（中医内科学专业论文）加味青蒿鳖甲汤干预bmscs对amlcr患者bmnc来源dcs诱导的影响.pdf

j 贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 filr l llr ll l l i i i ii iji iifj y 18 3 7 0 9 0 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也 不包含为获得贵阳中医学院或其他单位的学位或证书而使用过的材 料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确 说明。 作者： 日期：厉耖年f 肜扩日 关于学位论文使用授权说明 本人了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学 位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位 论文；学校可根据国家或贵州省有关部门规定送交学位论文。 名：蹭聊签鲈吼冲年厂月痞日 目录 中文摘要1 英文摘要3 引言6 文献研究7 实验研究1 8 1 实验材料与方法1 8 2 结果2 2 3 讨 仑3 2 4 结 仑3 5 全文总结与展望3 6 参考文献3 8 附录l 4 3 附录2 4 4 附录3 致诩 5 3 附录4 个人简介5 4 贵刚中医学院硕 学位论文 摘要 目的：本实验以体外培养的方法，以加味青蒿鳖甲汤灌胃动物( 大白兔) 制 备中药含药血清备用，将达到完全缓解标准的急性髓系白血病患者骨髓中分离出 基质细胞与加味青蒿鳖甲汤含药血清共同培养，同时将同一例患者的去t 细胞骨 髓单个核细胞( t d b m n c ) 与加味青蒿鳖甲汤含药血清共同培养，将基质细胞与b m n c 来源的d c s 共同培养，观察含药血清对此来源的树突状细胞( d c s ) 分化成熟的影 响。用此法诱导分化的d c s 与纯化的币常人和缓解期患者外周血t 细胞共同培养， 得到激发t 细胞，用激发的t 细胞与白血病细胞株( k 5 6 2 ) 共同培育，以m t t 法测 定该t 细胞对k 5 6 2 细胞株的杀伤活性，探讨加味青蒿鳖甲汤对急性髓细胞白血病 完全缓解期患者d c s 的免疫功能的影响。 方法：应用沈涤细胞、离心程序在a m l - c r 患者的骨髓中分离出b m s c s ，加入 加味青蒿鳖甲汤不同剂量含药血清组及含药血清联合细胞因子组、细胞因子组、 空白血清组的2 5 c m 2 培养瓶中，放置在3 7 。c ，5 c 0 ：的培养箱中培养，于接种3 d 后首次半量换液，以后隔同换液，在倒置显微镜下观察细胞形念及生长情况并拍 照：2 应用绵羊红细胞玫瑰花结程序从a m l - c r 患者骨髓中分离出去t 细胞的骨髓 单个核细胞( t d - b m n c ) ，用含i o f b s 的r p m l l 6 4 0 培养液调整t d b m n c 细胞浓度 后加入2 4 孔板中培养，培养9 d ，隔同换液1 次，以不同浓度中药含药血清、中药 含药血清联合细胞因子( g m - c s f 、i l 一4 、t n f - a ) 、细胞因子、空白血清组分别培 养：在培养过程中观察细胞的形态并拍照。3 用f i t c 标记的c d 2 9 、c d 4 4 及c d 一1 a 、 h l a d r 、c d 8 6 抗体分别标记b m s c s 及d c s ，用流式细胞仪检测各组各抗体的表达 率。4 收集培养9 d 后的b m s c s 与d c s ，用r p m l l 6 4 0 调整细胞浓度至1 x l o b m l 混 合培养5 d ；5 分别收集纯化的同种异体t 细胞、a m l c r 患者自体t 细胞、b m s c s 与a m l c r 患者t d - b m n c 来源的d c s 以1 0 ：1 比例加入2 4 孔培养板培养5 d ，培养 基中加入l o o u m l 的i l - 2 进行同种异体t 细胞及自体t 细胞的激发。6 激发后的 各组t 细胞与k 5 6 2 细胞分别以1 0 ：l 、2 0 ：1 、4 0 ：l 效靶比例培养2 4 h ，m t t 法 检测不同条件培养的d e s 诱导t 细胞的杀伤效应。 结果：b m s c s 免疫分子检测显示，a m l c r 患者骨髓基质细胞经各剂量加味青 蒿鳖甲汤含药血清组、各剂量加味青蒿鳖甲汤含药血清联合细胞因子组诱导培养 均能获得具备典型特征和高表达c d 2 9 、c d 4 4 的b m s c s ，c d 2 9 、c d 4 4 表达与空白组 贵刚中陕学院硕卜学位论文 及细胞因子组有显著差异并优于后两者；加味青蒿鳖甲汤高剂量组及加味青蒿褴 甲汤含药血清联合细胞因子组中均以高剂量组的c d 2 9 、c d 4 4 的表达最好。