2 - 2 1 - 2 0k d 的三链复合蛋白。魏琴等( 魏琴 等，2 0 0 4 ) ，对麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 的抗真菌活性进行研究，以麻疯树籽为原料，分离 获得一种毒蛋白( c u r c i n ) 其分子量也为2 8 2l 【d 。林娟、魏琴等( 林娟等2 0 0 2 ；魏琴 等，2 0 0 4 ) 研究还表明麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 对植物病原真菌，如水稻稻瘟病菌 ( i 嗲r i c u l a r i a o r y z a ec a d 、松赤桔病菌( p e s t a o t i af u n e r e a ) 、玉米纹桔病菌( r m z o c t o n i a s o l a mk u h a ) 、油菜菌核病菌( s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ( l i 砂d ea a r y ) 等真菌的生长及其 菌丝生长和孢子都有明显的抑制作用，具有一定的抗菌性。 3 国内外研究现状 1 3 1 对麻疯树燃料的开发利用 1 3 1 1 国外对麻疯树生物燃油的研究 当前，发展生物燃料已成为发达国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重 要措施。自从诺贝尔奖获得者、美国加州大学的化学家卡尔文开始大面积的种植油脂植物以 来，在世界各地相继发现了一些“柴油树”、。酒精树”和“蜡树” 许多国家对生产和应用生物柴油实施免税政策和低税率政策，以保护生态环境国外一 些国家在生物燃料方面已实现规模化生产和应用。2 0 0 5 年，全世界生物柴油总产量约2 2 0 万吨，其中德国约为1 5 0 万吨以麻疯树为原料制取生物柴油并不早，1 9 9 5 年在洛克菲勒 基金和德国政府支持下，巴西、尼泊尔、津巴布韦开始了对麻疯树油用做燃料的研究开发 目前，国外以麻疯树为原料生产生物柴油的国家，已实现初步的规模化生产和应用( s h a h 等，2 0 0 5 ) 1 3 1 2 国内对麻疯树燃油的开发研究 我国政府对生物燃料也非常重视，并制定了多项指导性政策促进其发展。在“七五”期 问，四川省计划委员会能源办公室下达了“野生植物油作柴油代用燃料的开发应用示范”项 目，四川省林业科学研究院等单位对攀西地区野生麻疯树的适生立地环境、栽培技术、生物 柴油提取与应用等进行了较为深入的研究，利用麻疯树果提取生物柴油获得成功。中科院 。八五”重点项目_ 燃料油植物的研究与应用技术”，完成了金沙江流域燃料油植物资源的 调查研究，建立了麻疯树栽培示范区( 吴国江等，2 0 0 6 ：陈元雄等，2 0 0 6 ) 在国民经济和 社会发展“十五纲要中已提出了发展各种石油替代品，将发展生物液体燃料确定为国家产 业发展方向并于2 0 0 5 年通过了可再生能源法。国家“十一五”发展规划又再次将可再 生能源发展提到高度上来，充分体现了政府对生物质能源研发的重视 目前，国内从事麻疯树生产生物柴油研究开发的单位有中科院华南植物所、四川大学和 贵州大学，均处于生物柴油的研制阶段。 4 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 132 麻疯树饼粕的综合利用研究 由于世界范围内以麻疯树为原料生产生物柴油的研究已成为热门课题，而且其成果逐步 得到推广应用。致使对麻疯树生产生物柴泊的下游产品饼粕的开发利用逐渐引起关注。但目 前国内外也还处于立项阶段，未见具体报道。 国内这方面的研究还是空白尚未见报。国内晟早的报道为：2 0 0 6 年7 月l i 1 2 日德 国霍汉哈姆大学热带与亚热带动物生产研究所b e c k e r 教授、m a k k a r 教授和f r a n c i s 博士来华， 与浙江大学动物科学学院、中国农业科学院、南京农业大学、四川农业大学的专家和学者在 杭州举行了中德麻疯树合作项目研讨会签定了联合研究麻疯树饼粕的脱毒、蛋白饲料调制、 生物效价评定以及在畜禽饲粮中的应用等关键技术合作项目( 吴国江等，2 0 0 6 ；陈元雄等， 2 0 0 6 ：余伯良，1 9 9 9 ) 。目前，该项目的合作仍然还处于立项阶段。 14 贵州麻疯树资源及其研究概况 近年来，由于退耕还林的推进，西南各地大量种植麻疯树。未来全国麻疯树种植面积 至少可遮3 0 0 0 万亩以上，预计可产柴油5 8 0 多万吨( 按每亩每年产干果6 5 0k g ，每1k g 果可 榨取03k g 柴油计) ，显示了良好的资源开发利用前景。 贵州是典型的喀斯特地貌山区，由于地质原因，农作物的生长受到制约，过量的开荒种 植严重破坏地表植被。