（物理化学专业论文）电位型酶传感器的研制及有机磷农药的快速检测.pdf

电位型酵侍感器的研制殴有机磷农药的快速检测 电位型酶传感器的研制及有机磷农药的快速检测 指导教师：冯春梁教授 研究生：李言 学科专业：物理化学 研究方向：生物传感器 中文摘要 有机磷农药是农业生产中使用最为广泛的杀虫剂，对增产增收具有重要作用，己成 为必不可少的农业生产资料。然而，农产品中的农药残留己成为人类健康的一大威胁。 农残的控制与检测是目前亟待解决的环境问题。传统检测有机磷农残的方法主要包括气 相色谱法，液相色谱法等。这些方法耗时长、成本高、难以满足现场快速检测的需要。 相对而言，生物传感器可为有机磷农药的检测提供一种快速、简便的手段。 有机磷农药生物传感器已有很多报道，其设计原理大多是基于乙酰胆碱酯酶的不可 逆抑制作用。因此类酶传感器一般只能一次性使用，成本太高。因此，本论文设计了一 种新型电化学酶传感器，该传感器制备简单，使用方便，可对有机磷农药进行快速检测， 并可重复使用。我们的工作主要包括如下两个方面： 1 辣根过氧化物酶( h r p ) 修饰石墨电极的制备及h 2 0 2 的灵敏检测 h 2 0 2 的快速、准确检测是研制本文设计的有机磷农药酶传感器的重要基础。本实验 中分别利用石墨电极，聚邻苯二胺( p o p d ) 修饰石墨电极，n a t i o n 修饰石墨电极为基底 电极并分别使用再生丝素包埋法，聚乙烯醇包埋法，壳聚耱包埋法，纳米金( n a n o a u ) 静电吸附法等方法固定h r p 并对h 2 0 2 进行检测，考查了底物浓度，酸度，电解质溶液 种类等各种条件对检测r t 2 0 2 的影响，确定了最佳实验条件。结果表明，以h r p n a n o - a u p o p d 石墨电极检测h 2 0 2 的检测下限为8 8 2 1 0 。s m o l l ，线性范围为3 5 3 1 0 7 8 2 3 1 0 4m o l l ，斜率为5 8 8 1 5 m v 。电位变化稳定迅速，电极制作方法简单可以进一步作 为制作检测有机磷农药传感器的基础电极。而h r p n a n o a u 半胱氨酸n a f i o n 石墨电极检 电位型醇传感器的研制厦有机磷农药的快速检测 测h 2 0 2 的检测下限为8 8 2 x 1 0 。9 m o l l , 线性范围为3 5 3 x 1 0 。8 8 8 2 x 1 0 4m o l l ，检测下限 很低，但制作方法较为繁琐，可以作为一种灵敏的柃测h 2 0 2 的方法。 2 电位型酶传感器对有机磷农药的检测 设计了种检测有机磷农药的双酶催化反应新体系，分别研究了各种条件对有机磷 农药检测的影响，通过实验确定碱性磷酸酶( a l p ) 最佳浓度为0 0 0 5 u m l ，最佳酸度条 件为p h = 9 8 0 ，抑制时间为2 0 m i n ，并测定了检测有机磷农药的标准曲线，其线性方程为 y = 1 7 5 x + 2 9 2 5 ，r 2 = 0 9 9 4 3 ，检测范围为0 0 5 - 0 4 5 u g m l 。该传感器具有良好的重现性 和稳定性，寿命至少为1 个月以上。 关键词：酶传感器； 过氧化氢；有机磷农药；辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶 电住型酶传感器的研制及有机磷农药的快连检测 第1 章绪论 1 有机磷农药残留检测的意义和方法 1 1 有机磷农药残留检测的重要性和必要性 我国是一个农业大国，农药是农业生产中十分重要的生产资料，而农药主要是一些 有毒有害的化学物质，包括杀虫剂、除草剂和杀菌剂三种类型。这些物质的长期人量使 用，不仅对土壤、地表水、地下水和农产品造成污染，而且会进一步进入生物链，对环 境生物安全和人类健康都将产生巨大危害 1 ，2 】。有调查结果显示，我国农药年均使用量 5 0 万吨左右，使用量之大是其它国家所少有的。目前我国甲胺磷年产量高达7 万吨，高 于世界其他国家的总和【3 】。由于剧毒、高残留农药的过量使用和滥用，直接造成的中毒 事件时有报道，食品中农药残留量超标也是导致癌症患病率不断上升的重要因素之- - 4 。 这些问题的长期存在，一是广大农民缺乏科学知识，缺少环保意识，少数农民缺乏社会 道德，不顾消费者的身体健康和生命安全，过量施用农药化肥，只顾追求致富短、平、 快，速生速长速赚钱。二是目前还没有一种有效地快速检测农药残留量的实用技术，致 使政府职能部门缺少有力的监管手段。 世界各国也都把农药在农产品或食品中的残留量作为一项重要的进出口检验质量指 标，特别是发达国家有着严格的标准。若不能对农药残留量进行有效控制，我国农产品 的出口将会受到极大影响。要促进农药的科学使用，保证我国农产品农药残留量达到食 品安全标准，必须尽早建立一种农药残留的微量快速分析新技术。 杀虫剂主要是有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类化合物。有机氯类农药由于具有较大 毒性，于1 9 8 4 已在我国停止使用。有机磷类农药是继有机氯类农药之后被广泛使用的一 类杀虫剂，目前生产使用的至少有6 0 余种，其中多为低毒低残留品种，如乐果、倍硫磷、 双硫磷等，但如甲胺磷、甲拌磷、内吸磷等毒性较高的品种因为杀虫效果好也同时在生 产使用。