（微生物学专业论文）bordetella+sp菌株13顺式环氧琥珀酸水解酶的研究.pdf

摘要 d ( ) 酒石酸是一种非常重要的四碳手性源，在制药工业上主要用作手性拆分 剂，在食品工业中，也可用作酸味剂或防腐剂。但目前尚未发现天然存在的d ( ) 酒石酸，用化学拆分等方法生产d ( ) 酒石酸，存在工艺复杂、成本高、对环境 污染严重等缺点。由于生物转化具有高效性、高选择性、反应条件温和、对环境 友好等优点，使其成为生产d ( 一) 酒石酸的理想替代途径。顺式环氧琥珀酸水解 酶( c e s h ) 可以水解顺式环氧琥珀酸，生成d ( ) 酒石酸。但是目前关于该酶的 报道较少，仅见于日本的两个专利。 本研究从土壤中分离筛选到一株可以用于生物转化生产d ( ) 酒石酸的菌 株，并对其进行了系统的分类学鉴定。将该菌株固定化后转化底物顺式环氧琥珀 酸，成功得到了d ( ) 酒石酸。随后研究了该菌株产c e s h 的发酵条件，对该酶 进行了纯化并研究其酶性质。最后对该酶基因进行了克隆，并在大肠杆菌中进行 了高效表达。主要实验结果如下： 1 菌株的筛选分离及鉴定经过富集培养划线分离纯化后，得到了一株能够 生产d ( ) 酒石酸的菌株，通过对该菌株的形态学研究，生理生化测定，1 6 sr d n a 测序和系统发育分析，确定菌株1 3 属于博德特菌属( b o r d e m l l as p ) 。 2 固定化细胞进行生物转化的研究用凝胶包埋法固定菌株1 3 的细胞，生 物转化底物顺式环氧琥珀酸。将转化产物进行纯化之后，得到无色透明的晶体。 用红外光谱、核磁共振和旋光测定法对晶体进行鉴定，结果显示转化产物为d ( ) 酒石酸。 3 菌株产酶发酵条件的研究采用响应面的优化方法，以菌体生长量和酶 活为指标，确定该菌株产c e s h 的最优条件。结果显示，最优培养基组成为： 酵母膏7 8 l 、顺式环氧琥珀酸9 s g l 、k h 2 p 0 41 1 2 9 l 、k 2 h p 0 4 3 h 2 03 9 l 、 m g s 0 4 7 h 2 0o 6 2 5 l 、微量元素溶液1 2 5 舢、p h7 0 ；最适培养条件为：培 养温度3 0 、装液量为7 5 m l ( 5 0 0 m l 三角烧瓶) ，1 2 0 印m 培养3 0 h ；最终发酵 液的酶活可达9 2 7 u m l 。 4 酶的纯化和性质研究在发酵罐中培养1 0 升菌液，离心收集，沉淀经超 声波破壁后得到粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、d e a e c e l l u l o s e 离子交换层 析、t o y o p e a r lh w - 6 5 c 疏水层析、s e p h a d e xg - 7 5 分子筛层析后，纯度提高约17 7 倍，比活达到5 0 u m g 。聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 显示为单一条带， 分子量约为3 3 k d 。研究c e s h 的特性得知：该酶反应的最适p h 为7 o ；最适作 用温度为4 5 c ；在p h 5 o 1 0 0 、5 5 以下稳定；对顺式环氧琥珀酸的k m 值为 1 0 m m o l l ；h 9 2 + 、e d t a 和临菲罗磷几乎使该酶完全失活；该酶活性中心有z n 2 + 的存在。 5 顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆与表达采用p c r 扩增得到了菌株1 3 顺式环氧琥珀酸水解酶的基因序列，并将扩增产物连接到原核表达载体p e t - 1 5 b 中，最后将重组质粒转入大肠杆菌进行高效表达。结果显示：大肠杆菌重组c e s h 的产量比野生菌的产量提高七十倍以上。对重组酶特性进行研究后发现，其p h 稳定性为5 0 9 0 ，略窄于原始酶，其它性质无明显变化。 关键词：d ( ) 酒石酸、顺式环氧琥珀酸水解酶、博德特菌属、细胞固定化、 酶的纯化、克隆与表达 6 a b s t r a c t a sa i li m p o r t a n tc h i r a lp o o l ，d ( 一) - t a r t a r i ca c i di sm a i n l yu s e d 硒c h i r a lr e s o l v i n g a g e n ti np h a r m a c yi n d u s t r y , s o l a ra d d i t i v ea n dp r e s e r v a t i v ei nf o o di n d u s t r y , w h e r e a si t i sr a r e l ye x i s t 勰an a t u r a lr e s o u r c e p r o d u c i n go fd ( 一) t a r t a r i ca c i d 、7 l ，i t l lc h e m i c a l r e s o l u t i o ni sr e s t r i c t e db e c a u s eo ft