（微生物学专业论文）一种新型蛋白激酶信号转导系统的初步研究.pdf

一种新型蛋白澈酶信号转导系统的初步研究 缩略语表 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a n a b a e n aa n a b a e n as p s t r a i np c c7 1 2 0鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 a s pa s p a r t i ca c i d 天门冬氨酸 d f p a 2 , 2 - d i f l u o r o p e n t a n e d i o i ca c i d 2 ，2 二氟戊二酸 c m c h l o m m y e e t i n 氯霉素 d n t p d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 e d l a e t h y l e b e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e m e r y t h r o m y c i n 红霉素 g 够g l y c i n e 甘氨酸 h h o u t 小时 h 缸h i s t i d i n e 组氨酸 k dk i l o - d a l t o n千道尔顿 k i n k a n a m y e i n 卡那霉素 s ps p e c t i n o m y c i n 壮观霉素 m i nm i n u t e 分钟 n e o n e o m y c i n 新霉素 o r f o p e nr e a d i n gf l a m e 开放阅读框 ， p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r p m r o t a t i o np e rm i n u t e每分钟转速 g s - g o g a t g l u t a m i n e s y n t h e t a s e - g l u t a m a t e谷氨酰胺合成酶一谷 s y n t h a s ec y c l e 氨酸合成酶循环 s e ts e r i n e 丝氨酸 s m s t r e p t o m y c i n 链霉素 s p s p e e t i n o m y c i n 壮观霉素 t h r t h r o n i n e 苏氨酸 t y r t y r o s i n e 酪氨酸 、) i 呵 w i l dt y p e 野生型 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密爹 如需保密，解密时问年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：屏多珍 时问：妒年，l 月，日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印。缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适) 1 1 于本授权书 学位论文作者签名：钽翩签名：傅獬i 式7 签名日期：了一年1 ，月f 日 签名日期：加d 占 年，a 月2 7 日 注：请将水表“接袈玎红学位论文的廊页币口录之问 一种新型蛋凸澈酶信号转导系统的初步研究 摘要 鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 翻n a b a e n as p s t r a i np c c7 1 2 0 ) 是一种丝状体革兰氏阴性 细菌，该菌可以在缺乏化合念氮源的条件下分化形成行使生物固氮功能的异形胞。 基因组数据分析表明该菌的基因组含有1 3 个新型的蛋白激酶编码基因，这类新型蛋 白激酶的特点是：氨基端具有一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶保守结构域：羧基端具有 一个组氨酸蛋白激酶保守结构域，在两个保守结构域之白j 还具有g a f 或p a s 保守结 构域。到目前为止，这类蛋白激酶的功能还未知。本课题的目的是通过研究此类新 型蛋白激酶的功能揭示这类新型的信号转导机制。 本课题主要研究其中的两个基因咖4 j ( 动口7 d 9 ) 和咖钳( a l t 0 7 1 d ) 的功能。r n a d o tb l o t 和i m p c r 实验证实这两个基因的转录受缺铁的诱导，而且与培养基中氮源 的性质无关。这两个基因的o r f 之间只有7 2b p 的间隔，r t - p c r 实验结果证实它们 在缺铁条件下表现出共转录的特点。p k n 4 1 署t l p k n 4 2 基因的插入失活单突变体和基因 敲除双突变体表型分析显示：在正常条件下，突变体的生长与野生型没有明显的差 异，但是在有铁螯合剂存在或者同时缺铁缺氦的条件下，突变体的生长相对于野生 型明显地被抑制。细胞内铁含量测定结果显示突变体细胞内铁含量明显低于野生型 细胞，同时细胞在缺铁条件下的色素蛋白含量测定结果也表明突变体细胞色素蛋白 的含量低于野生型细胞，而且突变体细胞在缺铁条件下的过氧化氢酶活性明显高于 野生型细胞。