d c s 的 免疫分子检测显示，不同剂量的加味青蒿鳖甲汤含药血清组和加味青蒿鳖甲汤含 药血清联合细胞因子组均能诱导t d - b m n c 转化为高表达h l a d r 、c d 一8 6 和c d 一1 a 的d c s ，但细胞因子和加味青蒿鳖甲汤含药血清是否有协同诱导d c s 的作用仍待进 一步研究：b m s c s 与d c s 共同培养后激活外周血t 细胞对k 5 6 2 细胞的杀伤作用： 各组激活t 细胞对k 5 6 2 细胞均有杀伤作用，说明加味青蒿鳖甲汤含药血清诱导的 d c s 可以有效的捉呈肿瘤抗原并活化了t 细胞从而特异的杀伤k 5 6 2 肿瘤细胞；效 靶比1 0 ：l 、2 0 ：1 、4 0 ：l 时不同剂量加味青蒿鳖甲汤联合细胞因子组杀伤率普 遍优于细胞因子组及含药血清组，说明细胞因子与加味青蒿鳖甲汤在干预d c s 激 发t 细胞杀伤k 5 6 2 细胞方面有协同作用；在有显著差异的各组问患者自体t 细胞 杀伤率总体优于异体t 细胞，说明白体t 细胞对k 5 6 2 细胞的杀伤活性比异体t 细 胞对k 5 6 2 肿瘤细胞的杀伤活性强，这可能与肿瘤免疫逃避机制有关；组内比较效 靶比与杀伤率之l 廿j 没有一定的规律可循，这与文献报道的杀伤作用随效靶比的增 加而增加不符，有待以后的实验进一步研究。 结论： 1 急性髓系白血病完全缓解患者骨髓经加味青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养可获得 具备典型特征和细胞表型的b m s c s 。 2 急性髓系白血病完全缓解患者t d - b m n c 经加味青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养可获 得具备典型特征和细胞表型的d c s 。 3 经加味青蒿鳖甲汤含药血清干预的b m s c s 影响t d b m n c 来源d c s 后，d c s 激活的 t 淋巴细胞能够特异性杀伤k 5 6 2 肿瘤细胞。 关键词：加味青蒿鳖甲汤a m l c rb m s c sd c s 贵刚中医学院硕十学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：i nt h i se x p e r i m e n t ，i nv i t r om e t h o d st os o u pf l a v o r e db i e j i a f e da n i m a l s ( r a b b i t s ) t op r e p a r ea l t e r n a t i v ec h i n e s e h e r bm e d i c i n e ，t o r e a c hc o m p l e t er e m i s s i o nc r i t e r i ai np a t i e n t sw i t ha c u t em y e l o i dl e u k e m i a b o n em a r r o ws t r o m a le e l l si s o l a t e df r o ma r t e m i s i aa n n u aa n dm o d i f i e dt u r t l e s h e l lc o n t a i n i n gs e r u mw e r ec u l t u r e da tt h es a m et i m et ot h es a m etc e l l s i np a t i e n t sw i t hb o n em a r r o wm o n o n u c l e a rc e l l s ( t d b h n c ) a n dm o d i f i e d b i e j i ac o n t a i n i n gs e r u mc o c u l t u r e 。w i 1 lb et h es o u r c eo fs t r o m a lc e l l s a n dd c sw e r ec u l t u r e db m n co b s e r v e dw i t ht h i ss e r u md e n d r i t i ce e li s ( d c s ) i n f l u e n c et h ed i f f e r e n t i a t i o na n dm a t u r a t i o n m e t h o dh a sb e e na p p l i e da n d p u r l f i c a t i o no fd c si n d u c e dd i f f e r e n t i a t i o no fn o r m a lh u m a na n dp a t i e n t s i nr e m i s s i o nw e r ec u l t u r e dp e r i p h e r a lb l o o drc e l l s ，re e l l sa r es t i m u l a t e d w i t htc e l l ss t i m u l a t e dw i t hl e u k e m i ac e l ll i n e ( k 5 6 2 ) j o i n tt r a i n i n g 。