（分析化学专业论文）木素过氧化物酶光度法检测环境污染物.pdf

山东大学硕十学位 摘要 随着社会经济的迅速发展和人口的急剧增多，人类活动( 包括生产活动和生 活活动) 向环境中排放的各种污染物日益增多。在这众多的污染物中，芳香化合 物( 尤其是芳香胺、酚类物质) 和有机过氧化物的污染越来越引起人们的关注。 芳香胺主要来自染料、聚合体、除草剂、杀虫剂等在环境中的降解。酚类主要是 来自石油化工、树脂、塑料、医药品、聚合体、杀虫剂、抗氧化剂等工业排出的 废水中。大气中的过氧化物主要来源于光化学烟雾的二次污染物，而油脂自动氧 化也能产生氢过氧化物。这些有害化学品对人体健康和环境的危害是环境保护中 亟待解决的重要问题，必须引起全社会高度重视，因此很有必要建立简单可行的 芳香化合物和有机过氧化物的测检方法。 木素过氧化物酶( l i p ) 是2 0 世纪8 0 年代初发现的真菌过氧化物酶。它与 其它过氧化物酶的结构和催化反应机制相似，但其氧化还原电位更高( 1 3 6v v s n 脏) ，许多酚型和非酚型有机化合物都可作为l i p 的反应底物，其中藜芦醇( v a ) 是最适底物。然而它在分析检测方面的应用报道还非常少。以往的过氧化物酶法 检测多是人工一次性加入h 2 0 2 来引发反应，并且都集中在传统的水介质中。这 就出现了数据重现性差、方法选择性差、以及疏水性化合物难以检测等问题。为 了克服以上缺点，本文利用葡萄糖氧化酶( g o d ) 氧化葡萄糖产生h 2 0 2 ，h 2 0 2 缓释明显改善了l i p 的催化活性，从而使初速率增大，准确性大幅度提高；利用 l i p 酶促双底物氧化机制，通过选取适当的指示底物，提高酚类物质测定选择性； 利用l i p 酶的过氧化物依赖性，借助胶束酶学研究方法，在反胶束中建立了疏水 性有机过氧化物的l i p 酶法检测。以上三种措施可以克服现有过氧化物酶法检测 的缺点，也是本论文的主要创新之处。 论文分四章： 第一章介绍了芳香胺、酚类、有机过氧化物的污染现状及常规分析检测方法， 重点突出了酶法分析。此外，就本课程采用的l i p 酶也做了一些背景介绍，简单 论述了反胶束介质中l i p 酶的催化性能与反应动力学。共引用了1 2 2 篇文献。 在论文的第二章中，研究了水介质中g o d 和l i p 偶联分光光度法测定芳香 胺的分析特性。利用g o d 和葡萄糖反应产生的h 2 0 2 来引发l i p 的反应，以防 山东人学硕j j 学位 止h 2 0 2 的浓度过高对l i p 活力产生抑制的负面影响。从葡萄糖浓度、p h 值、 g o d 的量等几方面讨论了反应条件对灵敏度的影响，确定了最佳的实验条件和 分析方法的分析特性，并用加标法测定了胡萝卜中的芳香胺。单酶体系和双酶偶 联体系比较表明：酶法产生h 2 0 2 要比人t p l , 部一次性加入好，记录的动力学曲 线线性范围宽，初始速率大，提高了检测的灵敏度，又利于准确定量测定。 在本论文的第三章，尝试根据酚类物质对l i p 催化氧化芳香胺的动力学曲线 的影响，建立酚类物质选择性酶法测定方法。酚对l i p 催化氧化芳香胺的影响与 酚和指示底物氧化还原电位的相对高低有关。当选用3 ，3 二甲基联苯胺( o t d ) 做指示底物时，发现氧化还原电位高于o t d 的酚可以与o t d 同时被氧化，而氧 化还原电位低于o t d 的酚则比o t d 更易被氧化，致使延迟一段时间之后才能在 a - t 曲线上观察到指示反应的进行。寻找最佳实验条件，通过记录指示反应的初 速率降低值或抑制时间可以选择性测定酚类物质。在以对甲氧基苯胺( p a d ) 做 指示底物时，能观察到氧化还原电位高于p a d 的酚增大指示反应的反应速率， 氧化还原电位低于p a d 的酚降低指示反应的反应速率，但通过记录指示反应的 初速率降低值或升高值不能选择性测定酚类物质。本文通过h 2 0 2 的缓释，可以 提高测定结果灵敏度和工作曲线的线性范围。 本论文的第四章建立了a o t b r i j 3 0 反胶束介质中有机过氧化物的酶法光度 检测方法。方法思路是l i p 催化氧化邻苯二胺，其反应的初速率与样品中有机过 氧化物的浓度成一定的比例关系。由于有机过氧化物的水不溶性，所以选择一个 既能增溶有机过氧化物又能使l i p 保持高活力的介质是首先需要解决的问题。本 文通过一定比例的a o t 与b 埔3 0 复配，形成一种新的反胶束体系，即提高疏水 性化合物的溶解度又能使l i p 保持很高的催化活力。研究了反胶束大小( c o o ) 、 p h 等介质对检测灵敏度的影响，确定了最佳的实验条件和分析方法的分析特性， 并用加标法测定橄榄油中的有机过氧化物。橄榄油先用盐酸水解，除去水溶性干 扰物质，油相用乙酸乙酯萃取，萃取液直接加到反应体系中进行检测。与现有方 法相比，步骤少，避免了样品制备过程中的污染和损失。是一种简单可靠的方法， 其检测限和灵敏度满足橄榄油中过氧化物的检测要求。 