（无机化学专业论文）含萘铜配合物的合成、结构及其核酸酶活性研究.pdf

2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 摘要 核酸是生物体的重要组成物质，对于生命遗传密码的翻译、转录、复制起 着非常重要的作用，而金属离子对核酸结构的改变有密切的关系，研究金属配 合物与核酸的相互作用将有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质。 为了研究和探讨金属配合物与d n a 的作用机制及对d n a 的断裂，我 们通过分子设计，合成了两种含萘双核铜( i i ) 配合物，为了比较，还合成了 两个相应的单核铜( i i ) 配合物，系统地研究了四个配合物与d n a 的作用方 式和断裂作用。本文内容主要包括以下方面： 1 设计合成了下列四种配体，1 - 二( 吡啶一2 一甲基) 氨甲基 萘( l 1 ) ，2 - 【二 ( 吡啶一2 一甲基) 氨甲基】萘( l 2 ) ，1 , 4 一二【二( 吡啶一2 一甲基) 氨甲基】萘( r ) ，l ，5 - 二【二( 吡啶一2 一甲基) 氨甲基】萘( l 4 ) ，及其铜( i i ) 的配合物 c u ( l 1 ) ( c 1 0 4 h 2 h 2 0 ( 1 ) ，【c u ( l z ) ( c 1 0 4 ) 2 - 2 h 2 0 ( 2 ) ，【c u 2 ( l ) ( c 1 0 4 ) 4 6 h 2 0 ( 3 ) 和 c u 2 ( l 4 ) 1 ( c 1 0 4 ) 4 4 h 2 0 ( 4 ) ，通过元素分析、质谱和核磁共振技术对配 体作了表征，通过元素分析、质谱、电子吸收光谱和电化学研究对配合物进 行了表征，通过x 射线衍射技术对配合物2 和3 进行了晶体结构分析，所有 表征均表明合成的就是我们的目标产物。 2 通过热变性和荧光猝灭实验研究了铜配合物与小牛胸腺d n a 的相 互作用，结果表明双核配合物与d n a 的结合明显强于单核配合物，且顺序 如下：双核配合物3 4 ，单核配合物1 2 。 3 通过凝胶电泳实验研究了铜配合物对超螺旋p b r 3 2 2 d n a 的氧化、 水解断裂及在氧自由基清除剂下的断裂，在过氧化氢和抗坏血酸存在下，四 个配合物都能快速断裂d n a 双链，而在水解机制下，配合物3 仍能高效地 断裂d n a 双链，计算所得的动力学参数表明双核配合物断裂d n a 的能力 明显强于单核配合物，且有如下顺序：双核配合物3 4 ，单核配合物1 2 。 在氧自由基清除剂存在下的断裂研究证明了c u “在水解断裂d n a 时起了主要 作用，单线态氧( 0 2 ) 也有参与到反应中并对d n a 的断裂起了一定的辅助作 用，而超氧阴离子自由基( 0 2 一) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟基自由基( o h ) 2 0 0 s 届中山大学硕士学位论文邓淑仪 几乎没有产生作用。证实了配合物能以水解机理断裂d n a 。 关键词：含萘铜( i i ) 配合物核酸酶活性d n a 晶体结构凝胶电泳 i l 竺竺l 生坐盔兰! 堕兰垡笙主 型塑垡 s y n t h e s i s ，c r y s t a ls t r u c t u r ea n dn u c l e a s e a c t i v i t y o f n a p h t h a l e n e b a s e dc o p p e r ( i i ) c o m p l e x e s m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：d e n gs h u - y i s u p e r v i s o r ：p r o f m a oz o n g w a n n u c l e a s ea r et h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so fo r g a n i s m s ，a n dt h e ya r et h ed o m i n a n t s u b s t a n c ei nt h ei n h e r i t e dp a s s w o r d st r a n s l a t i o n ，c o n v e y ，r e p r o d u c t i o nf o rl i f e s t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o n sa n dm e c h a n i s mo fm e t a lc o m p l e x e sb i n d i n gw i t hd n a m a yb eam o l ec o m p l e t eu n d e r s t a n d i n go ft h eo r i g i no fl i f eo nam o l e c u l a rl e v e l ， w h i l em e t a li o n sh a v ec l o s er e l a t i o n s h i pw i t hn u c l e a s es t r u c t u r e i nr e c