有机磷类农药对人体的危害主要是抑制吡液和组织中胆碱酯酶的活性，引起乙 3 电位型酶传感器的研制及有机磷捉药的快速检测 酰胆酯在体内大量积聚而出现一系列神经中毒症状如精神错乱，语言失常等。因此， 国家农药残留最大限量标准规定，甲胺磷、甲拌磷、内吸磷等毒性较高的农药在食品中 不得检出5 1 。解决农产品安全问题关键是检测技术问题，建立一种准确迅速、简便廉价 的农药残留量检测方法是食品安全与生态环境保护的当务之急。 l _ 2 现有主要检测方法及存在的问题 现在使用的农药绝大部分是有机磷和氨基甲酸酯类化合物。国内外对农药残留的常 规检测方法主要是理化分析方法，即通常讲的利用仪器如气相色谱仪、液相色谱仪、气 质联用仪、液质联用仪等进行农药残留量的分析检测。这些方法的优点是可以定性、定 量的检测农药残留量也是国家规定的标准检测方法。这些方法需要对样品进行萃取分 离等复杂预处理过程，需要大量的人力物力，检测时间长且仪器价格昂贵。需要专业技 术人员维护，检测成本高，不适于现场检测，不能满足种类繁多的农产品检测需求嘲。 生物传感技术是当今高科技领域的前沿课题。生物传感器有望成为一种准确迅速、 简便廉价的农药残留检测方法，在国内外受到了越来越广泛的关注【7 】。自上个世纪9 0 年 代以来，关于用生物传感器检测农药的报道不断增加【8 ，9 】，如电化学生物传感器【1 0 】、 光学生物传感器【1 1 1 4 1 、压电晶体生物传感器【1 5 ，16 】、场效应晶体管生物传感器【1 7 】、 热生物传感器【1 8 】和表面等离子体共振生物传感器等等。在检测农药的生物传感技术中， 电化学生物传感器的研究较为j “泛、发展迅速而且现代电化学仪器性能稳定，灵敏度 高，可以用微机控制，更容易实现自动检测分析。因此可以预见，在不久的将来，电化 学生物传感器将成为一种农药残留快速检测的新手段。 4 电位型酶传感嚣的研制度有机磷农药的快速捡测 2 生物传感器概述 生物传感器是利用生物分子( 酶底物，抗原抗体，激素受体，核酸等) ，细胞微 生物或组织等生物材料的特异性识别功能，通过各种物理化学信号转换器的信号转换， 实现待测物质的定性或定量分析的器件或装置【1 9 2 1 。它是用生物材料与物理化学信号 转换器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监 控方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法。 生物传感器的原理示意图如下： 图1 1 生物传感器的原理示意图 如图所示，生物传感器通常有两个部分组成：一个是生物识别部分( 敏感元件) ，一 般由具有分子识别能力的生物活性物质( 如酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物膜等) 构成；另一个是信号转换部分( 信号转换器) 通常由电极，压电晶体，场效应晶体管， 光线等检测元件构成。但分子识别元件与待测物结合后，产生的复合物通过信号转换器 转变为可以输出的电信号，光信号，从而达到分析检测的目的。生物敏感材料决定了生 物传感器的选择性，而信号转换器的类型和生物材料的圃定化技术 2 z 2 4 1 决定了生物传 感器的灵敏度，生物材料的固定化是制作高灵敏度生物传感器的一个最关键的步骤。 生物技术、信息技术是2 1 世纪的两大领先技术，在这两者之间，存在着许多技术交 义，其中，生物传感技术将有望成为大规模的新兴产业。生物传感器是是发展生物技术 必不可少的一种先进的检测方法与监控手段，也是对物质在分子水平上的快速检测与微 量分析方法。在2 1 世纪的知识经济发展中，生物传感器技术必将是介于信息和生物技术 5 电位型酶传感嚣的研制覆有机磷农药的快速捡测 之间的新增长点，在国民经济中的i 业控制、食品和药物分析( 包括生物药物研究开发) 、 环境保护、临床诊断以及生物技术、生物芯片等研究中有着广泛的应用前景。 3 电化学酶传感器在有机磷农药检测中的应用 电化学酶传感器也称为酶电极是应用最为广泛的酶生物传感器，它最先是由c l a r k 于1 9 6 2 年出 2 5 1 。将酶电极应片j 了：有机磷农药的测定主要有两种类型：抑制刑酶电极 和水解型酶电极。 3 1 抑制型酶电极 3 1 1 基于胆碱酯酶抑制的酶电极 抑制型酶电极研究得最多的是胆碱酯酶型酶电极。胆碱酯酶测定农药残留的反应原 理是，乙酰胆碱在胆碱脂酶的催化作用下分解形成胆碱和乙酸，胆碱再被胆碱氧化酶氧 化而生成甜菜碱并放出h 2 0 2 。有机磷农药是底物胆碱的结构类似物。它们同胆碱酯酶作 用时，首先形成非共价的中间复合物。此复合物很不稳定，极易水解。水解的同时，磷 酰基与胆碱酯酶活性中心丝氨酸羟基作用生成以共价结合的磷酰化酶，使酶的活性降低， 水解反应被抑制，反应产物减少。而溶液p h 值的变化以及胆碱在胆碱氧化酶的氧化作用 r 生成的h 2 0 2 的浓度的改变或反应中氧的消耗量能被电化学传感器测定。 