随着国民经济的发展和 口数量的不断增长，“石漠化”问题将成为 制约贵州乃至西南经济发展的一个不可忽视的重要因素。而麻疯树植物的主要特点是耐瘠耐 早，生长力极强，可以在沙石地等贫瘠的土地上生妊，不需要占用耕地，还具有抗旱、抗病 虫等特点。 根据对麻疯树资源的考察和研究，贵州省适宜种植麻疯树植物的区域主要分布在黔南、 黔东南、黔西南、黔中、黔北和黔东北地区( 见图卜l 图卜2 ) 。 图卜1 贵州省天然( 野生) 廨疯树分布围 f i g u r ei - 1 o u i z h o un m u r a ld i s t r i b u t i o n o f j a n d p h a 圄1 - 2 贵州省麻疯树适宜植区域围 f i g m c1 - 2g u i z h o u p l a n t i n gj a f f o p h a c u r c a sa p p m p r l a l er e g i o n a l 经近年的立项研究，贵州省已经筛选出了优质麻疯树种植、管理、采收提油等系列组合 技术。为麻疯树太规模产业化种植提供了技术支撑。麻枫树植物及果实形态见图卜3 ，果核、 籽仁、耔榨油后的饼粕形态见图卜4 ( 贵州大学2 0 0 7 ) 。 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 图1 3 麻枫树植物厦果实形态 f i g u r ei - 3j a t m p h a p l a n k a n d f r u i ts h a p e 麻瓤树是贵州的种特色油料植物资源 圈1 - 4 麻枫树籽殛榨油后的饼粕形态 f i g u f el 一4j a t r o p h a a 5 s e e da n do i i - m e a lf o r i l l 以贵州麻疯树果t 为原料研究开发生物柴油 口前已经i 坟得了定的成果。开发利川觫臧树资源对贵州而青儿有以下重要意义：( 1 ) 可以 减少水十流火加强环境保扩加强k 江j 一游地卜( 生态建搜，减少贵州石漠化面秘：( 2 ) 麻 疯树的人规模人1 种植、生物柴汕的生产规模化将推动种植地吒农业经济的发展，对于解扶 “了农”问题、对土地贫瘠地区农k 的脱贫有积极意义；( 3 ) 麻疯树种f 是制簪生物柴油板 蚶的原料来源，可推动生物柴油相芙技术的研止，储备和其规模化生产，减轻对l 油依赖的 危机( 贵i - h 人学2 0 0 7 ) ：( 4 ) 麻疯树含有# 富的_ 二萜醉哺类他合物在畦药用l 农鲋方面t f 屯 要的开发前景，”r 咀开发，e 产制药，：虻j 裢麻疯树生物制药产业； ( 5 ) 利川麻疯树饼粕开发 动物饲料推进音牧业的发展。 目前，贵州已建成麻疯树种植基地25 亩，其中在黔南的罗匈落实井建立了麻疯树快 速繁殖种植基地5 0 0 0 亩，h 以培育优质麻疯树种子、种苗和高产优质麻疯树植物：在黔西 卣辞地区落实井建立了优质麻疯树种植基地2 万亩j _ i j 于麻疯树优质品种的种植，井为十产 乍物柴油提供原料。至今为止麻疯树种植面积已逃8 万亩f 贵州人学，2 0 0 7 ) 。 15 研究目的和意义 随着世界 口的增加、经济增长的新需求干新挑战的加剧世界：| | = 冉生资游的数苗j j ： 在减少，田此人类必须u 约资源和充分提高对资源的利h 水平。同时，备牧业、家禽业及 饲料j 业的发展，蛋向饲料的短缺和小足已成为世界异国普遍面临的问题。阿动物蛋白价格 昂贵白然对植物蛋白的需求越来越重要，开发植物蚩n 已势在必行。 麻疯树作为种可雨生资源，在社会经济、i 业、农业发展和环境生态建设中均具有 举足轻重的作用。麻疯树农业产业化种植，将为麻疯树生物柴油的生产提供丰富的原料及 其推动麻疯树生物柴油产q k 快速发展。同时也什随产生人付的觫疯树饼柏，这为延k 产 业链和提高资源综台利效率提出了新的课题。现有的麻疯树饼粕人部分被作为肥料用或 直接排放于自然环境中不但严重地浪费r 太量的优质馑闩资源而乩匝造成严重的环境 污染。 麻疯树饼粕虽人特点就是含有根高的蚩闩含龉币i 较宽的营养范围。因此t 可将麻疯树 饼粕开发为蚩白饲料等食j 】产品。但必须是先对麻疯树汕饼粕进行脱毒。对麻疯树饼粕的 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 脱毒仅用简单的物理或化学方法处理难以达到预期的结果。