以上突变体表型分析结果表b 羽p k n 4 1 7 d l p k n 4 2 参与细胞内的铁代谢调控 突变体表型分析和突变体互补实验结果也很好地表明p k n 4 1 f f d p k n 4 2 基因具有共转录 的特点。受缺铁诱导的基因行矽和甩弘腑p 在咖4 j 和p 砌彳2 基因单突变体中表现出很 高的诱导表达，并且与培养基中是否缺铁无关，这表明咖彳j 和砌钳基因参与对哟c ， 和n i f j - l i k e 的调控或它们的缺失造成细胞内缺铁而诱导n i f j 和n i f d - l i k e 基因的表达。以 上的结果表明砌4 j 和咖铊基因参与细胞对缺铁的适应性调节。 p k n 4 1 基因的a t g 上游具有一个保守的n t e a 蛋白结合位点g t a - n r t a c ，e m s a 体外实验证明n t c a 蛋白可以结合到p k n 4 1 基因的启动子区域。同时r t p c r 和 r e a l - t i m ep c r 结果证明p 砌4 衍砌4 2 基因在缺铁条件下的诱导表达可以被n t c a 基因 突变体抑制，这些结果表明n t c a 蛋白确实参与了对咖4 j 和砌钳基因的表达调控 n t c a 蛋白对p 南w j 和砌钍基因的调控表明n t e a 蛋白不仅参与对细胞氮代谢和碳代 谢的调控而且参与细胞对缺铁环境的适应 关键词；蓝细菌；蛋白激酶；信号转导；氧化胁迫 一种新型蛋白激酶信号转导系统的初步研究 a b s t r a c t t h ef i l a m e n t o u sc y a n o b a c t e r i n ma n a b a e n as p s w a i np c c7 1 2 0 啪f i xn 2w h e n c o m b i n e dn i t r o g e ni sn o ta v a i l a b l ei nt h eg r o w t hm e d i u m i th a saf a m i l yo f1 3g e n e s e n c o d i n gp r o t e i n sw i t hb o t has e r f r h rk i n a s ed o m a i na tn - t e m i n a lr e g i o na n dah i s k i n a s ed o m a i na tc t e r m i n a lr e g i o n s of a r , t h ef u n c t i o no ft h e s ee n z y m e si su n k n o w n t w oo f t h e ma e n c o d e db y p k n 4 1 ( a i r 0 7 0 9 ) a n d p k n 4 2 ( a l r 0 7 1 们t h i s s t u d yf o c u s e so n t h ef u n c t i o no ft h e s et w og e n e si ns i g n a lt r a n s d u c t i o n t h er e s u l t so fr n ad o tb l o ta n d r t p c rs h o wt h a tt h ee x p r e s s i o no f p k n 4 1a n dp k n 4 2i si n d u c e db yi r o nd e p r i v a t i o n i r r e s p e c t i v eo ft h en a t u l o ft h en i t r o g e ns o u r p k n 4 1a n dp k n 4 2 a r cs e p a r a t e db yo n l y 7 2b po nt h ec h r o m o s o m e a n do u rr e s u l t si n d i c a t et h a tt h e ya c o t r a n s c r i b e du n d e r i r o n - l i m i t e dc o n d i t i o n s m u t a n t si nw h i c he i t h e rp k n 4 1 ，p k n 4 2 ，o rb o t ha r ci n a c t i v a t e d g r o ws i m i l a r l yt ot h ew i l dt y p eu n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，b u tt h e i rg r o w t hi si m p a i r e d e i t h e ri nt h ep r e s e n c eo f a ni r o nc h e l a t o r , 2 , 2 - d i o p y r i d y l ，o ru n d e rc o n d i t i o n so f n i t r o g e n f i x a t i o na n di r o nl i m i t a t i o n , t w os i t u a t i o n sw h e r et h ed e m a n df o ri r o ni sp a r t i c u l a r l y s t r o n g c o n s i s t e n tw i t ht h e s er