（有机化学专业论文）吲哚满二酮类化合物的分子设计、合成及其对ahas抑制活性研究.pdf

摘要 摘要 乙酰羟酸合成酶( a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ，a h a s ) 是催化植物和微生物 体内支链氨基酸生物合成过程的第一个关键酶，通过抑制该酶的活性可以阻断 支链氨基酸生物合成，从而达到除草目的并且对人畜无害，因而a h a s 成为设 计新颖绿色除草剂的理想作用靶点。 本课题组前期基于a h a s 的晶体结构，通过计算机辅助设计和虚拟筛选发现 了一些新结构特征的a h a s 抑制剂，为新的分子设计提供了基础。本论文在此基 础上进一步设计合成了七个系列共计6 6 个吲哚满二酮类化合物( 其中新化合物 2 4 个) ，其结构经过1 hn m r 、i r 、m s 和元素分析确认，部分代表性化合物单晶 结构通过x 射线单晶衍射分析得到确证。生物测定结果表明，吲哚满二酮类化 合物在体外和体内对a h a s 都表现出一定的抑制活性，是一类未见文献报道的结 构新型的a h a s 抑制剂，相关结果有望为进一步设计发现更高活性的化合物提供 参考。 为了更进一步的研究结构活性关系，利用c o m f a 方法选取了部分代表性吲 哚满二酮类化合物，对其进行结构优化，得到最低能量构象，研究了三维定量 构效关系( 3 d q s a r ) 。分析结果发现，化合物上电荷分布以及各取代基空间效 应的差异都会对活性产生影响，这将为今后的分子设计和结构优化工作提供理 论上的指导和帮助。 关键词：新型a h a s 抑制剂，吲哚满二酮类化合物，合成，生物活性，3 d q s a r a b s t r a c t _ _ 一 a b s t r a c t a h as ( a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ) i st h ef i r s tk e ye n z y m ei n v o l v e di nt h e b i o s y n t h e s i so ft h eb r a n c h e d c h a i na m i n oa c i d sf o rp l a n t sa n dm i c r o 。o r g a n i s m s i n h i b i t i o no fa h a sw i l lb l o c kt h eb i o s y n t h e s i so fb r a n c h e d c h a i na m i n oa c i d s ，w h i c h w i l li n h i b i tt h eg r o w t ho fw e e d si nf a r m l a n dw h i l ef r i e n d l yt om a m m a l s t h u sa h a s h a sb e c o m et ob ea ni d e a lt a r g e tt od e s i g ng r e e nh e r b i c i d e b a s e do nt h ec r y s t a ls t r u c t u r eo fa h a se n z y m e ，o u rg r o u pp r e v i o u s l y d i s c o v e r e ds o m en e wa h a si n h i b i t o r sv i ac o m p u t a t i o n a lv i r t u a ls c r e e n i n g ，w h i c h h a v ep r o v i d e dn e wb a s i st od e s i g nn o v e li n h i b i t o r s i nt h i st h e s i s ，7s e r i e sc o n t a i n i n g 6 6c o m p o u n d so fi s a t i nd e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e da n da l lc o m p o u n d sh a v eb e e n c h a r a c t e r i z e db y1 hn m r ，乙m sa n de l e m e n t a la n a l y s e s ，a m o n gw h i c h2 4 c o m p o u n d sa r en e wo n e s s o m eo ft h e mh a v eb e e nf u r t h e rc o n f i r m e db yx r a y d i f f r a c t i o na n a l y s i s a l lc o m p o u n d sw e r es c r e e n e df o ra h a s nv i t r oi n h i b i