（分析化学专业论文）利用滚环放大技术及共振光散射检测dna及其突变的研究.pdfVIP

摘要 摘要 滚环放大( r 0 1 l i l l gc i 】c l e 鼬p l i f i c 撕o n ，r c a ) 是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方 法。该技术是借鉴噬菌体d n a 分子滚环式的复制方式建立起的核酸扩增技术。这种方 法可以直接扩增d 1 叮a 实现对靶核酸的信号放大，取得核酸分析的高灵敏度，因此在核酸 检测中具有很大的应用价值和潜力。 在本文中，我们利用锁式探针在连接反应中的单碱基识别的特异性和滚环放大技术 对目标研妊进行检测，同时研究了由于单碱基突变所形成的单核苷酸多态性。锁式探针 是一段线性d n a ，它可以与另一段具有特殊序列的叮a 发生识别作用，弯曲成环状结 构。只有能够发生连接反应的锁式探针才可发生滚环放大反应。放大后，延伸产物与标 记在金纳米粒子上的妊进行杂交，通过检测其共振光散射( r e s o n 舳c e l i 抄锨舭血g ，r l s ) 强度来检测目标d n a 的含量。该方法在放大反应后不需分离，得 到的共振光散射强度与目标研妊浓度在o 1 衄1 0 l l 尸2 0 衄儿范围内呈良好线性 关系，检出限为0 0 7 7 舢儿。 在r c a 反应过程中会产生大量的碱基延伸，当d n t p s 结合到模板的同时释放出等 量的焦磷酸( p p i ) ，而焦磷酸可以降解为磷酸，所以可以通过检测溶液中磷酸的含量间接 检测m 蛆。本文第三部分中，我们建立了一种测定微量磷酸的共振光散射分析新方法。 研究发现在h 2 s 0 4 介质中，p 0 4 3 与m 0 0 4 2 反应生成磷钼杂多酸，磷钼杂多酸与阳离子 染料奎宁可形成稳定的离子缔合物，并在3 9 8 o 腿处产生灵敏的共振光散射峰。磷酸浓 度在l 2 0 0p g l 范围内与共振光散射强度具有良好线性关系，对磷酸的检出限( 3 0 ) 可 达到0 5 嵋几。该方法操作简便、灵敏度高、选择性好，为进一步检测d _ n a 打下了基 础。 关键词滚环放大金纳米粒子d n a 杂交共振光散射奎宁离子缔合物 a b 姗t a b s 仃a c t r d l l i i 坞c i r c l e 锄叩l 洫c a t i o n ( r c a ) i sa 舱c e n t l yd e v e l o p e di s o t b e 彻a l 肌c i e i c i d 锄p l i 丘c 嘶0 nm 甜1 0 d m 珊言m o di sb 鸽c d0 n 也e 丘d m n g 妇d n ac 硫l e sc 姐b ec o p i e db y ar o l l i l l gc 硫l e 锄1 p l i f i c a 缸o nm e c h a n i s 弛h 1 0 w n 舶mt h e 唧l i c 砸o no f p h a l g eg e m e s t h i s m 础0 dc a nn o to n l y 锄p 崎d n ad i r e c l 堍b u ta l a l l o wm e 耐嘲e m e n to fs i g n a lf b o m t a ：唱e tm j c l e i ca c i d sw i t l lt h es e n s i d v 蚵u pt 0o n ec o p yo fn u c l e i ca c i ( bm o l e c 试e a sa 心砌t ， r c a t e c b i n i q u ei n d i c a t e sg r e a t 砌u e s 舳dp o 删a l si nt l l ed e t e c t i o no fn u c l e i c i d s 1 1 1t h i s 腼| b s i sw ed e s c r i b ean l e 廿川f o rs n p sd e t e c t i o n 舶mt a r g e td n ab a s e do n p a m o c k 即b eh g a - d 1 e d i a ：t cs i n 西em j c l e o t i d ed i 而坷n a ：t i o na n ds i 印a l 跚p l i f i c a ：t i o nb y r c a p a d l o c k 砌ei sl i l 坞盯d n ap r o b e 廿豫tb e c o m ec i 彻l 】鲥z e d u p o n c 0 画t i o fa s p e c i f i cn u c l e i ca c i d q u 铋c e ，s i i l o n l yh g a e dp