关键词：木素过氧化物酶；双酶偶联；污染物检测；反胶束 i i 山东人学硕士学位 a b s t r a t e a st h er a p i dd e v e l o p m e n to fw o r l de c o n o m ya n dt h ei n c r e a s eo fp o p u l a t i o n ，m o r e a n dm o r ec o n t a m i n a t i o n sa r er e l e a s e di nt h ee n v i r o n m e n t t h ep o l l u t i o no fa r o m a t i c a m i n e ，p h e n o l sc o m p o u n d sa n do r g a n i cp e r o x i d e sg e tm o r ec o n c e r na m o n gt h e n u m e r o u sc o n t a m i n a t i o n s s o u r c e so fa r o m a t i cc o m p o u n d si nt h ee n v i r o n m e n t i n c l u d et h ea b i o t i ca n db i o t i cd e g r a d a t i o no fn i t r o a r o m a t i cc o m p o u n d s ，a z od y e s ， s e v e r a lc l a s s e so fp e s t i c i d e sl i k ec a r b a m a t e s ，p h e n y l u r e a s p h e n o l i cc o m p o u n d s c a nb ef o u n di ni n d u s t r i a lw a s t ef r o mf o re x a m p l ec o a lm i n i n g ，o i lr e f i n e r y ，p a i n t ， p l a s t i c ，a n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y t h ep e r o x i d e si na t m o s p h e r em o s t l yr o o t si nt h e s e c o n dc o n t a m i n a t i o no fp h o t o c h e m i c a ls m o gw h i c hi sa ni m p o r t a n tp h o t o c h e m i c a l o x i d a n t t h ef a t sa l s oa u t o m a t i c a l l yp r o d u c eh y d r o g e np e r o x i d eo x i d a t i o n s oi ti s n e c e s s a r yt os e tu ps i m p l ea n a l y t i cm e t h o d st od e t e r m i n et h o s ec o m p o u n d si nt h e l i g n i np e r o x i d a s ei san o v e lf u n g a lp e r o x i d a s ef o u n di nt h ee a r l y19 8 0 s ，i t s h a r e sm a n ys t r u c t u r a la n dm e c h a n i s t i cf e a t u r e sw i t ho t h e rp e r o x i d a s e s ，y e ti t s o x i d i z i n gp o w e r ( 1 3 6vv s n h e ) i sm u c hs t r o n g e r an u m b e ro fp h e n o l i ca n d n o n p h e n o l i cc o m p o u n d sh a v eb e e ns h o w nt ob es u b s t r a t e sf o rt h i se n z y m e ，a n d a m o n gt h e mv e r a t r y la l c o h o l a ) i st h eo p t i m u mo n e h o w e v e r , t h e r ea r ef e wr e p o r t s a b o u tt h ed e t e r m i n a t i o no fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s t r a d i t i o n a l l y , a q u e o u ss o l v e n t s a r eu s e da st h em e d i af o re n z y m a t i cd e t e r m i n a t i o n ，a n dh 2 0 2w a ss u p p l i e de x