t i o na n d 切访，dh e r b i c i d a la c t i v i t i e s t h ep r e l i m i n a r yb i o a s s a yi n d i c a t e dt h a tm a n yc o m p o u n d s p o s s e s sh e r b i c i d a la c t i v i t yt os o m ee x t e n t t h i sd i s c o v e r yp r o v i d e sm e a n i n g f u lc l u e s f o rf u r t h e rd e s i g na n ds y n t h e s i so fn o v e lc o m p o u n d sw i t he n h a n c e da c t i v i t y w i t ht y p i c a l3 d q s a rt e c h n i q u e ，c o m f aw a sa p p l i e dt og i v eas y s t e m a t i c r e s e a r c ho nt h r e ed i m e n s i o n a lq u a n t i t a t i v es t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p so fi s a t i n d e r i v a t i v e s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec h a r g ed i s t r i b u t i o na sw e l la ss t e r i ce f f e c t h a si m p a c to i lb i o a c t i v i t y ，w h i c hw i l lp r o v i d et h e o r e t i c a lg u i d a n c ea n da s s i s t a n c ei n t h ef u t u r em o l e c u l a rd e s i g na n ds t r u c t u r a lo p t i m i z a t i o n k e y w o r d s ：n o v e la h a si n h i b i t o r , i s a t i nd e r i v a t i v e s ，s y n t h e s i s ，b i o l o g i c a la c t i v i t y , 3 d - q s a r n 南开大学学位论文电子版授权使用协议 ( 请将此协议书装订于论文首页) 论文吗悚熵二嘲瓣蝴蜥寻趟、鲥菇4 惮 l 触i 怖本人在 南开大学工作和学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩。 本人系本作品的唯一作者( 第一作者) ，即著作权人。现本人同意将本作品收 录于“南开大学博硕士学位论文全文数据库”。本人承诺：已提交的学位论文电子 版与印刷版论文的内容一致，如因不同而引起学术声誉上的损失由本人自负。 本人完全了解直匠盔堂图盘鱼苤王堡在! 焦用堂笪途塞的筐理壶选! 同意 南开大学图书馆在下述范围内免费使用本人作品的电子版： 本作品呈交当年，在校园网上提供论文目录检索、文摘浏览以及论文全文部分 浏览服务( 论文前1 6 页) 。公开级学位论文全文电子版于提交1 年后，在校园网上允 许读者浏览并下载全文。 注：本协议书对于“非公开学位论文”在保密期限过后同样适用。 院系所名称：也喾喾阮 作者签名： 谭裔牺 学号： 2 l2 舌0 6 0 弓 日期：? 叼年5 月2 9 日 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存 论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务； 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术 活动。 学位敝作者签名啤缶南 2 c 砷年多月) 8 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者虢诨盗起 2 聊年芗月一2 8 日 第一章前言 第一章前言 进入二十一世纪以来，随着世界人口的不断增长，粮食问题依然是人类面 临的一个巨大挑战，粮食对人类的生存和发展具有极其重要的意义。在世界耕 地面积有限的情况下，世界人口总量仍然持续增长，全球粮食供应愈来愈紧张， 这样就给农业的发展带来巨大的压力，因此全世界都在呼吁更加重视提高现有 耕地和单位面积的产量。提高农业单位面积产量的举措是多方面的，农药的使 用就是其重要的措施之一。使用农药可以节省劳力，降低农产品成本，提高经 济效益。农药在植物生长、调节、收获及储存、保鲜、运输、加工等过程中均 起到重要的作用【l j 。 