这种酶电极的反应原理可以表示如下【2 6 】 a c h e ，a c c t y lc h o l i l l e s t e r a s e h o ( c h 3 ) ，n c h ! c h 2 0 0 c c h 3 + h 2 0 一h o ( c h 3 ) ，n c h 2 c h 2 0 h + c n c o o h ( 乙酰胆碱a e e t y l c h o l i n e )( 乙酰胆碱酯酶)( 胆碱，c h o l i n e )( 乙酸) c o x ，c h o l i n eo x i d a s e h o ( c h j ) | 3 n c b c h 2 0 h + 2 0 2 + h ：o ( 胆碱，c h o l i n e )( 胆碱氧化酶) h o ( c h 3 ) 小c 啦c h 2 c o o h 十2 h 2 啦 ( 2 ) ( 甜菜碱，h c t a i a e )( 过氧化氢) 根据上面的反廊原理，第一个反应有乙酸产生，它可以电离，从而使溶液的p h 值发 生变化，有机磷抑制该酶反应，影响溶液的p h 值，由此可以设计电位型酶电极，如果用 电位型酶传感器的研制蕊有机磷农药的快速检测 硫代乙酝疆碱代饕五酿疆碱，乍戏约巯基援碱w 以在r 、玻璇电极表瑟氧化，姨磊设计 为电流型酶电极。 3 1 1 1 电位型月日碱酯酶电极 t r a n m i n 镶 2 ；q g t a c h e 雠在嚣爝酰黢，译基霭烯酰藏凝聚骥中，褥鲻酶薄冀，照 意将酶薄片同定在p h 电极表面，构成了测定有机磷农药的电位型酶电极，掰该电极测定 对氧磷和马拉硫磷，检出限分别为1o _ 9 m 0 1 几和1 0 。1 9m o l l ，抑制酶电极的时t 洲j 8 1 0 m i n 。 对基子乙嬲g 璇酝酶的生糖健感器来说，冀捡溯过程容易受至l 秘，c # ，强等离子 的_ = f 扰，s t e i n 等避过研究发现f 2 8 】，将牛血清臼蛋白与酶共同圈定得到的敏感膜可有效的 消除此种重金赋离子的干扰，使干扰的影响降低到标准偏嫠瓤围以内。对于锕豳子浓度 受3 m g 色靛特溅溶渡来说，其手撬可绫原来1 0 - - 2 0 降低n o 3 强。对予锌燕子浓褒为 5 m g l 的溶液来说，其干扰也可从原来的l o 释降到2 3 。 除了乙酰腮碱酯酶，有人述采用丁酰胆碱酯酶作为敏感材料。k u m a r a n 等【2 9 】将 丁躐疆碱醋酶( b u c h e ) 吸瓣在颈先涎他了躲趸宠一蘩酸弦膜土，势胡趸燕稠辫载酶的貘冀 瑚定在p h 电极嵌面，由此测定从土壤中提取的有机磷杀虫荆，测定乙基对硫磷和速灭磷 的检出限分别为1 ，3 x 1 0 一m o l 1 湘6 ，2 x 1 0 4 m o l l 。 还有大枣l 嗣主嚣嚣爱痘辍臻将嚣静酶( 乙溅疆碱臻m a c h e 翻疆疆氧诧簸c o x ) 共嚣 围定在电极表面上，从而利用两种酶的双重放大作用实现有机磷农药的检测。如e s p i n o s a 等【3 0 】采用丝网印刷术设计了墩位型生物传感器。它是以碳电极作基底电极，将a c h e - 与 c o x 共强弱定予蘩簌电援表露锱艘瓣一转赣羹魄经登酶奄掇。羰窀疆表嚣醚痴2 熬还嚣， 因反应的超电位降低，电极电位发生移动。电板电位的增长率与a c h e 的活性成比例，测 定有机磷农药的检出限小w n m o l l ，整个检测过程不超过2 0 m i n 。 3 1 1 2 电流鍪f 麓城赘酶电投 电流型传感器测量的是0 2 ，h 2 0 2 等电活性物质浓度。它有两种类型，第一种类型是 基t ：反应( 反应1 ) 中生成的胆碱被胆碱氧化酶( c o x ) 氧化，消耗氧而生成r i 2 0 2 ( 反应2 ) ， 鼠嚣透过测定滚滚孛熬氧蕺r 1 2 0 2 来阗接溅量酶浆撺靠l 浆。繁一二狰方法是只傻撵a c h e ， 7 电位型酶传感嚣的研制及有机磷农药的快速检测 而用硫代乙酰胆碱为底物，生成的产物在铂、石墨等电极上被氧化。 b e m a b e i 等人在透气膜上固定了乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶两种酶并将酶膜与溶氧 电极结合构成了一种电流型酶膜生物传感器。他们发现，在乙酰胆碱酯酶与胆碱氧化酶 的物质的量比为0 2 5 ：5 时检测的灵敏度最高，其对地虫磷和对氧磷的检测限分别可达加6 和1 0 一o m o l l 。 电流型生物传感器也可以用h 2 0 2 电极制备【3 l ，3 2 】，以p i 电极为基底电极o k a z a k i 采 用了一种简单方法制备酶电极，首先将一定量a c h e 溶液滴于p l 电极表面。待干燥后蒋将 一定量台 a c h e ，戊二醛与白蛋白的混合液滴于其上，干燥形成交联酶层，因为白蛋白对 酶的毒化作用很小，a c l i e 在内外两层膜内都能保持原有的活性。这种酶电极不仅制备简 单，而且检出限低，稳定性较好。测定对氧磷的检出限为1 0 n m o l l ，传感器在4 c 磷酸盐 缓冲液中活性可保持2 个月，在干燥条件下可维持一年。 3 1 2 基于抗坏血酸氧化酶抑制的酶电极 3 3 】 有机磷农药也会对抗坏血酸氧化酶的活力产生抑制，利用这个原理也可以实现有机磷 农药的检测。 2 - 十九坏m 腋能+ 0 2 丛生垫型丛i ! 