e n ty e a r s ，t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nm a c r o m o l e c u l e sa n d b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c a l e si sa n i m p o r t a n ts t u d yt a s ko ni n o r g a n i cb i o c h e m i s t r y e s p e c i a l l y , t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n t r a n s i t i o nm e t a lc o m p l e x e sa n dd n a 、r n ah a v ec a u s e dp e o p l e se x t e n s i v e i n t e r e s t i no r d e rt oi n v e s t i g a t ea n de x p l o r et h em e c h a n i s mo fm e t a lc o m p l e x e sb i n d i n g w i t hd n aa n dt h ec l e a v a g eo fd n a ，t w on o v e ld i n u c l e a rl i g a n d sa n dt h e i r c o p p e r ( i i ) c o m p l e x e sw i t hn a p h t h a l e n eh a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d f o r t h es a k eo f c o m p a r i s o n ，w e s t i l l s y n t h e s i z e dt w om o n o n u c l e a rc o p p e r ( i i1 c o m p l e x e s t h e i rn u c l e a s e a c t i v i t i e sh a v e b e e n s t u d i e d ，a n dt h ed i n u c l e a r c o m p l e x e ss h o ws t r o n g e ra b i l i t yt h a nt h em o n o n u c l e a rc o m p l e x e sb o t hi nt h e c o m p l e x d n a - b i n d i n ga n dt h ec l e a v a g eo fs u p e r c o i l e dp l a s m i dd n a t h i st h e s i s c o n s i s t so ft h ef o l l o w i n gp o i n t s ： 1 f o u r l i g a n d s ，1 - b i s ( p y r i d i n e - 2 一y l m e t h y l ) a m i n o m e t h y l n a p h t h a l e n e ( l 1 ) ， 2 - b i s ( p y r i d i n e 一2 y l m e t h y l ) a m i n o m e t h y l n a p h t h a l e n e( l 2 ) ， 1 ，4 一d i b i s ( p y r i d i n e 一2 一y l m e t h y l ) a m i n o m e t h y l n a p h t h a l e n e( l 3 ) ， 1 1 1 ! 竺旦! 坐查兰婴圭兰篁堡塞 型塑堡 1 , 5 一d i b i s ( p y r i d i n e - 2 - y l m e t h y l ) a m i n o m e t h y l l n a p h t h a l e n e ( l 4 ) a n dt h e i rc o p p e r ( i i ) c o m p l e x e s c u ( l 1 ) ( c 1 0 4 ) 2 2 h 2 0( 1 ) ， c u ( l 2 ) 】( c 1 0 4 ) 2 2 h 2 0( 2 ) ， c u 2 ( l 3 ) 】( c 1 0 4 ) 4 - 6 h 2 0 ( 3 ) a n d c u 2 ( l 4 ) ( c 1 0 4 ) 4 4 h 2 0 ( 4 ) h a v eb e e ns y n t h e s i z e d t h el i g a n d sh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e db ye a ，e s i m sa n d1 h n m rw h i l et h e c o m p l e x e sb ye a ，e s i m s ，u v - v i sa b s o r p t i o na n dc y c l i cv o l t a m m e t r yt