农药在对现代农业生产做出了巨大贡献促进社会的发展与进步的同时，人 类赖以生存的自然环境却由于一些传统农药环境毒性、安全性及抗性等方面存 在的问题引起了严重后果。随着人们对环境保护重要性认识的日益加深，对农 药的要求将更为严格。未来的农药将是微毒、超高效的、环境友好的绿色农药， 它的主要作用是影响、控制和调节各种有害生物的生长繁殖过程，使有害生物 得到抑制，又不对人类健康产生危害，不破坏生态平衡。因此，最大限度的保 障粮食同时最低程度的降低对环境带来负面影响已经成为刻不容缓的历史任 务，使用超高效、微毒、环保型的绿色农药来增加粮食产量就成为一个理想的 选择。 在对新药物( 农药) 的开发研制过程经历了从随机合成进行化合物的生物 筛选，到生物合理分子设计，达到了一次质的飞跃。现在，随着相关学科和一 些新技术的发展，如分子生物学、细胞生物学、基因组学、生物信息学、组合 化学和高通量筛选等都给农药设计提供了很好的借鉴知识和技术，随着越来越 多的生物大分子三维结构的阐明，采用各种理论计算方法和分子图形模拟技术， 在计算机辅助下进行生物活性分子设计，大大提高了新药研发工作筛选命中率， 已经成为当前国际上药物研究中最活跃的前沿领域之一。 第一章前言 第一节除草剂靶酶乙酰羟酸合成酶( a h a s ) 及其抑制剂的研究进展 植物体和微生物( 如细菌) 体内，支链氨基酸缬氨酸( v - a 1 ) 、亮氨酸( l e u ) 及异亮氨酸( 1 i e ) 的生物合成是至关重要的生命过程。对此过程的抑制，将导 致植物生长严重受损直至死亡。植物体内支链氨基酸合成路径( 图1 1 ) 中包含 几个特殊的反应和酶。很多除草剂品种正是通过对这一路径中酶的抑制而发挥 除草作用的。 ip m i ip m d c h 3 h c c h 3 h o e c o ( ) - hn h ， l i 。 一 h 3 c - - c i - - c i c o o t d f苏氨酸 0 。0 0 l i 一 一i i 一 一 “ 一h 3 c c c o oh 3 c c c o o h 3 c h 2 c c ii c o d 丙酮酸i三oh酮30 c h 酸) ， | i c = o e o o - 2 - 酮异己酸 弘h 一6 c h 刊3 。 c h 2 h 3 n - - c - - c o o h 亮氨酸 吲邺罩 冈 l _ _ _ 一 订 l - _ _ - _ _ j c = o i c o o 2 酮异戊酸 lt a | g h 3 h g c h 3 h ，n c c o o 。 i h 缬氨酸 图1 1 支链氨基酸的生物合成路径 2 2 乙酰2 c 羟o 基0j 一酸 l 葶h h ：3 h o - - c , - - c h 3 l h 0 一c h i 卢二矗墨憾戊酸 苫h h ：3 h o - - c - - c h 3 l c io o _ l 2 - 酮。蚕主基戊酸 h - - c - - c h 3 +i h 3 n - - c l c 0 0 第一章前言 此路径中，前3 步反应分别需要3 种酶来催化：乙酰羟酸合成酶 ( a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ，a h a s ) 、酮醇酸还原异构酶( k e t o l - a c i d r e d u c t o i s o m e r a s e ，k a r i ) 以及二羟基酸脱水酶( d e h y d o x ya c i dd e h y d r a t a s e ， d h a d ) 。这些酶都可以作为除草剂的靶标，通过抑制酶的活性中断支链氨基酸 的合成使植物死亡，达到除草目的。 迄今为止，抑制支链氨基酸生物合成的除草剂是开发较为成功的一类抑制 剂，其中的乙酰羟酸合成酶( a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ，a h a s ) 是支链氨基酸生 物合成中的第一个酬2 1 ，哺乳动物体内缺乏对这几种氨基酸的生物合成能力，因 此抑制剂在阻断支链氨基酸生物合成起到杀灭杂草作用的同时对人畜无害，因 而a h a s 成为设计新颖绿色除草剂的理想作用靶点。酰脲类、咪唑啉酮类、磺 酰胺类、嘧啶水杨酸类等除草剂靶向a h a s 的除草剂在农业生产中的广泛应用， 从实践上证明了支链氨基酸的生物合成途径是基于靶标除草剂分子设计的有效 靶点【3 】。我们希望利用生物合理分子设计方法，基于a h a s 的晶体结构，用分 子对接的方法进行计算机虚拟筛选，设计并合成出一类新结构特征的针对靶酶 a h a s 的抑制剂，并希望通过结构优化得到新型除草剂品种或新的先导化合物。 1 1 1 靶酶a h a s 的确认 2 0 世纪7 0 年代初，美国d u p o n t 公司科学家l e v i t tg 博士在研究中偶然发现， 磺酰脲结构的化合物具有微弱的植物生长抑制活性【4 】，这一发现引起了研究人员 的兴趣，因而对该类结构进行了改进和修饰，继而展开了对磺酰脲类化合物的 大规模研究开发，很快成功开发了第一个商品化磺酰脲类除草剂氯磺隆和随后 的甲磺隆【5 “】，其用量以g h a 1 计，大大打破了常规除草剂的用量。