（林木遗传育种专业论文）扶芳藤育种中lt60gtCoγ射线辐射效应与杂交技术的初步研究.pdf

摘要 扶芳藤( e u o n y m u s f o r t u n e i ( t u r c z ) h a n d - m a z z ) 属卫矛科卫矛属常绿阔叶藤本植 物，广泛用于绿化和水土保持。本文研究了“c 0y 射线对扶芳藤种子和枝条辐射效应， 筛选了不同性状突变株。对红脉型、宽瓣型扶芳藤和胶东卫矛进行了初步杂交试验。 种子辐射剂量为o 、6 0 、8 0 、1 0 0 2 0 0g y ，每处理3 0 0 粒种子。枝条辐射剂量 为0 、2 0 、4 0 1 6 06 y ，每处理2 1 0 根插穗。辐射剂量率均为1 3 lg y m i n 。种子辐 射后，出苗率、存苗率、高生长与辐射剂量在o o l 水平负相关。匍匐株型最多的剂 量为1 6 0g y 。半致死剂量为1 2 8 5 6g y 。枝条辐射后插穗生根情况和长度均与剂量在 0 0 1 水平负相关。辐射明显抑制幼芽萌发。随剂量增大，直立型植株减少，倾斜和 匍匐型增加。剂量为8 0g y 时，倾斜和匍匐生长的最多，且冬季绿叶植株多于其他剂 量。枝条半致死剂量为9 5 5 4g y 。辐射诱发大量突变体，对突变株和对照d n a 的 p c r 扩增出不同结果，突变材料d n a 扩出带型与对照都有差异。 杂交亲本中，胶东卫矛花期早于红脉、宽瓣扶芳藤，均在温度低于2 0 1 2 时开花 最多。红脉、宽瓣花粉活力接近，二者明显高于胶东卫矛花粉活力。结实率宽瓣型( 旱) x 红脉型( 最高，三种母本的人工授粉结实率高于自然授粉。宽瓣型( 旱) 胶东卫 矛( 6 ) 种子出苗率最高，红脉型( 早) 胶东卫矛( 6 ) 最低。 关键词：扶芳藤：辐射效应；杂交育种；突变体；p c r ：花粉活力 北京市科技新星项目“扶芳藤种质资源评价及抗旱抗寒新品种选育”( 2 0 0 3 8 1 8 ) 。 s t u d i e so fi r r a d i a t i o ne f f e c t so f6 0 c o1 rr a ya n dc r o s s i n g t e c h n i q u eo ne u o n y m u s f o r t u n e i ( t u r c z ) h a n d m a z z a b s t r a c t e u o n y m u sf o r t u n e ib e l o n g st oe u o n y m u s , c e l a s t r a c e a e 。w h i c hw 豁、“d e l yu s e di n v e r t i c a lg r e e n i n ga n dw a t e rc o n s e r v a t i o ne n g i n e e r i n g t h i sp a p e rh a ss t u d i e di r r a d i a t i o n e f f e c t so f6 0 c otr a yo ns e e d sa n db r a n c h e so fe u o n y m u sf o r t u n e i d i f f e r e n tc h a r a c t e r m u t a n t s 呲f i l t e r e d a tt h es a m et i m e c r o s se x p e r i m e n t a t i o nw e r ed o n ea m o n g 点 f o r t u n e i h o n g m a i3 e , f o r t u n e i k u a n b a n ：a n de ，k i a u t s c h o v i c u sl o e s t h ed o s a g e so i ls e e d sw e r e0 、6 0 、8 0 。2 0 0 g y , a n de a c hd o s a g eh a d3 0 0 s e e d s b r a n c h e s d o s a g e sw e r e0 、2 0 、4 0 1 6 0g y , a n de a c hd o s a g eh a d 2 1 0b r a n c h e s t h e d o s a g er a t e sw e r e1 3 lg y m i nb o t h a f t e rs e e d sw e r ei r r a d i a t e d ，i t se m e r g e n c er a t e ， s u r v i v i n gr a t ea n dh e i g h to fs e e d l i n g sw e r en e g a t i v ec o r r e l a d o n 谢t 1 1i r r a d i a t i o nd o s a g e 俾 0 0 1 ) a f t e ri r r a d i a t e dw i t h1 6 0g y , e s p a l i e rg r o w t hf o r mw a sm o s ti na l lo t h