e c h n i q u e s t h ec r y s t a ls t r u c t u r eo f2a n d3w e r ea n a l y z e db yx r a yt e c h n i q u e 2 t h es t u d i e sb a s e do nt h e r m a lm e l t i n gc a l v e sa n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p e so f c o m p l e x - d n a - - b i n d i n gi n d i c a t et h ea b i l i t i e so ft h ec o m p l e x e st ob i n dc a l ft h y m u s d n af o l l o wt h eo r d e r ：3 4i nt h ed i n u c l e a rc o m p l e x e s 1 2i nt h em o n o n u c l e a r c o m p l e x e s 。 3 t h ec o m p l e x e s m e d i a t e dp b r 3 2 2 d n as c i s s i o nv i ao x i d a t i v e ，h y d r o l y t i c m e c h a n i s m sa n du n d e rs o m eo x y g e ns c a v e n g e r sa r ea l s od i s c u s s e db yt h eg e l e l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n t v 卅l e nt h e yw e r ea p p l i e d t ot h ec l e a v a g ei nt h ep r e s e n c e o fh 2 0 2a n da s c o r b i ca c i d ，a l lt h ec o m p l e x e ss h o wv e r y s t r o n ga b i l i t y o f d o u b l e s t r a n dc l e a v a g eo ft h ed n a i nt h ea b s e n c eo fa n yr e d u c i n ga g e n t ，3i sa b l e t oa f f e c td o u b l e s t r a n dc l e a v a g em a r k e d l y t h eo b t a i n e dp s e u d o m i c h a e l i s m e n t e n k i n e t i cp a r a m e t e r si n d i c a t et h a td n ac l e a v a g ee f f i c i e n c i e sf o l l o wt h eo r d e r ：3 4 i nt h ed i n u c l e a rc o m p l e x e s ，1 2i nt h em o n o n u c l e a rc o m p l e x e s r e l a t i v et ot h e m o n o n u c l e a ra n a l o g ，t h ek c 砒v a l u eo fb i n u c l e a r4i so n l ys i m p l ya c c u m u l a t i v et o t a l o f2 ，b u tt h ev a l u eo fb i n u c l e a r3i sm a r k e d l yh i g h t h es t u d yo fc l e a v a g ei nt h e p r e s e n c eo fv a r i o u so x y g e ns c a v e n g e r si n d i c a t et h a tc o p p e rb i n d i n gb yt h el i g a n d s i se s s e n t i a la n dt h a t0 2i si n v o l v e di nm e d i a t i n gd n ac l e a v a g e k e y w o r d s ：n a p h t h a l e n e b a s e dc o p p e r ( i i ) c o m p l e x e s ，n u c l e a s ea c t i v i t y ，d n a ， c r y s t a ls t r u c t u r e ，g e le l e c t r o p h o r e s i s 2 0 皓届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 1 1 引言 第1 章前言 核酸是重要的生物大分子，而且是生物体的重要组成物质，遗传信息的携 带者和基因表达的物质基础，它的结构直接影响其功能，并与生物的生长、发 育等正常的生命活动以及癌变等异常生命活动有关。