t e r n a l l y i no n eb a t c ha tt h eb e g i n n i n gt oi n i t i a t et h er e a c t i o n i nt h i sw a y ，w eg o tp o o r r e p r o d u c i b i l i t yo fd a t aa n ds e l e c t i v i t y , a n dw eh a dd i f f i c u l t y i nd e t e r m i n i n gt h e h y d r o p h o b i cc o m p o u n d s t oo v e r c o m et h e s ed r a w b a c k s ，w eu s e dg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) a n dg l u c o s eg e n e r a t i n gh 2 0 2i nt h i sp a p e r ，s oas u s t a i n a b l ec o n s t a n ta c t i v i wo f l i pw a so b s e r v e dd u et ot h ec o n t r o l l e dr e l e a s eo fh 2 0 2 a c c o r d i n gt ot h e t w o - s u b s t r a t em e c h a n i s mo fl i p ，t h e s e l e c t i v i t y o fd e t e r m i n a t i o no fp h e n o l i c c o m p o u n d sc a nb ei m p r o v e db yc h o o s i n ga p p r o p r i a t ei n d i c a t o rs u b s t r a t e h e r ew e d e t e r m i n e do r g a n i cp e r o x i d e si nh 2 0 a o t b r i j 3 0 o c t a n es y s t e m o u ra i mw a st o i i i 山东大学硕十学位 o v e r c o m et h es h o r t c o m i n g so ft h ee x i s t i n ge n z y m ed e t e r m i n a t i o nb yu s i n gt h e s et h r e e m e a s u r e s ，a n da l s ot h i sw a st h eo r i g i n a l i t yo ft h ep a p e r , t h i sp a p e rw a sd i v i d e di nf o u rs e c t i o n s ： i nt h ef i r s ts e c t i o n ，w ei n t r o d u c et h ep o l l u t i o na n da n a l y s i sm e t h o d so fa r o m a t i c a m i n e ，p h e n o l sa n do r g a n i cp e r o x i d e s ，a n ds u m m a r i z e dr e c e n td e v e l o p m e n t so f m i c e l l a r e n z y m o l o g ya n d l i ps t u d y , a n d12 4r e f e r e n c e sa r ec i t e d i nt h es e c o n d s e c t i o n ，w e s t u d i e dt h e a n a l y t i c a l c h a r a c t e r i s t i c so ft h e d e t e r m i n a t i o no fa r o m a t i ca m i n ei nw h i c hl i p c o u p l e dw i t h g o du s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d w eu s e dg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) a n dg l u c o s eg e n e r a t i n g h 2 0 2 d u et ot h ec o n t r o l l e dr e l e a s eo fh 2 0 2 ，s oas u s t a i n a b l ec o n s t a n ta c t i v i t yo fl i p w a so b s e r v e dd u et ot h ec o n t r o l l e dr e l