e rd o s a g e h a l fl e t h a ld o s a g ew a s1 2 85 6o y a f t e rb r a n c h e sw e r ei r r a d i a t e d ，t h en u m b e ra n dl e n g t h o fb r a n c hr o o t sw e r es i g n i f i c a n t l yn e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t hi r r a d i m i o nd o s a g e 6 0 c oyr a y h a d s i g n i f i c a n t l yc o n t r o le f f e c to nc h i tg e r m i n a t i o n w i t ht h ei n c r e a s eo f d o s a g et h er a t eo f e r e c tp l a n t sd e c r e a s e da n dc r e e p i n gp l a n t si n c r e a s e d t h en u m b e r so fs l a n l w i s ea n d c r e e p i n gp l a n t si r r a d i a t e dw i t h8 0g yw e r em o r et h a no t h e rd o s a g e s t h er a t eo fg r e e n p l a n t si nw i m e rw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e rd o s a g e s b r a n c h e s h a l fl e t h a ld o s a g e w a s9 5 5 4g y t h e r ew e r em a n yc h a r a c t e rm u t a n t sa f t e ri r r a d i a t e d t h ep e rr e s u l t so f m u t a n t sa n dc h e c k sd n aw e r ed i f i e r e n t t h e r ew e r ed i f f e r e n c eb e t w e e nm u t a n t sa n d c h e c k sd n a s t r i p i nc r o s s i n ge x p e r i m e m ，e k i a u t s c h o v i c u sl o e s sf l o r e s c e n c ew a se a r l i e rt h a nh o n g m a i a n dk u a n b a n w h e nt e m p e r a t u r ew a sb e l o w2 0 e f f l o r e s c e n c en u m b e rw a sm o s t h o n g m a ia n dk u a n b a n sp o l l e nv i t a l i t yw e r es i m i l a r , a n dw e r eb o t hh i g h e rt h a nt h a to f m a u g c h o v w u s l o e s 。s e r i n gp e r c e n t a g eo fk u a n b a n ( g ) x h o n g m a i ( 6 ) c o m b i n a t i o nw a s h i g h e s t a r t i f i c i a lp o l l i n a t i o ns e t t i n gp e r c e n t a g ew a gh i g h e rt h a nn a t u r a lp o l l i n a t i o no f t h r e e f e m a l ep a r m e n t s me m e r g e n c er a t eo fk u a n b a ( 早) ek i a u t s c h o v i c u sl o e s 心) c o m b i n a t i o nw a sh i g h e s t ，a n dt t o n g m a i ( 早) ek i a u t s c h o v i c u sl o e s ( g ) c o m b i n a t i o n s e m e r g e n c er a t ew a sl o w e rt h a nt 1 1 a to f o t h e rc o m b i n a t i o n s k e yw o r d s ：e u o n y m u s f o r t u n e i ；i r r a d i a t i o ne f f e c t s c r o s s i n g ：m u t a n t s ；p c r ；p o