而金属离子在d n a 的复 制、遗传密码转录和翻译的过程中是必不可少的因素，并且由于金属配合物可 作为d n a 结构和构象的探针，近年来，小分子配合物与大分d n a 的相互作用 的研究已经成为生物无机化学领域上十分活跃的研究方向，并已取得了许多令 人瞩目的成果i “8 1 。 为了研究配合物与d n a 的相互作用及其机理，有必要先了解一些关于 d n a 的结构和配合物与d n a 的作用方式等基本知识。 1 2d n a 的结构与性质 1 2 1d n a 的组成及结构o 】 鼓h 。最肆泠吼 a d e n i n e g u a n i n e c y t o s i n e t h y m i n e 图1 - 1d n a 中的四种碱基 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 d n a 的结构有一级、二级、三级之分。d n a 的4 种脱氧核苷酸之间彼此通 过3 ，5 一磷酸二酯键连接起来形成单链，d n a 的一级结构就是指这4 种脱氧核苷 酸在分子中的排列顺序。d n a 的一级结构决定了它携带的信息和行使的功能。 1 9 5 3 年，w a t s o n 年l j c r i c k 在前人工作的基础上，提出了著名的d n a 双螺旋 结构模型，即是指d n a 是籍两条多聚核苷酸链上碱基之间的氢键维系而成的 有规则的双链螺旋结构的模型，如图1 2 所示。d n a 双螺旋是核酸二级结构的 重要形式。双螺旋结构理论支配了近代核酸结构功能的研究和发展，是生命科 学发展史上的杰出贡献。 图1 - 2d n a 的双螺旋结构 ( a ) 双螺旋结构示意图；( b ) 互补链碱基示意图；( c ) 碱基对结构 d n a 的二级结构具有以下特点： ( 1 ) d n a 由两条呈反平行的多核苷酸链 环绕一个共同的轴旋转形成双螺旋，两条链均为右手螺旋，由脱氧核糖和磷酸 基组成的主链处在螺旋的外侧，嘌呤和嘧啶碱基处于螺旋的内侧。 ( 2 ) 脱氧 2 2 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 核糖环和磷酸基交替而成的两条d n a 主链像一个转梯的两条扶手，嘌呤一嘧啶 碱基对就是其中的梯级，只有在a 与t 配对，g 与c 配对时，d n a 螺旋的两条链 才能吻合。a t 和g - c 碱基对可以形成很好的线性氢键，a - t 之间形成2 个氢键， g - c 之间有3 个氢键。从碱基与糖的连接点测量出来的a _ t 和g c 的几何形状是 一样的，且这些碱基对处于一个平面，在平面内有两次对称轴，碱基对旋转1 8 0 。 不影响双螺旋的对称性，即螺旋结构与d n a 的核苷酸顺序无关，因此不同碱 基组成的d n a 呈现同样的螺旋结构。碱基对平面在螺旋中与螺旋轴几乎垂直， 螺旋轴穿过碱基平面，相邻碱基对沿轴旋转3 6 。并上升0 3 4n m 。所以，每1 0 个 碱基对旋转一圈成一个螺旋结构，螺距3 4n m ，螺旋直径2n m 。这种碱基对的 互补配对是d n a 双螺旋结构的主要特征，只要一条链上的碱基顺序确定后， 另一条互补链的碱基顺序也就随之被决定了。 ( 3 ) 配对的碱基并没有充满螺 旋的空间，由于碱基对与糖环连接不是在碱基对的相反两侧而是在同侧( 图 1 2 ) ，碱基对与糖环的这种不对称连接导致双螺旋表面形成两个凹下去的沟， 一条宽的称为大沟( n l a j o rg r o o v e ) ，宽度为1 2a ，深度为8 5a ，另一条相对 较窄，称为小沟( m i n o rg r o o v e ) ，宽度为0 6a ，深度为7 5a 。大小两沟的深 度差不多，但大沟携带了其他分子能阅读的信息( 碱基顺序) ，且沟也足够大 能允许蛋白质分子进入。相比之下，小沟的信息较少。 维持d n a 级结构稳定的因素包括：( 1 ) d n a 中a t 与g c 间特定的碱 基配对形成的氢键( h y d r o g e nb o n d ) 。d n a 中这些氢键的集合能量是十分大 的，它赋予d n a 分子结构的稳定性，一旦某些氢键被打开，接着就会重新恢 复形成原有的键而保持构象不变。( 2 ) 碱基对之间在垂直方向上的碱基堆积 力( b a s es t a c k i n gf o r c e ) 。d n a 中相邻碱基平面间隔0 3 4n m ，仍处于v a nd e r w a a l s 力作用的范围内，因此碱基平面上分布的兀电子云系统之间的吸引力，碱 基上永久性偶极间的作用力和诱导偶极的相互作用等分子间作用力能促使堆 积状态稳定。堆积作用的强度与堆积碱基之间环的大小成正比，即：嘌呤一嘌 呤 嘌呤嘧啶 嘧啶嘧啶。 ( 3 ) 碱基还有一种尽量减少与水接触的表面 积而趋于成簇的疏水性质( h y d r o p h o b i cp r o p e r t y ) ，碱基成环部分的疏水性进 一步促成了碱基堆积，并使之成为在水中最有利的构象。 由于d n a 分子的柔性，磷酸和碱基的排列组合可以形成各种扭转角度和 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 各种碱基排列方式，这就产生了各种各样构型的d n a 分子，如a 、b 、c 、d 、 z 等等构型( 图l - 3 所示) 。