2 - 脱= 董抗坏| f 【艘盐+ 2 h ：o r e k h a 等人利用这个原理检测乙烷对氧磷的浓度，检测下限为1 , 0 x 1 0 m o l l 。 3 1 3 基于磷酸酶抑制的酶电极 3 4 】 酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性也可以被有机磷农药抑制。 酸性磷酸酶的催化反应原理如下： 6 畸艘涮+ , l i b , i f 十h 2 0 堕丛堡堕堕 锎钓新+ 忙剌衙 彻柚1 l i f + 0 2j 啦型匦熊 + 黼0 柑艘+ h 二0 2 通过检测h ：0 2 在电极表面的氧化电流，来检测有机磷毒剂的抑制，对氧磷毒剂的检 测限为5 x 1 0 一m o l l ，该传感器每天可以测试4 次- 6 次，两周后可以保持8 0 的活力。 碱性磷酸酶的催化反应原理如1 3 5 3 7 】： 8 电位型酶传感器的研制蕊有机磷农药的快速检测 , o p 0 3 4 ：g 一骂：q 且旺露d + 凇 旨机磷农药 l 句存在会瓣整| 碱性磷酸酶的淫靛，最终导致产生酌h 2 0 2 量减少，从而实 理有机磷农药的检测。本论文是研究是通过这个原理实现了宥机磷农药的梭测。 3 1 4 基于小麦醑酶抑制的酶电极【3 8 】 厶峨一蕊颤；+ 强 )尘童鍪整，鬈黝+ 黻 禁绚+ 剧照。b e 巾絮”色似碱化介物+ 麓化蹿+ t 睃 3 2 水解型酶电械 鞋上费缓豹凡秘体系都是慧予酶貔捧裁终嗣，晕j 蠲这秘簸瑾期残的生耪铸感爨存在 一些缺陷，环境中的其它因素也会造成酶活性盼丧失，从而造成假阳性的检测结果。其 不可逆性也造成了生物传感器凭法多次使用。而使用有机磷水解酶制备的生物传感器可 娃竟鼹上述壤豢。 有机磷水解酶能催化水解静机磷农药( p o 和p - s 键) 。其反成机理如下： r x 一z + h ：。一r 一；一。h + z n x x 代表氧原子或硫原子，r 楚烷氧基，r 憝烷氧蓁或苯蒸，z 是苯氧基，巯基，氰基 或卤索原子。撒据上面原理可以分别设计成电位裂或电流型传感器。有机磷农药在有机 骥拳勰酶戆露羯下生藏了黪帮黢，酸叉会电凑产生萋裹子，产生氢离予匏浓澄嚣畜援磷 农药的浓度具有相关性，这构成了制作电位型酶电极的基础。如果产生的酚具有电化学 活性，则可以设计成为电流型酶电极。如加拿大的m u t c h a n d a n i 教授利用细胞膜表面表达 餐撬磷承粲酶静燕缓擞生凌毒l 奄泡滚型生物传旗器，羯于害孛经蠖毒裁魏捡测羚9 l 。荬爱壅 原理为： 奇 一 电位型酶情感器的研制茂有机磷农药的快速检测 该反应裁够检测到0 2 u m o l l 辩稍基磷醢，l u m o l l 甲旗慰硫磷。这种方法铡用了酶 瓣催化伟崩，丽不是利用酶盼撺翻作用，简单茯速，适合在线捻测。 4 电化学测试，亨法、原理 4 。1 电位分赣法 电位分析法是一种通过测嫩电极电位来测定物质含量的分析方法。根据能斯特方程， 电辍邀证e 与被灏物质嬲活度移在定量关系，霹强透过邀极彀经塞求出被铡物鹱豹活廑。 电极电位的测景需要构成一个化学电池，个电池有两个电极，在电位分析中，将 电极电位随被测物质活度变化的电极称为指示觑极，将另一个与被测物质无关的，提供 测鳖邀位参考的魄辍称为参毙纛辍，电解鏖溶渡由被测试徉致冀它组分组成。耀z 2 是班 曾汞电极作为指辩电极的电位测鼙体系，依靠这种体系可啦谶行电位攒i 量。 酶电极的分析原理是基于用电位法直接测凝酶促反应中艇应物的消耗戏擞成物的产 生嚣实现对藏穆势辑魏一静势拯方法。它将黪溪性凌矮覆盖袭瞧援表瑟，这按酶活蛙豹 瓞与被测的有机物或无机物( 底物) 反应，形成种能被电掇响应的物质，例如，尿素 在尿素酶催化下发生下面反应： n h z c o n h 2 十2 h z o 避删+ 噼 氨基酸在氮赫酸氧化酶催化f 发生反应 r c h n h 2 c o o h + h 2 0 + 0 2 型壁匙kr c o c o o w + n h 4 + + 0 2 反痘生藏麴镀离子可臻锼离予电援亲测定。菪将臻素酶涂在铰枣子电援上粼袋为暴 素电极，此电极插入含有尿液的试液中，可由尿素分解产生的铵离子的响应衙间接测出 艨索的含量。 2 循环侠安法 伏安分析法是指以被分析溶液中电极的电骶。电流行为为基础的一类电化学分析方 法。与电位分析法不同，伏安分丰斤法是在一定的电位下对体系电流的测量；而电位分析 法楚茬零电滚条襻f 霹体系迄侮的溺壁。辍谗分耩方法( p o l a r o g r a p h y ) 是扶蜜分辑方法 1 0 电位型酶传感器的研制及有机磷农药的快速检测 的早期形式，1 9 2 2 年由j a r o s l a vh e y r o v s k y 创立。因其在这一研究中的杰出贡献，1 9 5 9 年h e y r o v s k y 被授予诺贝尔化学奖。从六十年代末，随着电子技术的发展，以及固体电 极，修饰电极的广泛使用以及电分析化学在生命科学与材料科学中的广泛应用，使伏安 分析法得到了长足的发展，过去单一的极谱分析方法已经成为伏安分析法的一种特例。 4 2 1 循环伏安法概述 伏安分析法是在一定电位下测量体系的电流得到伏安特性曲线。根据伏安特性曲 线进行定性定量分析。