氯磺隆可以 有效除掉小麦田中的杂草，而小麦本身对氯磺隆有先天抗性不受影响，并且磺 酰脲类对温血动物基本无毒。与传统除草剂相比，该类除草剂具有无法比拟的 优越条件，磺酰脲除草剂的问世开辟了世界农药研究的新里程碑。 尽管磺酰脲具有超高效、对哺乳动物低毒的优点，但在其问世后的最初一 段时期，人们并没有弄清它们在植物体内的作用位点。直到1 9 8 4 年，r a 矿通过 研究才发现，氯磺隆是通过抑制豌豆体内支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨 酸的生物合成而达到除草效果的。与此同时，c h a l e f f 等【8 】进一步发现两种磺酰 脲类除草剂的作用位点是高等植物体内的乙酰乳酸合成酶( a l s ) ；l a r o s s a 和 s c h l o s s 等 9 】也发现甲嘧磺隆可以强烈抑制细菌& t y p h i m u r i u m 体内的a l s ，人们 3 第一章前言 终于通过实验手段弄清磺酰脲除草剂是通过抑制a h a s ，阻碍了支链氨基酸的生 物合成进而达到除草效果的。在这里值得一提的是，早期英美等国家研究者将 该靶酶简称为a l s ，后来在该领域极具权威的研究课题组一澳大利亚r o n a l dg d u g g l e b y 博士研究组提出a h a s 说法，本课题组由于一直跟他们有密切合作关 系，故下面均用a h a s 表示该靶酶。 1 1 2a h a s 的生化功能及性质简介 a h a s 属于依赖氯化硫胺焦磷酸素t h d p ( 以前曾被称为t p p ) 酶的家族【2 ，l o 】， 它催化支链氨基酸的生物合成。如同其它需要t h d p 的酶一样，它催化一个普通 的起始步骤，不可逆的丙酮酸脱羧后连接到羟乙基硫胺焦磷酸素上，反应中间 体与另一个分子的丙酮酸反应缩合生成乙酰乳酸，或是与一分子的2 酮丁酸缩合 生成2 乙酰2 羟基丁酸。a h a s 涉及的生物化学反应如图1 1 所示，a h a s 是整个 过程中的第一个酶，催化两个平行的反应。反应中间体经过酮醇酸还原异构酶 k a r i 进行还原异构化，再经过双羟酸脱水酶d h 催化脱水，分别得到缬氨酸和异 亮氨酸的前体，最后经转氨酶t a 实现缬氨酸和异亮氨酸的生物合成；对于亮氨 酸，则是经d h 脱水以后，中间体2 一酮异戊酸依次经2 异丙基苹果酸合成酶i p m s ， 异丙基苹果酸异构酶i p m i ，3 异丙基苹果酸脱氢酶i p m d 的生物催化生成亮氨 酸。在这个过程中，需要有t h d p 、f a d ( 黄素腺嘌呤二核苷酸，f l a v i na d e n i n e d i n u c l e o t i d e ) 署 f l m 9 2 + 三种辅助因子的配合作用才可以实现。事实上，根据其功 能的不同生物体内存在两种a h a s 。一般情况下提及的a h a s 就是本文所指的催 化支链氨基酸生物合成的酶，另外一种具有分解代谢的功能，只能催化乙酰乳 酸的生物合成，生成的乙酰乳酸经过乙酰乳酸脱羧酶，乙酰甲基元醇还原酶催 化的生物化学反应，生成2 ，3 丁二醇。为了区别起见，后者被称为a l s 。 具有生物合成功能的a h a s 在细菌、真菌、海藻和植物中都有发现。这些 生命体可以通过自身合成支链氨基酸，不同生物源的a h a s 的亚基组成的四级 结构各异，大部分天然a h a s 都由催化亚基和调控亚基组成。一般情况下，催 化亚基分子量相对较大，而调控亚基分子量较小，但这也不是绝对的。根据 s d s p a g e 、羧甲基化和凝胶过滤、结合动力学以及放射性标记等手段的研究 1 1 1 3 】，可以得出结论：a h a s 同功酶为眈b 2 四级结构，含有催化亚基和调控亚 基各两个。细菌的调控亚基是通过授予酶对最终产物的反馈抑制作用和充分增 加酶的活性来控制a h a s 酶活性。真菌只有一个a l i a s 同功酶，在被克隆基因 4 第一章前言 的下游没有发现调控亚基基因。在酵母基因组序列分析中发现了与细菌a h a s 调控亚基相似的基因，通过功能分析和生物化学性质的研究，认为这是酵母 a h a s 调控亚基的基因。 对于高等植物，由于人们发现了磺酰脲类除草剂的作用靶标是植物体内的 a h a s ，在这方面开展的研究更多一些。m a z u r 等 1 4 a 首次用酵母a h a s 基因i l v 2 做异种探针，从拟南芥和烟草中分别得到了植物a h a s 基因。此后，从油菜、 玉米、棉花等体内相继确定了a h a s 的存在，从植物基因推演出来的a h a s 氨 基酸序列同源性较高，除了n 末端转移肽序列外，与酵母a h a s 的催化亚基的 同源性也很好。尽管研究较多，因为酶的产量很低，很少有关于从自然界中提 纯的植物酶的报道。和细菌催化亚基对应的几个a h a s 基因已经被克隆，并通 过大肠杆菌进行了超表达。