d n a 的构象除了与核苷酸的顺序和碱基组成有关外， 在很大程度上还取决于环境条件，如盐的种类、相对湿度等。目前，人们普遍 认为生物体中绝大部分是b d n a ，而极少部分是以z 型d n a 形式存在。b d n a 和z - d n a 之间存在着平衡状态。对于b d n a ，其碱基位于双螺旋内侧，是疏 水性的，而由磷酸二酯键形成的多核苷酸主链位于外侧，是亲水性的。对于 z - d n a ，两条糖磷酸酯骨架比b d n a 靠得更近，因而碱基对位于双螺旋的外 侧，这样碱基对受到的保护程度就小了，可能就会成为某些化学致癌物的进攻 目标1 。 图1 3d n a 的几种不同构象的侧视图和相应的俯视图 连续的线段表示糖和磷酸主链，线段表示碱基对位置 在双螺旋二级结构的基础上，d n a 还可以形成三级结构，即是指d n a 双 螺旋的进一步扭曲形成的构象型式：双链环形d n a ( d o u b l es t r a n d e dc y c l i c d n a ) 的超螺旋型( s u p e r h e l i c a lf o r m ) 和开环型( o p e nc i r c u l a r f o r m ) ( 图l 一4 ) 。 许多d n a 是双链环型的，其中的超螺旋型d n a 具有更为紧密的结构，更 高的浮力密度，更高的熔点和更大的s 值。除了链状结构外，生物体普遍采取 舣链环行d n a 。完整的双链环 t d n a 在某些情况下可以扭曲成麻花状的超螺 4 旋或超卷曲结构。当超螺旋d n a 的一条链中出现一个缺刻( n i c k ) 时，超螺旋 结构就被松开，形成开环结构。 图1 4d n a 的三级结构 ( a ) 为直线型双螺旋结构；( b ) 为松弛环型结构：( c ) 为对( a ) 先拧松两周，在连接 成环形时，可形成以下( d ) 和( e ) 两种环形结构；( d ) 为解链型环型d n a ，l 代表 链缠绕的次数，t 代表w a t s o n c r i c k 螺旋数e l ，而w 代表超螺旋周数；( e ) 为 超螺旋( s u p e r h e l i x ) d n a 1 2 2d n a 的变性( d e n a t u r a t i o n ) d n a 的变性是指d n a 分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的 现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基问的堆积力遭到破坏，但不 涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、有机试剂 甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 变性d n a 常发生一些理化及生物学性质的改变：溶液粘度降低，溶液旋 光性发生改变，增色效应。对双链d n a 进行加热变性，当温度升高到一定高 度时，d n a 溶液在2 6 0a m 处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度 继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对d n a 溶液的紫外吸光率作图， 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文邓淑仪 得到的典型d n a 变性曲线呈s 型。d n a 变性是在一个很窄的温度范围内发生 的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的5 0 时的温度称 为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度( ， m e l t i n gt e m p e r a t u r e ) 。在时，核酸分子内5 0 的双螺旋结构被破坏。一定 条件下( 相对较短的核酸分子) ，t m 值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分 子越长，值越大；另外，溶液的离子强度较低时，值较低，融点范围也 较宽，反之亦然，因此d n a 胄f j 剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 1 3 配合物与d n a 的相互作用及研究方法 1 3 1 配合物与d n a 作用的基本模式 金属离子和配合物与核酸有多种作用方式，较强的是共价结合，相对较弱 的是非共价结合，包括插入结合、沟面结合、静电作用等方式。 图1 5 配合物与d n a 的作用方式 ( a ) 共价作用， ( b ) 插入作用， ( c ) 氢键作用 2 0 0 5 届中山大学磺士学位论文 邓淑仪 1 共价结合( c o v a l e n ti n t e r a c t i o n ) 小分子可以多种方式与d n a 结合，其中配位结合是配合物所特有的。这 种方式主要是金属离子和d n a 的碱基或磷酸根配位结合，结合力较强。如图 1 - 5 ( a ) 所示。随着软度的减小，过渡金属离子还能与磷酸根的氧原子配位结 合1 3 1 。