e s u l t s , t h e s em u t a n t sd i s p l a yl o w e ri n t r a c e l l u l a ri r o n c o n t e n tt h a nt h e 、 ，i l dt y p ea n dah i g h e rl e v e lo fe x p r e s s i o nf o r 开口7a n dn f f d - t f k e ，w h i c h e n c o d ep y r u v a t e ：f e r r e d o x i no x i d o r e d u c t a s e s b o t hn i f ja n dn f f j - z f k ea r ek n o w nt ob e i n d u c e db yi r o nl i m i t a t i o n t h ep i g m e n tc o n t e n t so f t h em u t a n t sa r ea l s ol o w e rt h a n 、埘l d t y p eu n d e ri r o n - l i m i t e dc o n d i t i o n sa n dt h ea c t i v i t yo fc a t a l a s eo ft h em u t a n t sa r ch i g h e r t h a nt h a to f w i l dt y p eu n d e ri r o n - l i m i t e dc o n d i t i o n s t h e s er e s u l t sa r ec o n s i s t e n tw i t ht h e f a c t st h a tt h ei n t r a c e l l u l a ri r o nc o n t e n t so f t h em u t a n t sa r el o w e rt h a nt h a to fw t n t e a , a g l o b a lr e g n i a t o r yf a c t o rf o rd i f f e r e n tm e t a b o l i cp a t h w a y s ，b i n d st ot h ep u t a t i v ep r o m o t e r r e g i o no fp k n 4 1 ，a n dt h ei n d u c t i o no fp l m 4 1i nr e s p o n s et oi r o nl i m i t a t i o nn ol o n g e r o c c i r ii na l ln t c am u t a n t o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tn t c an o to n l yr e g u l a t e st h ee x p r e s s i o n o f g e n e si n v o l v e di nn i t r o g e na n dc a r b o nm e t a b o l i s mb u ta l s oc o o r d i n a t e si r o na c q u i s i t i o n a n dn i t r o g e nm e t a b o l i s mb ya c t i v a t i n gt h ee x p r e s s i o no f p k n 4 1a n d p k n 4 2 k e yw o r d s ：a n a b a e n a ；s i g n a l i n g ；p r o t e i nk i n a s e s ；o x i d a t i v es t r e s s 2 一种新型蛋白激酶信号转导系统的初步研究 1 文献综述 1 1 鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的氮代谢和缺氮胁迫 1 1 1 鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的特点 鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 是一种革兰氏阴性蓝细菌，属于光能自养型，能够利用太 阳光能进行光合作用( s t a n i c r e t a l ，1 9 7 7 ) 。在环境中鱼腥蓝细菌p c c 7 1 2 0 可以利用 多种氮源，如尿素、铵盐、硝酸盐和n 2 等( 见图1 1 ) ( w o l k e t a l ，1 9 9 4 ) 。在正常条 件下，这种蓝细菌只有一种类型的细胞，即营养细胞。但是在缺少化合态氮源的条 件下，鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的5 一1 0 的营养细胞可以分化形成异形胞一种 可专门进行固氮作用的细胞，以满足菌丝体生长的需要( w b l k 甜a l ，1 9 9 4 ) ，并且在 功能和生理上这两种细胞相互依存。这些特点使鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 成为很好的模 式生物，被用于细胞的发育和分化研究。