l l e nv i t a l i t y dir o o t e db y ：p r o f z h a n gg u os h e n g a p p i ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：a 0y a h ( f o r c s qg e n e t i c sa n db r e e d i n g ) ( f o r e s t r yc o l l e g e ，i n n e rm o n g o l i aa g d c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u h h o t 0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) b e i j i n gs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yn e ws t a ri t e m “e v a l u a t i o no fe u o n y m u sf o r t u n e ig e r m p l a s mr e s o u r c ea n dn e w b r e e dw i t h s t a n d i n gc o l da n dd r o u g h t ”( 2 0 0 3 b18 ) 缩写符号 e d t a e b t e d n a d n l p t r i s t b e d d h z o p c r 英文缩略词 英文名称 e t h y l e n e d i a m i a et e t r a a c e t i ea c i d e t h i d i u mb r o m i d e t r i s h c l e 1 ) t ab u f f e r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t r i s h c l h 出0 4 ，e d t ab u f f e r d i s t i l l e da n dd i m o n i z e dw a t e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 中文名称 乙二胺四乙酸 溴化乙锭 t r i s - i l c l ，e d t a 缓冲液 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷酸三磷脂 三羟甲基氨基甲烷 t r i s 一硼酸一e d t a 缓冲液 重蒸水 聚合酶链式反应 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 研究的目的和意义 扶芳藤( 砌d 枷话f o k t u n e i ( t o x c 乏) h a f i d z m a z z ；) 一属卫矛科( c e l a s t r a c e a e ) 卫矛属 ( e u o n y m u s ) 常绿藤本植物n m 。具有爬蔓能力强、抗逆能力强、颜色表现多样、易于造 型且冬季不落叶等特点，能满足立体绿化、冬季绿化、沙荒地绿化以及景观造型绿化 的需要，非常适合用于高层建筑、立交( 高架) 桥、轻轨铁路、高速公路、渠道等设 施的立体面或斜坡绿化n “。扶芳藤又是优良的地被植物，可有效替代草坪用于平地绿 化。扶芳藤为多年生植物，生长快，耐修剪。它的匍匐茎具有很强的繁殖更新能力， 在轻度践踏下不易损坏，植物群落相当稳定，故一次栽植可多年利用。并且耐寒、耐 热、耐阴、耐瘠薄，具有良好的应用前景。由于扶芳藤分技多，匍匐茎纵横交织，节 节生根，能形成“根结皮”和致密的多层叶，加上枝、叶柄、气生根及扎入地面的须 根系等，覆盖地面能力极强，具有良好的固土保水作用，因此是优良的沙漠治理、水 土保持植物；扶芳藤在中医上用作舒经络、活血化淤、止痛、治风湿性关节痛，临床 报道可用于治疗心绞痛和肺心病，被称为“棉花杜仲”、“土杜仲”，具有重要的药用 价值m ，。 扶芳藤虽具有较丰富的种质资源，但是，目前还没有冬季叶色为绿色并且匍匐生 长的品种。辐射诱变育种是创造新种质、选育新品种的有效途径，是常规育种有力的 重要补充”1 一。由于其诱变谱宽，产生的突变性状随机性大，因而很有可能诱变出匍 匐生长且冬季绿叶的新品种，同时，也有可能出现具有其他方面优良性状的突变株， 比如具有优良观赏特性( 叶色、株型等) 或其他生物学特性的新品种，创造出新种质。 辐射育种中常用的辐射材料有植物种子、枝条、花粉以及愈伤组织等等。本文系统地 研究了钿c ov 射线对扶芳藤的种子和枝条的辐射效应，分析了辐射对种子的萌发、植 株存活、株高、株型以及致死效应。同时研究了辐射对插穗的生根、成活、分枝、植 株冬季叶色变化等方面的影响。并从质量和数量性状方面筛选了部分发生不同性状突 变的突变植株，比如株高、叶序、节长、彩叶突变等，进行了p c r 检测m 4 1 ，为卫矛 科植物辐射诱变育种提供参考。 本试验还对不同扶芳藤品种红脉型和宽瓣型扶芳藤和同属卫矛科的胶东卫矛进 行了初步的杂交试验。