（分析化学专业论文）蛋白质与染料、药物相互作用及其应用研究.pdf

摘要 摘要 蛋白质是一类重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。它是重要 的生命物质，它与营养、发育、遗传、新陈代谢等生命活动有着密切的联系。 蛋白质的研究无疑将成为2 1 世纪生命科学之中主要的任务之。 对蛋白质和染料、药物相互作用的研究，不仅对改进和发展检测蛋自质的 方法有促进作用；同时也对药物设计分子、新药开发等均具有重要的指导意义。 本文对蛋白质与染料光谱探针、药物作用及应用的研究进行综述。研究了 酸性黄蛋白质体系、并将其运用于分析检测；探讨了头孢曲松钠与蛋白质的相 互作用；建立了催化法测定头孢曲松钠、痕量银的新方法。 一蛋白质与酸性黄作用机理的研究及分析应用 基于在p h = 1 6 4 的c l a r k l u b s 缓冲溶液中，牛血清白蛋白与酸性黄作用时 导致吸收光谱发生变化，在5 3 2 n m 附近吸光度明显降低，而在4 2 4 n m 附近吸光 度则呈增强趋势，其i 4i - 与c p 。呈良好线性。本文系统研究了蛋白质与酸 性黄的作用机理及实验条件对蛋白质与酸性黄结合反应的影响，探讨了蛋白质 与酸性黄之间的作用力。在选择的实验条件下，检出限为o 8 8 m g l 一，线性范 围为1 2 3 6 0 m g l - 1 ，应用于人尿中总蛋白的测定与邻苯三酚红钼法基本吻合。 二头孢曲松钠与牛血清白蛋白的相互作用研究 在模拟动物体p h 条件下，用荧光光谱和紫外一可见吸收光谱法研究了牛血 清白蛋白( b s a ) 头孢( c t r x ) 体系的荧光光谱进行了研究，采用同步荧光 河南人掌化学化丁学院2 0 0 4 级硕i j 学位论文邓翠贞 技术考察了头孢曲松钠对牛血清白蛋白构象的影响。实验发现，c t r x 对b s a 有较强的荧光猝灭作用，用s t e m - v o l m e r 和l i n e w e a v e r - b u r k 方程分别处理试验 数据，发现b s a 与c t r x 发生反应生成了新的复合物，属于静态荧光猝灭，发 生分子内的非辐射能量转移。求得c t r x b s a 的形成常数鼠b 及热力学函数 a g 、脯和丛，根据热力学函数确定了c t r x 和b s a 之间的作用力类型为静 电作用力，依据f 6 r s t e r 非辐射能量转移机制，确定了给体一受体i 日j 的结合距离 和能量转移效率，计算出结合位置距离蛋白质色氨酸残基为4 2 0 r i m 。 三阻抑催化光度法测定头孢曲松钠 对在磷酸介质中，c t r x 阻抑c u 2 + 高碘酸钾偶氮胂( i m 反应体系进行了研 究，并以此为基础建立了阻抑光度法测定c t r x 的新方法，研究确定了反应的 最佳实验条件。研究结果表明，该方法的检出限为0 0 0 2 2 m g l - l ，线性范围为 0 1 0 m g l 。该方法用于头孢曲松钠针剂中头孢曲松钠含量的测定，同时与高 效液相法进行了比较，结果满意。 四 乙基紫一k 2 s 2 0 s - a g ( i ) 催化反应体系研究及痕量银的测定 基于在醋酸一醋酸钠介质中a g ( i ) 催化过硫酸钾氧化乙基紫的褪色反应体 系进行了研究，并以此为基础建立了催化光度法测定痕量银的新方法，研究确 定了反应的最佳实验条件。研究结果表明，该方法的检出限为4 0 r t g l 一，线性 范围为0 8 0 1 t g l ，反应的表观速率常数为3 9 6 x 1 0 4 s 一，表观活化能为 4 0 0 4 k j m o l 。该方法用于废定影液样品中银的测定，同时与火焰原子吸收分光 光度法进行了比较，结果满意。 关键词：蛋白质酸性黄头孢曲松钠银 i l 摘要 a b s t r a c t p r o t e i ni sak i n do fi m p o r t a n tb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s a n da c ta sas p e c i a lr o l e i nt h eo r g a n i s m b e i n ga ni m p o r t a n tb i o l o g i c a ls u b s t a n c e ，i ti sn e a r l yr e l a t e dw i t h n u t r i t i o n , g r o w t h ，h e r e d i t ya n dm e t a b o l i s m i ti so b v i o u st h a tt h es t u d yo fp r o t e i n w i l lb eo n eo f t h em o s ti m p o r t a n tr e s e a r c ht a s k sd u r i n g2 1 t hc e n t u r y , t h er e s e a r c ho fi n t e r a c t i o nb e t w e e nd y e ，d r u ga n dp r o t e i n , w h i c hp r o m o t et h e d e v e