h e c o m p l e xt e c h n i q u e s ，h i g l l c o s t sa n d e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n h a v i n gh i g he f f e c t i v e n e s s ，h i g hs e l e c t i v i t y , m i l dr e a c t i o n c o n d i t i o n sa n de n v i r o n m e n t a l f r i e n d l i n e s s ，b i o t r a n s f o r m a t i o nb e c o m e sa ni d e a l a l t e r a t i v em e t h o dt op r o d u c ed ( - ) - t a r t a r i ca c i d c i s - e p o x y s u c c i n i ca c i dh y d r o l a s ec a l l h y d r o l y z ec s - e p o x y s u c c i n i ca c i dt op r o d u c ed ( - ) - t a r t a r i ca c i d a tp r e s e n t , r e s e a r c h r e p o r ta b o u tt h i sh y d r o l a s ei sr a r ee x c e p tf o rt w op a t e n t sf r o mj a p a n i nt h i ss t u d y , ab a c t e r i u mn a m e ds t r a i n1 - 3w a si s o l a t e df r o ms o i la n dt h e b i o t r a n s f o r m a t i o no fd ( - ) - t a r t a r i ca c i dw a sa c h i e v e db yt h ei m m o b i l i z e dc e l l so fs t r a i n 1 - 3 s u b s e q u e n t l y , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h i sb a c t e r i u mw e r eo p t i m i z e db y u s i n gr e s p o n s es u r f a c em e t h o d t h ec s - e p o x y s u c c i n i ca c i dh y d r o l a s ew a st h e n p u r i f i e da n di t sc h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e d f i n a l l y , t h eg e n eo ft h i se n z y m ew a s c l o n e da n de x p r e s s e di nec o l i t h er e s u l t so ft h i sr e s e a r c hw e r es u m e r i z e da s f o l l o w s ： i t h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fc s e p o x y s u c c i n i ca c i d h y d r o l a s e p r o d u c i n gs t r a i n ：ab a c t e r i u ms t r a i nw h i c hc a np r o d u c ed ( 一) 一t a r t a r i ca c i dw a s i s o l a t e da f t e re n r i c h m e n tc u l t u r ea n ds t r e a k i n gp l a t ep u r i f i c a t i o n b a s e do ni t s m o r p h o l o g i c a ls t u d i e s ，p h y s i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n , 16 sr d n as e q u e n c i n ga n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，t h i si s o l a t ew a si d e n t i f i e dt ob eb o r d e t e l l as p 2 b i o t r a n s f o r m a t i o nb yu s i n gi m m o b i l i z e dc e l l s ：a f