t o t h ete e l lm t tm e t h o do nt h ek i l l i n ga c t i v i t yo fk 5 6 2e e l l l i n et oe x p l o r e t h em o d i f i e db i e j i as o u po na c u t em y e l o i dl e u k e m i ai nc o m p l e t er e m i s s i o n i np a t i e n t sw i t h i m m u n ef u n c t i o no fd c s m e t h o d s ：a p p li c a t i o nw a s h i n ge e ll s ，c e n t r if u g ep r o g r a mi na m l c rp a t i e n t s w it hb o n em a r r o wis o la t e db m s c s a d d in gs o u pf l a v o r e dbi e ji as e r u m c o n t a i n i n gd if f e r e n td o s e so fg r o u p2 5 c m 2c u l t u r ef l a s k ，p l a c e di n3 7 ， 5 c 0 2i ni n c u b a t o r ，3 di n o c u l a t i o nm e d i u mw a sc h a n g e da f t e rt h ef i r s t h a l f ，a f t e rt h em e d i u mw a sc h a n g e de v e r yo t h e rd a y ，i nt h e i n v e r t e d m i c r o s c o p et oo b s e r v ee e llm o r p h o l o g ya n dg r o w t h ，a n dp h o t o g r a p h s ：2 r o s e t t ep r o c e d u r e so ns h e e pr e db l o o dc e ll sf r o mt h eb o n em a r r o wo fp a t i e n t s w i t ha m l - c rs e p a r a t i o no fb o n em a r r o wtc e l l sm o n o n u c l e a rc e l l s ( t d b m n c ) ， c o n t a i n i n g1 0 f b si nr p m l l 6 4 0c u l t u r em e d i u mt oa d j u s tt h ec o n c e n t r a t i o n o ft d - b m n ce e l lc u l t u r ea f t e rt h ea c c e s s i o no f2 4w e l lp l a t e s 。c u l t u r e d 9 d ， t h em e d i u mw a sc h a n g e de v e r yo t h e rd a y1 ，w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o fh e r bs e r u m ，c h i n e s eh e r bm e d i c i n ec o m b i n e de e llf a c t o r ( g m c s f ，i l 一4 ， 贵| j | i 中医学院硕十学化论文 t n f f 1 ) 。c y t o k i n e s ，b l a n ks e r u mw e r ec u l t u r e d ：c e l l sw a so b s e r v e di nt h e t r a i n i n gp r o c e s ss h a p e ，a n dt a k ep h o t o g r a p h s 3 w it hf i t c c d 2 9 ，c d 4 4a n d c d l a ，t l l a d r ，c d 8 6a n t i b o d i e sw e r el a b e l e db m s c sa n dd c s ，e a c hg r o u pw a s d e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r ye x p r e s s i o no ft h ea n t i b o d y 4 c o l l e c t i o no f c u l t u r e db m s c s a f t e r9 da n dd c s ，w it ht h er p m i 1 6 4 0c e l lc o n c e n t r a t i o n a d j u s t e dt olx l0 6 m lm ix e d t r a i n i n g5 d ：5 w e r ec o l l e c t e dp u r l f l e da l l o g e n e i ctc e l l s ，a m l c rp a t i e n t s w i t ha u t o l o g o u stc e l l s 。