e a s eo fh 2 0 2 t oo p t i m i z et h ec o n d i t i o n s ，w e s t u d i e dt h ee f f e c to fp h ，c o n c e n t r a t i o n so fg o d ，g l u c o s ea n dh y d r o g e np e r o x i d et o g e tt h ea n a l y t i c a lc h a r a c t e r i s t i co ft h em e t h o d t h ed e t e r m i n a t i o no fa r o m a t i ca m i n ei n c a r r o t sw a sc a r d e do u tb yu s i n gt h es t a n d a r da d d i t i o n sm e t h o d t od e m o n s t r a t et h e a d v a n t a g e so ft h ec o n t r o l l e dr e l e a s eo fh 2 0 2s u p p l ys t r a t e g y ，a ne x t e r n a lh 2 0 2s u p p l y s t r a t e g yw a sa l s ou s e dt oi m t i m el i p c a t a l y z e do x i d a t i o no fo p d r e s u l t ss h o w e dt h a t t h eu s eo ft h ep r o p o s e dh 2 0 2s u p p l ys t r a t e g yh a ds o m ea d v a n t a g e s n o to n l yt h ei n i t i a l r a t ei n c r e a s e dg r e a t l y , b u ta l s ot h el i n e a rr a n g eo ft h ea - tc u r v ew i d e n e d i nt h et h i r ds e c t i o n ，b a s e do nt h ee f f e c to fp h e n o l so nt h ek i n e t i c so fo x i d a t i o no f a r o m a t i ca m i n ec a t a l y z e db yl i p , a na t t e m p tw a sm a d et od e t e r m i n ee n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s - p h e n o l ss e l e c t i v e l y t h ei n f l u e n c eo fp h e n o l so nt h ek i n e t i c so fe n z y m a t i c o x i d a t i o no fa r o m a t i ca m i n ew i t hh e 0 2w a sf o u n dt od e p e n do nac o r r e l a t i o nb e t w e e n r e d o xp r o p e r t i e so fp h e n o l sa n dt h ei n d i c a t o r - s u b s t r a t eo fp e r o x i d a s e u s i n go - t o l i d i n e o x i d a t i o nc a t a l y z e db yl i pa sa ni n d i c a t o r ，t h er a t eo ft h ei n d i c a t o rr e a c t i o nd e c r e a s e d i nt h ep r e s e n c eo fp h e n o lw h o s er e d o xp o t e n t i a l sh i g h e rt h a no - t o l i d i n e h o w e r e r ， p h e n o l sw i t hl o w e rp o t e n t i a l sl e dt oa ni n d u c t i o np e r i o do nk i n e t i cc u r v e so ft h e i n d i c a t o rr e a c t i o n ，t h ed u r a t i o no ft h ei n d u c t i o np e r i o di sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fp h e n o l i cc o m p o u n d s d i f f e r e n ta n a