t e ri m m o b i l i z a t i o n 、杭t l l g e l e m b e d d i n gm e t h o d ，t h ec e l l sw e r eu s e dt ot r a n s f o r mc s e p o x y s u c c i n i ca c i d t h e p r o d u c t i o no fb i o t r a n s f o r m a t i o nw a sp u r i f i e da n dat r a n s p a r e n tc r y s t a lw a so b t a i n e d a f t e rt h ea n a l y s i so ff o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , n u c l e a rm a g n e t i c r e s o n a n c ea n d s p e c i f i co p t i c a lr o t a t i o n , t h ep r o d u c t i o nw a s i d e n t i f i e dt ob e d ( ) - t a r t a r i ca c i d 7 3 o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ：t h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r es t u d i e du s i n gr e s p o n s er u f f a c em e t h o d o l o g y 、i t hb i o m a s sa n d e n z y m ea c t i v i t ya sv a r i a n t s t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u mi n c l u d e dy e a s te x t r a c t i o n 7 8g l ，c s - e p o x y s u c c i n i ca c i d9 8g l ，k h 2 p 0 41 1 2 9 l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 03 9 m ， m g s 0 4 7 h 2 00 6 2 5 9 l ，e l e m e n ts o l u t i o n1 2 5m l l ，p h7 0 a f t e rf e r m e n t a t i o na t3 0 f o r3 0 h ，t h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e d9 2 7u m l 4 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fe s - e p o x y s u c c i n i ca c i d h y d r o l a s e ： c e l l sw e r eh a r v e s t e df r o m101c u l t u r em e d i u mb yc e n t r i f u g a t i o na n dt h ec e l l sw e r e d i s r u p t e dw i mu l t r a s o n i ct oo b t a i nc r u d ee n z y m e t h ee n z y m ew a sp u r i f i e d17 7f o l d s a f t e rg r a d i e n t p r e c i p i t a t i o no fa m m o n i u ms u l f a t e ，d e a e c e l l u l o s ei o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , t o y o p e a r lh w - 6 5 ch y d r o p h o b i cc h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a d e x g - 7 5m o l e c u l a r - e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e de n z y m ew a sh o m o g e n e o u s a sj u d g e db yp a g e ，a n dt h es u b u n i tm o l e c u l a rm a s sw a se s t i m a t e dt ob e3 3k d a b y s d s p a g e s t u d i e so nc h a r a c t e r i s t i c ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r e w a s4 5 * ( 2a n dt h eo p t i m a lp hw a s7 0 t h ec s e p o x y s u c c i r d ca c i dh y d r o l a s ew a s s t a b l eb e t w e e np h5 0 1 0 0a n da tt h et e m p e r a t u r eb e l o w5 5 。