所加电位称为激励信号，如果电位激励信号为线性电位激励，所 获得的电流响应与电位的关系称为线性伏安扫描；如果电位激励信号如图1 2 那样的三角 波激励信号，所获得的电流响应与电位激励信号的关系称为循环伏安扫描。正向扫描时， 若电位从e 1 扫到e 2 ，即从0 2 v 扫到0 6 vv ss c e 。电位辐值为0 8 v 。反扫时电位从e 2 扫到e 1 ( 从0 6 到0 2 v v s s c e ) 。e p c ，e p ，分别为阴极峰值电位与阳极峰值电位。k ，k 分别为阴极峰值电流与阳极峰值电流。这里p 代表峰值，a 代表阳极，c 代表阴极。循环 伏安扫描时的电位范围确定的基本要求是建立在对背景( 电化学窗口) 扫描的基础上的。 换句话说，背景扫描应为一条稳定的基线。基线的特征应主要表现为电极表面的电容特 性。它与电极的性质，表面粗糙度，电极表面积以及设定的灵敏度相关。 巾，v e 2 e 1 图1 2 循环伏安法的加压方式 4 2 2 可逆体系下的循环伏安扫描 5 0 4 0 3 0 量2 0 蟮1 o _ 田】0 s 一10 稻2 0 _ 3 0 4 0 电极电位( m v ) 图1 3 循环伏安法图 电极反应过程受扩散控制的过程称为可逆反应。 以氧化过程为例进行分析，设电极反应方程式为：r e d = o x + n e 因为扩散控制了反应过程，根据f i c k 第二定律 皇竺型竺竺查堡竺! 型墨查垫竺查堕竺堡兰竺型一 数。 程。 i o c r 嘲c 等，等酬鲁， o ，c d 分别为还原态和氧化态浓度；d r d o 分别为还原过程和氧化过程的扩散系 初始条件为t = n x = o 时c r = 岱c d = d ，- 边界条件为f = o j j 沾时c r = c j c o - 田 t o , x = o 时伽( 尝) = - 肋( 尝) = 击d x ax r t r 因为是可逆反应，n e m s t 方程成立 罴岳n f e x d ( e 召) 】 _ l i e e 。 已 r r 、 。 r r 和r o 分别为还原态和氧化态的活度系数。 由初始电位晶开始，以扫速v 进行扫描e = e i + v t 令a = n f ( r 习v 所以，a t = n f ( r t ) v t = 棚( r d ( b 两 从而求得： ，= n f a c r * ( p d n a ) i _ ( a t ) 这个方程式决定包括循环伏安法在内的静止溶液体系中电流一电位曲线形状的重要方 根据上述方程可以推导出峰电流和峰电位表达式为 l 。= 0 4 4 6 1 0 3 一f a i 2 a 曝t ) i ：2 d i l ；2 c r l i 2 2 5o cl i = -i 。：2 6 9a 【 耐8 d c 一i 2 、羊波电健e l | f e o + r t ( n d i n o p i 6 r p ：“、 峰电位西= e u z + j j 0 9 r ! 协d 2 5 c 鼬e 。= e 1 2 + o 0 2 8 5 n 1 2 电位型酶传感嚣的研制及有机磷农药的快速检测 假定的半值对应的电位为如那么弓和耳口的差值为： d e p = e re p f z = 0 0 5 6 5 n 可逆反应的循环伏安曲线具有下列性质： ( 1 ) 厶和本体浓度岛+ 成正比； ( 2 ) 厶与t , i 2 成止比； ( 3 ) e 与v 、g + 无关，是一个定值； ( 4 ) 陆h k ； ( 5 ) 昂= - = 5 9 n 咖v ) f e ( c n ) 6 3 与f e ( c n ) 6 4 是典型可逆氧化还原体系。图1 3 是f e ( c n ) 6 a 一在碳电极上典型 的循环伏安扫描曲线。电位激励信号为三角波信号。西与岛分别为- 0 2 ，0 6 v v s s c e ， 电位辐值为0 8 v 。正品昂。分别为阴极峰值电位与阳极峰值电位a 分别为阴极峰值 电流与阳极峰值电流。确定峰值电流的方法可以采用切线法。 正扫时( 向左的扫描) 为阴极扫描： f e ( c n ) 6 3 + e = f e ( c n p 。 ( 1 ) 反扫时( 向右的扫描) 为阳极扫描： f e ( c n ) 6 4 e = f e ( c n ) 6 3 ( 2 ) 在该电极体系中，式( i ) 与式( 2 ) 还原与氧化过程中的电荷转移的速率很快，电 极过程可逆。这可以从伏安图中还原峰值电位与氧化峰值电位之间的距离得到判断。一 般地，阳极扫描峰值电位耳。与阴极扫描峰值电位昂。的差值( a e p ) 可以用来检测电极 反应是否是n e r n s t 反应。当一个电极反应的a e v 接近2 3r t n f ( 或5 9 nm v ，2 5 。c ) 时， 我们可以判断该反应为n e m s t 反应，即是一个可逆反应。从图1 3 可见，缉相差接近于 5 9 m v ，还原电流与氧化电流增加较快。这是因为，在阴极过程中，f e ( c n ) 6 a 一获得电子还 原成f c ( c n ) ，的速度较快，电极表面f e ( c n ) 6 ：1 离子浓度迅速降低，反应电流迅速增加。 由于反应电流增加的较快导致电极表面n e r n s t 层恢复n e m s t 平衡的倾向增加，在阴极扫 描中出现峰值电流及峰值电位。