杂交试验所选择的亲本中，红脉型扶芳藤为匍匐生长且冬季叶 色为红色，宽瓣型扶芳藤为直立生长冬季叶色为绿色，胶东卫矛则具有较强的抗寒抗 旱能力，以三者为亲本杂交则可能得到匍匐型且冬季绿叶的品种，并且进一步提高后 代的抗逆性。另外，扶芳藤和胶东卫矛的花朵都很小，人工杂交授粉有一定难度，也 未见以往对扶芳藤杂交技术方面的报道，本试验通过初步杂交试验可为今后扶芳藤的 杂交育种提供技术参考。并且，国内外对于扶芳藤的辐射诱变效应、杂交育种技术报 道较少，亟待开展相关研究。 2 扶芳藤育种中。c 口y 射线辐射效应与杂交技术的初步研究 1 2 研究基础 1 2 1 扶芳藤的研究进展 1 2 1 1 扶芳藤形态特征 扶芳藤属卫矛科卫矛属常绿藤本植物。为多年生常绿匍匐或攀援性灌木，高可达 1 0m 以上。其实生茁主根发达，扦插苗生根快，茎枝上常有气生根：小枝灰绿色， 茎稍扁，常密生小瘤状突起的皮孔：冬芽灰绿色，较大，芽鳞革质，边缘紫褐色：叶 薄革质，对生，近圆形、宽椭圆形、长方椭圆形、卵形、椭圆状卵形、匙形等，叶长 2 i - ic m ，宽一i 6c m ；叶先端尖、渐尖或急尖；基部圆形或楔形，锯齿较粗钝，两 面平滑：聚伞花序3 5 次分枝，腋生，花序梗长达4c m ，第一次分枝长5 - 1 0 岫， 长的可达2 5 - 4 5m m ，第二次分枝一般在5m m ，但长的可达2 0 唧，每枝有多数具短 梗的花组成球状小聚伞，分枝中央有一单花，小花梗长约5m m ，一个总花序最多时 可达6 3 朵小花；花4 数，花瓣卵形，绿白色，直径约6 m r f l ：萼片半圆形，长l 2m m ， 宽l - 2 姗；花盘方形，边长2 5m l n ：雄蕊花丝细长，长2 - 3n l i i l ，着生于花盘的边 缘：花药圆心形，黄色；子房三角锥状，四棱，花柱柱状，长1 唧：蒴果黄红色， 近球形，直径达6 - 1 2 唧；种子乳白色略带棕红色的斑点，假种皮桔红色，全包种子： 花期7 月中旬至8 月上中旬；果期1 1 月，能保留至第二年1 月。 l2 1 2 扶芳藤地理分布、生态学特性及已选育品种 扶芳藤原产于中国，自然分布于中国、朝鲜、日本、缅甸、东喜玛拉雅山脉一带 2 1 - “i 。遍布于我国的华东、华中、华南、西南和西北及华北的部分地区n ”，主要产于 四川、云南、贵州、广西、安徽、江苏、浙江、福建、江西、湖南、湖北、山东、河 南、陕西、甘肃、山西等省区”m 。在北京、天津。，、山东m ，等地也有大量扶芳藤栽 培。 扶芳藤耐寒能力强。张德舜等通过测定电解质外渗率、电阻值和气孔关闭率发现 扶芳藤可耐- 3 0 以下低温m ，。w 曲b cj 在一4 0 的低温驯化试验中发现：小叶黄杨、 锦熟黄杨、常春藤、杜鹃、葡萄、苹果等细胞张力迅速下降甚至完全丧失，而冬青和 扶芳藤细胞张力下降较平缓w 。 扶芳藤由于气生根发达，因此爬蔓能力强，根系多、分布面积大。s t a n k o v a 在抗 旱试验中使用卫矛属( 9 个种) 、枸子属( 1 3 个种) 、株木属( 9 个种) 进行试验，结 果表明卫矛属抗旱能力强，其中矮卫矛、扶芳藤抗旱能力最强m w ：王和祥等对园林 绿化常用的4 0 种灌木和木质藤本植物种进行抗旱试验，结果发现土壤含水量为6 5 1 4 5 时r 扶芳藤是最抗旱的。 ， 扶芳藤属阳性植物，喜光，但也极耐阴。王和祥等测定扶芳藤在透光率只有2 0 的林下、遮阴网下栽培时能正常生长。 扶芳藤耐贫瘠。曲宝军等研究表明扶芳藤在土质疏松的砂石地生长好，在砂石山 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 区、石灰岩山地及火成岩地区均能栽培，但在页岩地生长较慢。 许多国家对扶芳藤进行了系统的品种选育，表l 是目前已选育的扶芳藤品种。 表1国内外已选育的扶芳藤品种 t a bls e l e c t e dv a r i e t yo f e f o r t u n e ii nt h ew o r l d 1 2 2 植物辐射诱变育种 1 2 2 1 植物辐射诱变技术及其特点 在植物辐射育种的研究中，早期辐射育种以x 射线为诱变源，6 0 年代后y 射线、 中子流以及化学诱变因素应用渐广，8 0 年代以后激光、离子束开始应用于辐射育种w 。 9 0 年代后随着空间技术的发展，利用宇宙射线对植物进行诱变育种已经成为常用手 段。尽管在辐射诱变育种中有多种诱变因素，y 射线仍是植物诱变育种中最常用的 辐射诱变因素m 。 y 射线是原子核由高激发能级跃迁到低能级或基态产生的一种高能电磁辐射。y 4 扶芳藤育种中。c 0 7 射线辐射效应与杂交技术的初步研究 射线处理有两种方式，一种为设置y 圃，以o 源为中心种植多种处理材料，并按照 材料与气。源中心距离和照射时间来控制照射剂量w 。这种方法用于诱变育种不是十 分合适，但作为植物对辐照效应以及辐射生物学等理论的研究是很有意义的。另一种 方式为设置较小的鲫c o 室进行处理，可以处理植株或植株的局部，也可以对种子和花 粉进行处理。在早期的辐射诱变育种中主要是围绕种子繁殖植物来进行的，诱变对象 为种子m 。随着分子生物技术的发展，诱变对像扩展为植物的器官、细胞以及d n a 。 对植物器官和细胞进行离体诱变不仅可以大大提高诱变群体，同时也可以提高突变频 率【蚰“。 