c t h ek mv a l u ef o r c s - e p o x y s u c c i n i ca c i dw a s10m m o l l t h ee n z y m ew a sm a r k e d l yi n h i b i t e db yn g + ， e d t aa n do p h e n a n t h r o l i n i c p m sa n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h i sh y d r o l a s eh a dz n + a s ac o f a c t o r 5 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fc s - e p o x y s u c c i n i ca c i dh y d r o l a s e ：t h ed n a f r a g m e n te n c o d i n gc s - e p o x y s u c c i n i ca c i dh y d r o l a s ew a sa m p l i f i e dw i t hp c ra n di t w a st h e ni n s e r t e di n t o p e t - 15 be x p r e s s i o nv e c t o r r e c o m b i n a n tp e t - 15 bw a s t r a n s f o r m e di n t oe c o l l b l 21t oe x p r e s st h ec s e p o x y s u c c i n i ca c i dh y d r o l a s e t h e a m o u n to fe n z y m ep r o d u c t i o nb yec o l i b l 21w a si n c r e a s e dm o r et h a n7 0f o l d st h a n t h a to fp r o d u c e db yt h es t r a i n1 - 3 t h es t u d i e so nt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e r e c o m b i n a n te n z y m es h o w e dt h a ti tw a ss t a b l ei nt h er a n g eo fp h5 0 - 9 0 ，w h i c hw a s a p p r e c i a b l yn a r r o w e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a l s ，w h e r e a so t h e rc h a r a c t e r i s t i c sa r e s a m ea st h eo r i g i n a lo n e k e yw o r d s ：d ( - ) 一t a r t 耐ca c i d ，c s - e p o x y s u c c i n i ca c i dh y d r o l a s e ，b o r d e t e l l as p ， c e l l si m m o b i l i z a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n , c l o n ea n de x p r e s s i o n 8 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江盘鲎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日 签字日期： 年月日 致谢 五年的硕博连读即将画上圆满的句点，回首这五年时光，除了喜悦和留恋外， 我心中满怀感激。在此，我怀着一颗感恩的心，感谢所有教导我、关心我、支持 我和帮助我成长的人。 首先感谢我的导师赵宇华教授和马晓航副研究员。本论文是在马老师和赵老 师的悉心指导下完成的。从论文的选题、技术路线设计和最后整理成文，都倾注 了导师大量的心血。两位老师渊博的学识、严谨的治学态度、开拓创新的学者风 范和为人师表的高尚人格给了我莫大的启迪和教诲，两位老师为人、为师、为学 的态度将使我终身受益。 在论文的完成过程中，得到了浙江大学贾小明副教授给予的热情帮助和指 点，在此对他们表示忠心的感谢。 