b m s c sa n da m l c rp a t i e n t sw i t ht d b m n cs o u r c eo f 1 0 ：1r a t i oo fd c st oj o i nt h e2 4 一h o l ei n c u b a t e d5 d ，m e d i u ma d d i t i o no f l o o u m lo fi l 一2t oa l l o g e n e i ctc e l l sa n ds t i m u l a t ea u t o l o g o u stc e l l s 6 i n s p i r ee a c hg r o u pa f t e rt h etc e ll sa n dk 5 6 2c e l l sw e r ec u l t u r e dw i t h 1 0 ：1 ，2 0 ：l ，4 0 ：1e f f i c i e n c yt a r g e tr a t i oo f2 4 h ，m t ta s s a yc u l t u r eo fd c s i n d u c e db yd i f f e r e n tc o n d i t i o n s tc e l lk i l l i n ge f f e c t r e s u l t ：d e t e c t i o no fi m m u n em o l e c u l e sb m s c ss h o w e dt h ee f f e c to ft h e m o d i f i e db i e j i ac o n t a i n i n gs e r u mg r o u p ，t h ed o s eo ff l a v o r e db i e j i a c o n t a i n i n gs e r u mc y t o k i n eg r o u p sw e r ec o m b i n e de x p r e s s i o no fc d 2 9 ，c d 4 4 ， a n dc y t o k i n e sw i t ht h ec o n t r o lg r o u ph a das i g n if i c a n t l yd if f e r e n ta n d b e t t e rt h a nt h el a t t e rt w o ，i n d i c a t i n ga m l c rp a t i e n t sw i t hb o n em a r r o w s t r o m a lc e l l sb ym o d i f i e db i e j i ac o n t a i n i n gs e r u mo b t a i n e dw i t ht h et y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fi n d u c e dc u l t u r ea n dc e l lp h e n o t y p eo fb m s c s ：m o d i f l e d b i e j i as o u pa n dh i g hd o s eg r o u pm o d if i e db i e j i ac o n t a i n i n gs e r u mc y t o k i n e s 贵刚中医学院硕十学位论文 as y n e r g i s t i cr o l eo fd c sr e m a i nt ob ef u r t h e rs t u d i e d a c t i v a t i o no ft c e l i st ok 5 6 2c e l lk i l l i n gr a t e ，t h ea c t i v a t i o no ftc e l i si ne a c hg r o u p w e r ek i l l i n ge f f e c to nk 5 6 2c e l l s ，d e s c r i p t i o nm o d i f i e db i e j i ac o n t a i n i n g s e r u mc a nb ee f f e c t i v e l yi n d u c e db yd c sp r e s e n t i n gt u m o ra n t i g e n sa n d a c t i v a t i o no ftc e l l st os p e c i f i ca n t i k 5 6 2t u m o rc e l l s ：1 0 ：i ，2 0 ：1 ，4 0 ：1 m o d i f l e db i e j