这些重组的植物a h a s 比活性较低，是二聚体，对 缬氨酸抑制不敏感。这些酶缺少调控基因，与天然酶有些不同。h e r s h e y e l 4 b 通过 与有细菌调控亚基的氨基酸序列的比较识别了植物的调控基因，植物调控亚基 分子量大约是细菌调控亚基的两倍。植物调控亚基的加入，使催化亚基的比活 性和稳定性都提高了。与细菌不同的是，来自不同植物种属的亚基之间有交叉 反应，比如烟草p l u m b a g i n i f o l i a 的调控亚基可以促进拟南芥a t h a l i a n a 催化 亚基的活性。科学家也克隆了藻类a h a s 的基因，与高等植物有所不同，有些 情况下这些基因位于质体当中。根据基因组完整的核苷酸系列，人们也识别了 其a h a s 的调控亚基基因 1 4 引。c h i p m a n 1 5 】和d u g g l e b y 2 】等曾经对不同生物源 a h a s 的催化亚基的氨基酸序列进行了比较，发现了比较明显的同源性，只是来 自酵母和植物的几个残基序列在n 端相对有所增长。 对于动物，尽管曾经克隆过与表达细菌a h a s 催化单元的基因有同源性的 人类类似基因，然而在表达出蛋白质后，没有检测到a h a s 应有的活性【1 6 】，加 上哺乳动物类必须从食物当中摄取支链氨基酸以维持生命，无法自身合成这些 必须成分的事实，基本上可以认为动物体内不存在a h a s 。这也进一步说明了以 a h a s 为作用靶点的除草剂对哺乳动物相对低毒友好的原因所在。 1 1 3a h a s 晶体及复合物结构介绍 自从磺酰脲类作用靶标a h a s 确定后，杜邦公司就同普林斯顿大学合作， 试图得到a h a si i 的单晶结构以及其x 一射线衍射数据，以期阐明其作用方式并 进行基于受体结构的新抑制剂设计，但是未能成功。在此后的近2 0 年间，人们 5 第章前言 对a l i a s 结构的认识，只是通过分子模拟，构建了一些同源模建的结构对其作 用方式和结构特征进行r 一些解释。 2 0 0 2 年，澳太利亚昆上兰大学生物化学与分子生物学系r o n a l dgd u g g l e b y 博上研究组经过五年多1 ；懈的努力，终于首次在世界上得了酵母sc e r e v t s i a e a l i a s 纯酶晶体结构旧4 l 。在此基础上2 0 0 3 年，d u g g l e b y 和p a n g 等1 1 9 1 义报 道了磺酰脲除草剂氯嘧磺隆一酵母a h a s 的复合物( 图1 2 ) 。总体来看，酵母 a h a s 结构与通过同源模建得到的结构很相似，f a d 与t h d p 相距太远不足以 起作用。 圈l j t h e o v e r a l l f o l d o f a t a h a s ( a ) t h e t e t r a m e n e $ 1 a l c t x a e w i t he a c h m o n o m e rc o l o r e ds o p m a t e l y ( b ) as i n g l es u b 帅l t 第一章前言 2 0 0 6 年，d u g g l e b y $ 铂j e n n i f e r 等2 明又报道了五个磺酰脲类除草剂和一个咪唑 啉酮类除草剂与拟南芥a h a s 的复合物晶体结构。拟南芥a h a s 的结构是一个 四聚体( 图1 3 a ) ，由四个相同的催化亚基单体组成( 图1 3 - b ) ，这些单体与酵母 的结构类似。 1 1 4 主要a l i a s 抑制剂品种 2 0 世纪7 0 年代初，美国d u p o n t 公司科学家l e v i t t 博士在研究中偶然发现，磺 酰脲结构的化合物1 具有微弱的植物生长抑制活性【4 】。这一发现引起了研究人员 的兴趣，因而对该类结构进行了改进和修饰，1 9 7 5 年，化合物2 得以合成，以2 0 k g h a 1 的剂量施用后呈现出很高的除草活性。他们深受鼓舞，继而展开了对磺酰 脲类化合物的大规模研究开发，很快成功开发了第一个商品化磺酰脲类除草剂 氯磺隆3 和随后的甲磺隆4 【5 一，其用量以g 1 1 a - 1 计，大大打破了常规除草剂的用量。 氯磺隆可以有效除掉小麦田中的杂草，而小麦本身对氯磺隆有先天抗性却不受 影响，并且磺酰脲类对温血动物基本无毒。与传统除草剂相比，该类除草剂具 有无法比拟的优越条件，毫不夸张地说，磺酰脲除草剂的问世开辟了世界农药 研究的新里程碑。从此，对于磺酰脲除草剂的研究开发在全世界范围内掀起了 一股热潮，各国多家农药公司和科研机构在该领域的竞争角逐近乎白热化。在 近2 0 年的时间里，各国己合成了6 万多个不同结构的新磺酰脲类化合物，申请的 专利近4 0 0 篇，所涉及的化学结构则以千万计，3 0 余个磺酰脲商品化品种在美、 日、瑞士等国相继问世 14 1 。 