l o p m e n to ft h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n i ti sa l s ou s e f u lf o rp h a r m a c o k i n e t i c ， d r u gd e s i g na n dd r u gd e v e l o p i n g i nt h i sp a p e r , f i r s t l yar e v i e wa b o u tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np c c t r a lp r o b e ，d r u ga n d p r o t e i n si ss u m m a r i z e d s e c o n d l yt h er e a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e np r o t e i na n da c i d y e l l o wi sr e s e a r c h e d , a n di ti sa p p l i e dt oa n a l y z e l a s t l y , w ef o u n da n e wm e t h o do f d e t e r m i n a t i o nc e f t r i a x o n es o d i u ma n dt r a c i n ga g ( i ) 1 s t u d yo nt h er e a c t i o nm e c h a n i s mb g 晰e e np r o t e i na n da c i dy e l l o wa n di t s a n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s i np h = 1 6 4c l a r k - l u b sb u f f e rs o l u t i o n , p r o t e i nr e a c t sw i t ha c i dy e l l o wt of o r m c o m p l e x , w h i c hc u l s e st h ed e c r e a s eo fa b s o r b a n c ea t5 3 2 n ma n dt h ei n c r e a s eo f a b s o r b a n c ea t4 2 4 n m ，t h ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sa ne x c e l l e n tl i n e a r i t y b e t w e e nf 爿f - ja n dc p - t h ei n t e r a c t i o na n dt h eb i n d i n gf o r c eb e t w e e na c i d y e l l o wa n dp r o t e i n 黼s t u d i e db yu vs p e c t r a t h ea b s o r p t i o nc h a r a c t e ro fa c i d y e l l o wa n dp r o t e i nc o m p l e xi nv a r i o u sc o n d i t i o n sw a s a l s os t u d i e d t h em e t h o dh a s b e e nu s e df o rd e t e r m i n a t i o no ft o t a l p r o t e i ni nh u m a nu r i n es a m p l e ，t h er e s u l t s o b t a i n e da g r e e dw e l lw i t ht h o s eb yt h ep y r o g a l l o lr e d - m o l y b d a t ec o m p l e xm e t h o d 1 1 1 河南大学纯学纯下学院2 0 0 4 级颀一 学位论文邓犟贞 2 t h es t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nb o v i n es e r u ma l b u m i n sa n dc e f t r i a x o n e s o d i u m u n d e rt h ei m i t a t e dp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o no fa n i m a lb o d y , t h eb i n d i n go fb o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) t oc e f t r i a x o n es o d i u m ( c t r x ) w a ss t u d i e db yf l u o