i aw h e nt h es o u po fd i f f e r e n td o s e so fc o m b i n e dc y t o k i n eg r o u p r a t e sa r eb e t t e rt h a na n t i c y t o k i n eg r o u pa n dc o n t a i n i n gs e r u mg r o u p ， i n d i c a t i n gc e l lf a c t o ra n df l a v o r e ds o u pi nt h ei n t e r v e n t i o nb i e j i ad c s s t i m u l a t etc e l lk i l l i n gk 5 6 2c e l i sh a v eac o l l a b o r a t i o nw i t h ：i n s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sa m o n gg r o u p so fp a t i e n t sw i t ha u t o l o g o u stc e l l k i l l i n gr a t et h a na l l o g e n e i ctc e l l s 。i n d i c a t i n ga u t o l o g o u st c e l l st ok 5 6 2 c e l lk i l l i n ga c t i v i t yt h a na l l o g e n e i ctc e l l st ok 5 6 2t u m o rc e l lk i i i i n g a c t i v i t y ，a n dt h i sm a yb er e l a t e dt ot u m o ri m m u n ee v a s i o nm e c h a n i s m so f t u m o r ：t h eg r o u pm o r ee f f e c t i v ea n t i t a r g e tr a t i ob e t w e e nt h er a t ea n dn o t ac e r t a inr e g u l a r it y ， t h i sk i l li n ge f f e c to ft h er e p o r t e dt a r g e tw i t ht h ee f f e c t i v ei n c r e a s eo f m o r et h a ni n c o n s i s t e n tt ob ef u t u r ee x p e r i m e n t st of u r t h e rs t u d y c o n c l u s i o n ： 1 c o m p l e t er e m i s s i o no fa c u t em y e l o i dl e u k e m i ap a t i e n t sa f t e rb o n em a r r o w s o u pf l a v o r e db i e j i ai n d u c t i o no fd r u g c o n t a i n i n gs e r u ma n dc e l l so b t a i n e d w i t ht y p i c a lp h e n o t y p eo fb m s c s 2 a c u t em y e l o i dl e u k e m i ap a t i e n t sw i t hc o m p l e t er e m i s s i o na f t e rt d b m n c m o d i f i e db i e j i ai n d u c e dc u l t u r ec o n t a i n i n gs e r u ma n dc e l l so b t a i n e dw i t h t y p i c a lp h e n o t y p eo fd c s 3 t h em o d i f i e d b i e ji ac o n t a i n i n g s e r u mb m s c si n t e r f e r e n c es o u r c e s a f f e c t i n gt d - b m n ca f t e rd c s ，d c sa c t i v a t e dtl y m p h o c y t e st os p e c i f i c k i l l i n go fk 5 6 2t u m o rc e l l s k e y w o r d s ：m o d i f i e db i e j i as o u pa m l c r b m s c sd e s 5 贵同i 中阪学院硕十学何论文 引言 微小贱留白血病( m i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s ei nl e u k e m i a ，m r d l ) 是指急 性白血病患者经治疗完全缓解后体内仍旧残留微量白血病细胞的状态，是白血病 复发导致患者最终死亡的主要原因。