9 s 0 2 n h c o n h 岔c n c h 3 9 s 0 2 n h c o n h 2 o h 3 2 n 岁各c o s o c c s o n h c o n h - n 2 房 卜s c 七_ 3 氯磺隆 c h 3 7 n h c o n h | n 4 甲磺隆 h h 掣c 第一章前言 本课题组为了更加系统全面的研究磺酰脲类构效关系，发现高活性新颖结 构，采取了与国外众多公司不同的优化策略，即在保持最佳芳环不变的前提下， 对杂环进行修饰。自1 9 9 0 年以来，已经合成了新型磺酰脲结构近千个，均进行 了室内除草活性的测定工作。1 9 9 2 1 9 9 4 年【2 l 2 2 间，发现了两个杂环为单取代的 新磺酰脲化合物也表现出了与国外品种氯磺隆同样优异的超高效除草活性。它 们分别被命名为单嘧磺隆( # 9 2 8 2 5 ) 、单嘧磺酯( # 9 4 8 2 7 ) 。单嘧磺隆作为我 国第一个具有自主知识产权的创制除草剂新品种，已纳入科学技术部十五攻关 项目( 2 0 0 1 b a 3 0 8 a 0 1 0 4 ) 进行了产业化阶段的工作，填补了我国谷田除草剂市 场的空白。单嘧磺酯也已完成了产业化的阶段( 2 0 0 1 b a 3 0 8 a 0 2 0 6 ) ，成为另一 个优秀的除草剂品种。这些发现对l e v i t t 的磺酰脲活性结构理论进行了修正完善， 填补了国内外磺酰脲基础研究和除草剂应用领域的空白。 p 0 2 ，c h 3 9 s 0 2 n h c o n h 麒n _ _ v o c h 3 ，c h 3 s 0 2 洲c o 洲n ) = = 几乎与磺酰脲类同时问世，由美国氰胺公司推出的咪唑啉酮类【2 引，如灭草 烟、灭草喹等也表现出了与磺酰脲除草剂相似的高效、低毒、对环境友好的特 征。在用量上，咪唑啉酮类的剂量大约比磺酰脲高一个数量级左右。这一类除 草剂的发明者m a r i n u sl 博士也于1 9 9 3 年获得了与l e v i t t 同样的殊荣。经研究发 现，咪唑啉酮类的作用位点也是a h a s 1 4 1 。由于磺酰脲和咪唑啉酮类除草剂显示 出如此诱人的应用前景，新颖结构的a h a s 抑制剂的研究和开发也成为热点。人 们将磺酰脲桥重排发现三唑嘧啶磺酰胺类化合物阱】也是很好的a h a s 抑制剂。 弋n 麓t c o o 猕h 吼，2 o 灭草隆 r 1 嘧啶水杨酸类除草剂是近年来开发成功的一类新型a j - l a s 抑制剂，此类除草 8 第一章前言 剂以其超高效、广谱、低毒、低残留、高选择性和良好的环境相容性，而备受 关注。其中最具代表性的是日本组合化学公司开发的稻田稗草特效除草剂 k i h 2 2 0 2 3 、k i h 2 6 1 2 7 、k i h 2 2 0 3 1 。从结构式可以看出，这三个农药分子都含有 二甲氧基嘧啶基团，又经大量的构效关系研究证明：二甲氧基嘧啶类化合物在 嘧啶水杨酸类化合物中具有最高的除草活性2 5 1 。 h l ( i h 2 6 1 2 7 h 3 h 3 csoona n s 弋 n 弋 o c h 3 k i h 2 2 0 2 3 k i h 2 2 0 3 1 1 1 5a h a s 抑制剂的作用机理研究 a h a s 被抑制是一个复杂的过程。在细菌的三种同功酶中，a h a si i 对除草 剂最为敏感，但仍然比植物的a h a s 敏感性要差些。磺酰脲憾从n m 到l x m ) l 匕 咪唑啉酮( 墨从n m 到l x m ) 的抑制要更强一些。a h a s 的抑制是一个依赖于时 间的、两相的过程。初始状态是一个微弱的抑制，缓慢转化成一个最终稳定的 状态，这时的抑制很强烈【9 】。初始抑制、终态抑制以及转化的速率常数都依赖于 抑制剂的浓度。根据定点突变的一些结果，人们认为磺酰脲类和咪唑啉酮类和 a h a s 的结合部位不同，但有部分交叉。 人们基于除草剂的抑制认为a h a s 抑制动力学是可逆的。有报道【2 6 】指出， 通过凝胶过滤法( g e lf i l t r a t i o n ) 和平衡透析( e q u i l i b r i u md i a l y s i s ) 可以将抑制剂分离 出来，但对于此后酶是否恢复活性存在争议。 9 第一章前言 第二节基于a h a s 靶酶结构的新颖抑制剂的设计 1 2 1 基于靶标结构的药物设计 1 8 9 4 年，e m i lf i s c h e r 提出了药物作用的“锁钥原理”，即药物作用于体内 特定部位有如锁和钥匙的关系。随着生物技术、组合化学、计算机科学以及分 子结构测定等多项新技术在药物研发过程中的应用，新药的研发过程发生了根 本性变化。近年来，应用各种理论计算方法和分子模拟技术，进行计算机辅助 药物设计( c o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) ，已成为国际上十分活跃的研究 领域。 先导药物设计目的在于发现新结构类型药物，克服已知药物的缺点，例如， 耐药性，各种副作用等等。由于生物的生存竞争和进化，已知药物会不断地出 现耐药性，许多药物被逐渐淘汰，同时还会不断出现新的病种。因此，先导药 物设计是一项永久的研究课题。