l y t i c a ls i g n a l s - t h ei n i t i a lr a t ea n d t h el a gt i m eo ft h ei n d i c a t o rr e a c t i o n w e r eu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p h e n o l sw i t h v a r i o u s g r o u p s i tw a se x p e d i e n tt o s t u d yt h ep o s s i b i l i t yo ft h e i n d i v i d u a l 山东大学硕一1 j 学位 d e t e r m i n a t i o no fi s o m e r sw i t l ld i f f e r e n tg r o u p s w h e nt h er e a c t i o no fp - a n i s i d i n e ( p a d ) o x i d a t i o nc a t a l y z e db yl i pw a su s e da si n d i c a t o r , t h er a t eo ft h ei n d i c a t o r r e a c t i o ni n c r e a s e da n dw a sp r o p o r t i o n a l l yt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp h e n o lw h o s er e d o x p o t e n t i a l sh i g h e rt h a nt h a to fp a d w h e r e a s ，t h er a t eo ft h ei n d i c a t o rr e a c t i o n d e c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo fp h e n o lw i t hl o w e r r e d o x p o t e n t i a l s a n dw a s p r o p o r t i o n a l l yt o t h e i rc o n c e n t r a t i o n b u ti tw a si m p o s s i b l et od e t e r m i n e p h e n o l s s e l e c t i v e l y i nt h ef o u r t hs e c t i o n ，am o t h o df o rs p e c t r o p h o t o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fo r g a n i c p e r o x i d e si nt h er e v e r s e dm i c e l l e su s i n go - p h e n y l e n e d i a m i n e ( o p d ) a st h es u b s t r a t e o fl i pw a sr e p o r t e d t h ei n i t i a lr a t ei sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp e r o x i d e s i ns o l u t i o n i nt h ep a p e r , an e wm i x e dr e v e r s e dm i c e l l ef o r m e db ya n i o n i cs u r f a c t a n t a o ta n dn o n i o n i cs u r f a c t a n tp o l y o x y e t h y l e n el a u r y le t h e r ( b r i j 3 0 ) w a su s e dt o d e t e r m i n a t i o no r g a n i cp e r o x i d e s t h em e d i aa l l o w st h ee n z y m a t i cd e t e r m i n a t i o no f s u b s t a n c e ss c a r c e l ys o l u b l ei nw a t e r f u r t h e r m o r e ，t h ec o n t e n to ft h ew a t e rn e e d e df o r t h eh y d r a t i o no ft h ee n z y m e ，a n dt h e r e f o r e ，f o re n z y m eo p e r a t i o n ，i se a s yt oc o n t r o l a n do p t i