感谢我的师姐孙桂芹，师兄周学来，同学郭康平、林晓燕，师弟赵伟峰、丁 海涛、开雷、王磊，师妹徐晓红、卢洪波以及实验室的郭桂枝、孔素英两位阿姨 和郦萍博士等同学给我的热心帮助，是他们营造了良好的研究气氛和学习环境， 使我度过了非常愉快的五年博士学习时光，他们的友谊和留给我的美好回忆将是 我人生最宝贵的财富。 值此论文完成之际，特别感激深爱我的父母、家人和朋友徐同成，感谢他们 五年来对我的学业给予了无怨无悔的理解和支持，他们对我的无私帮助和不断的 鼓励是我前进的动力。 最后向在我成长过程中所有关心和支持过我的老师、同学和朋友表示真挚的 感谢! 同时，向参加本论文评阅、评议和答辩委员会的全体专家，教授及为论文 答辩辛勤工作的人员致以崇高的敬意1 4 李霞 2 0 0 8 年5 月于浙大紫金港 1 1 生物催化 第一章文献综述 自生物技术诞生之日起，人们就一直致力于把它应用到工业生产当中，工业 生物转化则是生物技术应用中一个新兴和关键的领域。生物转化 ( b i o t r a n s f o r m a t i o n ) 也称生物催化( b i o c a t a l y s i s ) ，是指应用生物反应器( 酶及 多酶系统包括微生物，动植物细胞等) 对前体化合物进行结构修饰和改造，合成 新型的有机化合物的反应。它是生物学、化学、过程工程科学的交叉领域，其核 心目标是大规模采用微生物或酶为催化剂生产化学品、医药、能源、材料等，最 终建立在生物催化基础上的新物质加工体系。生物催化技术首先从和它联系最紧 密的医药、农业开始，逐渐涉及到化工、材料等行业，并通过它们影响社会生产、 生活的各个方面( 1 ) 。同时，生物催化的研究，是我国参与生物技术国际竞争的 一个难得的机遇和切入点，是我国生物技术应用研究的一个战略重点。 生物催化过程对于化学催化过程而言具有高效和高选择性的催化特性，并在 一些化学合成领域有着传统的催化剂不可比拟的优势，它们易于催化得到相对较 纯的产品，因此可减少废物排放，且可以完成传统化学过程所不能胜任的位点专 一性、化学专一性和立体专一性催化( 2 ) 。这主要得益于生物催化剂的高效性和 高选择性，也正是因为这一特性使得生物催化在化学工业上的应用已经具有越来 越大的吸引力。生物催化反应通常在2 0 7 0 有效进行，能量输入很少，多步 串联的生物催化反应也可以在一种微生物体内高效地进行，因此生物催化可以成 为许多传统合成反应的理想替代途径。 1 1 1 生物催化技术的核心一生物催化剂 生物催化剂是由生物合成的具有催化作用的物质，它是生物催化和转化技术 的核心。现阶段工业上应用的生物催化剂包括生物体( 微生物) 和酶类，有时为 了保证酶的生物活性，把整个生物体用作催化剂。酶催化剂所特有的一些性质， 使其成为有机合成中很有吸引力的一类“试剂 。首先，它们是经过进化而具有 专一性催化结构的特殊蛋白质，酶通常与底物特异性地结合在一起，从而表现出 高度的区域、立体和对映选择性，这些重要的特征免除了传统有机合成中通常为 了阻断不必要的副反应而需要的基团保护和去保护措施。其次，酶促反应一般在 温和的条件下进行，无需强酸或强碱、极端温度和压力、重金属以及其他一些化 学催化所必要的条件( 3 ) 。 生物催化的这些优点，越来越受到重视，并且随着该技术的不断完善和发展， 生物催化的一些大宗产品如丙烯酰胺、长链二元酸等已经逐渐被市场接纳，表现 出极大的竞争优势。但是，目前工业酶催化的生产过程还是比较有限的，其主要 原因在于：一是酶的品种少；二是自然界的酶都是在自然生理条件下进化而来 的，当其应用到条件迥然不同的非生理条件下的工业制造过程中时，其活性、耐 温性、耐酸碱变化的能力等都是比较差的。因此必须对现有的酶进行改性研究， 提高酶的活性和耐受性，拓宽工业生物催化剂应用的领域，以适应实际工程的需 要。近年来，这方面的研究工作主要集中在极端菌的探索，非水相酶的研究以及 分子水平的定向进化( d i r e c t e de v o l u t i o n ) 、合理化设计( r a t i o n a ld e s i g n ) 等。 自然界存在的一些极端菌，如嗜高温菌、嗜低温菌、嗜盐菌、嗜极端p h 菌 等，在高温、高盐浓度等条件下仍然可以生存。对这些极端菌进行研究，有望逐 步改善工业生物催化剂对温和环境依赖性等缺陷，从而提高酶在高温、高压等条 件下的催化活性，拓宽生物催化剂使用的范围。嗜高温菌可以应用于食品工业和 洗涤剂工业，而嗜低温菌则有助于提高热敏性产品的产量，嗜盐菌由于在高盐浓 度下稳定而被用于低含水体系的催化剂( 4 ) 。2 0 世纪8 0 年代中期k l i b a n o v 等( 5 ) 的 研究表明，许多酶在非水相中不仅不失活，而且在某些情况下其活力与在水相中 相当，这为非水相酶学的研究奠定了基础。一些酶在不同的溶剂中催化活力、选 择性有较大的变化，这就会使一些本来在水中不能和不容易进行的反应可以在有 机相中较容易地发生，因此，非水相酶催化反应对一些传统化学催化困难的过程 具有重要意义。尽管非水相体系有诸多优点，但是酶在有机相中由于分子间键能 的变化，容易发生结构重排而失活。为了提高酶活性和使用寿命，可采用化学修 饰、表面改性、固定化等多种方法，业已取得显著的成果( 1 ) 。 