当反向扫描时，在电极表面产物f e ( c n ) 6 。离子的浓度接 13 电位型酶传感器的研制覆有机磷农药的快速检测 近于反应离子f e ( c n ) 6 3 的初始浓度。换句话说，反扫描所获得伏安扫描曲线相当于在与 f e ( c n ) 6 3 初始浓度相同的f e ( c n 矿离子的阳极伏安扫描。于是阴极波与阳极波基本上是 对称的。 4 2 。3 不可逆体系下的循环伏安扫描 电极反应过程受电极反应速率控制的过程称为不可逆反应。 当电极反应不可逆时，氧化峰与还原峰的峰值电位差值相距较大。相距越大不可逆 程度越大。一般地，我们利用不可逆波来获取电化学动力学的一些参数，如电子传递系 数a 以及电极反应速度常数k 等。 设电极反应方程式为：o x = r e d t i e 电极反应速率常数为：k = k se x p a n a f ( r t ) ( e - e 。) a 称为交换系数，r t 。是控制过程的反应电子数 电流表达式为：j = n f a c o d l ：z ( a n f r t ) 2 节：2 x ( b t ) 其中，b = 似h 善 r t ) ( e 酽 经推导峰电流为：厶= j 1 0 9 ( a n 。，”咖( 可逆) = 2 9 9 ( a n 。) 。7 2 a d o r n c o * v l z ( 2 5d 不可逆反应的峰电流具有下列性质： ( 1 ) 厶正比于o + ； ( 2 ) l 和v 7 ”成正比。 峰电舸标为：e ，i ell2-罢【0780+in(警+ln譬)12anop 】 sn d 昂：昂嘞：_ 1 8 7 5 r t ，塑胁v 不可逆体系的峰电位具有如下性质： ( 1 ) 昂的大小与扫描速度有关，当进行还原反应时v 越大，昂越向负方向偏移。 反之，进行氧化反应时，v 越大，e 越向正方向偏移。在2 5 ( 2 时，扫描速率增大加倍， 已大约偏移3 0 m v ： 1 4 电住型醇传感器的研制厦有机聩农药的快速检测 ( 2 ) 墨越小，岛和e 口的偏差越大，其值与v 和c + 无关： ( 3 ) v 一定时，e 和巴无关。 5 我们的工作 由丁有机磷农药对胆碱酯酶的抑制是不可逆的，因此基于这类原理制备的酶传感器 一般只能一次性使用，成本太高。鉴于此我们提出了一种新型有机磷生物传感器。我们 选用h r p 修饰石墨电极为基础电极，在检测体系中，加入a l p 和它的底物3 吲哚氧基 磷酸酯( 3 q p ) ，它会在a l p 的催化作用f 水解并耦合最终放出h 2 0 2 ，h 2 0 2 又会被电极 表面的h r p 催化反应而引起电极电位的响应。当有机磷农药抻制该a l p 反应时，水解反 应的速率减小，导致了h 2 0 2 生成时间的延迟，该时间可以由电位一时间曲线测定，而h 2 0 2 生成时间的延迟与有机磷( 氨基甲酸酯) 农药浓度成正比。因此，可通过测定时间的变 化就可得到农药的含量。该传感器中的h r p 主要州于放大反鹿信号，增强检测灵敏度， ：q 辟z q 且q 务妁俐她 z g 骂z g 一且q 涔d + 2 h z 仉 zo ：! + s 邺：h 。q ：d s 邺 本实验利用多酶体系的协同催化作用，将反应信号放大，为检测微量农药残留奠定 的有效稳定的固定化和超微量h ：o ：的定量检测。而实现这两个关键技术必需做如下三个 电位型酶传感嚣的研制及有机磷农药的快速检测 灵敏的检测超微量h 2 0 2 必须深入了解h r p 的催化的最佳反应条件和动力学性质， 而采用a l p 抑制法检测有机磷农药也同样需要了解a l p 催化的最佳反、t 条件和动力学性 质，因此我们在实验的前期 作中对这两种酶的催化反应最佳条件和催化动力学进行了 较为深入的研究。 基底电极的选择对于实现酶的固定化也是非常重要的，而且必需了解不同基底电极 的电化学性质，在前期实验中我们也对不同基底电极( 如金电极，银电极，石墨电极， 碳棒电极等) 在不同体系溶液中的电化学行为进行了研究。 在选择基底电极的基础上我们还考查了实现酶固定化的不同固定方法。 我们在前期已经分别是对h r p 及a l p 动力学研究，金电极及修饰金电极在不同体 系中的电化学行为研究，银电极及修饰银电极在不同体系中的电化学行为研究。这些工 作为前期t 作，本论文不再论述，而石墨电极对h 2 0 2 的检测和电位型有机磷农药生物传 感器的研制，将分别在第二章和第三章介绍。 6 小结 本论文提出的电位型有机磷农药酶传感器，应用p o p d n a n o - a u 技术固定酶分子， 所形成的酶膜均匀牢固，可多次使用。利用多酶体系的协同催化作用，将反应信号放大， 为检测微最农药残留奠定了坚实基础。这种生物传感器设计新颖，经过网上检索，国内 外均没有报道，富有创新性，并有可靠的理论依据和扎实的前期工作基础，有望获得达 到国际先进水平的预期成果。 电位型酶传感器的研制及有机磷农药的快速检测 第2 章电位型酶传感器的制备及对h ：0 。的检测 如前面所述，实现微量h 2 0 ：的灵敏快速检测是研制有机磷农药生物传感器的关键步 骤。除此之外h 2 0 2 本身也是一种有毒的化学物质，不但具有很强的氧化性，还具有极强 的腐蚀性。