r o b e sa 阳锄叩l i f i e d t h ec o u r s eo fr c a 陀删o ni ss h 碰e db yh y b r i 此妇go l i 9 0 n u c l e o t i d 憝l a b e l e do n9 0 l dn 觚o p a r t i c l et or c a p r o d u c t s ar e s o m m c el i g h t - a t t e 血1 9 ( r l s ) b 嬲e d a d o u ti se i n p l o y e dw h i c hd o e s1 1 0 t n e c e s s 硫ep o s t - 嬲s a y 衄f i 础o ns t 印s t h er l si n t e n s i 够i s p r o p o r t i o n a l t ot h e c o n c e n t r a t i o no ft a ：唱e td n ai nt h er 姐g eo f0 1 ，珊优艺0n m o 。觚dt h ed e t e c t i o n l i m i t ( 3 0 i s0 0 7 7 + 彻l i b e c a l 啪o ft e n so f 岫a n d sb 乏圆e 印【t e 璐i o ni n 也ep 加l c e s s0 fr c a ，e q u i v a l e n t p 弘叩h o s p h o r i ca c i d ( p p i ) i sr e l e 嬲e dd u r i l l g 弧甲o r a t i o no fd n t p s 幽t h et 唧l a t e a sp p i c 趾b ed e 伊a d e dt 0p h 0 s p h o r o u s i d ，衄t h ed n ac 砚b ch i i r t l yd e t e c t e db yd e t e c t i n g p h o s p h o r o l l s i d i l l 也e 也i r dp a r to f 也e 也e s i sw ej f i n d 也a ti nt l 埒m e d i 眦0 fh 2 s 0 4 ，p 0 4 ) 比a c t sw 池m o o 。t 0 即d u c ep h o s p h 伽l y b d a 钯h e t e r o p o l y 斌w i l i c hc 趿c o m b i n e 硎o i l i cd y e - q u i n j n et 0f 0 眦蛆嬲c i a t i e dc o m p l e x t h ec o m p l e xe ) 【l l i b i t sas e l l s i t i v e r e s o 姐n c en g h t - s c a n e r 蚍p e a l 【a t3 9 8 0 衄7 i k r ei sa9 0 0 dl i i l e 盯r c l a t i o 璐h i pb e t 、e e nt h e r l si 1 1 t e r 塔时a n d 廿1 ec o n c e 曲觚o no fp h o s p h o r o 璐i di nt h e 啪g eo fl 砣o o 熠几1 k d e t e c t i o nl i l n i t ( 3 0 ) 蠡) rp h 0 s p h o r 0 璐i di s0 5 腭皿b 嬲e d0 n 也i s ，a wr l sm e m o d 矗w d c = t c 棚血觚o no f 血c r 0 砒小m n ：t so fp h 0 s p h o f 0 璐a c i dh 雒b e e ne 鼬a b l i s h e d t h ep r o p o s e d m c 也o di c o n v e n i e 咄s e 璐i t i v ea n ds e l c c t i v e ，w i l i c h 叩e 璐u pn e 、p o s s i b i l i t i e sf o r 觚a l y s i so f d n a k e yw o r d s ：r o l l i i l gc i l c l e 锄p l 涵c a l i o n ，g o i dn 锄o p a r t i c l e s ，d n ah y b r i d i z a t i o n ，r e s o 施n c e l i g h tsc a _ t t e i i i l g ，q u i n i j 嬲c i a t e dc o m p l e x 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了致谢。 