除了极端菌和非水相酶催化技术，9 0 年代中期出现的蛋白质定向进化技术 ( d i r e c t e de v o l u t i o n ) ，大大加速了人类改造酶的原有功能和开发新功能的步伐。 酶的定向进化又称为酶的体外分子进化，是在试管中模拟达尔文进化的过程，利 2 用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得 到理想的变异。此技术最大的优势在于可操作性强，它可以使蛋白质( 酶) 在自 然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短到几年甚至几个月。定向进化的核心 技术为易错p c r 技术、d n as h u f f l i n g 技术及高通量筛选技术，其主要研究方向是： 提高热稳定性、提高有机溶剂中酶的活性和稳定性，扩大底物的选择性，改变光 学异构体的选择性等。定向进化技术已在改进酶制剂的上述性质方面取得了令人 瞩目的成就，m i y a z a k i 等对嗜冷菌的枯草杆菌蛋白酶进行了3 轮的定向进化，使 此蛋白酶在6 0 的稳定性比野生型提高t 5 0 0 倍( 6 ) ；j o o 等对p s e u d o m o n a 8p u t i d a 所产p 4 5 0 酶进行了定向进化，得到的突变株可以在缺少电子供体辅助因子的条件 下使萘羟基化，比原始酶的活性提高7 2 0 倍( 7 ) 。 1 1 2 生物催化反应的类型 历经2 0 多年的发展，酶的工业应用已取得了令人瞩目的成就，现在得到确 认的酶有3 0 0 0 多种，随着基因组学和蛋白质组学的发展，将会有更多的酶被鉴 定、分离或合成出来。采用高效、高选择性的酶作为催化剂，在开发环境友好的 工艺以代替传统工艺方面，显示出巨大的潜力。根据生物催化剂的制备和生物催 化反应的关系，工业生物催化过程可分为两类：催化过程与菌体生长耦联型，催 化过程与菌体生长非耦联型( 1 ) 。 催化过程与菌体生长耦联型催化过程的特点是：菌体只有在具有生命活力的 时候才能起到催化作用；菌体生长提供催化所需的催化剂，催化剂的制备和催化 反应同时进行；催化的反应一般是由菌体内多种酶耦合起来催化的串联反应，其 中经常涉及到氧化还原状态的变化以及一些辅酶的再生等，催化过程中副产物较 多，分离负担重( 1 ) 。发酵法生产1 ，3 丙二醇的过程是典型的催化过程与菌体生长 耦联的类型。l ，3 丙二醇( 1 , 3 - p r o p a n e d i 0 1 ) 是一种重要的化工原料，由它合成的 聚酯如聚对苯二甲酸丙二酯( p t ) 等具有良好的性能和美好的工业化前景。肺 炎杆菌属( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 、丁酸梭状芽孢杆菌属( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 以及在此基础上改造得到的基因工程菌都具有工业应用的价值( 8 ，9 ) 。甘油转化 为l ，3 - 丙二醇的过程需要与菌体生长耦合在一起的多个酶协同作用，并且菌体有 生物活性的情况下才能保证催化反应的顺利进行。 催化过程与菌体生长非耦联型的特点是：生物催化剂的制备与酶催化过程是 在不同的体系中进行的，菌体在生长时通过各种措施在菌体内积累高活力的酶， 然后在反应器内进行单独催化，不需要细胞再生长。该过程催化底物比较单一， 催化反应也常为一步催化。生物法生产丙烯酰胺是催化过程与茵体生长非耦联型 的一个很好的例子。丙烯酰胺是一种重要的有机化工原料，以它为单体合成的聚 丙烯酰胺用途非常广泛，用腈水合酶类及腈水解酶来生产酰胺及其衍生物已成为 一种常用的方法，这种酶促反应不仅条件温和，选择性好，而且微生物细胞能将 腈转化成光学活性的酰胺或羧酸( 1 0 ) ，无需酶的分离纯化。固定化异构酶生产葡 萄糖浆( 1 1 ) ，酶法拆分l 丝氨酸、l 半胱氨酸( 1 2 ，1 3 ) 等都是催化过程与菌体生长 非耦联型的例子。 现阶段一些生物催化的机理和过程还不清楚，很多催化的研究尚处于初级阶 段。对生长耦联型生物催化，通过分析代谢流找到关键酶，进一步强化关键酶和 阻断代谢旁路将会显著提高转化率，加速工业化进程。对于生长非耦联型，采用 游离细胞或纯酶作为催化剂，而采用固定化酶的技术将会增加酶的稳定性和耐受 性，无疑能降低生产的成本。随着对生物催化机理方面的研究不断的深入，催化 过程的本质也必将进一步揭示出来。 1 1 3 生物催化的发展策略与前景 以生物催化剂为核心内容的工业生物技术，在支撑新世纪社会进步与经济发 展的技术体系中的地位已经被提到空前的战略高度。发达国家已不同程度地制定 出在今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划。日本政府从2 0 0 1 年开 始实施“基于利用生物机能的循环产业体系的创造 的计划( 1 4 ) ，重点开发用于 生产各种化学物质的细胞及相关应用体系，将生物催化过程视为能够形成与环境 协调的产业体系的现实技术。美国政府在2 l 世纪发展规划提出，到2 0 2 0 年，通 过生物催化技术，实现化学工业的原料、水资源及能量的消耗降低3 0 ，污染 物排放和污染扩散减少3 0 。