r e s c e n c e s p e c t r u ma n du l t r a - v i o l e ts p e c t r u m t h ee f f e c to fc e f t r i a x o n es o d i u mo nt h e c o n f o r m a t i o no fb s ah a sa l s ob e e n a n a l y z e du s i n gs y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y i tw a ss h o w nt h a tt h i sc o m p o u n dh a saq u i t es t r o n ga b i l i t yt oq u e n c h t h ef l u o r e s c e n c el a u n c h i n gf r o mb s a a f t e ra n a l y z e dt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g d a t aa c c o r d i n gt os t e r n - v o l m e re q u a t i o na n dl i n e w e a v e r - b u r kd o u b l e ，r e c i p r o c a l e q u a t i o n w ef o u n dt h a tb s ah a dr e t e dw i t l lc e f t r i a x o n es o d i u ma n df o r m e da c e r t a i nn e wc o m p o u n d t h eq u e n c h i n gb e l o n g e dt os t a t i cf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ， w i t hn o n r a d i a t i o ne n e r g yt r a n s t 研h a p p e n i n g , w i t h i ns i n g l em o l e c u l e a c c o r d i n gt o l i n e w e a v e r - b u r ke q u a t i o n , t h ef o r m i n gc o n s t a n t so ft h ec o m p o u n da td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e sa n dt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sa l l ，a s ，a ga tc o r r e s p o n d e n c e t e m p e r a t u r e sw e r eo b t a i n e d t h eb i n d i n gl o c a l i t yw a sa l la r e a2 0 7n ma w a yf r o m t r y p t o p h a ni nb s a b a s e do nf 6 r s t e r sn o n - r a d i a t i o ne n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s m 3 s t u d yo i lt h ed e t e r m i n a t i o no fc e f t r i a x o n es o d i u mb yi n h i b i t o r yk i n e t i c s p e c t r o p h o t o m e t r an e wi n h i b i t o r yk i n e t i cs p e c t r o p h o t o m e t rm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c e f t r i a x o n es o d i u m ( c t r x lc a l lb es e e ni nt h i s p a p e r i tw a sb a s e do nt h e i u b i b h 0 1 ) re f f e c to fc t r xo nd i s c o l o r i n gr e a c t i o no fp o t a s s i u mp e r i o d a t ea n d a r s e n a z oi i ic a t a l y z e db yc u 2 + i nt h ep h o s p h o r i ca c i db u f f e ra n d6 5 w a t e rb a t h 摘要 t h ei n f l u e n t i a lf a c t o r so fr e a c t i o na n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ed