1j 作者签名：鱼盔蓝日期：垄塑年臣月j 三日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密曰。 ( 请在以上相应方格内打“”) 作者签名： 导师签名： 1 毒 茹蠛日期：塑年上月l 日 日期：趟年月j 三昌 保护知识产权声明 枞赢大学亍吵姗为麟一撇 论文，是我个人在导师鼋誊研) 指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得 的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全 了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北 声明人：盔垄：丝 ：日期：鲨塑年月l 乏一日 作者签名： 导师签名： 日期：业上月立日日期：鲨：望年上月l 日 日期：坦塞年上月上三一日 第l 章引言 第1 章引言 核酸( n u c l e i ca c i d ) ，储存着生命体的全部遗传信息，在生命的起源、生物的遗传变 异、物种的进化等方面起着决定性的作用。核酸的研究，是化学、生物学、医学等诸多 学科最为活跃的研究领域之一。特别是脱氧核糖核酸( d e o x 如b o n u c l e i c a c i d ，d n a ) 在 生物体的生命活动中起着重要的作用【l 】，它是主要的遗传物质，具有重要的生物功能。核 酸特殊序列及单碱基多态性的检测，在临床诊断，病理分析方面都有很重要的作用。 但是，一般能获得的人类样品d n a 的含量有限，须在提取d n a 后对整个基因组进行 扩增。目前，该扩增可用聚合酶链反应( p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ，但p c r 会产 生非特异性扩增，同时具有操作频繁( 需要多个热循环) ，不易实现高通量分析等缺点， 故需更为简单、稳定的方法进行基因组的扩增和分析。 1 9 9 8 年建立的滚环放大( r o l l i n gc i r c l e 锄p l i f i c a t i o n ，r c a ) 技术可用于大量扩增 环状d n a 模板，例如质粒和噬菌体d n a 。该技术是借鉴自然界中环状病原生物体d n a 分子滚环式的复制方式建立的核酸扩增技术，可在室温下进行，使用两个引物就可实现 指数滚环扩增，具有快速、灵敏、特异的特点。 1 1 滚环放大原理及其在生物领域的应用 1 1 1 滚环放大的原理 r c a 检测技术是基于d n a 或r n a 引物沿环状d n a 等温滚动复制的技术。实验中 首先设计一个大约8 0 个碱基的单链d n a ，在此单链的3 和5 端各有一段序列可以与所 检测基因上一段连续的靶序列完全互补，当被检测的d n a 或i a 样品中含有可互补于 单链环两端序列的靶序列时，将与之杂交形成有一切口的局部双链，在盐离子和a t p 含 量合适的环境下，连接酶可以将杂交在靶d n a 上相邻的两段基因间的这个切口连接起 来形成挂锁式拓扑环。此时预先设计的扩增引物便以该坏为模板进行滚环复制，形成滚 环的单链重复体，通常称其为线性滚环放大。在线性r c a 的基础上加入另一引物，使 之结合到滚环复制后的重复拷贝单链产物上进行扩增，这个扩增序列又可成为最初与滚 环结合的引物模板再进行新一轮扩增，如此周而复始最终扩增出以滚坏长度为单位的不 同长度双链d n a 产物，这种扩增形式称作支链放大扩增，支链扩增的产物在电泳凝胶上 1 河北大学理学硕十学位论文 也呈现阶梯样分布。反之，如果样品中不含有要检测的靶序列，环形探针不能被环化，这 些扩增反应也就不会发生，故也有人将这种反应称为连接依赖性r c a 扩增【2 1 。等【3 】 专门对拓扑结构下的滚环复制过程进行研究发现，模板d n a 或r n a 的拓扑结构并不影 响通常的聚合酶对r c a 的催化反应，并且在r c a 反应后模板d n a 又可恢复天然的拓扑 结构。所以，不需要对模板进行特殊的变性过程，这无疑为r c a 在临床诊断上的应用提 供了可行的依据。 1 实用r c a 形式 利用r c a 检测靶核酸序列一般有两种途径：一种直接扩增环形单链模板，然后检测 扩增信号，例如测序模板的制备，测序的起始物可来源于菌落、培养物、甘油储存的细菌 或噬斑等的环形模板【4 】；另一种则首先通过连接反应环化与模板链杂交的探针，再扩增已 环化的探针，然后检测扩增信号，例如，s n p s 的检测。后一种途径中的探针常被称为锁式 探针( p a d l o c kp r o b e ) 。锁式探针的两端与靶核酸序列特异性互补，当有错配碱基存在时， 探针的连接反应就无法完成，因此确保了d n a 和r n a 检测中的高特异性【5 1 。