m i z e t oo p t i m i z et h ec o n d i t i o n so fo p do x i d a t i o n 、析t l l2 - b u t a n o n ep e r o x i d e i nt h ep r e s e n c eo fl i p ，w es t u d i e dt h ee f f e c to fp ha n d0 0t 6 酚t h ea n a l y t i c a l c h a r a c t e r i s t i co ft h em e t h o d t h ed e t e r m i n a t i o no fo r g a n i cp e r o x i d e si no l i v eo i lw a s c a r r i e do u tb yu s i n gt h es t a n d a r da d d i t i o n sm e t h o d i no r d e rt oa v o i dt h ed i s t u r b a n c e o fw a t e r - s o l u b l es u b s t r a t e ，w ed i s s o l v e dt h eo l i v eo i li n0 5 m m o l l h c ls o l u t i o n l a t e rt h eo r g a n i cp h a s ew a se x t r a c t e du s i n ge t h y la c e t a t e ，a n dt h ee x t r a c t i o nw a s a d d e dt or e v e r s e dm i e e l l a rt od e t e r m i n e c o m p a r e dw i t l lt h ee x i s t i n gm e t h o d t h i sw a y n o to n l yd e c r e a s e dt h es t e p so fo p e r a t i o n , b u ta l s oa v o i d e dt h ep o l l u t i o na n dl o s so f s a m p l e s t h em e t h o dc o u l ds a t i s f yt h et h el i m i t so fd e t e c t i o na n ds e n s i t i v i t yi nt h e d e t e r m i n a t i o no fo r g a n i cp e r o x i d e si nt h eo l i v eo i l k e yw o r d s ：l i 昏l i np e r o x i d a s e ；c o u p l e de n z y m a t i cr e a c t i o n ；d e t e r m i n a t i o no f p o l l u t a n t s ；r e v e r s e dm i c e l l e v 山东大学硕上学位 l i p 蹈 o p d d a n g o d o t d p a d m e k p t b h o d s u v 4 a a p 0 符号与缩写 木素过氧化物酶 藜芦醇 邻苯二胺 2 ，3 一二氨基萘 葡萄糖氧化酶 3 ，3 二甲基联苯胺 对甲氧基苯胺 过氧化2 丁酮 叔丁基过氧化氢 3 ，3 - 二甲氧基联苯胺 紫外可见光谱 4 氨基安替比林 反胶束中水与表面活性剂的摩尔比 t w e e n - 8 0 聚氧乙烯( 2 0 ) 山梨醇酐单油酸酯 b r i j 3 0 a o t 月桂醇聚氧乙烯( 4 ) 醚 琥珀酸二辛酯磺酸钠 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：i 互旦坠 e t 期：趔赵!皇! ! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 蝴一：龇翩签孵缛 山东大学硕斗学位 第一章绪论 工业技术的迅猛发展，给人类社会带来了高度的物质文明，但同时也带来许 多负面效应，尤其是对人类生存环境造成的危害。人类活动( 包括生产活动和生 活活动) 不断地向环境中排放各种各样的有害物质，而这些有害物质能在环境中 以一定的寿命( 停留时间) 存在，当环境中某种有害物质的浓度超过环境所能允 许的极限( 环境容量) 而对人类、生态、材料或其它环境要素( 如大气性质、水 体水质、气候等) 产生不良效应时，就构成了环境污染。通常这些环境污染主要 是指由于人类不明智的社会经济活动导致的环境质量下降。环境污染是多方面 的，农业的、工业的、物理的、化学的等，而在诸多污染中，又数化学品污染最 为严重。这些化学品的排放不仅使局部地区的环境遭到污染，而且对全球范围内 生态环境造成极为严重的危害。近几十年来，全世界已发生过6 0 多起严重化学 品环境污染事件，公害病患者有4 0 万5 0 万人，死亡l o 多万人。