随着现代治疗方法的不断发展和新的化疗药 物的丌发，造血干细胞移植技术的同臻成熟，国内外在治疗急性白血病方面有了 相当程度的提高，但是迄今为止对急性白血病的治疗都足以达到完全缓解为主要 目标，对于完全缓解后引起忠者复发的微小残留病的研究重点集中在诊断和监测 上，着重于残留白血病的定位及增贿动力学与正常造血关系的研究。治疗上尚缺 乏有效方法。研究发现，一些免疫治疗方法可能对白血病微小病变有效，目前白血 病的免疫治疗逐渐成为白血病治疗中的热点。研究表明白血病在获得完全缓解后 进行免疫治疗可提高疗效，并可望达到治愈白血病的目的。免疫治疗是当前的研究 重点，骨髓基质细胞与急性白血病的发生有着密切的关系，其对白血病细胞的抗 原提呈是否有影响，是否对树突状细胞的诱导、功能产生影响，中药干预基质细 胞对d c 是否产生影响值得深入研究。 中医在渗疗疾病上着重强调整体观念和辨证论治，f 所谓“阴平阳秘，精神 乃治；阴阳离决，精气乃绝”，整体的统一和平衡是疾病治愈的关键，因此治疗多 因素相关的复杂疾病，中医具有其独特的优势。我们认为急性白血病缓解后微小 残留病变的基本病理是正气虚弱、余毒留伏阴分，故清除伏毒即成为微小残留白 血病治疗的主要目标，而如何利用中医药进行肿瘤类疾病的免疫相关治疗具有重 要的研究意义。 本课题通过血清药理学及细胞体外培养的方法，从调控免疫功能角度出发， 研究加味青蒿鳖甲汤能否通过干预a m l - c r 患者b m s c s 从而对其骨髓单个核细胞来 源的d c s 诱导作用产生影向，探求根掘扶正祛毒透毒法立方的复方中药对微小残 留白血病的可能治疗机制。 6 正文 文献研究 1 现代医学对微小残留白血病的认知 急性白血病( a c u t e l e u k e m i a ，a l ) 是囚造血干祖细胞于分化过程中发生分化 阻滞、凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤。化疗是目 自订急性白血病主要的治疗方法，有效的化疗可以杀灭绝大多数白血病细胞从而达 到完全缓解( c o m p l e t er e m i s s i o n ，c r ) ，缓解后通过巩固强化及维持化疗可使患 者达到持续缓解，但仍不能彻底清除白血病细胞导致其在患者体内留存。 微小残留白血病是指白血病患者经过现代治疗按目日i 所确定的疗效标准取得 完全缓解后体内残存微量白血病细胞的状态。完全缓解后患者体内残存仍旧微量 白血病细胞( 1 0 n 1 0 9 ) 且恶性克隆增箔的潜力可存在于此数量以下的白血病细胞 中，一定条件下这些残留的微量白血病细胞不断增贿至一定水平而导致临床复发 最终导致患者死亡。 现代医学对微小残留白血病研究己深入开展，临床研究现今着重于如何进一 步提高残留白血病的检测技术水平和如何杀伤残留白血病细胞，减少复发，实验 研究主要着重于残留白血病的定位及其增箔动力学与j 下常造血关系的研究。细胞 免疫和分子免疫的研究进展使人们在不断认识免疫与肿瘤细胞相互作用的复杂机 制中，运用不同的方法治疗肿瘤。但是这些方法仍处于探索阶段，尚不能满足临 床大规模运用的要求且目自订尚无疗效肯定的方法和药物。 1 1 微小残留白血病的形成机制 患者经过多个疗程的单药及联合化疗仍不能完全杀灭白血病细胞，这可能与 白血病细胞的多药耐药性、静止期白血病细胞、“避难所”及自身的免疫功能异常 等多种因素有关。 1 1 1 多药耐药 多药耐药性( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ，m d r ) 指患者接触了一种( 或几种) 药 物后，不但对该药产生耐药性，而且对其它结构和作用机制不同的药物也产生耐 药性。白血病细胞对许多结构和功能都完全不同的药物的交叉耐药足急性白血病 治疗过程中的一种主要的耐药形式，是临床肿瘤化疗失败的主要原因。 7 贵同i 中陕学院硕十学何论文 1 1 2 静止期白血病细胞 许多研究证明，复发的白血病多数来自原发时的白血病细胞克隆他叫1 ，说明残 留白血病细胞不但能逃逸化疗药物的杀伤，而且能长期潜伏于体内，并在合适的 条件下再生长。白血病细胞的增熵周期对化疗效果具有显著的影响，处于增贿周 期的白血病细胞是化疗药物的主要治疗目标，但处于g 。期即暂不增殖的细胞群体 对化疗药物不敏感，这些细胞可能成为白血病完全缓解后的残留白血病细胞，成 为白血病同后复发的重要原因。 1 1 3 “避难所”的作用 白血病细胞在骨髓呈现克隆性增殖并播敞到外周血或浸涧到其它脏器，例如 白血病细胞可能通过血源播散、直接播敞、淋巴途径传播等途径侵入神经系统形 成中枢神经系统自血病，浸涧在睾丸形成睾丸白血病晴1 ，而化疗药物难于通过血 脑屏障及血睾屏障，减匿在中枢神经系统及睾丸中的白血病细胞不能被有效杀灭， 最终引起白血病髓外复发。 1 1 4 免疫清除能力减弱 m r d l 状态下患者免疫系统不能有效清除残留的白血病细胞，主要与下列因素 有关： ( 1 ) 白血病细胞的广泛浸润包括对免疫器官组织胸腺、脾、淋巴结的浸润， 使免疫系统处于抑制状态。 ( 2 ) 治疗活动对免疫系统损伤或抑制。化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也 在损伤正常细胞，包括对免疫细胞的损伤，反复强烈的化疗足提高缓解率的有效 手段，也同时抑制了患者免疫功能，进一步加重免疫抑制随7 1 。 ( 3 ) 白血病细胞通过肿瘤抗原性弱、肿瘤抗原调变、细胞表面“抗原覆盖”、 分泌免疫抑制因子等多种机制产生免疫逃逸躲避免疫攻击。 ( 4 ) 患者抗原提呈能力减弱。树突细胞( d e n d r i t i cc e l l s ，d c s ) 是最强有力 的抗原提呈细胞( a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l ，a p c ) ，白血病细胞的广泛浸润( 包 括对免疫器官) 、化疗、放疗对d c s 造成损伤，抑制d c s 的转化，使d c s 数量减少， 抗原提呈功能减弱，故推测在m r d - l 状态时，由于各种细胞因子的水平降低或紊 乱，内环境的改变也对d g s 的转化、d c s 的功能产生影响。 1 2 树突细胞与免疫应答 贵刚中医学院硕十学位论文 抗肿瘤免疫功能的f 常发挥有赖于功能性的抗原提呈细胞对肿瘤抗原的有 效提呈，而树突细胞足迄今所知人体功能最强大和最具免疫治疗活力的抗原呈递 细胞，是唯一能够刺激初始t 细胞增贿的免疫细胞，能诱导原发和继发的免疫应 答，激活辅助t 淋巴细胞( t h ) 和细胞毒性t 淋巴细胞( c y t o t o x i cl y m p h o c y t e ， c t l ) ，克服对肿瘤抗原的自身耐受，从而产生强大的抗肿瘤反应。 近年来的研究认为，d c s 的功能取决于其成熟和激活的状态。d c s 因状态的不 同可分为未成熟d c s ( i m m a t u r ed e n d r i t i cc e l l s ，i d c s ) 和成熟d c s ( m a t u r e d e n d r i t i c c e l l ，m d c s ) 。i d c s 表面仅中度表达m h c i i 类分子，不表达或低水平表达 共刺激分子和细胞间黏附分子，由于缺乏免疫应答所必需的表面分子，i d c s 会导 致特异性t 细胞无反应，发生凋亡或产生调节性t 细胞，诱导外周免疫耐受。而m d c s 表面高水平表达m h c ii 类分子和共刺激分子，这些都是t 细胞免疫应答所必需的信 号分子，能够通过激活相应t 淋巴细胞激活免疫应答m 1 。传统的d c s 是在细胞因子作 用下从c d 3 4 + 或c d l 4 + 细胞诱导分化而来的。但要得到临床治疗所需数量，则需要大 量的前体细胞的体外培养诱导旧1 。白血病细胞在一定条件诱导下能发育成为具有提 呈肿瘤抗原特性的树突细胞( d e n d r i t i cc e ll s ，d c s ) n 。1 ，白血病细胞诱导成为具 有抗原递呈功能的细胞具备以下优点：( 1 ) 省略需与d c s 发育同步化的抗原负载 步骤；( 2 ) 自身作为免疫原，无需鉴别肿瘤抗原；( 3 ) 能产生针对大量多肽的t 细胞应答，避免白血病细胞逃避针对于1 种多肽的特异。i 生c t l 应答；( 4 ) 能绕过体 内d c 数量和功能上的异常：( 5 ) 避免应用白血病细胞未加选择的表位( 包括自 身抗原，如核蛋白、d n a 或r n a ) 抗原多肽负载，理沦上可减少发生自身免疫性疾 病的概率。因此，白血病细胞来源的d e s 与来源于j 下常自订体和负载外源性白血病 抗原的d c s j r n 比，可能能更好地直接激发细胞毒性t 淋巴细胞刳，但在机体条件下 难以做到理想的诱导，如能通过治疗干预促进c d 3 4 + 细胞转化为具有肿瘤抗原提呈 能力的d c s 贝j 可能是重要的研究思路。 1 3 基质细胞与微小残留白血病 人体造血微环境是支持和调节造血细胞生长发育的内环境，骨髓基质细胞 ( b o n em a r r o ws t r o m a lc e l l s ，b m s c s ) 作为造血微环境的主要组成部分，是影响造 血干细胞生长、分化和自我更新的重要细胞，可通过分泌细胞因子、直接黏附等 对萨常造血具有调控作用n 3 川。 9 贵田i 中医学院硕+ ：学化论文 白血病细胞的生长同样依赖异常造血微环境的调控，骨髓基质细胞对白血病 细胞所产生的支持和庇护作用足白血病发生和难治的重要因素n 引。白血病患者不 仅有造血细胞的恶性克隆性增值，而且骨髓基质细胞的结构功能都有一定的改变 n 6 。，且异常骨髓造血微环境中基质细胞的异常可能引起造血细胞恶性克隆的选择 和增贿，从而导致急性白血病复发。在髓系白血病的研究中发现，骨髓基质细胞可 降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，从而发挥其对白血病细胞的保护作用n7 1 ， 这可能是白血病缓解后微小残留白血病形成的重要因素。 