辐射诱变育种有以下基本特点： ( 1 ) 创造多种突变体，丰富种质资源库 诱变育种的基本特点是人为地诱发植物遗传基因突变。自然界自发突变是经常发 生的，但突变频率很低。辐射诱变的突变率是自然突变率的几倍到几千倍。而且产生 的突变体，有许多是自然界本来没有的新性状，因此可以丰富种质资源，为育种提供 原始材料。 ( 2 ) 打破基因连锁，提高重组率 由于基因的紧密连锁，有些不良性状总与一些有利性状相伴随，在杂交育种中难 以淘汰不良性状。植物的性状由基因控制，基因呈直线排列在染色体上，利用辐射处 理，可以使染色体断裂，当断裂的末端以另一种方式连接时，可产生多种形式的染色 体结构变异，即染色体易位、倒位、重复和缺失等，将紧靠的连锁基因拆开，使基因 重新组合，获得新类型。 ( 3 ) 保持优良特性，改良品种的某些个别不利性状 辐射处理往往产生个别点的基因突变，可以在较短时间内有效地使品种的某些单 一性状得到改良。而同时又使品种基本保持原有的遗传背景。实践证明，理化因素在 诱发大幅度缩短生育期，降低植株高度，改良株型，提高抗病性和抗虫性，对胁迫因 索的抗性，改善品质，以及改变育性等突变均有较好效果。 ( 4 ) 突变性状稳定快，育种年限短 诱变产生的突变，大多为隐性，因而突变性状稳定快，育种年限短。一般经过 2 4 代即可稳定，隐性突变在第一代一般不表现，只有到第二代隐性基因纯合时才表 现出来，并稳定遗传。有的到第三代获得稳定株系，有利于缩短育种进程，自花授粉 作物表现尤为突出。 1 2 2 2 辐射诱变的机制 辐射的作用方式主要有直接作用和间接作用两种方式。直接作用是指射线直接将 能量传递给生物分子，引起电离和激发，导致分子结构的改变和生物活性的丧失。直 接作用理论认为由于辐射造成的分子原初损伤导致了最终生物效应出现。间接作用也 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 即自由基作用理论。射线( 粒子) 首先直接作用于水，引起水分子的活化和自由基的 生成，然后通过自由基再作用于生物分子，造成它们的损伤。另外，辐射的生物效应 还受外界环境条件的影响，有氧或无氧、温度的高低、含水量的多少都能增加或降低 对生物体的损伤。 x 射线和y 射线可以使原子的内层电子激活释放，致使原子离子化而可与其它原 子和分子结合，造成共价键断裂，引起d n a 链的断裂，当修复时不能恢复到原状就 会产生突变。如果射线击中染色体则可能导致断裂，再修复时会造成缺失、重复、倒 位和易位等染色体畸变。中子与生物体内的原予核撞击后，使原子核变换产生射线等 能量交换，从而影响d 咐a 和染色体的改变。染色体结构变异是主要的诱变方式，同 时电离辐射也可诱发一定的单基因突变体m ，。细胞水平上的突变机理的中心问题是染 色体的畸变。辐射可诱发染色体数量、结构和行为畸变，染色体数量的变化往往导致 单倍体及非整倍体类型的出现，重组体的产生、染色体断裂、结构重排，以及引起染 色体行为变异，如染色体桥的出现、染色体落后等m ，。 1 2 2 3 辐射诱变的发展及成就 上世纪初，d ev r i e s 提出了辐射诱发突变的作用。m u l l e r 在柏林举行的第三届国 际遗传会议上论述了x 射线使果蝇发生突变，并认为诱发突变将在植物改良上发挥重 要作用“”。自从t o l l e m e a r 用x 射线处理烟草育成了第一个农作物突变品种c h l o r i n a f l 以来“，人们对辐射诱发突变规律开始逐步了解。在咀后的2 0 年间较多进行了关于辐 射诱变改良作物品种的方法技术，以及辐射生物学效应等基础性研究，为辐射诱变改 良作物品种的理论和技术奠定了良好的基础。上世纪5 0 年代后辐射诱变育种开始在世 界各国广泛开展起来。6 0 年代末期，辐射诱变育种取得几项突出的成就。日本利用y 射线处理育成了矮秆抗倒伏、耐寒、高产的水稻品种“黎明”，该品种成为著名的水 稻突变品种；美国利用热中子处理感染枯萎病的工业用薄荷品种m i t c h a m ，首次育成 了多年来用常规杂交育种未能成功的抗病品种t o d d sm i t c h a m ，有效地控制了枯萎病 对薄荷的严重危害：日本利用辐射诱变获得了蛋白质含量由6 5 提高至1 1 6 5 的水 稻优质突变系等。这些成就取得了显著的经济效益和社会效益，也引起了世界各国育 种家对诱变育种的重视。2 0 世纪7 0 年代以来，诱变育种的方法技术日益改进和完善， 诱变源由原来的x 射线、y 射线、中子等扩展到紫外线、电子束、激光束、离子束等。 中国利用核辐射诱发突变改良作物品种始于2 0 世纪5 0 年代后半期。主要农作物水 稻、小麦、大豆等辐射育种开始起步并取得进展。从2 0 世纪6 0 年代末期n 7 0 年代初期， 第一批水稻、小麦、大豆、谷子、花生、油菜、玉米和高粱8 种作物8 0 多个品种育成 并在生产上应用。水稻辐育1 号、小麦鄂麦6 号、大豆黑农1 6 号等就是这个时期育成的 有代表性的优良品种。同时我国开始了桑树诱变育种，中国农业科学院桑叶研究所用 y 射线处理新一之濑冬芽选育出丰产的扶桑一号，浙江省农业科学院蚕桑研究所用 6 扶芳藤育种中0 7 射线辐射效应与杂交技术的初步研究 ”c oy 射线照射新濑嫁接茁，培育出叶质优并抗疫病的四倍体桑r 8 1 一l 、r 8 1 2 等突 变体。