通常，与碱基作用会降低d n a 双螺旋的稳定性，而与磷酸根结合则增 加d n a 双螺旋的稳定性。 2 插入结合( i n t e r c a l a t i v ei n t e r a c t i o n ) 含有平面芳香稠环结构配体的配合物以平面芳香杂环配体插入d n a ，并且 与d n a 中的碱基对重叠，通过7 c 7 c 堆积作用而稳定。这种结合模式最引人注意， 因为现在已经发现某些抗癌药的抗癌作用与插入结合有关 1 4 , 1 5 】。另外在d n a 介导的电子转移研究中插入结合也是一个必不可少的因素。当配合物以插入方 式与d n a 结合时，会引起配合物物化性质的一系列变化，如配合物的吸收光 谱强度减弱，最大吸收峰位移向长波方向移动，荧光强度增强等现象 1 6 - 1 8 ；同 时，由于配合物的插入，也会导致d n a 的熔点升高，粘度增大，这也是检验 小分子化合物是否插) x d n a 的重要手段 1 9 - 2 1 】。在插入结合中，依据插入的几 何情况的不同，又可以分为插入( i n t e r c a l a t i o n ) 或部分插入( p a r t i a li n s e r t i o n ) 、 不完全插入( s e m i i n t e r c a l a t i o n ) 和准插入( q u a s i i n t e r c a l a t i o n ) 【2 2 】。 3 沟面结合( g r o o v e f a c ei n t e r a c t i o n ) 过渡金属配合物结合在d n a 的沟面，主要依靠氢键和碱基的疏水性起稳 定作用。蛋白质大分子与d n a 的特异性结合是通过大沟区作用的，而小分子 化合物则一般在小沟区与d n a 结合，主要依靠氢键和碱基的疏水性起稳定作 用。典型的小沟区结合的分子多含有几种简单的芳香杂环结构如呋喃、吡咯或 苯环等，这些芳环由扭转自由的键连接，由此产生合适的扭转力来配合小沟区 内的螺旋曲线，取代沟中的水分子并与d n a 双螺旋链中沟区的碱基对边缘通 过氢键、范德华力结合。配合物以沟面结合方式与d n a 作用时，引起的光谱 变化相对较小。d n a 的粘度变化不明显，熔点曲线有规律地平移。 4 静电作用( e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n ) 核酸是一种带负电荷的多聚阴离子，通常以钠盐的形式存在。金属离子及 许多配合物带有正电荷，因此它们与核酸在外层通过静电发生作用，但这种静 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 电结合力是非常弱的。 1 3 2 研究方法 电子吸收光谱和发射光谱是研究配合物与d n a 相互作用的常用方法。 通常配合物与d n a 结合后会导致其配体所处的环境发生改变，配合物的光物 理性质在与d n a 结合前后也会因此发生相应的改变，这种变化反映了二者相 互作用的强弱。一般来说，当小分子以插入方式进入d n a 双螺旋碱基对之间 时，其吸收光谱表现出峰位的红移及减色效应【23 1 。需要注意的是，光谱学方 法对于确定配合物与d n a 作用的模式只能提供必要的数据，不能仅凭光谱变 化的大小去判断配合物与d n a 的作用模式。 通过单晶x 衍射的测定，我们可以了解到精确的配合物与d n a 作用的结 构信息。从而为研究配合物与d n a 键合机理及模式，提供有力的论证。在缺 少晶体结构资料的情况下，粘度测定是检测配合物与d n a 是否以插入方式结 合的最有效的方法，根据粘度的变化情况，可以判断配合物与d n a 相互作用 的模式，其结果比光谱数据更具说服力。 常用到的方法还有荧光猝灭，溴化乙锭( e b ) 作为一个具有芳香平面型 的分子，能平行地插入d n a 双股螺旋内部碱基对之间形成堆积，e b 本身具 有较弱的荧光，当插入d n a 后荧光增强5 0 1 0 0 倍，当e b 从d n a 中游离 出来或d n a 双螺旋减少时，荧光显著降低。利用这一特性可判断配合物是否 以插入方式与d n a 作用。稳态荧光，配合物与d n a 插入结合时，通常引起 荧光强度的增强，并且增强的幅度与配合物和d n a 的结合程度有关。同时， 配合物的激发态寿命也大大增强。c d 光谱，圆二色谱可以检测有无旋光物质 的存在，测定透析后的配合物的c d 光谱，还可帮助确定配合物与d n a 的相 互作用有无异构选择性。n m r 谱，n m r 谱能直接提供配合物和d n a 键合的 详细信息，用于更深层次上探测小分子化合物与d n a 的键合机理及作用位点 ( 如d n a 的大沟、小沟、或碱基位置的特异性结合等) 。电化学，电化学方 法作用研究电子转移方面的有力手段，可对光谱测量结果进行有效的补充，从 而更深入地反映金属配合物与d n a 相互作用的机理【2 ”。 8 型竺型邑! 些查兰燮壁垒奎 翌塑堡 1 4 配合物对d n a 的断裂 1 4 1 配合物对d n a 的断裂机制 过渡金属配合物作为“化学核酸酶”( c h e m i c a ln u c l e a s e s ) 【2 5 1 与核酸的反应 可以分为两类：一类涉及到金属配合物使核酸氧化的氧化还原反应；另一类是 金属与糖的磷酸酯骨架配位，使核酸水解的水解反应。 1 氧化还原机制 氧化反应依反应机理不同分为攫氢及碱基氧化。