图1 1 和图1 2 分别显示了鱼腥蓝细菌p c c 7 1 2 0 在缺氮条件下的细胞类型和异形胞细胞结构。异形胞要进行固氮作用，必须具 有特定的结构特征( 图1 - 2 ) ，其原因主要是因为固氮酶对氧敏感，在有氧存在的条 件下固氮酶会失活( w b l kp f4 f ，1 9 9 4 ) 。 圈1 1 ；缺氨条件下的鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 f i g 1 - l ：a n a b a e n as p s t r a i np c c 7 1 2 0g r o w nw i t h o u tt - n ) c o m b i n e dn i t r o g e n 凰中箭头所指为异形胞 h c t e r o c y s t sa r ei n d i c a t e db ya r r o w h e a d s 异形胞与营养细胞的在结构上的主要区别：具有一层多糖层和致密的糖脂层。 在生理层次：异形胞没有光合系统i i ，只有光合系统i ，因此异形胞光合系统只利 用光合磷酸化产生a t p ，而没有氧气的生成；异形胞为了使细胞内的氧气分子含 量降低，极大地增强了呼吸作用( m u r r ye ta 1 ，1 9 8 9 ) ：但是在异形胞中，部分进入细 4 一种新型蛋白激酶信号转导系统的初步研究 胞的氧分子能够被光合系统i 还原为超氧化物自由基( 0 2 ) ，0 2 具有很大的毒性，可 以破坏d n a 和蛋白质等的结构，因此很多种蓝细菌具有消除0 2 的机制( 如过氧化物 歧化酶) ( w o l ke t a l ，1 9 9 4 ) 。鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 拥有过氧化物歧化酶a ( 编码m n 过氧化物歧化酶) 和过氧化物歧化酶b ( 编码f e 过氧化物歧化酶) 两个编码过氧化 物歧化酶的基因。免疫杂交、n o r t h e mb l o t 和酶活测定实验研究表明鱼腥蓝细菌p c c 7 1 2 0 在异形胞中只有f e 过氧化物歧化酶，虽然从有氮到缺氮培养基时，过氧化物歧 化酶b 基因的表达量有所升高，但是在异形胞中f e 过氧化物歧化酶的活性有所降低 ( l i ue ta 1 ，2 0 0 0 ；l ie ta ，2 0 0 2 ) ；异形胞会合成大量的固氮酶和固氮酶还原酶 ( w o l k e t a l ，1 9 9 4 ) ；异形胞中色素蛋白会发生降解( w o o d a n d h a s e l k o m ，1 9 8 0 ) 。 图1 - 2 ：鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 电镜图( b l a c k , 1 9 9 5 ) f i g 1 - 2 ：t r a m m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o g r a p h so f a n a b a e n as p s t r a i np c c 7 1 2 0 ( b l a c k , 1 9 9 5 ) h ，异形胞：v ，营养细胞；p ，多糖层；g ，糖脂层 i - lh e t e r o c y s t ；、v e g e t a t i v ec e l l s ；p ，p o l y s a c c h a t i d el a y e r s ；g g l y c o l i p i dl a y e r 1 1 2 鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的氮代谢和氮胁迫 当环境中氮源成分发生改变后，鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 会做出不同的反应在有 铵盐的条件下，由于n h 4 + 可以通过g s g ( ) g a t 循环直接进入细胞的代谢合成途径， 因此利用其它氮源的代谢酶都被抑制了( w o l ke t 口，1 9 9 4 ) ，而被激活的氮源利用 基因主要为a m t ( 编码铵箍转运蛋白) ，这时起主要抑制作用的是n t c a 蛋白和p i i 蛋 白( w o l ke t 耐1 9 9 4 ) 。当氮源变为硝酸盐时，细胞在将硝酸盐整合至合成途径之 前必须把硝酸盐转换为n h 4 + ( w b l l 【甜a ，1 9 9 4 ) ，因此与氮源利用有关的酶基因必 一种新墅蛋白澈酶信号转导系统的初步研究 须被激活，如n i r a ( 编码亚硝酸盐还原酶) 、n a r b ( 编码硝酸盐还原酶) 和n r m b c d 操纵子( 编码硝酸盐转运蛋白) ( f l o r e s a n d h e r r e r o ，1 9 9 4 ；c a ie t 耐，1 9 9 6 ；f r i a se t a l ， 1 9 9 6 ) 。研究表明这些基因共转录，而且表达受n t c a 蛋白的正调控( f i a se t a l ，1 9 9 6 ) 。 当细胞感受到缺氮的条件时，细胞也会激活这些基因的表达，但是研究表明这些基 因的突变体对异形胞的分化没有影响( c a ie ta 1 ，1 9 9 6 ；f r i a se t 讲，1 9 9 6 ) 。