它曾作为漂白剂、杀菌剂和防腐剂广泛地添加在食品中。但1 9 8 0 年人们发现 了它有致癌性，接着又发现它还能加速人体衰老，对丁：人体的危害性极大。因此世界许 多国家都出台强制性法规：食品加工过程中全面禁l e 使用h 2 0 2 或规定食品在出厂前，必 须要把h 2 0 2 成分全部分解掉或除掉，我国也在同一时期出台国家强制性标准与法规：食 品中( 包括食品成晶及保健食品) 不得有i - t 2 0 2 残留。但遗憾的是，直到目前为止，我国 还没有一种快速检测h 2 0 2 的标准方法。因此，灵敏检测微量h 2 0 2 对于加强食品安全同 样具有重要意义。 通常检测h 2 0 2 的方法是高锰酸钾法或碘量法。这两种方法均为滴定法，存在的一定 的局限性，如它只能进行常量或半微量的检测，而不能进行微量的检测。这就使得药品 的用量较大，同时造成药品的大量浪费。它的检测时间较长，操作较复杂，对药品的纯 度要求也较高，并且准确度较低。除此之外，多种物质对高锰酸钾滴定法存在干扰( 乙 酰苯胺、尿素和尿酸等有机物都能与高锰酸盐发生化学反应，因而影响高锰酸钾法测定 结果的准确性) ，而碘量法也容易产生误差，主要是空气氧化酸性碘化物溶液和碘自身的 挥发损失，所以现有的两种方法难以满足h ：o z 的快速灵敏检测。 生物传感器可根据h 2 0 2 在某种电极上所产生的电信号的大小来测定h 2 0 2 浓度，不 但检测灵敏，操作简单，费用低廉，并且受外界环境的影响也特别小，可望成为检测领 域一种理想的方法。 本实验以检测h 2 0 2 为核心完成了以下几方面工作： 1 基底电极种类的选择：分别选择直径为3 m m 和o 7 m m 的石墨电极和5 号和7 号 碳棒电极，并进行同定面积和不固定面积的比较通过测定标准曲线进行电极性能的比 较，结果表明石墨电极优于碳棒电极，圆柱电极优f # 状电极，直径为3 r a m 的电极优于 1 7 电位型酶传感器的研制度有机磷农药的快速检测 直径为o 7 m m 电极，特别是3 m m 圆盘石墨电极，其线性范围宽，响应斜率接近能斯特 响应斜率，可以作为检测h 2 0 2 的基底电极。 2 裸石墨电极对h 2 0 ：的响应：以裸石墨电极作为指示电极，研究其对h 2 0 2 的响应 现象。实验表明，裸石墨电极电位稳定迅速，对h 2 0 ：的响戍良好，可以作为检测过8 2 0 2 的基底电极。 3 不同方法固定h r p 修饰石墨电极的制备和对h ：o ：的检测：在这一部分中，我们 分别研究了用石墨电极，聚邻苯二胺( p o p d ) 修饰石墨电极，n a t i o n 修饰石墨电极为基 底电极并分别使用再生丝素包埋法，聚乙烯醇包埋法，壳聚糖包埋法，纳米金( n a n o - a u ) 静电吸附法等方法固定h r p 并对h 2 0 2 进行检测，考查了底物浓度，酸度，电解质溶液 种类等各种条件对检测h 2 0 2 的影响，并确定了最佳实验条件。 实验结果表明，h r p n a n o - a u p o p d 石墨电极检测h 2 0 2 的检测下限为8 8 2 1 0 4 m o l l ，线性范围为3 5 3 x1 0 _ 7 8 2 3 1 0 m o ll ，斜率为5 8 8 1 5 m v 。电位变化稳定 迅速，电极制作方法简单，可以进一步作为制作检测有机磷农药传感器的基础电极。而 h p , p n a n o - a u 半胱氨酸小a f i o n 石墨电极检测h 2 0 2 的检测下限为8 8 2 x 1 0 9 m o l l , 线性范 围为3 5 3 x1 0 8 8 8 2 x 1 0 一m o l l ，检测下限很低，但制作方法较为繁琐，可以作为一种 灵敏的检测h 2 0 z 的方法。 1 8 电位型酶传感器的研制段有机磷农药的快速检测 实验漂毽 z o s 邺：k v n n 一n h 2 ：一：。 纵 2 实验部分 2 1 仪器 m 璇- 3 徽辊传多功能离予分精器( 汪苏江势电分橱坟器蠢黻公司) ；8 5 - - 2 c 磁力藤 热搅拌器( 巩义市英峪予华仪器厂) ；p h s 3 c 型精密酸度计( 上海精密分析仪器公司) ； s a r t o r i u sb s 2 1 0 s 型分析天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公嘲) ；l o u l 微掇移液器( 临 海常华威分橱铰嚣有陵公司) ；麓纯承系统( h u m a nl i p 9 0 0 ，h a m a n 公司，韩国) ；h r p 修饰石墨电极作为指示电极或t 作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电 掇。 1 9 电位型酶传感嚣的研制威有机磷农药的快速栓测 2 。2 试剂 缣根过氧纯物酶( h r p ，e c1 11 1 7 ，r z 3 ，2 5 0 u r a g ，籀对分子震重为4 4 0 0 0 9 t o o l ， 上海金璐贸易材限公司，1 0 m g m l ，p h = 7 4 磷酸盐缓冲溶液配制) ；邻苯二胺( 大津市 辩整敞化学试剡开发中心，0 5 9 l ，o ，l m o l l k n 0 3 溶液配制) ；魄0 2 溶液( 的) ( 天津 市科密欧纯学试潮开发中心) ；k n o j ( o i m o y l ) ，氯金酸，柠檬酸三铺，磷酸二氢镡， 磷酸一氢钠。 