2 0 世纪8 0 年代后，我国获得了大批优良品种，例如获国家发明一等奖的棉花鲁 棉1 号、水稻原丰早、大豆铁丰1 8 号、玉米鲁原单4 号、小麦山农辐6 3 、油菜甘油5 号 等，都是种植面积大、经济效益显著的品种。山东农科院原子能所用气oy 射线处理 玉米自交系武1 0 5 和多2 2 9 的杂交代f 1 种子，后代自交选择育成自交系原武0 2 即。以 原武0 2 作亲本，育成了一批适于黄淮海夏玉米区不同生态种植的早熟杂交种。我国通 过物理诱变育成的大麦品种主要有4 个，为7 9 3 8 、辐选4 8 、江海大麦和盐辐矮早3 。其 中盐辐矮早3 是江苏沿海地区农科所用2 5 0g yv 射线辐照早熟3 号千种子，育成的罩 熟、抗倒伏、丰产的矮秆突变大麦品种。据国际原子能机构( i a e a ) 统计，截至2 0 0 0 年，全世界已在1 6 6 种植物上诱变育成2 2 0 0 多个商用品种，我国已在4 0 多种植物上育 成6 0 0 多个新品种，占到世界辐射诱变育成品种总数的四分之一左右m 。中国的植物 辐射育种研究虽然比国外发达国家晚3 0 年，但是发展迅速，成绩斐然。 1 2 3 杂交育种研究 杂交是指遗传型不同的个体间的交配，杂交作为一种科学方法不仅促进了遗传学 的诞生和发展，而且历来就是育种学家创造变异和培育新品种的主要手段。随着现 代遗传学理论的不断发展，遗传学新分支的不断出现，人工创造新变异的方法以及新 的育种途径也不断出现，但到目前为止，最有成效的育种方法还是杂交育种。例如， 1 9 4 9 1 9 7 9 年3 0 年间，我国2 5 种主要农作物共育成新品种2 7 2 9 个，其中1 3 4 9 个为 杂交育成，占育成品种总数的4 9 。据查“c r o ps c i e n c e ”，从1 9 6 2 - 1 9 8 9 年2 8 年间， 共发表注珊小麦品种3 1 4 个，其中杂交育成的品种2 9 0 个，占育成总数的9 2 4 。 我们完全有理由相信，在今后相当长的历史时期内，在人类还不能对生物的许多目的 基因实现随意操作和组合以前，杂交育种仍将是生物改良的主要途径，分子标记等现 代生物技术的发展将为杂交育种的理论和应用研究注入新的活力。 杂种优势是指两个遗传型不同的亲本杂交产生的杂种一代在生长势、生活力、繁 殖力、抗逆性、产量和品质上比双亲优异的现象。关于杂种优势的遗传学理论很多， 其中最主要的是“显性学说”( 非等位基因间的遗传互补) 和“超显性假说”( 等位基 因问的遗传互补) ，在林业上也提出过“杂种生境”假说m 一。近年来从生理生化角度 和分子水平的研究表明，杂种优势的遗传原因在功能上表现为基因的刺激、抑制、互 补和协调。并指出杂种优势与结构基因和调节基因都可能有关，并与细胞核一细胞质 互作有关，而且也受整个遗传系统的影响。 通过杂交育种的研究，从不同种、属的杂交亲和性，杂种的结实性，杂种的遗传 学特征及新物种的人工合成等，可以阐明一些种、属的亲缘关系和自然界物种的形成 途径。此外，还可创造一些不同寻常的广泛的新类型，使杂种向着期望的育种方向发 展，有可能得到适应生态条件的新类型，这在解决引种、驯化问题上也有重要意义。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 通过杂交育种产生新品种新类型，有时也要经过某些中间杂种阶段，研究这些具有规 律性的中间阶段，有利于我们制定控制新种形成过程的方法，从而获得具有良好综合 性状的杂种。同时，在杂种类型的形成过程中，可能会出现一些自然界以前丧失了的 种和类型，也可能会产生一些新种和新类型，也是研究系统发育的重要手段。 2 试验材料和方法 2 1 试验地自然概况 试验地位于北京市海淀区香山脚下，地处东经1 1 6 。3 0 北纬3 9 。5 0 ，属山前 冲积地带，年降雨量平均6 4 4 3m m ，土壤p t t = 8 3 。2 0 0 5 年1 月2 0 0 6 年1 月为本文 试验时间，期间试验地的主要气温指标见表2 。 表2 试验期间气温情况 t a b2a i rt e m p e r a t u r ed u r i n ge x p e r i m e n t 2 2 ”c o y 射线辐射材料与方；去i 1 2 2 1 材料 供试扶芳藤品种为宽瓣扶芳藤饵f o r t u n e i k u a n b a n ，2 0 0 3 年通过国家林业局林 木新品种审定委员会审定并评为良种) 的种子和二年生匍匐型枝条。宽瓣扶芳藤直立 或攀援生长，叶阔椭圆形，在北京2 月底3 月初萌芽，1 1 月中旬停止生长，四季常 绿。抗旱能力强，可在年降雨量2 0 0 哪的地区栽培：抗寒能力强；适用于各种立体 绿化和篱笆、隔离带绿化。 2 2 2 方法 气oy 射线辐射处理在中国农业科学院原子能利用研究所辐照中心进行。种子于 1 2 月底辐射，辐射剂量分别为0 、6 0 、8 0 、1 0 0 、1 2 0 、1 4 0 、1 6 0 、1 8 0 和2 0 0g y ，剂 量率为1 3 1g y m i n 。每处理照射3 0 0 粒种子。枝条于8 月下旬辐射，辐射剂量为0 、 2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、i 0 0 、1 2 0 、1 4 0 和1 6 0g y ，剂量率为1 3 1g y m i n 。