对于药物先导化合物的随机筛选效率极其低下 的问题，人们将合理药物设计方法( r a t i o n a ld r u gd e s i g n ) 引入到药物先导结构 发现中，从而大大提高了发现新药的概率。在此过程中，人们发展了很多药物 设计的方法，如定量构效关系( q u a n t i t a t i v es t r u c t u r ea c t i v i t yr d a t i o n s h i p ，q s a r ) 和三维定量构效关系( 3 d q s a r ) 方法、三维药效基团模建、数据库搜寻以及 全新药物设计( d en o v od r u gd e s i g n ) 等【2 7 , 2 8 】。 生物合理药物分子设计方法的提出，建立在多种技术的发展使得人们对受 体结构了解不断加深，并且能够直观地观察受体相互作用的基础之上。其中x 一 射线晶体学、多维核磁共振技术、基因重组、定位诱导突变等技术是了解受体 结构及其配体相互作用的重要技术手段，而分子图形学则为药物学家更直观了 解这种相互作用提供了技术支持。根据人们对药物受体或受体相互作用信息的 了解程度，或药物学家研究的角度不同，药物分子设计分为未知受体结构药物 分子设计和基于靶标结构的药物分子设计( s t r u c t u r e - b a s e dd r u gd e s i g n ，s b d d ) ， 而后者极具发展潜力，有人预言，未来的药物将从组合化学与s b d d 的相结合 中产生。 基于靶标分子结构的药物设计指的是根据生物大分子靶标及相应的配体靶 标复合物三维结构获得的信息来设计新颖药物【2 9 1 。其基本过程是： 1 0 第一章前言 ( 1 ) 确定药物作用的靶标分子： ( 2 ) 对靶标分子用生物技术手段加以分离纯化，t ( 3 ) 确定靶标分子的三维结构以及依据相关理论或经验提出的一系列 假定的配体与靶标分子复合物的三维结构； ( 4 ) 依据这些结构信息，利用相关的计算机程序和法则模拟出最佳的配 体结构模型； ( 5 ) 合成出这些模拟出来的结构，进行活性测试，如果对测试结果感到 满意，则进行后面的药代动力学、毒理学、临床实验等研究，如 果对结果不满意，则重复以上过程，直至满意为止。 1 2 2 基于a h a s 靶酶结构的新颖抑制剂的设计 本课题组与澳大利亚昆士兰大学合作，获得了具有自主知识产权的单嘧 磺隆、单嘧磺酯与拟南芥a h a s 的复合物【3 2 a ，这为基于靶酶结构设计新颖 a h a s 抑制剂提供了基础。前期利用酵母a h a s 同氯嘧磺隆c e 的复合物结构 ( p d b 代号1 n o h ，分辨率2 8a ) 和拟南芥a h a s 同c e 的复合物( p d b 代号1 y b h ， 分辨率2 5a ) ，通过d o c k4 0 程序对小分子数据库选取a c d 3 d 商业数据库进 行筛选，通过比较酵母a h a s 和拟南芥a h a s 分别所得的2 0 0 0 个分子，发现有 将近3 0 的化合物结构是一样的，从这些结构中发现潜在的a h a s 抑制剂可能 性较大。由于疏水性特征是化合物能否成为药物分子的一个重要指标，据统 计 3 0 1 大部分商品化的除草剂疏水性参数在0 5 和3 之间。在研究中，本课题组 选用x l o g p 程序【3 1 】，计算了所有分子的l o g p 值，最终从交集分子中挑选了2 9 6 个结构进行了研究。这些结构大约可以分为9 大类。它们分别是酰胺类、磺酰 胺类、肽类、n 取代基多肽类、丙二酸类、多元羧酸类、氨基羧酸类、杂环 及其他类型。我们购买了其中1 4 个打分较高的化合物【32 b 。，并对其进行了体内 体外活性测试，发现其中的3 个化合物对拟南芥a h a s 具有较好的抑制活性( 图 1 4 ) 。它们的抑制活性常数分别为：1 5 2 + 1 3p m ( c o m p 2 ) ；4 2 1 4 - 1 0 4 p m ( c o m p 1 1 ) ；9 0 7 4 - 9 2p m ( c o m p 1 3 ) 。 第一章前言 表1s t m c t u r e so f t h e t h r e ep o t e n t i a lc o m p o u n d sa n d t h e i r d o c k e de n e r g y f r o m d o c ka n d a u t o d o c ke a l c u l a t i o n s 付s 、。肛。，。州。 o o c a - ，“ w 觏一”z s s 。 一p “、s 9。s 一”* v abc 罔1 4 b m d m g m o d e s o f c o m p o l j n d 2 ( a ) ，c o m p o u n d l 3 ( b ) a n dc o m p o u n d l l ( c ) 利用计算机辅助设计和虚拟筛选得到的这三个新结构特征的a h a s 抑制 剂，为新的分子设计提供了基础。