e t e r m i n a t i o n o f c t r x 懈i n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h ed e t e c t i o nl i m i ti s0 0 0 2 2m g l t h el i n e a r r a n g eo fd e t e r m i n a t i o ni s0 1 0 m g l 1f o rc t r x t h em e t h o dw a sb e e na p p l i e dt o t h ed e t e r m i n a t i o no fc t r xi ni n j e c t i o n , a n dc o m p a r e dw i t ht h eh p l c m e t h o d w i t ha s a t i s f a c t o r yr e s u l t 4 t h e s t u d y o fe t h y lv i o l e t p o t a s s i u m a g ( 1 ) c a t a l y t i cr e a c t i o na n dt h e d e t e r m i n a t i o no f t r a c e a g ( i ) an e wc a t a l y t i cs p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o df o rt h ed e t e m l i n a t i o no fr a c es i l v e r c a nb es e e ni nt h i sp a p e r i tw a sb a s e do nt h ec a t a l y t i ce f f e c t so fa g ( i ) o nt h e o x i d a t i o nr e a c t i o nb e t w e e np o t a s s i u mp e r s u l f a t ea n de t h y lv i o l e ti nt h eh a c - n a a c b u f f e ra n d8 8 cw a t e rb a t h t h ei n f l u e n t i a lf a c t o r so fr e a c t i o na n dt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs i l v e rw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h ed e t e c t i o n l i m i ti s4 0 i _ t g 。1 t h el i n e a rr a n g eo fd e t e r m i n a t i o ni s o 一8 0 p g l 1f o rs i l v e r t h e a p p a r e n tr e a c t i o nr a t ei s3 9 6 x1 0 4 s 1a n dt h ea p p a r e n ta c t i v a t i o ne n t , ，f g yo f c a t a l y t i c r e a c t i o ni s4 0 0 4 k j + m o l t h em e t h o dw a sb e e na p p l i e dt ot h et r a c i n go fs i l v e ri n w a s t e rf i x a t i v e ，a n dc o m p a r e dw i t ht h ea t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r ym e t h o dw i t h as a t i s f a c t o r yr e s u l t k e yw o r d ：p r o t e i n ；a c i dy e l l o w ；c e f l r i a x o n es o d i u m ；s i l v e r v 美亏：学位论交独立完成和内客创新的声明 聂，人、向_ ：l 可南大学提岩硕士学位中请。奉人郑重声明：所呈交的学位论天是 左、，人、在导师的指导下独立完成的，对所研究酌课题有新的见解。据我所如紫 互串特别加以说明、标注乖致谢的地方外，论文中不包括共他人已经发表或撰 写迂的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证专；而 使用辽的材料。与我一同二作的同、享藏本研窥所儆的任何贡献均已丧论二：! 二凹任 了明确的说明并表示了谢意。 、，1o 学位获得者( 学位论又作者) 釜名： 20o 年舌月岁。目 瓠论文指强幡名：7 蒸叠芝 2 。p 7 年鲫歹d 固 刖晶 前言 蛋白质是生命的物质基础，它与人体的生长、发育、遗传、繁殖等一切生 命活动都息息相关。 