不同的配合物在核酸中有 不同的结合部位和结合模式，攫取不同的核糖环上的氢原子哳】，进而导致不同 的氧化断裂产物。f e n t o n 反应是引起聚核苷酸发生氧还反应的典型例子，该反 应通过自由基作用于糖环，引起d n a 链断裂。用f e ( e d t a ) 2 。进行的该反应示于 图1 6 ( a ) 。 ( q 嘲“ + h 】m 一啊_ + 圈+ 0 1 i 。 f 斟l u l + r 一州i i 图1 - 6f e n t o n 反应产生的氢氧自由基能引起d n a 链的断裂 ( a ) f e ( e d t a ) 2 一与h 2 0 2 反应生成氢氧自由基 ( b ) 断裂反应由c 4 一h 的抽提作用引起，得到相应产物 r 仃 ， 归 肾 申卞 o 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 像其他氧环活性的二价金属离子那样，在过氧化氢存在下，亚铁离子的作用能 生成氢氧自由基。在某些还原剂存在下，产生的氢氧基具有催化活性。亚铁离 子本身与核酸并无明显作用，而且当它与e d t a 螯合成一个阴离子配合物时， 会受到核酸聚阴离子的排斥作用。但所生成的氢氧自由基却能攻击糖环上的不 同位点，引起糖磷酸骨架的断裂，见图1 - 6 ( b ) 。 c u “可以切割d n a ，但活性较弱，浓度需要达到1m m o l l 级才有明显的 切割效果。不过当有某些还原性物质存在时其切割活性可以得到提高。切割机 理是c u “被还原成c u + ，然后c u + 再经过一系列的反应生成羟基自由基或是其他 的氧自由基，这些自由基再对d n a 产生切割作用。 2 水解机制 水解反应是金属配合物的中心金属离子直接或间接与磷酸骨架上的氧原 子配位，进攻磷酸二酯键引起水解或酯转移反应，并导致核酸的链断裂的反应 t 2 7 。金属离子在水解反应中的作用可以归纳为：( 1 ) 金属离子或金属配合物 具有l e w i s 酸的功能，与磷酸二酯键的氧配位时，使磷酸二二酯键活化；( 2 ) 利 用电子及空间效应稳定离去基团、中间体和过渡态；( 3 ) 利用模板效应调节 断裂试剂一核酸复合物的空间结构；( 4 ) 通过静电相互作用加强与核酸磷酸 酯骨架的结合。水解反应的作用机理与天然核酸酶基本相似，与氧化反应相比， 水解反应的断裂产物有较高的序列特异性，产物单一，反应条件温和。一些简 单金属离子女h z n 2 + ，p b “对r n a 水解的促进作用早已为人们所了解【2 8 1 ，c o ( 1 l i ) 乙啊二胺磷酸酯等模拟系统的研究揭示了配合物参与核酸水解反应的机理【2 。 与r n a 相比，d n a 具有显著的稳定性，生理条件下很难水解，是最稳定 的生物大分子之一。这是由于其双螺旋结构非常稳定，不易降解。因此小分子 化合物很难在生理条件下水解断裂d n a 。尽管如此，近年来还是发现了一些 能水解断裂d n a 的小分子化合物。 迄今设计的d n a 断裂试剂多以氧化还原机理断裂d n a ，氧化断裂试剂的 特异性主要依赖于在d n a 不同位置的反应性差异以及断裂试剂与d n a 的特异 性结合造成的局部自由基富集；自由基对生物活体有毒副作用，因而无论是用 于活体细胞内的研究还是作为药用都是不利的，而且由于自由基的高反应性和 1 0 竺幽一坐查堂堡圭竺垡堡苎 翌塑堡 扩散性，其特异性一般较差，反应难于控制，产物种类较多，切割产生的碎片 的末端结构不同于酶解产生的末端结构，因此它们不能再用连接酶连接而很 难被进一步利用，从而大大限制了其应用。而以水解机理断裂d n a 的试剂分 子则必须与d n a 链结合并相互作用，通常是金属离子直接或间接与磷酸骨架 上的氧原子配位，进攻磷酸二酯键引起水解或酯转移反应并导致链断裂，其机 理与天然核酸酶基本相同。因此，水解断裂与氧化断裂试剂相比具有相当的优 越性，可达到较高的序列特异性，并且反应条件温和、产物单一。 能水解断裂d n a 的金属配合物配体多为含氮大环或多胺，并常常带有芳 香环。芳香环与碱基对之间的疏水相互作用及其侧链与磷酸骨架之间的静电相 互作用均可有效促进与d n a 结合；配体将金属离子固定于d n a 骨架附近的有 效位置，配合物与d n a 的结合方式可以是插入或结合于大沟、小沟，一般有 配位的h 2 0 或o h 作为亲核试剂。而金属离子在水解断裂中一般有以下作用： ( 1 ) 作为l e w i s 酸促使亲核试剂产生；( 2 ) 与o 原子配位使磷酸二酯键活化： ( 3 ) 利用电子及空间效应稳定离去基团、中间体和过渡态；( 4 ) 利用模板效 应调节断裂试剂d n a 复合物空间结构；( 5 ) 通过静电相互作用加强与d n a 磷 酸骨架的结合。虽然氧化断裂反应依赖于氧化剂或光激发，但水解断裂也有些 需要h 2 0 2 或0 2 参与，水解断裂反应中可能伴随有部分氧化反应，其催化效率 一般比氧化断裂要低。虽然过渡金属配合物由水解机理断裂d n a 双链的特异 性优于氧化机理，但由于双螺旋d n a 有显著的稳定性，所以与氧化断裂试剂 相比，能成功水解断裂d n a 的分子极少。 1 4 2 研究方法 配合物与d n a 的反应即配合物对d n a 的切割用凝胶电泳实验来监测。 质粒d n a 一般有三种构型( 图1 7 ) ：第一种是共价闭环超螺旋d n a ( f o r m i ) ，它的结构比较紧密；第二种是开环缺亥i j d n a ( f o r m i i ) 构型，当超螺旋 d n a 的一条链上出现一个缺刻时，就成为这种构型。