这其中具有靛蓝( 1 n d i g o t i n ，a ) 母体结构的 化台物1 l 引起丁我们的兴趣，考虑到该类化合物结构的对称性以及合成、将来 结构优化等方面难易程度，我们提出创造性设想：认为吲哚满二酮( i s a t i n ，b ) 类化台物同样具有对a h a s 抑制活性。根据这一设想本课题组前期通过购买和 简单合成，初步得到一些吲哚满二酮类化合物，并对其进行了离体拟南芥 a h a s 抑制活性和除草生物活性研究。实验结果实验表明：吲哚满二酮类化合 物作为一类新型a h a s 抑制荆，其在体外“ v i t r o ) 3 阳体内( i nv i v o ) 均具有一定韵 生物活性。 第一章前言 a b 图1 5s t r u c t u r eo fi n d i g o t i n ( a ) a n di s a t i n ( b ) 常见吲哚满二酮的活性报道表现在抗衰老、抗老年性震颤麻痹、降血脂、 抗氧化、维持脑血管正常功能、抗癌活性、杀菌抗炎等方面【3 5 】，到目前为止尚 未见任何文献报道这类化合物具有a h a s 的抑制活性。因此这类化合物将突破 传统的a h a s 抑制剂的结构特征，进一步研究其对a h a s 抑制活性将有助于设 计发明新的对环境友好的除草剂先导结构。 第三节吲哚满二酮及其衍生物的介绍 1 3 1 吲哚满二酮的简介 吲哚满二酮( i s a t i n ；i n d o l e 2 ，3 d i o n e ) 又名靛红、2 ，3 吲哚醌，是吲哚类衍生 物，1 8 4 1 年e r d m a n 和l a u r e n t 分别独立首次发现：利用硝酸和铬酸混酸氧化靛 青可以得到i s a t i n 。该化合物在众多生物体内被发现，有研究表明其存在于人体 和经典的清热解毒抗癌中药青黛中，是我国自行研制开发的i 类抗癌新药靛玉红 化学二聚体结构的单体。同时该物质也是寄生于海洋生物龙虾体内的一种菌株 产生的抗生物质，是维持龙虾生存所必不可少的一种天然海洋生物活性物质【3 6 。 吲哚满二酮是成分单一的有机天然物质，化学结构明确，毒性低，副作用小， 对正常细胞有保护作用，具有促进癌细胞凋亡、降血脂、维持脑血管正常功能、 抗衰老、杀菌消炎等广泛的生物活性。 吲哚满二酮，c a s ：9 1 5 6 5 ，分子式tc 8 h 5 n 0 2 ，分子量：1 4 7 1 3 ，其为橙 红色单余棱柱结晶，熔点2 0 3 5 ( 部分升华) 。易溶于热乙醇，微溶于乙醚， 溶于热水、苯、丙酮，溶于碱金属氢氧氧化物。溶液呈紫红色，放置后变成黄 色，碱性极弱【3 刀。 1 3 2 吲哚满二酮的合成方法 由于i s a t i n 广泛的生物活性，加之3 位羰基的高反应活性可使其与多种亲核 试剂作用进而合成更为复杂的含氮杂环化合物，因此i s a t i n 的合成也引起了人们 1 3 第一章前言 的关注，早在1 9 4 5 年c h e m r e v 1 - _ 就有一篇关于i s a t i n 类化合物的综述【3 8 】，其中 较为详细的介绍了之前该类化合物的合成以及相关反应。根据现有文献调研情 况，对其相关的合成方法简单介绍。 i 3 2 1 以取代苯胺为原料合成肟基乙酰苯胺中间体，通过环合反应得到产物 早在2 0 世纪初，就已经有文献报道了i s a t i n 的合成方法。最古老最经典又 最被人们常用的方法是s a n d m e y c r 方法，即以取代苯胺为原料，与三氯乙醛在 盐酸羟胺溶液中回流，得到肟基乙酰苯胺，之后在浓硫酸催化下加热合环得到 该类化合物 3 9 1 。该方法中各种原料均经济、易得，反应产率也很高。采用不同 取代基的苯胺，可以得到不同取代基的目标类化合物，因此该方法可以制备一 系列不同取代基的衍生物，只是反应的难易程度和产率高低要受具体取代基的 影响。 o r q n 蔗警r 姒q 斟h 弋c 3 7 0 2 n o h o 第一章前言 在2 0 0 7 年有文献报导7 ：8 0 温度在三氯化 t 4 3 1 或三氯化铈1 催化下，用2 碘酰基苯甲酸( 2 i o d o x y b e n z o i ca c i d ) 对吲哚甲醛进行氧化，可以得至l j i s a t i n ，该反 应条件温和并且产率较高。 c h o h o h r8 0 - - - - - - - - c h 3 c n ih 2 0 o h r ：i n c l 3 4 3 】 o r ：c e c l 3 4 4 1 以叔丁醇做溶剂，溴代琥珀酰亚胺和吲哚甲醛反应，水解后得到产物 i s a t i n 4 5 1 。 c h oo h 1n b r o m o s u c c i n i m i d e t b u o h 2h 2 0 m e o h h o 1 3 2 3 以3 位取代吲哚二酮为原料或中间体，通过氧化反应得到目标产物 这类合成是主要是以3 位取代的吲哚二酮为原料，采用不同氧化剂氧化得到 i s a t i n 类化合物。女l l p a u lgg 课题组利用苯胺制备成中间体3 甲基硫羟吲哚，之后 用次氯酸琥珀酰亚胺氧化3 位的次甲基碳，得到目标化合物，这种方法适用于各 种吸电子及供电子取代基相关化合物的制型4 6 1 。 x y