对蛋白质与有机小分子的相互作用及应用研究，已成为从事生命科学、化 学、药代动力学和临床医学科研者的共同关注课题。对蛋白质与有机小分子相 互作用的研究，主要集中于蛋白质与染料探针的机理及结合模型、蛋白质与染 料探针的作用及蛋白质与药物的作用等几方面。 研究蛋白质与染料作用的机理及结合模型有利于研究生物大分子和有机小 分子相互结合作用的配位本质，对促进生命科学的发展有着重要的意义。 蛋白质含量的检测是临床检验中诊断疾病和检验疾病治疗效果的重要指 标。如尿蛋白的检测是肾脏疾病诊断和治疗的重要指标之一。健康成年人的尿 总蛋白的含量用常规的方法检测为阴性，当肾脏出现肾小球、肾小管疾病时， 尿蛋白常呈现异常增高。故通过尿蛋白的有无、蛋白含量的检测，对肾脏疾病 的诊断、鉴别诊断以及疾病的严重程度、治疗效果评价与预后判断具有重要意 义。 药物与人类生活密切相关，研究蛋白质与药物小分子的作用，对临床用药、 进行药物分子设计、开发新药等具有重要的指导意义。 本文研究的目的是：( 1 ) 寻找新的灵敏的染料探针，研究新的染料- 蛋白体 系，并将其应用于体液中蛋白质的分析；( 2 ) 研究蛋白质和头孢曲松钠的相互 作用，为阐明药物在体内的作用机制做理论铺垫。同时，建立新的头孢曲松钠 的分析方法，并将其应用于粉针剂的分析。 由于本人知识水平有限，论文中存在的缺点和不足敬请各位专家批评指正! 第一章蛋亡j 质与染料、药物作用研究进展 第一章蛋白质与染料、药物作用研究进展 蛋白质是一类重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。是重要的 生命物质，它与营养、发育、遗传、新陈代谢等生命活动有着密切的联系。随 着人类对生命现象研究的深入，人类对自己的了解也越来越清晰。1 9 9 0 年美国 制订了世界上最庞大的人类基因组项目。2 0 0 1 年2 月，( n a t u r e ) ) 和( ( s c i e n c e ) ) 杂志分别发表了人类基因组工作框架图，这是人类基因组计划实施以来所取得 的最重大进展1 1 捌。随着人类基因组研究的不断深入，人们又提出了后基因组一 蛋白质组研究d a , s 。蛋白质组的研究将成为2 1 世纪生命科学中继基因组研究 之后的主要任务。 蛋白质能和许多有机小分子发生作用，如药物小分子和用于检测蛋白质的 染料光谱探针等。对蛋白质与小分子相互作用的研究，主要集中于蛋白质与染 料作用的机理及结合模型、蛋白质与染料光谱探针作用的应用及蛋白质与药物 小分子的作用等几方面。 1 1 蛋白质与染料作用研究 蛋白质与染料作用主要是应用于蛋白质的定量检测，而蛋白质与染料反应 机理及结合模型的研究主要是从蛋白质的检测深化而来的。对蛋白质和染料相 互作用的研究，不仅对改进和发展检测蛋白质的方法有促进作用，而且对研究 生物大分子和小分子相互结合作用的配位本质，促进生命科学的发展有着重要 的意义。 河南，定学化学化t 学院2 0 0 4 级顾十学位论义邓带贞 1 蛋白质与染料反应机理及结合模型 1 , 1 反应机理 在研究用考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c b b g 2 5 0 ) n 定蛋白质时b r a d f o r d t 6 l 发现，不 同蛋白质对c b b g 2 5 0 的响应程度不同。这种现象促使人们迸一步探索染料与 蛋白质的反应机理、结合力、结合模型等，从而对实验现象作出合理的解释。 继b r a d f o r d 发现不同蛋白质对c b b g 2 5 0 的响应程度不同后，f a z e k a sd es t g r o t h t 7 】在研究普施安亮蓝r s 和考马斯亮蓝r - 2 5 0 ( c b b r 2 5 0 ) 与蛋白质相结合 时提出染料离子与蛋白质主要是依靠染料与蛋白质上的- n h 3 + 静电引力相结合 的。m o s h e t a l s 】指出，c b b r 在不同蛋白质上的结合数与蛋白质所带正电荷数 成正比，c b b r 上存在着s 0 3 ，它就是依靠s 0 3 与蛋白质碱性氨基酸残基作用 的。l i n d 9 1 曾对蛋白质上的碱性基团进行修饰，并且发现蛋白质对溴酚蓝的亲 和性降低的程度正比于被修饰的带正电的基团。现在普遍认为小分子与蛋白质 相互结合的主要部位是蛋白质上的碱性氨基酸残基。相互作用力有静电作用力、 疏水作用和范德华力等，通常并不是某一种作用力的单独作用而是多种作用力 的协同作用。这些碱性氨基酸残基包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸和n 端氨基【1 0 】。 当蛋白质在酸性条件下时，蛋白质上的氨基带正电( - n h 3 + ) ，增强了与带有酸性 基团的有机小分子的络合作用。目前研究较多的且可作为探针的染料分子中大 部分含有带电荷的亲水性基团如羟基、磺酸基、酚羟基及不带电荷的疏水性基 团，如苯环。在酸性条件下，带正电的蛋白质和带负电荷的染料分子通过静电 作用相互吸引到蛋白质的表面；同时由于一些非静电力如疏水作用、范德华力 的协同作用，使两者结合的更加紧密。染料分子与蛋白质的结合方式也是多种 多样的，蛋白质的主要结合点上可以结合多个染料分子。 1 2 结合模型 研究者提出了多种染料和蛋白质的结合模型，并用于计算结合参数，它们 分别适用于不同的情况。