白血病患者骨髓基质细胞通过分泌细胞因子和异常粘附分子对白血病细胞恶 性克隆的选择、增殖分化、迁移、凋亡有重要作用，从多个方面影响白血病细胞 的生物学特性，参与白血病的发病过程和病理过程n 引。以此为基础，有研究者将 血液系统肿瘤细胞与细胞外基质成分纤维连接蛋白或骨髓基质细胞系黏附培养， 并证实了肿瘤细胞与周围微环境的黏附作用与其耐药产生有关，故肿瘤微环境可 能成为逆转血液系统肿瘤细胞多药耐药新的突破心。梁广佳等通过实验证明，k 5 6 2 细胞与b m s c s 培养后，b m s c s 的生长受到影响，其中细胞因子的间接因素和白血病细 胞的直接接触因素都能抑韦l j b m s c s 的生长。正常b m s c s 与k 5 6 2 细胞培养时，j 下常 b m s c s 的凋亡呈上升趋势，接触培养中凋亡更明显。表示b m s c s 与白血病细胞培养 后受其影响，d n a 断点增加，即凋亡增加，尤其是在直接接触因素下凋亡更明显瞳1 | ， 这可能是白血病细胞导致造血微环境损伤的主要原因之一。 b m s c s 因其具有强大的多向分化潜能和独特的免疫调节作用在细胞治疗领域 日益受到重视瞳厶圳。研究发现，b m s c s 对同种异体免疫反应具有负性调节作用，能 降低同种异体移植后移植物抗宿主反应的发生率他4 1 ，众多学者对其可能的作用机 制进行了研究，目前认为可能通过与免疫细胞( 如t 细胞，树突状细胞，b 细胞等) 直 接接触或通过改变细胞因子分泌网络问接影响免疫细胞发挥效应有关，但确切机 制仍不清楚心引。有实验表明，b m s c s 可通过与t 细胞直接接触，抑制t 细胞分化增 殖。经健康人b m s c s 处理的成熟d c s 刺激同种异体t 细胞，其增殖能力显著低于 未处理组，可能与d c s 表面共刺激分子和成熟抗原c d 8 6 + 、c d 8 3 + 表达水平下降，不 能充分活化同种反应性t 细胞，从而抑制了同种反应性t 细胞的增殖有关乜引，因 此b m s c s 可能通过影响d c s 的成熟和功能从而问接抑制t 细胞增殖发挥免疫抑制 作用。也有研究表明b m s c s 具有抗肿瘤作用和免疫调节作用，实验显示基质细胞 l o 贵田1 中医学院硕十学何论文 和髓系白血病细胞通过直接的相互作用调节髓系白血病细胞的增靖和分化，且对 髓系白血病细胞的增殖和分化的调节能力较外源性分化诱导剂强，表明基质细胞 为髓型白血病细胞提供了特定的增殖和分化的微环境他。另有人从f 常人基质细 胞入手，观察了其对白血病细胞株h l 6 0 的影响，发现基质细胞可明显诱导其分化 和抑制其增贿，表明强化基质细胞的调控作用对预防肿瘤的发生及肿瘤细胞逆转 等具有重要意义。因此如何通过治疗干预骨髓基质细胞，改变造血微环境，从 而调节机体的肿瘤免疫功能，是研究微小残留白血病治疗方法的重要思路。 2 中医治疗微小残留白血病的思路 2 1 正气虚弱、余毒留伏阴分是m r d - l 的基本病机 中医学历代医书中并无白血病之名，只有与其临床表现相似的温病、血症、 热劳、急劳、积聚、虚劳等记钱，至于微小残留白血病则更未涉及，依据其临床 表现及中医古籍的论述，本病当属中医“虚劳”范畴。以古代医家经验及古籍记 载为基础，张姗姗等认为疾病是人体讵邪相争的过程，f 气的强弱决定疾病的发 生、发展、变化和转归。提出微小残留白血病患者以正虚为主，证属诈虚邪恋瞳圳； 麻柔发现急性白血病经化疗达到完全缓解后进入微小残留白血病阶段，患者邪气 相对不著，而f 气由于邪毒及放化疗的攻伐则更加虚衰，多表现为邪去f 衰，j 下 虚为主，邪毒留恋幽1 ；苗土生提出本病的发生是邪毒入血伤髓而致瘀血，瘀血不 去，新血不生而致血虚，由血虚累及气虚，气为血之帅，血为气之母，气血两虚 致阴阳两竭，因虚致病，因病致虚，虚实相兼的复杂病理过程。川；综上所述，中 医界普遍认为微小残留白血病的中医病因病机在于邪退正衰，j 下虚邪恋。我们认 为急性白血病患者受邪毒损伤、化疗攻伐的影响，诱导缓解后的体质多气血阴阳 虚损、脏腑功能失调，而引起急性白血病的温热邪毒又有伏留体内的特点，故正 虚毒伏是微小残留白血病重要病理，伏毒积蓄是白血病复发的根本原因，骨髓、 血液、脑脊液、睾丸等至阴之分为余毒伏藏之处。因此缓解期的基本病理为气血 阴阳虚损、脏腑功能失调而余毒留伏。州。 2 2 扶正透毒祛毒法是m r d - l 的治疗原则 中医观点认为，急性白血病完全缓解后忠者机体处于“邪去f 衰”、“正气虚 弱”而“余邪未尽”的状念。医宗金鉴治诸法大论提出“形虚病盛先扶正， 形证俱实去病疾，大积大聚哀其半，需知养正积自除”的治疗原则； 素问调 贵冈l 中医学院硕十学位论文 经论强调：“气复反则生，不反则死。从占人的经验可知，扶助j 下气、培本 固源、调整阴阳气血达到“j 下气存内，邪不可干”的状态是治疗肿瘤性疾病的重 要方法，尤其是对于m r d 患者，经过白血病细胞的浸润及化疗药物的攻伐后，机体 处于“邪去正衰”的状态，故扶下培本，重建及恢复微小残留白血病病人免疫功 能，消灭或根除微小残留白血病细胞是治疗微小残留白血病的大法心引。王欣总结 目前中医药治疗微小残留白血病主要集中于益气养阴、清热解毒和活血化瘀三方 面，认为急性白血病病机为邪毒入血伤髓，表现为虚实央杂，邪实f 虚，即初期 多以邪实为主，治宜主攻；后期多以币虚