每处理照射2 1 0 根插穗。 8 扶芳藤育种中舯c 哪射线辐射效应与杂交技术的初步研究 2 2 2 1 辐射效应观测项目及方法 扶芳藤种子于1 1 月采收，晾干后未经休眠直接辐射。辐射后每处理备取1 0 0 粒 种子播于垫有干净河沙的培养皿中，置于2 5 恒温箱中培养，2 0d 后统计发芽率， 发芽率= 发芽种子数1 0 0 1 0 0 。其余种子于1 月2 0 日播于温室内，采用完全随机 设计，并使环境条件保持一致。播种后4 5d 调查出茁率，出苗率= 出苗数量播种总 数x 1 0 0 。同时统计各性状的损伤度，损伤度= ( 对照值一处理值) 对照值1 0 0 。 第1 真叶期的调查以7 5 幼苗的第1 真叶叶长达到lc m 为准。于播后1 0 0d 开始调 查苗高，连续调查4 次，每次间隔3 0d ，各处理分别观测3 0 株，分3 个重复。于播 后1 8 0d 调查存苗率，存苗率= 存活植株数出苗数1 0 0 。于播后2 0 0d 调查不同 辐射剂量植株主枝倾斜角度，即主枝与地面夹角，将夹角在0 。- 3 0 0 之问的视为匍匐 型植株，在3 0 0 - 6 0 。之间的视为倾斜型植株，在6 0 。- 9 0 0 之间的视为直立型植株， 每剂量随机调查9 0 株，分3 个重复，统计匍匐型与直立型植株的百分比。同时，测 量匍匐型与直立型植株的地径与苗高，计算植株的粗长值。 枝条于清晨剪取，选择苗木上生长健壮的二年生匍匐型枝条，根据以往扶芳藤扦 插试验得出同一类型扶芳藤枝条的生根能力表现为二年生枝条大于当年及一年生枝 条。将枝条剪成长1 2 - 1 5c m 的插穗进行辐射。枝条辐射后扦插于沙床，采用完全随 机设计，并保证水肥和光照条件一致。于扦插后2 0d 调查愈伤率，每个处理随机调查 3 0 个插穗，分3 次重复，愈伤率= 产生愈伤组织插穗数调查插穗总数10 0 。插后 4 0d 调查生根情况，每个剂量调查3 0 个插穗的生根数量及最长根的长度，调查后重 新栽予沙床中，整个过程尽量保证根系完整不受损。于插后1 2 0d 调查存活率，并将 植株从沙床中移栽到营养杯中。于次年7 月调查插穗萌发新枝情况，每个剂量分3 次重复，共调查1 5 0 个插穗，统计萌发新枝的数量及平均数。测量不同处理所有植株 每株最长枝条盼倾斜角度，统计植株的株型，即匍匐型、倾斜型与直立型的百分率( 类 型划分标准同种子辐射) 。同时，测量最长枝条的基部径租与枝条长度，计算粗长值。 8 月将营养杯中扶芳藤移植到温室外大田中，按不同处理做好标记。自1 1 月3 0 日起， 连续4 次调查不同处理植株冬季叶色保持绿色的百分率，每次调查间隔1 5d 。 2 2 2 2 突变株的田间观测与筛选 观测项目有株高、平均节长、地径、粗长、叶形指数( 叶长叶宽) 、叶尖叶 长、叶面积等数量性状，以及枝条断尖、分叉、叶序为三叶一轮或互生、叶色为彩叶 等质量性状。观测材料为种子和枝条经过辐射处理后的实生苗和无性繁殖苗，种子辐 射后实生苗共观测1 7 7 0 株，枝条辐射后扦插苗共观测4 0 0 株。 观测方法如下：株高为植株主枝茎基部子叶生长处距离茎尖的长度。平均节长= 株高( 叶子轮数一1 ) 。地径为地表处茎的直径。粗长= 地径株高。叶形指数( 叶长 叶宽) 的观钡4 均选取植株自顶端向下数的第8 - 1 0 对叶子中生长正常的一片，量其 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 叶长( 叶基到叶尖的长度) ，叶宽则以该片叶子最宽处为准测量。叶尖叶长为叶子最 宽处距离叶尖的长度与叶子长度的比值。叶面积= ( 2 3 ) 叶长叶宽。枝条断尖指 枝条尖部死亡或枯萎。分叉指枝条顶部产生分枝，呈分叉状平行生长的两个枝条。彩 叶指叶片及茎的颜色为黄绿相间的变化。 关于数量性状突变株的确定方法，范海阔m ，、苏学合m 等采用的方法是：以( 对 照平均值3 x 标准差) 为范围，各数量性状观测值在此范围之外的均视为突变株， 突变频率按照突变株数调查总株数1 0 0 计算。本试验同样参考以上方法，随机观 测1 5 0 株对照植株的各项指标值，并计算出突变范围，将大于该范围的定为正向突变 体，小于的为负向突变体。 2 2 ，2 3 突变株的p e r 检测 ( 1 ) 植物材料及引物 辐射后发生突变的植株中，以株高、地径、粗长、节长、彩叶、三叶、断尖以 及对照植株为试材( 包括种子辐射和枝条辐射的处理，按突变性状分组提取) 。本试 验从3 5 个随机引物筛选出9 个适合分析突变材料的引物。引物购于上海生物工程公 司，序列和编号见表3 。 表3 引物序列 t a b 3 s e q u e n c eo f p r i m e r ( 2 ) 所用仪器及试剂 本试验所用的试剂引物、p c r 缓冲液、m 9 2 + 、t a q 酶等均购于上海生物工程公司， d n t p s 购于北京鼎国生物技术公司，琼脂糖为西班牙进口分装，氯仿、乙醇、异丙醇、 异戊醇等均为国产分析纯试剂。 