辑用试剂均为分橱纯；掰蠢潘液配制用水均为超纯承。 在本章中除非特铡说明，所用溶液均兔上磷所述浓度。 2 3 测定装置 参毙电校 指示电掇 撼箨子 闵2 2 电位型酶传感器对h 2 0 2 的捡测实验装鼠示意图 2 4 实验方法 在小烧杯中加入一定量的o p d 溶液作为底物溶液。组装好指示电极和参比电极( 饱 和甘汞电极) ，待电位示数稳怒j 茜，连续定量加入一定浓度的h 2 0 2 标准溶液，测定电位 鹣变佬毽。彗土壤偿的变诧瑾对薹薹必2 浓度豹对数箨强，其塞绫郫分露舞竣测h 2 0 2 瓣标准 曲线。 3 结果与讨论 3 + 1 基底电蔽的选择 通过前期泼骚，发现使用斑属电极( 金电极，铂电极) 作为基底电极，电位稳定时 翔较，覆虽对f i f o z 嚷应没蠢瓣律。因燕本安疆分捌建建纛经为3 糊帮0 7m m 毂石 2 0 电位型酶传感嚣的研制穗有机磷农药的快遣检测 蹩电掇和5 号釉7 号羰捧电援俸为基底电擞，势避孬固定露织襄不固定蕊积的比较，测 定标准曲线。寓验结果如图4 , 3 和表2 1 所示。 i o g c h 2 0 2 ( m o l l ) 一- - 3 r a m 心盘石墨电极 - - 6 m3 r a m 撞藏石墨电撮 一i 一0 7 r a m 圆盘石墨电瑕 一卜0 ，7 m m 柱状石墨电极 一一5 碍圆盘碳棒电极 一一5 号桂状碳棒电掇 一 一7 霹舞盘穰棒毫授 一_ 7 峰柱状碳棒电撮 图2 。3 基底电扳的选择 裹2 。1 攀麓类壑基底藏檄肆h ：g ：辁浏秘影响 从实验结聚可以看山，石擞电极优于碳棒电极，圆盘电极优于柱状电极，随径为3 m m 姻电极优于囊径为o ，7 m m 电投。特别是3 r a m 圜盘石墨电板，其线性范围宽，响应斜率 接近能新特瓣斑斜率，可疆作为捡瓣h 2 0 ：的蒸底电极。 因此，我们选择3 m m 圆搬石墨电极作为检测h 2 0 2 的基底电极，以f 嶷验如不特别 说明都延指3 r a m 鳗盘石墨电极。 3 2 石墨电极对h t 如的响症 实验发现，h 2 0 2 会在石爨屯极表面发生反扁而导致电极电位的变化，并且电位变化 bh z o z 豹浓度的对数在一定浓度范强能呈线性关系。因此，石墨电极具有制作h 2 0 2 投 耋言 伽 啪 即 。 锄 瞄 e | 皇竺型竺堡垒璺竺竺塑墨童! 堡垒堑竺堡垒垒型 传感器的先决条件。下面将讨论石墨电极直接检测h 2 0 2 的实验条件和标准曲线。 3 2 1k n 0 3 浓度的选择 分别选用浓度为0 0 5 ，o 1 0 ，0 1 5 ，0 2 0 m o l l 的k n 0 3 溶液作为电解质溶液，以石 墨电极作为指示电极检测过氧化氢，实验结果如图2 4 和表2 2 所示。 1 0 9 c | h 2 0 一( m o m 图2 4k n 0 ，浓度的选择 切删帅哪 图2 5 n o ，酸度的选择 表2 2k n 0 ，浓度对裸石墨电极检测h 2 0 2 的影响 从实验结果可以看出在0 1 0 m o l i k n o ，溶液中检测h 2 0 2 线性范围最宽 ( 3 5 3 x 1 0 4 8 0 5 x l f f l m o l l ) ，斜率最大( 6 3 1 0 0 m v ) ，因此选择该浓度为检测h 2 0 2 的最 佳浓度。 3 2 2k n 0 3 酸度的选择 分别选用p h 为4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 的k n 0 3 溶液作为电解质溶液，以石墨电极 作为指示电极检测过氧化氢，实验结果如图2 5 和表2 3 所示。 表2 3p h 值对裸石墨电极检测h 2 0 2 的影响 电位型酶传感器的研制及有机磷农药的快速检测 从实验结果可以看出，酸度对实验结果影响不大，中性环境下检测结果较好。因此 实验所用k n o ，可直接用超纯水配制，而不必调节酸度。 3 2 3 石墨电极在k n o ，溶液中对h 2 0 2 的检测标准曲线 以石墨电极作为指示电极在k n o ，溶液中检测h 2 0 2 ，结果如图2 6 - 2 9 所示。 u m m 图2 6 石墨电极在i ( n 0 ，中的时间响应曲线 i r a i n 图2 7 石墨电极对k i 1 0 3 中h 2 0 2 的响应 ； 匕2 孽爱 i o o c i h 2 0 2 】，( m o l i ) 1 0 0 c ! 鸭o , l f r r , o a ) 图2 8 平衡电位与h 2 0 2 浓度关系曲线 图2 9 石墨电板检测h 2 0 2 的标准曲线 从图2 6 2 9 中可以看出，在k n 0 3 溶液中，用石墨电极直接检测h 2 0 2 检测下限为 3 5 3 1 0 4 m o l l ，线性范围为8 8 2 1 0 4 8 0 5 1 0 m o l l ，斜率为5 8 8 4 m v 。斜率能达 到能斯特响应的理论斜率，但检测下限太高不适合离接用于微量h 2 0 2 的分析。但是从 未