例如，1 9 5 2 年伦敦的烟雾事件使一万多人丧生；再如，1 9 7 6 年日本的四日市由于空气中漂 浮的粉尘和二氧化硫，使几百人患有哮喘病；近年来，我国死亡中癌症比率增大， 也与空气中含有大量的化学品污染物有关。有害化学品对人体健康和环境的危害 是环境保护中亟待解决的重要问题，必须引起全社会高度重视。而化学品中的芳 香胺化合物、酚类化合物以及有机过氧化物被列为重点污染物。因此，本论文根 据现有的实验条件研究建立更为简便有效测定芳香胺、酚和有机过氧化物的方 法，并用于实际测定中，不仅使人们对环境中污染物的现状有新的认识，而且为 接下来进一步开拓新的研究领域打下基础，对防治环境污染，改善环境，保护人 类健康有着重要的意义。 l 文献综述 1 1 芳香胺化合物的污染现状及分析方法 芳香胺化合物系氨分子中氢原子被芳香基取代后的衍生物，主要应用于染 料、聚合体、除草剂、杀虫剂等的合成，这些产品在环境中都以不同的途径降解 为芳香胺。芳香胺也存在于汽车排放废气，香烟烟雾与公路焦油中。芳香胺为前 致癌物，有些芳香胺是诱变剂或致癌剂，或有其他生物毒性 1 ，2 】。流行病学研究 发现职业性接触芳香胺化合物的工人如化学工业、染印工业、纺织工业、天然气 山东人学硕十学位 工业、杀虫剂制造工业，其膀胱癌患病率比一般人为高。比如，苯二胺及其化学 构造相似的化学物或衍生物被用作染发剂，经常染发或职业上使用这些染发剂的 人，其膀胱癌患病率显著地高于一般人；联苯胺除会诱发膀胱癌外也会诱发人的 胃、肾脏、神经系统、口腔、咽喉、食道、肝脏、胆囊、胆管和胰脏之肿瘤。因 此，芳香胺被列为环境重点污染物。1 9 9 5 年6 月3 0 日德国颁布有关法令，苯胺等 二十类芳香胺制造的产品及其着色的制品( 纺织品等) 不准进入德国市场。2 0 0 2 年o k e o t e x 标准1 0 0 最新版本规定，在还原条件下不允许从偶氮染料中裂解出的 芳香胺类有2 3 种 3 。2 0 0 3 年9 月1 1 日，欧盟公布了第2 0 0 2 6 1 号令，凡是在还原条 件下释放出2 2 种致癌芳香胺的偶氮染料都将被禁止使用。所以芳香胺化合物是环 境科学必须检测的一类有机污染物，对其测定方法的研究是环境分析的课题之 一。目前芳香胺分析检测方法主要有化学分析法 4 ，分光光度法 5 ，6 ，7 ，8 ，气相 色谱 9 ，1 0 ，1 l ，1 2 】，液相色谱 1 3 ，1 4 ，1 5 1 ，电化学方法 1 6 ，1 7 1 等。每种方法都有各自 的优点及不足之处。 在陈全伦 4 的纺织化学分析中介绍氧化黑( 苯胺、联苯胺) 的测定方 法，原理是利用苯胺、联苯胺在浓硫酸和氢氧化钠溶液中的颜色变化来检测，优 点是仪器设备投资少，减少了分析成本，适用于普通实验室的常规分析，其不足 之处是灵敏度较低。l u c i a n 用p y r i m i d i n y l p y r a z o l o n e 做偶合剂分光光度法测定废水 中微量芳香胺 5 ，在酸性环境中，芳香胺用亚硝酸钠重氮化，然后在碱性环境 中与偶合剂生成有颜色的偶氮染料，通过记录4 2 0 n m 处吸光度随时间的变化率即 可求得芳香胺的浓度。本法操作简单，稳定性好，其不足之处无论是重氮化还是 偶合反应都需要很长时间，选择计算初速率的时间不好确定，而且操作繁琐。对 于气相色谱必需使用气相一质谱联用或气相质谱检测器等较贵重的仪器。陈建村 1 3 】用经典的纸色谱技术对染料中的联苯胺类化合物进行分离、富集、检测，此 方法实用、方便、可靠，其不足之处灵敏度低。近年来，用酶法检测芳香胺逐渐 多起来，m a r i a 1 6 在反胶束介质，利用葡萄糖氧化酶一辣根过氧化物酶电极测定 蔬菜中的微量芳香胺。葡萄糖氧化酶和葡萄糖反应产生的h 2 0 2 来引发反应，以防 止h 2 0 2 的浓度过高对酶活产生抑制的负面影响。但是，用此方法得到线性范围窄， 并且电极制造繁琐。因此，针对只需测定芳香胺总量的情况，本实验研究建立更 为简便有效、快速、经济、灵敏度高、检测限低的芳香胺的检测方法。 2 山东大学硕l ：学位 1 2 酚类化合物的污染现状及分析方法 酚类化合物是苯环或稠环上带有羟基的化合物，是环境中普遍存在的有机污 染物，它们广泛应用于石油化工、树脂、塑料、医药品、聚合体、杀虫剂、抗氧 化剂等工业生产中，因此这些生产排出的废物中含有酚类。水中的氯酚和硝基酚 也可能来自土壤中各种氯酚酸除草剂和有机磷杀虫剂的降解产物的渗透。一些天 然的有机化合物如腐殖质、木质素、獾油等的分解产物也含有酚类化合物 1 8 】。 酚类化合物是原型质毒物，对人体具有致癌、致畸、致突变的潜在毒性 1 9 ，2 0 1 ， 毒性的大小与它的基团和结构有关，与取代基的大小、位置、分布状态有关。长 期引用被酚污染的水可引起头晕，出疹和搔痒等神经系统症状的疾病。酚类化合 物除了对人体有害外，还直接影响水产养殖。水中含酚o 1 o 2 m g 时，鱼内既 有酚味；含酚l m g l ，可影响鱼的产卵和洄游；达5 - - - ，1 0 m g l 时，鱼类大量死亡。 因此酚的排放被严格规定，被列入环境中优先检测的有机污染物。美国国家环保 局颁布的1 2 9 项优先检测物中有11 项是酚类化合物。