在缺氮条件 下，形成异形胞后对氮代谢真正起关键作用的是由聆琚删噪纵子编码的固氮酶复合 体，该酶复合体直接将n 2 还原为n h 4 + ( f l o r c sa n dh e r r e r o , 1 9 9 4 ) 。研究表明 g s g o g a t 循环e f l g l n d 基因( 编码谷氨酰胺合成酶) 的表达受n t c a 蛋白的正调控 ( c h a s t a i n e t a ，1 9 9 0 ；w e ie t a ，1 9 9 4 ) 。 在鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的异形胞中固氮酶的活性受到严格的调控，并且只在 异形胞发育成熟之后才发挥作用( e l h a ie ta ，1 9 9 0 ；e r n s te ta 1 ，1 9 9 2 ) 。但是，在鱼 腥蓝细菌变种a t c c2 9 4 1 3 似n a b a e n av a r i b i l i sa t c c2 9 4 1 3 ) 中，由3 个成簇的基因 控制固氮功自b 叫孵，n i l 2 和v n f o 厅卵基因簇只在异形胞中表达，但是n f 2 基因簇不 仅在异形胞中表达，而且在无氧的条件下还可以在营养细胞中表达( t h i e le ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。v n f 基因簇编码另一个固氮酶系统，用一个钒辅因子取代通常的钼辅因子， 而且在钼不存在时仅在异形胞中表达。 在大多数蓝细菌中藻青素是氮源的储存者。但奇怪的是，藻青素的代谢对于有 氧条件下的周氮生长并不是必需的( z i e g l e re t 耐，2 0 0 1 ) 。研究表明，在鱼腥蓝细菌 变种a t c c2 9 4 1 3 中将编码藻青素合成酶的c p h l 基因失活，得到的突变株不再产生 藻青素而且在异形胞中也没有由藻青素组成的极性颗粒，但是却可以和野生型一样 进行固氮生长。 在异形胞的发育过程中，除了上述代谢途径的变化外，异形胞在形成过程中也 可以诱导产生蛋白酶，这些蛋白酶可以降解藻胆蛋白和一些固定c 0 2 的酶类。异形 胞中还可以诱导产生氢化酶和氧化戊糖途径中的酶类，还可以产生谷氨酰胺合成酶 及谷氨酰胺合成酶的运输系统。 在蓝细菌中，缺氮可以引发多种生理反应，其中最明显的是色素的降解。蓝细 菌的色素形式主要为叶绿素和藻蓝体( p b s ) ，它们的降解导致蓝细菌的颜色由蓝绿 色变为黄绿色，这一现象被称为漂白或变色。在正常条件下藻蓝体蛋白几乎占了细 胞总蛋白的5 0 ，但是在缺氮时，它们可以迅速降解。藻蓝素是藻蓝体的主要组成 部分，也是蓝细菌细胞内的重要氮源储存蛋白，它的降解可以为细胞的生长提供氮 源。研究显示：在聚球蓝细菌p c c7 9 4 2 ( s y n e c h o c o c c u ss p s t r a i np c c7 9 4 2 ) 和集胞蓝 细菌p c c6 8 0 3 ( s y n e c h o c y s t i ss p s t r a i np c c6 8 0 3 ) 中，柏z 基因的失活可以抑制细胞漂 白现象的发生，这表明柏，基因参与调控细胞内色素的降解过程( r i c h a u de t a l ，2 0 0 1 ) 。 目前研究比较清楚的万6 瑾因有：n b l a 基因( 编码的蛋白具体功能不祥) 、刀6 馏基因( 编 码的蛋白序列与藻胆素裂解酶相似) 、n b l r 基因( 编码双组分蛋白激酶信号转导系统 的反应调控子) 。生物信息学分析表明在蓝细菌中普遍存在n b l a 基因，如集胞蓝细菌 6 一种新型蛋臼激酶信呼转导系统的初步研究 p c c6 8 0 3 和鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 拥有两个”6 阴基因，念珠蓝细菌p u n c t i f o r m e ( n o s t o c p u n c t i f o r m e ) 含有两个以上的”6 阴基因。研究显示鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的两个n b l a 基因分别位于染色体和质粒6 上，而染色体上的n b l a 基因对于藻蓝体的降解是必需的 ( r i c h a u de t a l ，2 0 0 1 ；b a i e re t a l ，2 0 0 4 ) 。 研究表明多种营养元素的缺乏都会引发蓝细菌细胞内色素的降解：如缺硫、缺 磷、缺铁和缺碳等。因为藻蓝蛋白只是含有极少的含硫氨基酸，而且不含磷元素和 铁元素，因此在缺硫、缺磷或缺铁时色素的降解只是一种适应性的反应，降低细胞 对光能的吸收，而不是为细胞的生长提供缺乏的营养物质。研究显示在不同的营养 缺失条件下，色素的降解经历了不同的调控机制，例如色素降解基因n b l a 在缺氮或 缺硫时被诱导表达，但是在缺磷时不能被诱导表达。 1 2 n t c a 蛋白的调控作用 1 2 1 异形胞发育信号分子的可能受体n t c a 蛋白 目前，世界各地的科学家已经对鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的异形胞发育和分化机制 有了很好的研究和认识。在鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的异形胞发育和分化过程中，有很 多关键的因素发挥了作用，最终导致异形胞的形成。