提出的结合模型主要有：s e a t e h a r d 模型、专一性和非 专一性模型( s - n s 模型) 、相分配模型、l a n g m u i r 单分子层等温吸附模型。其中 4 第一章蛋白质与染科、药物作用研究进展 s c a t c h a r d 模型被人们认为是比较经典的结合模型。而l a n 鄄a u i r 单分子层等温 吸附模型则是最近几年才提出的新的结合模型。 s c a t c h a r d i i i i 模型假设对于每一种配体，蛋白质上每个结合部位都是完全 一致的，并且这些结合部位与配体的作用是相互独立的，不存在相互作用。 专一性和非专一性模型( s n s 模型) 1 1 a i f a f l 提出了专一性和非专一性模型 ( s - n s 模型) ，专一性结合的特点是高亲合性和较小的最大结合数；非专一性结 合的特点是低亲合性和不存在最大结合数，两种作用之间不存在协同作用，因 而平均结合数n 是这两种结合数位数的加和。 相分配模型p l s a v e n t 0 1 1 3 1 在研究1 ( 四唑基偶氮) 2 萘酚3 ，6 二磺酸与蛋白质 作用时提出了相分配模型，认为牛血清白蛋白( b s a ) 对配体的吸收光谱和质子化 常数的影响类似于表面活性齐胶束的作用，没有特定的专一性的结合点，把b s a 当作不溶于水的微相配体在微相和水相中分配，其分配常数为一恒定值。 l a n g m u i r 单分子层等温吸附模型郜洪文1 1 4 】等则认为蛋白质分子由于复杂 的立体构想形成微弱静电场，在其作用下带电荷的小分子以单分子层形式被吸 附到微相电场表面，由于生化反应平衡方程与吸附剂在溶液中对吸附质单分子 层吸附一致，故用l a n g m u i r 单分子层等温吸附理论可以解释蛋白质与小分子问 的相互作用。 2 蛋白质与染料相互作用及其应用 由于蛋白质本身在可见光区没有吸收，且其荧光量子效率也较低。检测微 量的蛋白质，必须借助光谱探针，而染料是最常用的光谱探针。因此，研究蛋 白质与染料的相互作用，并将其应用于微量蛋白质的分析吸引了许多化学科研 工作者的目光。 蛋白质与有机小分子反应的研究主要是利用染料光谱探针小分子与蛋白质 发生反应生成复合物，从而使体系的光信号发生改变，再用相应的检测技术( 分 光光度法、荧光光度法、共振瑞利散射法等) 检测出信号的改变从而应用于定 5 河南人学化学化_ t 学院2 0 0 4 级硕1 ：学位论文邓翠贞 量分析体液中蛋白质的含量。 传统的蛋白质定量分析方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、l o w r y 法和b r a d f o l d 法等。本文就光度法、荧光法、共振瑞利散射法等借助染料探针束测定蛋白质 的方法进行了综述。 2 1 光度法 光度法多数是基于蛋白质与染料的结合而发生的显色反应或褪色反应，以 及利用会属染料螯合阴离子能与蛋白质作用的性质而发展起来的一种定量分 析蛋白质的方法。某些变色酸偶氮染料与蛋白质的结合作用尤引起人们的兴 趣。光度法以简便、经济、快速和准确等特点备受人们的青睐。 2 1 1 染料蛋白质体系方法 这类方法是基于在酸性介质中，蛋白质的肽键亚胺和n 端氨基质子化成阳 离子，若有阴离子染料存在时，由于电荷作用蛋白质便与染料结合、或改变结 合染料的光吸收特性，借染料颜色变化的程度测定蛋白质的含量。早期人们用 的染料有溴甲酚绿【1 5 】、溴酚蓝【1 6 】、考马斯亮蓝g - 2 5 0 7 1 。 胡秋娈1 1 8 1 研究发现氯酚磺s 与蛋白质能形成复合物，此法能很好的用于人 血中的蛋白质准确检测。迟燕华等【19 】发现茜素红s 在p h = 4 3 0 左右的b r 缓冲 溶液中，茜素红s 与人血清白蛋白( h s a ) 结合，生成红色复合物，吸光值与 h s a 含量呈线性关系，应用该法测定了人血清样品蛋白质的含量。庄惠生【2 0 等发现了使用四溴荧光素作为蛋白质的染色剂，建立了一种测定蛋白质的分子 吸收光谱分析新体系b s a 一四溴荧光素。可直接用于血清样品中蛋白质的测 定。马卫兴【2 l 】等发现在n h = 1 4 的c l 缓冲介质中，固绿f c f 与血清蛋白质作 用在室温下能迅速结合形成复合物，其最大吸收波长为6 6 0 r i m ，比固绿f c f 本 身红移了3 6 r i m 。用分光光度法研究了该结合反应的最佳条件，并在此基础上建 立了测定蛋白质的新方法。最近几年总体情况具体见表1 。 6 第一章噩e f 质与染料、药物作用研究进展 表1 染料在分光光度法测定蛋白质中的应用 t a b 1t h ea p p l i c a t i o no fd y ei nt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n b ys p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d 体系 删x 线性范围摩尔吸光系数 检测参考 ( i l i l l )( l t o o l - io c m 一1 ) 对象 文献 硝基磺酚c - 蛋白质 6 7 5 o 1 4 0 2 7 x 1 0 5b s a 3 1 x l o s y - g f 2 2 】 1 9 x 1 0 5h a s 曙红b 蚩自质聚乙烯醇 5 3 80 2 8 0 x1 0 71 4 1 1o ob s a 【2 3 】 曙红y - 虽白质 5 4 5。