我国水中优先检测污染黑 名单6 8 项中有6 项是酚类化合物。根据国家建设部制定的城市供水行业2 0 0 0 年 技术进步规定水质目标8 9 项中有6 项是酚类化合物 2 1 ，2 2 】。所以酚类化合物是 环境科学必须检测的一类有机污染物，目前酚类分析检测方法主要有分光光度法 2 3 ，2 4 、气相色谱法【2 5 ，2 6 ，2 7 1 、液相色谱法 2 8 ，2 9 ，3 0 、毛细管电泳法 3 1 1 。目前 生活饮用水标准检验法g b 5 7 5 0 8 5 中用的就是4 氨基安替比林( 4 a a p ) 光度 法 2 3 1 。该法基于在铁氰化钾存在下，酚类化合物与4 氨基安替比林缩合显色反 应，在酸性介质中，4 础谨可与酚类化合物缩合成能溶于氯仿的安替比林红。该 法又分为直接光度法和萃取光度法。当水样中酚的浓度为0 1 0 2 m g l ( 如废水 检测) 时用直接光度法，0 o 1 m g l ( 水库、地表水等) 时用萃取光度法。4 - a a p 法具有操作简便，分析快速，重现性好和不同酚类化合物所产生的最大吸收波长 均为同一波长等优点。其不足之处是该法只能测定挥发性酚类，而且由于显色剂 只能与邻位或间位有取代基团的酚反应，不能与对位有取代基团( 烷基或硝基等) 的酚反应，所以测定的总酚含量小于实际样品的含量。气相色谱法( 0 2 ) 是一 种应用比较广泛的酚类分析检测方法。低分子量的酚类可直接进样分析；分子量 较大的酚类由于其沸点高，挥发性差，须柱前衍生化后分析。g c 的方法可分为 直接注入法、萃取法和衍生化法。直接注入法是样品无需预处理，酚类化合物分 山东大学硕十学位 离后，以火焰离子化检测器( f i d ) 测定，该法适用于含酚量大于l m g l 的样品。 萃取法是适用于低含量样品，进样前需用二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚等萃取剂将 样品中酚类化合物萃取浓缩。衍生化法是通过化学反应将不适于进行气相色谱检 测的物质转化成适用于气相色谱分析的物质。环境监测中常用的衍生化试剂有溴 代甲基五氟苯、五氟苯甲酰氯、七氟丁酸酐等，由于衍生化试剂合成困难，毒性 较大，分离操作过程手续繁琐，其使用受到一定的限带l j 3 0 】。高效液相色谱法 ( h p l c ) 分为正相h p l c 和反相h p l c 两类。其中，反相h p l c 是目前世界上 最常用测定水中酚类化合物的方法。e p o c a r u l l 等运用离线固相萃取，通过c 1 8 反相高效液相色谱二极阵列紫外检测水中1 3 种酚类化合物，包括e p a 规定优先 测定的1 1 种酚类化合物，检测限在6 5 一l o o n g l 之间 3 0 】，该法重现性好，灵敏 度高，越来越受到人们的关注，其缺陷是分离手段比较复杂。 随着酶学理论与应用的研究，酶法分析已成为分析化学一个重要分支。过氧 化物酶是酶法分析中比较重要的一类酶。利用过氧化物酶测定酚类化合物已有很 多报道 3 2 ，3 3 ，3 4 ，3 5 ，3 6 ，3 7 。i g g a z a r y a n 3 7 等人研究比较了不同酚类化合物对不 同来源的五种过氧化物酶的抑制情况，发现苯酚是所有酶的抑制剂，导致反应速 率下降，而且反应速率的降低值与所加的抑制剂浓度在一定范围内呈比例关系； 而对苯二酚、邻苯二酚和连苯三酚则导致动力学曲线出现滞后现象，而且滞后时 间也与所加抑制剂的浓度成某种比例关系。其中，来自p h e l l i n u si g n i a r i u s 的真菌 过氧化物酶在测定这些酚类化合物时灵敏度最高。b a g i r o v a 也做了酚对花生过氧 化物酶的抑制情况 3 6 】，指示反应为花生过氧化物酶催化氧化邻联二茴香胺，根 据酚对指示反应的影响可以把酚分为两类：酶的抑制剂和第二底物。通过记录指 示反应初速率的降低值或抑制时间可以选择性测定酚类化合物。不过上述酶法测 定酚类物质，都是人工一次性加入h 2 0 2 来引发反应，我们知道h 2 0 2 过量时容易 使酶失活 3 8 ，3 9 ，4 0 】，导致数据重现性差，不利于准确定量测定，因此，针对上 述问题，本实验研究建立灵敏度高、选择性好、检测限低的酚的检测方法。 1 3 有机过氧化物的污染现状及分析方法 有机过氧化物是过氧化氢分子中的一个或两个氢原子被有机基团取代后的 衍生物，其通式为r - o o r 。按照分子内过氧键数目的多少，可划分为一元、二 4 山东人学硕1 ：学位 元及多元有机过氧化物。在自然界中，他是有油脂和高分子物质在贮藏中自动氧 化而成。有机过氧化物最早的合成实例是在1 8 5 8 年b r o d i e 报告的过氧化苯甲酰的 合成。约5 0 年前，有机过氧化物的自动氧化和聚合在工业上被广泛应用。纯学术 的研究从5 0 年代开始，到7 0 年代盛行。有机过氧化物广泛存在于大气、降水、植 物的叶片中以及各种油类物质中，对大气环境及生态造成不利影响，相当一部分 有机过氧化物无论是脂溶性的还是水溶性的，都有进入人体并损坏机体正常功能 的能力 4 1 ，4 2 。有机过氧化物还具有易燃易爆性和腐蚀性，其种