在这关键的因子中，近年来研 究比较热门的是小酮戊二酸( 2 - o x o g l u t a r a t e ) 分子在异形胞发育过程中的作用。 由于鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 中没有a 酮戊二酸脱氢酶，导致了t c a 途径不是闭合 的循环系统( 见图l - - 3 ，s t a m e re t a l ，1 9 7 7 ；k a n e k oe t a l ，2 0 0 1 ；l a u r e n t 甜a ，2 0 0 5 ) 。 在鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 中，弘酮戊二酸和n h + 通过g s g o g a t 循环进入氨基酸合成 途径( w o l ke a ，1 9 9 4 ；m e r r i c k & e d w a r d s , 1 9 9 5 ；h e r r c r oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。当细胞内缺 少化合态氮源时，会导致小酮戊二酸的浓度上升( 见图1 3 b ，m u r o p a s t o r e t a l 2 0 0 1 ： l a u r e n te t a l ，2 0 0 5 ) ，因此a - 酮戊二酸很有可能被作为鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 异形胞发 育的信号分子。近来研究表明在缺乏化合态氮源的条件下小酮戊二酸作为氮源缺乏 的信号分子，诱导异形胞的分化( l i 甜a ，2 0 0 3 ；l a u r e n te ta ，2 0 0 5 ；z h a n ge ta 。 2 0 0 6 ) 。这些结果首次表明：即使在有铵盐或硝酸盐存在的条件下a - 酮戊二酸浓度的 升高也可以诱导异形胞的分化在这个实验中，他们首先将大肠杆菌的a 酮戊二酸 透析酶基因k g t p ( s e o ip f a ，1 9 9 1 ) 进行改造，将该基因的启动子被替换成一个在鱼腥 蓝细菌p c c7 1 2 0 中受c u 2 + 诱导的启动子( 来源于鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的，蹉因启 动子) ，然后将构建好的质粒转入鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 中，使鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 具有转运n 酮戊二酸的能力。然而，由于小酮戊二酸在鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 细胞内 是很多代谢过程的底物，因此，不能排除小酮戊二酸的信号作用是问接的可能，即a - 酮戊二酸的代谢产物起了信号分子的作用。这个问题通过利用一个洳酮戊二酸的类 似物d f p a ( 2 , 2 - d i f l u o m p e n t a n c d i o i ca c i d ) 得到了解释，首先通过氟谱跟踪实验证明 这种类似物在鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 细胞内不能被代谢，因此就排除了代谢产物起作 7 一种新墅蛋白激酶信号转导系统的初步研究 用的可能性。而且在有铵盐存在的条件下d f p a 依然可以诱导鱼腥蓝纽菌p c c7 1 2 0 异形胞的分化。 a b e 装 孳警2 0 圣詈1 5 雹耋。1 j 0 0 m 狮严 ， 哪般鼍 图l - 3 ：鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 的t c 幻金径和g 髑o g a t 循环c a ) 缺乏化合态氮源条件下鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 细胞内小酮戊二酸浓度的变化情况 ( b ) ( l a u r e n te ta 2 帅5 ) f i g 1 3 ：t h ec r e b sp a t h w a ya n dg s - g o g a tc y c l ei na n a b a e n as p s t r a i np c c 7 1 2 0 ( a ) c h a n g e si ni n t r a c e l l u l a rp o o lo f 2 - o x o g l u t a r a t ei nr e s p o n s et oa m m o n i u m d e p l e t i o ni n a n a b a e n as p s t r a i np c c7 1 2 0 ( b ) ( l a u r e n te t a l ，2 0 0 5 ) 在研究者们了解到a 酮戊二酸作为鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 异形胞发育和分化的信 号载体后，他们必须面对一个问题：谁会是伽酮戊二酸的受体蛋白呢? 在大肠杆菌中，舡酮戊二酸可与p i i 蛋白结合，作为细胞内碳代谢的信号分子 ( n i n f a , a j ，1 9 9 8 ) 。