o 1 6 x1o | 72 1 x 1 0 6b s a 【2 4 】 伊红y 蛋白质5 4 5l o 1 6 1 0 i o2 1 2 x 1 矿b s a 2 5 】 5 4 5o 1 8 x1 0 o2 0 4 x 1 旷h s a 崮绿f c f 蛋白质 6 6 0“5 7 07 8 7 1 0 5b s a 鸟7 0 9 5 2 x1 0 h a s f 2 2 1 。5 9 0 1 6 0 1 0 0 l g g 二苯蓝f f 蛋白质5 6 0 铀6 0 1 3 3 1 矿 b s a 【2 6 】 # o 8 04 ，5 1 1 0 5h a s 吣8 05 ，7 8 1 0 5o v a 氯磺酚m 蛋白质 6 1 5埝1 0 04 3 4 x1 0 5b s a 【2 7 1 4 0 1 2 03 7 2 x1 0 5 h a s 协1 2 02 6 3 x1 0 5h b 4 0 1 8 0 4 5 0 x1 0 5y - g 水溶苯胺蓝蛋白质 6 0 0o 2 4 1 0 71 3 4 x1 0 4b s a 【2 8 附：“。表示：单位为t o o l - 1 c m 一；“”表示单位为r a g 一 2 1 2 金属离子染料结合分光光度法 金属离子一染料结合分光光度法是一种新发展起来的方法。1 9 8 3 年，f u j i 协y 等首次提出利用金属离子染料络合物测定蛋白质。这种方法灵敏度高，线性范 河南大学化学化工学院2 0 0 4 级硕 坞e 位论立邓举贞 围宽，干扰离子少，操作简单。 f u j i t ay 指出金属离子与含有一o h 或c = o 偶氮类的有机染料相遇时氧原 子中的孤对电子可以顺利进入杂化轨道形成稳定的配合体系，该体系在酸性条 件下遇到结构不对称的蛋白质时互相极化产生静电作用而结合成新的大分子 团。另外，大分子内部易形成氢键作用，蛋白质分子中的芳香氨基酸残基与有 机染料分子中的芳香结构都具有疏水作用而相互靠近，从而改变了原体系的光 谱性能，进而能定量测定蛋白质的含量【2 9 1 。 周秋云等1 3 0 | 用平衡透析法和分光光度法结合研究了2 ( 8 羟基喹啉5 一磺酸 偶氮1 ，8 二羟基3 ，6 一萘二磺酸与牛血清白蛋白在酸性溶液中的结合反应，并探 讨了其结合模型。马卫兴等 3 1 1 对铬偶氮k s 与蛋白质作用迸行了研究，发现偶 氮k s 与蛋白质作用形成紫色复合物，其最大吸收波长为5 8 8 n m 。胡庆红【3 2 】等 发现在p h = 1 o 2 ，0 的c l 缓冲溶液中，铬蓝s e 与蛋白质结合形成复合物，导 致铬蓝s e 褪色，建立了测定多种蛋白质的分光光度分析法。李进等人【3 3 】研究 了十几种变色酸偶氮染料与蛋白质的作用及所引起的光谱性能变化，详细探讨 了实验条件、染料结构对其互相作用的影响。他认为含有水溶性较好的酸性基 团( 如s 0 3 h ，- p 0 3 h 2 、- a s 0 3 h 2 等) 越多，灵敏度越高，从而表明与蛋白质的作 用越强。 f u j i t a y 【3 4 1 等发现邻苯三酚红钼( v ) 络合物在酸性条件下为红棕色，最 大吸收峰在4 6 7 n m 处。当它与蛋白质反应后变为蓝色，最大吸收峰在5 9 4 n m 处， 在6 0 0 n m 处吸光度值与蛋白质含量成正比。该方法的优点是试剂不被比色皿壁 吸附，但试剂对白蛋白和球蛋白的影响不一致。卢业玉等 3 s l 对z n ( i i ) 锌试剂 络合物与蛋白质的显色反应进行了研究，发现在p h = 2 8 的氯乙酸的缓冲溶液中 有t r i o n x 1 0 0 存在下z n ( i i ) 一锌试剂络合物与蛋白质结合生成玫瑰红色复合物， 且将此体系应用于麦片、花生、豆类及牛奶中蛋白质的测定。此外人们还对邻 苯三酚红钼( ) 【3 6 1 、铬天青s - a i ( i i i ) 【3 7 1 、3 4 5 6 四氯茜素紫钼( ) 【3 8 1 等金 属离子染料体系进行了研究。 第一章蛋白质j 染料、药物作用研究进展 2 2 荧光法 荧光法由于其干扰少、快速、灵敏度高、准确、实用性好等特点而发展迅速。 许多科研工作者在寻求定量分析蛋白质的荧光光谱探针方面进行了大量的研究 工作。 李东辉等【3 9 】以红区荧光染料四磺基铝酞菁为探针建立了荧光猝灭测定蛋白 质的新方法。该方法在最佳实验条件下线性区间为o 1 4 5 m g l - 1 ，检测限为 4 0 p g l 。卢臻等1 4 0 发现在p h ：2 5 3 的介质中，曙红y 与牛血清蛋白作用形成 复合物最大吸收峰从5 1 3 n m 红移到5 2 9 n m ，曙红y 荧光光谱发生显著的变化， 最大发射光波长5 4 0 r i m ( 最大激发光波长3 0 8 n m ) 荧光猝灭，其猝灭程度与b s a 含量成正比。高蜂等f 4 1 以苯并三唑、乙二醛、氨基硫脲为基本原料，合成了荧 光试剂- ( 1 h 苯并三唑) 乙二酮缩氨基硫脲席夫碱，并利用荧光分析法研究了它 在蛋白质测定中的应用。