此时，超螺旋结构被松 开，因此结构较松散。第三种是线形d n a ( f o r mi i i ) ，当超螺旋d n a 的两条 链在同一部位被切断时，d n a 不能成环，完全开放成线状。三种构型的d n a 分子量完全相同，但是由于立体构型的不同，使它们在琼脂糖凝胶中的迁移率 兰竖旦! 坐盔堂堕圭堂竺丝苎 垩塑垡 不同。超螺旋的f o mi 由于结构紧密，易通过凝胶向正极移动，走在最前面， 其次是线形f o n l li i i ，而缺刻型f o n n i i 由于结构松散，向正极移动受到抑制， 走在最后面【姗。 。p e nc i r c u l a rd n a 茎三 k i nc l o s e p r o t of i r s tn i c k 叫 觚t j 图1 7d n a 的几种形式 纯度较高的质粒d n a 中主要有两种成分，即超螺旋f o r mi 和缺亥1 f o r m l i ， 其中以f o r mi 为主。超螺旋环状d n a 与化合物作用时，由于平面芳香环的插入， 导致超螺旋进行解旋，这样不同解旋度的环状d n a 在凝胶电泳中其泳动速度 便不样。解旋度越大，则泳动速度越小。而以沟面或静电结合的化合物，一 般不会导致超螺旋的解旋【3 l 】。 超螺旋i 型d n a 与缺刻的i i 型d n a 由于具有不同的移动能力，可在琼 脂糖中区别出来；相互缠绕起来的超螺旋d n a 分子易于运动穿过凝胶本体向 上e 极靠近，而缺刻d n a 分子则由于自身较为松散在凝胶中的移动受阻变慢， 不含净超螺旋的闭合环状分子( 记为i o 型) 则随缺刻分子起移动。当插入剂 进入超螺旋体系后，由于插入剂使d n a 解旋，d n a 中的二级螺旋转动数减少： 对于负超螺旋、闭合环状的d n a 分子来说，其中的正超螺旋数目会增加，以 补偿二级螺旋转动的减小( 总的缠绕转动量不变) ；于是总体上的负超螺旋数 目减小，导致分子在凝胶中的迁移能力下降。随着加入插入剂浓度的不断加大， 超螺旋数目不断减少，到达一定程度时超螺旋不再存在，整个体系变得与缺刻 的i i 型d n a 具有同样的移动能力。进一步增加插入剂浓度会引起d n a 转向 正的超螺旋结构，其移动能力反而增强。解旋实验就是d n a 结构变化可用生 物化学方法进行灵敏监测的例子，实验所需样品量极少，小于1p 矿。 1 2 _|1一 ：2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文邓淑仪 1 5 d n a 断裂试剂的研究进展 近年来，人工核酸切割试剂的研究是化学生物学、生物化学和分子生物学 中最为活跃的前沿领域之一。能水解断裂d n a 的金属配合物配体多为含氮大 环或多胺，并常常带有芳香环。 在生物体内发生着核酸的合成与降解，涉及核酸上磷酸二酯键的生成与断 裂。磷酸二酯键的断裂模式有氧化性断裂和水解性断裂，水解性断裂的产物有 可能用连接酶再连接。近年来，磷酸二酯键水解断裂的配位化学模拟取得了很 大进展，如图1 8 的几个化合物( a ) f 3 3 】、( b ) 蚓、( c ) 1 3 5 l 、( d ) 1 3 6 1 和( e ) 【3 6 】，据研究所 得它们与d n a 的结合能力都比较强，其中( c ) 可以高效定点切割低聚核苷酸，( d ) 和( e ) 进行了厌氧实验，证实这两种配合物以水解方式断裂d n a ，由于空间位 阻的影响，( d ) 中金属间距较适宜，不易于桥联，活性较( e ) 高。 ( a ) ( c ) ( b ) 透蔼 ( d ) 图1 - 8 几种d n a 断裂试剂 ( e ) 步 暇g r 、一锭 2 0 0 5 届中山大学硕士学位论文 邓淑仪 在所发现的具有水解断裂核酸能力的金属配合物中，有单核金属配合物， 也有多核金属配合物，涉及的金属离子有过渡金属离子，也有镧系金属离子， 但反应速率同天然酶相比仍差几个数量级，用多核金属配合物来模拟核酸酶对 磷酸二酯键的水解断裂应当是一个有前途的研究方向。 1 6 研究展望与选题意义 d n a 的沟是疏水性空腔，疏水性配体进入这个空腔时，即使不能插入， 也能因疏水作用而稳定”】。含有简单芳香杂环结构的小分子特别容易在小沟区 通过氢键与d n a 结合，这些芳环由扭睦自由的键连接，由此产生合适的扭转 力来配合小沟区内的螺旋曲线，取代沟中的水分子并与d n a 双螺旋链中沟区 的碱基对边缘通过氢键、范德华力结合。鉴于d n a 双链结构的特点，我们选 择萘环作为配体中心，希望通过其分子与d n a 的插入或沟面作用增强配合物 的核酸酶活性。 铜在生命体中起着重要的作用，已发现许多金属酶和金属蛋白的活性部位 均含有双核铜结构单元，如血蓝蛋白、酪氨酸酶、细胞色素c 氧化酶等【3 引。 它们由于电子传递而产生的磁相互作用对生物体的生理和催化作用有着至关 重要的影响，因而双核铜配合物的设计、合成及酶的模拟研究引起了人们的极 大兴趣1 3 9 。4 0 】。在进行金属配合物氧化断裂d n a 实验时，c u “被还原成c u + ， 然后再经过一系列的反应生成羟基自由基或是其他的氧自由基对d n a 产生切 割作用，然而对于c u ( i ) 而言，毗啶环与之配位有利于提高金属离子的稳定性， 吡啶