蓝细菌中也有p i i 蛋白，丽且蓝细菌的p i i 蛋白也可以与弘酮戊二 酸结合参与细胞内代谢的调节，但是p i i 蛋白对于异形胞的发育是非必需的，因此， 在蓝细菌中很可能有另外一个蛋白与小酮戊二酸相互结合，以调控异形胞的起始 2 0 0 2 年日本的h i d e ot a k a h a s h i 课题组和西班牙的e n r i q u ef l o r e s 课题组研究证明了a 酮戊二酸可以与n t c a 蛋白一起调节$ n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 中n t c a 蛋白依赖型 基因g l n a 启动予在体外的转录的起始( t a n i g a w ae ta l ，2 0 0 2 ；v a z q u e z - b e r m u d e ze ta 1 ， g 妥z 劬 协 、卜己 一种新型蛋亡| 激酶信号转导系统的初步研究 2 0 0 2 ) 。这些结果表明n t c a 蛋自很有可能是a 酮戊二酸的结合蛋白。 1 2 2n t c a 蛋白的特点 n t c a 蛋白属于c a p 蛋白质家族，这个蛋白质家族的成员往往作为基因转录调控 蛋白，如已经了解的比较清楚的大肠杆菌c r p 和f n r 转录调控子( b u s b ye ta 1 ，1 9 9 6 ； v e g a - p a l a se ta 1 ，1 9 9 2 ) 。n t c a 基因在蓝细菌中广泛存在( f r i a se la 1 ，1 9 9 3 ) 。为了研 究鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0n t c a 基因的功能，研究者们首先从研究n t c a 基因突变体开始。 他们发现n t c a 基因突变体在以硝酸盐和n 2 作为氮源的条件下都不能存活，而且在n 2 作为氦源的条件下没有异形胞的分化，它只能在铵盐的条件下才能生长( w e i 甜口f ， 1 9 9 4 ；f r i a se ta l , 1 9 9 3 ) 。这表明n t c a 基因的功能与细胞的氮代谢和异形胞的发育有 关。后来的研究还表明n t c a 基因具有多个转录起始位点，这些转录起始位点大致分 为两类：缺氮条件下起始转录和有氮条件下起始转录( r a m a s u b r a m a n l a ne ta 1 ， 1 9 9 4 ) 。同时还发现：在缺氮条件下起始转录的起始位点上游存在一个保守的n t c a 蛋白结合位点，而且n t c a 基因在缺氮条件下的转录受n t c a 蛋白的正调控 ( r a m a s u b r a m a n l a ne t a l ，1 9 9 4 ) 。这表明n t c a 基因具有自我调控作用。 n t c a 作为一个转录调控蛋白，那么在其下游必然有一些受它调控的基因存在。 在后来的研究中，研究者陆续发现了一些受n t c a 蛋白直接调控的基因，同时发现这 些受n t c a 蛋白调控的基因都至少拥有一个保守的n t c a 蛋白结合位点g t a - n s _ t a c ( w e ie t a l ，1 9 9 3 ；f r i a se t a l ，1 9 9 4 ；1 9 9 7 ；2 0 0 0 ；r a m a s u b r a m a n l a ne t a l ，1 9 9 4 ；f i e d l e r 甜a l ，2 0 0 1 ；m u r o p a s t o re ta 1 ，1 9 9 6 ；1 9 9 9 ；v a l l a d a r e se ta 1 ，1 9 9 9 ) ，其中g t - n 1 0 - a c 被 认为对于n t c a 蛋白的结合是必须的( j i a n g e t a l 。2 0 0 0 ) 。研究还发现在蓝细菌中n t c a 蛋白结合位点的核苷酸序列非常保守( h e r r e r oe t a l ，2 0 0 1 ) 。 2 0 0 0 年瑞典斯德哥尔摩大学的b e n g tm a n n e r v i k 课题组报道了它们的最新研究 进展o i a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。他们通过体外筛选的方式，系统地研究了与n t c a 蛋白结 合的d n a 序列，根据序列的特征，可以将它们归纳为n g t a - n 7 ，8 ，9 - t a c a ，见图l - - 4 研究表明d n a 回文序列两端的8 个核苷酸对n t c a 蛋白的结合效率有很大的 影响，保守性越高结合效率越高，而且它们之间的碱基数量也影响n t c a 蛋白的结 合效率，如图l - - 4 中的第7 个d n a 片段的保守碱基数虽然明显高于第1 6 个d n a 片段，但是前者与d n a 的结合效率明显不如后者保守碱基之问的碱基种类也可 能影响着n t c a 蛋白的结合效率，实验结果分析显示体外筛选的d n a 片段保守碱基 之间的碱基大部分为a 或t ，而c r p 蛋白结合的d n a 保守区域富含a 和t ，而且 这一特征可能与蛋白质的特异性识别有关( b e r g a n d v o n h i p p e l ，1 9 8 8 ) 。