微生物具有繁殖快、数量大、 产酶系复杂等特点，利用微生物发酵工程技术进行麻疯树饼粕的全方位脱毒，不仅可降低 麻疯树饼粕中的毒素因子的毒性，增加产品的适口性，而且还可进一步提高蛋白质和营养 因子的含量 因此，利用生物工程、高新技术进一步加强对麻疯树资源的开发研究，深入挖掘其可持 续综合利用的潜力，如利用微生物工程技术可将麻疯饼粕脱毒处理，作为人和动物蛋白质补 充的良好食源，提高其在生态、社会和经济等方面的效益( 何文淑等，2 0 0 2 ) 1 6 课题研究内容 ( 1 )以麻疯树生长基地为微生物菌种采样源，采集经麻疯树果、叶等残体腐殖质长期 自然驯化的微生物样源，进行分离、培养、诱变筛选，获取能在麻疯树饼柏上生长的微生物 菌株( m j l 8 ) ，以此为出发菌株。 ( 2 ) 研究菌株出发菌株m j l 8 的生理、生化特性，对出发菌株m j l 8 进行了初步定性分 类；并考查了出发菌株耵1 8 对麻疯树饼粕中毒性成分麻疯树籽油和毒蛋白( c u r c i n ) 的降 解作用 ( 3 ) 考查了出发菌株l u l 8 对麻疯树饼粕发酵脱毒的工艺条件参数，初步确定了利用菌 株| l j l 8 进行麻疯树饼柏发酵脱毒的基础工艺参数。 ( 4 ) 利用生物发酵饲料生产常用微生物菌种白地零( g i 舷6 9 ，6 e o t r i c h u mc a n d i d u m l i n k ) 和菌株i u l 8 进行混菌加强型发酵脱毒，考查2 株菌混菌发酵的效果 ( 5 ) 利用理化和生化方法，考查了2 株菌混菌发酵脱毒后麻疯树脱毒饼粕的氨基酸态 氮、总蛋白、氮基酸含量的变化及毒性 7 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第二章菌株分离及诱变筛选 对采集的微生物土样源，先用马丁一盂加拉红培养基进行选择性筛选，再利用查氏 ( c z a p e k ) 琼脂培养基培养，获取出发菌株对分离得的出发菌株进行紫外诱变筛选，获取 目的菌株 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 原料 麻枫树饼粕：黔西南某麻疯树生物柴油生产企业副产品。 麻枫树油；贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室自制 2 1 1 2 试剂 ( n i l ) s o 、k h 2 p 0 4 、n a n 0 3 、k 2 h p 0 4 、k c i 、m g s 0 4 、f e s 0 4 、m g s 0 4 - 7 h 2 0 、蔗糖、 蛋白胨、葡萄糖等，均为分析纯；1 3 0 0 0 盂加拉红水溶液、链霉素、琼脂、碘液、无菌生 理盐水，自来水 2 1 3 菌株 2 1 1 3 1 菌株分离源 土样：罗甸县麻疯树种植基地，从麻疯树腐殖质土样中采集 2 1 1 3 2 菌株诱变筛选 m j l 和耵2 ：采用马丁一孟加拉红培养基和查氏琼脂培养基从2 1 2 1 3 1 和 2 1 2 1 3 2 节菌株分离源土样中分离筛选培养而得 2 1 1 4 培养基 马丁孟加拉红培养基：查氏( c z a p e k ) 琼脂培养基，查氏( c z a p e k ) 淀粉琼脂培养基， 查氏( c z a p e k ) 琼脂液体培养基( 沈萍等，2 0 0 2 ；杨文博，2 0 0 4 ) 2 1 1 5 设备仪器 2 5 0m l 锥形瓶、1 0 0 0m l 烧杯、9 0m n 培养皿、1 0 0 脚l 量筒、l 舶l 移液管、1 0m l 移液 管、玻璃棒、小试管、刮刀、吸水纸、滴管、p h 试纸、接种环、酒精灯、玻璃涂棒、吸管， 紫外线灯( 1 51 ) ，其他主要仪器见表2 - 1 表2 - 1菌株分离纯化所用主要设备仪器 一 ! 璺垒! 里! ：兰兰墅鲢曼型磐曼鲤2 堑墅呈堕磐粤兰i 巴罂! 序号设备名称规格型号生产单位 1 电热鼓风恒温干燥箱1 0 i - 1 a 型沪南电路烘箱厂 8 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2洁净工作台 3生化培养箱 4电子精密天平 5立式压力蒸汽灭菌器 6显微镜 7 电子万用炉 8 磁力搅拌器 9 振荡混合器 落地普通型大容量恒 l o 温培养振荡床 s 卜c j l f d上海博讯实业有限公司医疗设备厂 s p x - 2 5 0 b _ z 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 f a l 0 0 4 奥豪斯国际贸易( 上海) 有限公司 y x q _ l s - 5 0 s i 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 e c l i p s e - e 2 0 0 豫i g l e l c 0 m p a n l 弧- 9 8 一ii 天津市泰斯特仪器有限公司 8 卜2 型 上海司乐仪器有限公司 h y - 2 a 数显上海天呈科上海天呈科技有