在p h = 8 0 的磷酸缓冲溶液中，该试剂在3 9 4 n m 处 ( z e x = 3 4 2 n m ) 发射荧光。实验表明，其荧光强度随着蛋自质的加入明显增强，据 此建立了测定痕量蛋白质的新方法。此外石燕等【4 2 1 建立了用染料麦塔喇红固定 波长同步荧光法测定牛血清白蛋白的新方法。陈鸿琪1 4 3 1 研究了二溴苯基荧光酮 配合物作为蛋白质光谱探针的实验，在p h = 2 0 4 0 缓冲介质乳化剂存在下室 温下能与蛋白质迅速形成稳定的复合物，使配合物在5 3 2 n m 处吸收峰值降低。 该方法可直接用于人尿液或人血清蛋白的定量测定。 二聚体荧光染料作为一种新的荧光探针引起了人们的极大兴趣。自1 9 9 3 年 p h y 等报道的合成噻唑橙二聚体和恶唑磺二聚体为荧光探针测定d n a 具有很高 的灵敏度m 1 。郭祥群等【4 卸考察了表面活性剂作用下现场形成了吖啶及番红花红 弱荧光现场二聚体的性质及与核酸的作用，并用于核酸的定量分析。近年来人 们也开始研究用二聚体平衡法来测定蛋白质。 宋功武h 6 】研究发现荧光素表面活性剂作用下形成二聚体后荧光强度明显降 低，加入蛋白质后二聚体荧光强度增加，寻求到了一种用荧光素测定蛋白质的 方法。陈鸿琪【4 力研究了阴离子染料荧光素在阳离子表面活性剂十六烷基三甲基 9 河南人学化学化t 学院2 0 0 4 缓硕十学位论文邓翠贞 溴化铵作用下形成二聚体，利用体系荧光的变化定量测定了蛋白质。方光荣等 以荧光染料单体和二聚体平衡转化为基础，提出了以罗丹明6 g 荧光染料为 生物探测测定蛋白质的方法。罗丹明6 g 在十二烷基磺酸钠的存在下形成二聚 体，蛋白质的定量加入可以使二聚体解聚，调节单体和二聚体的平衡转化。该 法线性范围宽、灵敏度高、反应速度快、准确度高、抗干扰能力强。继而他们 4 9 1 又提出了采用流动注射法进行分析，更进一步改进了该方法。 高峰等1 5 0 对阳离子染料灿烂甲酚蓝在阴离子表面活性剂存在时的溶液的吸 收光谱进行了研究，同时还研究了灿烂甲酚蓝在阴离子表面活性剂作用下形成 的现场二聚体的荧光性能，并用其现场二聚体作为探针，用于蛋白质的测定。 2 3 共振瑞利散射法 共振瑞利散射( r r s ) 是当瑞利散射位于或接近它的吸收带时，由于电子吸 收，电磁波的频率与其散射频率相同，电子因共振而强烈吸收散射光的能量发 生再次散射，其入射光源可用普通光源。目前的分析应用于痕量金属、非会属 和某些有机物质的测定，也常利用其生色团在生物大分子上的聚集作用，导致 了r r s 显著增强，面用于蛋白质、核酸等生物大分子的定量测定。 杨睿等1 5 1 】采用曲利本蓝蛋白质体系的r r s 光谱对蛋白质含量进行研究。 发现在p h = 2 0 的盐酸乙酸钠介质中，在非离子表面活性剂曲通x 1 0 0 的存在 下，曲利本蓝溶液本身的r r s 十分微弱，加入某些蛋白质后，蛋白质与曲利本 蓝的结合反应使溶液的r r s 发生很大的变化，散射强度急剧增加并产生新的散 射光谱，并且在一定条件下散射强度与蛋白质浓度成正比。在体系中加入钼( i v ) 能提高方法的灵敏度，并使体系具有较好的稳定性。以曲利本蓝牛血清白蛋白 体系为例研究了体系的光谱特征、影响因素以及反应的适宜条件，并应用于合 成样品的测定。 吴会灵等5 2 1 发现微量蛋白质对依波西隆蓝( 2 ( 4 硝基苯偶氮) - 1 - 萘酚一3 。8 二磺酸二钠盐) 的共振光散射产生增强作用，且增强程度与蛋白质浓度有良好 的线性关系，由此建立了测定蛋白质的灵敏共振光散射分析方法。此外，有报 l o 第一章垂i 赝与染料、药物作用研究避艘 道利用磷锑钼蓝1 5 3 】、偶氮氯膦i i i t 5 4 1 、乙醇敏化钛黄、铬黑一5 6 1 、四磺基锰酞 青1 5 7 】等作为光谱探针定量测定蛋白质。 1 2 蛋白质与药物的相互作用 药物进入血液后，一部分可能与血浆中的蛋白质( 主要为白蛋白) 发生可逆 的结合，结合的部分称为结合型药物，未结合的部分称为游离型药物。当游离 型药物浓度降低时，结合型药物就部分解离为游离型，二者处于动态平衡。只 有游离型药物可透过血壁到达作用部位且与受体作用，绝大多数药物也只有游 离型可被机体代谢和排泄。因此，研究药物与血清白蛋白的相互作用对从分子 水平上了解和掌握药物在体内作用机理、毒理和代谢情况，从而把握最佳用药 量和用药周期以及多种药物联合使用时最佳配比等具有重要的指导意义。 用荧光法研究药物分子与蛋白质的结合反应可以综合利用蛋白质和药物的 荧光猝灭、荧光敏化、能量转移和实验条件的影响等方面的信息，因而是主要 的研究手段之一。因此，本节仅对用荧光法研究药物分子与蛋白质的相互作用 进行了综述。 1 荧光光度法研究蛋白质与各类药物作用的内容 药物分子与蛋白质相互作用的研究是介于化学与生命科学之间的边缘性课 题。从化学研究的角度来看，蛋白质与药物结合反应的研究主要包括结合位置、 结合数、结合常数、作用力类型、药物与蛋白质的结合对蛋白质构像的影响等。 1 1 结合部位的确定 血清白蛋白的三维晶体结构已探明，有3 个类似的结构域【5 e l ：s i t ei ，s i t e i i 和s i t e i i l 。每个结构域又含有a 与b 两个亚结构域，以槽口相对的方式形成圆 筒状结构。大多数药物在血清白蛋白上的结合部位为s i t ei 及s