这将对包括化学工业、医药工业及农业在内的各 产业带来极其深远的影响。在欧洲，传统化工产品市场正逐渐被生物催化和生物 转化的产品所取代。生物催化与生物转化应用于大规模化学品生产已初见端倪， 如农用化学品、精细化学品、大宗化学品、药物及高分子材料等领域。 4 全球许多公司正投入大量资金用于生物催化的研发，试图对化学品进行廉价 生产及开发一些新的化学品生产路线，并已开发出一些工业生物催化与生物转化 过程。在日本，三菱化纤、协和发酵和味之素等公司已开发了许多新筛选的菌种 及酶用于工业生物催化与生物转化过程，使得生物催化和化学合成相结合形成了 一个独特的研究热点。欧洲的b a s f 、d s m 、l o n z a 、d e g u s s a 及r o c h e 等大型跨 国公司已纷纷转向工业生物催化与生物转化领域，并均已有产品投放市场。如 d e g u s s a 公司2 0 0 4 年投资2 0 0 0 万欧元用于生物催化与生物转化方向，并在中国 成立一个研发中心。美国杜邦公司目前正与著名的酶制造商3 e n e n c o r 公司合作 开发用于l ，3 丙二醇生产的基因工程微生物。美国国家委员会预测，到2 0 2 0 年， 将有5 0 的有机化学品和材料产自生物质原料，而生物催化与生物转化将起着 核心作用。 正如2 0 世纪中期石油化工的飞速发展改变了人们的生产、生活方式一样， 生物催化的广泛应用将会给人们提供性能更佳的材料和能源。以可再生的生物原 料为基础的生物生产过程将逐步取代化石原料生产过程，成为2 1 世纪化工生产 的主体，从而实现绿色化工、绿色生产的目标( 1 ) 。 基于微生物和酶的生物催化和生物转化技术具有生物安全性相对较好、研发 投入较少、周期较短的优势，且我国已形成良好的产业基础，是参与生物技术国 际竞争的一个良好的机遇和难得的切入点，应成为我国生物技术应用研究的一个 战略重点。发展生物催化与生物转化技术，为大宗化学品、手性化合物、生物能 源和生物材料等对国民经济有重要意义的产品体系提供理论和技术支撑。在我国 全面建设小康社会之时，对物质的需求更加迫切，能源、环境的矛盾十分突出， 重视生物催化和转化的研究也符合当前国家的发展目标。 1 2 环氧化物水解酶 环氧化物水解酶( e c 3 3 2 3 ) 是一组功能相似的酶系，能够立体选择性地催 化环氧化合物生成相应的二醇，它们广泛存在于自然界的各类生物中，包括哺乳 动物、昆虫、植物和微生物中( 1 5 ) 。高等生物体内的环氧化物水解酶是由各种化 合物( 如有毒物质和植物性化合物等) 所诱导的，因此对动物来说，一般认为此 酶是解毒酶系的一部分( 1 6 ) ，而对植物来说则是种防御机制( 1 7 ) ；微生物的环 氧化物水解酶在生理学上的作用还不清楚，其中一些酶是诱导型的，并能参与一 些特定化合物的代谢( 4 ，1 8 - 2 3 ) 。 在过去的二十多年里，已对哺乳动物的环氧化物水解酶进行了深入的研究， 而对昆虫和植物体内的此酶研究的相对较少，植物和昆虫的环氧化物水解酶可以 分为不溶性的和可溶性的两大类( 1 5 ) 。对高等生物的环氧化物水解酶的研究，一 般集中在酶的生理功能方面，在分子机制和立体化学的特性方面的研究也很详 细，而对微生物环氧化物水解酶的研究则主要集中在生物催化的潜力方面，这些 研究也已成了当今的研究重点。微生物环氧化物水解酶可以用于工业的大规模生 产，因为大部分微生物可以很容易的大量培养，因此酶的产量相对较高。 在外消旋环氧化物的动力学拆分方面，环氧化物水解酶是一种引人注目的生 物催化剂，因为它们不需要辅助因素，能够和同一类的多种底物反应，并且多数 酶有较好的稳定性。通常情况下，动力学拆分外消旋底物的最大反应产率为5 0 ，而用环氧化物水解酶来生产光学纯的二醇，特定条件下的最大产率可以达到 1 0 0 ( 1 5 ) 。光学纯的环氧化物和它们相应的光学纯邻二醇，在作为生物活性的 终产物或在生产更复杂的生物活性光学纯物质方面非常重要( 2 4 ) ，各种化学的和 生物的生产方法已被报道( 2 5 - 2 7 ) 。 1 2 1 环氧化物水解酶的作用机制 通过对两种哺乳动物环氧化物水解酶( 不溶性的和可溶性的) 的研究，此类 水解酶的作用机制得以阐明，现在通常假定这两种类型的酶是相关的，并且和细 菌的卤代烷脱卤素酶及细菌的卤代醋酸盐脱卤素酶相关( 2 8 ，2 9 ) ，都属于“p 折 叠水解酶家族( 2 8 ，3 0 ) 。 基于对卤烷脱卤素酶的研究发现，不溶性和可溶性的环氧化物水解酶都遵循 两步催化的反应机制( 2 8 ，3 1 ) 。单一逆转的水解实验用h 2 i s 0 来做，而产物二醇 里面却没有1 8 0 ，这表明二醇上的o 原子是酶提供的。根据这一结果，酶的活性 是通过活性中心的氨基酸亲核进攻底物而被启动的。在形成a 羟基酯酶的中间 产物后，接下来通过给中间产物酯键的羧基碳加上一个活性水，使中间产物水解 而生成有活性的酶和相应的二醇。关于酶和底物的共价结合，已发现了更明确的 证据，将环氧化物水解酶跟放射性底物顺式9 ，1 0 环氧硬酯酸进行反应，共价中 6 间产物的形成可以通过s d s 凝胶电泳形象的展现。 