本试验所用仪器为：英国t e c h n e 公司生产的f g e n 0 5 t d 型p c r 仪，北京市 新技术应用研究所的宾达牌紫外分析仪，德国h e t t i c h 的m i k r 0 2 0 型高速离心机， m e d i ac y b e r n e t i c sg e l - p r oa n a l y z e r 型凝胶成像分析系统，北京鼎国生物技术发展 中心生产的d g i i i 型双稳数显电泳仪，上海精宏实验设备有限公司生产的d k 。$ 2 2 型 1 0 扶芳藤育种中。e 叫射线辐射效应与杂交技术的初步研究 电热恒温水浴锅。 ( 3 ) 溶液配制 提取缓冲液：1 0 0r n l v l t r i s h c i ( p h 8 o ) ，1 4 m n a c l ，2 0 m m e d t a ；2 0 n 1 m n a 2 s 2 0 5 ， 2 c 1 - a b 。 t e ( p h 8 o ) 缓冲液：1 0m mt r i s h c i ( p h 8 0 ) ，1m me d t a ( p h 8 0 ) 。 氯仿异戊醇：将氯仿、异戊醇按2 4 ：l 的比例混合。 电泳缓冲液：配制1 0 x t b e 保存，称取t r i s1 0 8g ，硼酸5 5g ，溶于lm m e d t a ( p h 8 o ) 4 0m l 溶液，定容到ll 。4 电泳时使用1 x t b e 。 ( 4 ) d n a 的提取 参考分子克隆实验指南m ，采用经过改良的c t a b 法提取d n a m x ，步骡如下： 1 ) 取幼嫩叶片约5 0m g ，置于研钵中，加入液氮，研磨成细粉末状( 磨碎的标 准是看不见叶组织) 。 2 ) 将粉末置于1 5m l 离心管中，加入提取缓冲液3 0 0 u l 。 ， 3 ) 上下颠倒2 - 3 次，置于6 0 水浴中5 0 m i n 。 4 ) 加入3 0 0 u l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，混匀后1 3 0 0 0r r a i n 离心5r a i n 。 5 ) 转上清液于新的离心管中。 6 ) 加入0 6 体积异丙醇，混匀，置于- 2 0 保存1 5 m i n 以上。 7 ) 1 3 0 0 0r m i n 离心5m i n ，放入时应视离心管内液体体积对称放置。 8 ) 弃上液，加入3 0 0 u l 7 0 乙醇( 含l om mn h 4 a c ) ，瞬时离心1 5s 。 9 ) 干燥d n a ，直至离心管内无乙醇的气味为止。 1 0 ) 提取的d n a 保存在2 0u l t e 中，置于2 0 条件。 1 1 ) d n a 浓度的调节采用加入t e 稀释的方法。将提取出的模板d n a 凝胶电 泳，经过5u lt e 进行浓度调节，直到亮度一致。条带太暗的则重新提取 d n a 。 ( 5 ) p c r 扩增及产物的电泳检测 p c r 反应采用常规p c r 反应程序。在冰上建立反应体系，反应液总体积为2 0u l ， 其中含模板( 1 0 0 n g ) d n a lu l ，p c r 缓冲液2 u l ，2 0 m m m 9 2 + 2 u l ，1 0 m i v l d n t p s l l l l ，随机引物2u l ，d n a 聚合酶o 2 5u l ，d d h 2 0 补足，加矿物油2 0u l 。扩增条 件为：9 4 预变性4 m i n ，9 4 变性4 0s ，3 6 复性3 0s ，7 2 延伸2 m i n ，共3 5 个 循环；晟后7 2 延伸1 0 m i n ，4 条件下保存备用。 琼脂糖用1 0 m l l t b e 和9 0 m l 灭菌水配制成1 5 琼脂糖凝胶，加入1 0 - 2 0u l 朗。再将凝胶倒入预先制备好的胶模中，插好梳子。待其冷却后取下梳子，置于lx t b e 电泳槽缓冲液中。将扩增产物与4u l 浓度为0 2 5 的溴酚兰混匀，加入点样孔 中。在5v c m 电压下电泳分离1 5 - 2h 后，在紫外凝胶分析仪内观察条带，并照相 记录。 内蒙古农业大学硕士学位论文11 2 3 杂交育种材料与方法 2 3 1 杂交组合的选择及目的 l 杂交试验于2 0 0 5 年、6 月中句至8 月初进行，试验所采用的亲本有： 红脉扶芳藤饵f o r t u n e i h o n g m a i ，以下简称“红脉型”，2 0 0 3 年通过国家林业 局林木品种审定委员会审定并评为良种) ：匍匐生长，叶片椭圆状，冬季叶片鲜红色， 部分叶片存活期可达3 年，可耐一3 5 的低温：可用于城市立体绿化、荒漠治理、水 土保持等；适应于我国东南、华南、西南和华中地区，可推广至我国华北北部、东北 的西南部和西北的部分干旱半干旱荒漠或沙漠地区。 宽瓣扶芳藤沮f o r t u n e i k u a n b a n ，以下简称“宽瓣型”，2 0 0 3 年通过国家林业局 林木品种审定委员会审定并评为良种) ：直立或攀援生长，叶阔椭圆形，在北京2 月 底3 月初萌芽，1 1 月中旬停止生长，四季常绿。抗旱能力强，可在年降雨量2 0 01 1 1 1 1 1 的地区栽培：抗寒能力强，可在一2 0 左右的气温条件下保持常绿状态越冬：适用于 各种立体绿化和篱笆、隔离带绿化。 胶东卫矛( ek i a u t s c h o