筛选得到的 d n a 回文序列表现为不对称性：d n a 回文序列一个手臂的碱基序列很保守，但是 另一个手臂的碱基序列变化较大，见图l 一4 ( b a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) c r p 蛋白结合 d n a 保守区域的序列也表现出不对称的情况，这种不对称序列可能与转录的起始有 关( d ec r o m b r u g g h ee ta 1 ，1 9 8 4 ) 。当d n a 序列只含有回文序列的一个手臂时，n t c a 9 一种新型蛋白激酶信号转导系统的初步研究 竺棼舞裟裟。1 8 。 t 粘t c t g t t a 丛丛 3 敛t a t a g g a g g a i ；i 2 0 t 口z a t a c t g t a c a k e 4 铘t a t 赢撇面盂2 1 t 嘲僦t c t g 巡7 0 豫n ，o l o 玉锰 图1 4 ：体外筛选n t c a 蛋白结合的保守d n a 序列 矾晷1 - 4 ：s e l e c t i o no f d n a f r a g m e n tb m d m g t on t c a ( j i a n ge t a ，2 0 0 0 ) 分析受n m a 蛋白调控的基因启动子序列，可以将它们分为两大类， t o t - ( n 9 ) - a c a 和n g t a - ( n g ) - t a c a ，体外实验的结果包括这两类d n a 序列( j i a n g e t a 1 ，2 0 0 0 ) 。 n t c a 蛋白与d n a 序列之间的结合效率受d 1 r r 的影响。因为d 1 r r 可以使蛋白 质的二硫键断开，因此推测d t r 可能作用于n t c a 蛋白的二硫键，进而改变n t c a 蛋白的构像，促进n t c a 蛋白与目标d n a 的结合。但是瑞典斯德哥尔摩大学的b e n g t m a n n c r v i k 课题组通过将n t c a 蛋白的第1 5 7 和第1 6 4 位的半胱氨酸突变的方式，发 现d 1 r r 仍然可以促进突变n t c a 蛋白与目标d n a 结合，这表明d t t 对n t c a 蛋白 结合效率的影响必定作用于n t c a 蛋白的其它位置，改变了蛋白电荷的排布( w i s e n 盯以2 0 0 4 ) ，影响蛋白功能。 1 2 3 n t e a 蛋白对目标基因的调控作用 目前已经证明很多与氮代谢有关的基因表达都受n t c a 蛋白的调控：如编码谷氨 酰胺合成酶的9 1 a 基因( w e ie ta ，1 9 9 3 ；r a m a s u b r a m a n l a ne ta l ，1 9 9 4 ；j i a n ge ta 1 。 1 0 一种新型蛋亡| 激酶信号转导系统的初步研究 1 9 9 5 ；v a l l a d a r e se t a l ，2 0 0 4 ) 、亚硝酸盐还原酶基因n i r a ( f r i a se l a l ，1 9 9 7 ；2 0 0 0 ) 、固 氮酶基因n i f h d k ( w e ie ta 1 ，1 9 9 3 ；r a m a s u b r a m a n l a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 、卵埘基因 ( v a l l a d a r e se t a l ，1 9 9 9 ) 、与异形胞发育有关的基因h e t c 和d e v b c a ( m u r o p a s t o r e t a l ， 1 9 9 9 ；f i e d l e r e l a l ，2 0 0 1 ) 等等。在调控这些基因的表达过程中，n t c a 蛋白都是作为 正调控因子，并在特定的条件下激活这些基因的表达。后来研究表明n t c a 蛋白还可 以作为负调控子抑制某些基因的表达。在关于n t c a 蛋白作为转录调控子研究的所有 工作中，研究者主要研究了与氮代谢有关的基因。图1 5 ( h e r r e r oe t a l ，2 0 0 4 ) 列出 了鱼腥蓝细菌p c c7 1 2 0 中些受n t c a 蛋白直接调控的基因，以及n t c a 蛋白保守结合 位点的比较结果。 蓝细菌的r n a 聚合酶类似于大肠杆菌的r n a 聚合酶，但是编码大肠杆菌r n a 聚 合酶b 甄基的r p o c 基因在蓝细菌中被分割为r p o c l 和r p o c 2 两个基因，将它们编码的 蛋白亚基分别命名为t 和p ，它们的功能分别相当于大肠杆菌r n a 聚合酶1 3 亚基的氨 基端和羧基端功能( b e r g s l a n da n dh a s e l k o m , 1 9 9 1 ；) ( i ee t a l ，1 9 8 9 ) 。蓝细菌基本。 因子同源于大肠杆菌的o ”和枯草芽孢杆菌的。郇( b r a h a m s h aa n dh a s e l k o m , 1 9 9 1 ) 。 分析显示很多蓝细菌基因的启动子序列含有保守一l o 区( t a n 3 t ) ( c u r t i sa n dm a r t i l l ， 1 9 9 4 ；l u q u ee t a l ，1 9 9 4 ) ，该区域与大肠杆菌的一l o 区相似( b a m e e l a l ，1 9 9 7 ；h a s e t h 甜a 1 。1 9 9 8 ) 。某些蓝