图1 1 环氧化物水解酶的作用机制 f i 9 1 1t h ec a t a l y t i cm e c h a n i s mf o re p o x i d eh y d r o l a s e 跟a 1 3 折叠水解酶的序列比对和对环氧化物水解酶e d n a 进行定点突变的结 果表明，参与亲核反应的氨基酸为天冬氨酸，其中不溶性环氧化物水解酶是 a s p - 2 2 6 ，可溶性环氧化物水解酶是a s p 3 5 2 ，而可溶性环氧化物水解酶的 h i s - 5 2 3 a s p - 4 9 5 则具有水解酯一酶中间产物的活性( 2 8 ，3 1 3 3 ) 。 1 2 2 各种来源的环氧化物水解酶 1 2 2 1 哺乳动物环氧化物水解酶 哺乳动物的两大环氧化物水解酶主要存在于动物的肝脏中，将这两种酶进行 1 0 0 ，0 0 0 g 的高速离心后，可溶性环氧化物水解酶存在于上清中，而不溶性环氧 化物水解酶存在于沉淀中，二者的名称也是因此而来。它们除了有以上区别外， 两种酶还有着不同的催化特性。两者的底物范围都很宽，且有部分交叠，但是最 适底物截然不同。通常含有单取代的或顺式双取代并且有一个亲脂取代基团的环 氧化物是不溶性环氧化物水解酶的最佳底物( 3 4 ，3 5 ) ，对可溶性环氧化物水解酶 来说，三和四个取代基的环氧化物，尤其是含有反式取代基的环氧化物是极好的 底物( 3 6 ，3 7 ) 。 哺乳动物的环氧化物水解酶的主要作用是水解外源的环氧化物，包括多环芳 香烃，因此高等动物的环氧化物水解酶具有解毒的作用，它能将亲脂性的底物转 化成易溶于水、容易排除的化合物。不溶性环氧化物水解酶主要存在于内质网， 7 哭痔 一一 矿飞 他们的分子量在5 2l a ( 3 8 ) 。很多报道表明，此酶对外消旋的底物有着高的底 物对映体选择性，对m e s o 底物则有着高的产物对映体选择性，因此可溶性环氧 化物水解酶是一种有用的生物催化剂，它可以用来生产对映结构纯的环氧化物和 二醇。可溶性环氧化物水解酶主要存在于细胞质和肝细胞的过氧化物酶体中 ( 3 9 ) ，酶以同型二聚体的形式存在，每个亚基的分子量为6 2k d a ( 3 0 ) ，与不溶性 环氧化物水解酶相比，对该酶底物对映体选择性的报道非常少。 1 2 2 2 植物的环氧化物水解酶 植物环氧化物水解酶很特殊，水解顺式脂肪酸环氧化物生成苏式二醇( 4 0 ) ， 这些环氧化物和相应的二醇在植物防御病原体机制方面起着十分关键的作用。这 些化合物能够参与合成角质，它对防御病原茵入侵起着重要的屏障作用( 4 1 ) 。 b l e e 和s c h u b e r 已对大豆中的脂肪酸环氧化物水解酶进行了详细的研究( 4 0 ， 4 2 ，4 3 ) ，作者发现这种酶以不溶性和可溶的两种形式存在，其中不溶性形式的占 小部分，可溶性的占大部分。大豆种子中的可溶性脂肪酸环氧化物水解酶已得到 纯化( 4 0 ) ，它是一种二聚体，每个亚基的分子量为3 2k d a ，此酶对顺式9 ，1 0 环 氧硬脂酸有着较高的活性，而对反式的异构体的活性则只有前者的4 5 。 因为具有立体化学的特性和相对高的活性，用植物环氧化物水解酶合成对映 体结构纯的环氧脂肪酸和二氢脂肪酸，理论上是可行的。另外，从植物中大量获 得此酶也比从动物体容易得多，但是他们的催化潜力还有待于进一步通过研究作 用的底物范围来确定。 1 2 2 3 微生物中的环氧化物水解酶 细菌中的环氧化物水解酶可分为组成型酶和诱导型酶。f a b e r 等人对前者进 行了系统地研究，他们筛选了大量的菌株用于拆分2 单取代基，2 ，2 和2 ，3 - 双取 代基的环氧化物( 4 4 ) 。这些菌株中，红球菌( r h o d o c o c c u s ) 、分支杆菌 ( m y c o b a c t e r i u m ) 和诺卡氏菌( n o c a r d i a ) 所产生的酶表现出较好的催化特性。 根据其研究结果可以得出以下结论：组成型环氧化物水解酶在水解2 甲基- 2 烃 基和2 甲基2 芳烃基环氧化物时具有较高的对映体选择性，而水解无支链的l ，2 8 环氧化物时，则表现出较低的对映体选择性。 诱导型环氧化物水解酶与组成型酶不同，它们通常具有相对窄的底物谱，但 对于特定底物酶的催化活性相对较高。这类酶应用的个典型例子是，通过酶拆 分来生产( 1 s ，2 s ) 1 甲基环己胺1 ，2 二醇( 4 5 ) ，该环氧化物水解酶可被1 ，2 环 氧环己胺、其相应的二醇及1 甲基二醇的衍生物所诱导。相比之下，对放射形土 壤杆菌( a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r ) a d l 所产的环氧化物水解酶的研究更详细， 对此酶进行纯化和酶性质的研究发现，该酶分子量为3 4k d a ( 4 6 ) 。将该环氧化物 水解酶的基因在大肠杆菌中进行表达后，进一步研究了其特性，结果表明它是“b 折叠水解酶家族中的一员( 4 7 ) 。此酶活性位点的三个氨基酸残基为f 1 0 8 ，1 2 1 9 和c 2 4 8 ( 4 8 ) ，r u i 等人将这三个位点进行突变以改变此酶对外消旋底物苯乙烯环 氧化物的对映体选择性。