同时，锁式 探针和靶序列的杂交会产生较为稳定的拓扑结构，从而保证了杂交连接产物的稳定性。 r c a 的检测既可以在液相完成，也可以微阵列的形式实现，从而实现高通量基因组检测。 检测方式有多种，例如荧光检测，放射性标记检测，紫外光吸收检测以及凝胶电泳检测。 2 r c a 的优势与不足 与其他核酸扩增技术相比，r c a 有许多优势：( 1 ) 高灵敏度。r c a 有很强的扩增能力， 线性r c a 的效率可达到1 0 5 倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单分子水平【6 】；( 2 ) 高 序列特异性。利用锁式探针检测靶序列时，由于探针5 端与3 端的连接需要探针的两段 识别序列与靶序列完全互补，因此可以区分单一位点的单碱基错配，广泛应用于s n p s 的检测；( 3 ) 多元性。r c a 中的通用引物可以等效率地扩增多条相异的锁式探针，克服 了p c r 等其他液相扩增方法中反应物和扩增产物的相互反应和干扰；( 4 ) 高通量。传统 的核酸扩增技术如p c r 等由于扩增产物扩散进液相而不能积累扩增信号，因此都不能在 芯片上进行扩增，而r c a 则可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保r c a 产生的信 号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增；( 5 ) 简单易操作【j 7 1 。一方面，r c a 是一种 等温扩增方式，不需要特别的热循环仪器，避免了复杂的热循环过程；另一方面，只要保 证探针的识别段序列与靶序列互补，探针与靶序列的杂交结合时可以不考虑靶序列的性 2 第l 章引言 质( r n a 或者d n a ) ，因此检测r n a 链时不再需要预先进行砌蛆的逆转录( r e v e r s e 咖n s 嘶p t i o n ，i 盯) 。 r c a 的检测方法也有一些不足之处。是锁式探针的成本问题。锁式探针目前主 要的获得方式是直接合成，由于它常有接近l o ob p 的长度，因此合成费用较高。通常针对 不同靶序列设计的探针可以有相同或几乎相同的连接序列，所以当需要较多数量的锁式 探针时，可以考虑采用以通用连接序列为模板、特异性互补区序列为引物的p c r 反应来 合成探针。目前有报道采用这种方法在实验室中合成探针，用p f h 聚合酶实现了 6 0 一7 0 探针产物的正确合成和相应的连接效率【8 1 ，这将在很大程度上降低成本。二是 信号检测时的背景问题。r c a 过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板d n a 或者 i a 可能产生一些背景信号。为了解决背景信号的问题，目前主要的方法是采用固相 r c a 反应，使用表面修饰的磁珠固定模板d n a 或r n a ，再进行扩增，结果证明可以检测 到单拷贝模板，且产生很强的信号【9 】；此外，在液相r c a 反应中引入d m s o 和t 4 基因 结合蛋白，也会在很大程度增强扩增的效率和虽后的信号强度；也可以通过外切酶消除 未成环锁式探针和未结合探针的模板d n a 产生的背景，m 撕a l l n a 和s z e m e s 等使用一种 e x o n u c l e a s ei 与e x o n u c l e a s e i i i 混合的酶反应液【5 】，能够在连接反应后有效地去除线性锁 式探针和未结合的模板d n a 。 1 1 2 滚环扩增在生物领域的应用 1 s n p s 检测 s n p s 是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列多态性，它是人 类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的9 0 以上。随着利用高密度s n p s 图谱分析疾病遗传学基础及药物反应的重要性不断提高，越来越有必要寻找到一种经济 且高通量的s n p s 分型方法。在s n p s 的分析中，p c r 是一种常用手段，但是由于p c r 技 术的特异性较低、对样品纯度要求高等一系列问题，已经成为其发展的瓶颈。r c a 技术 的应运而生使这些问题有了较大的改善。1 9 9 7 年n i l s s o n 等人【1 0 】首先将r c a 用于s n p s 方面的研究，研究中利用连接反应需连接末端准确匹配的特点进行基因突变的检测1 ， 这也是r c a 最早用于s n p s 分析研究的报道。用于s n p s 分析的r c a 技术一般首先设 计一种探针，这种探针的每个末端包含1 5 2 0 个可与靶序列互补的核苷酸。当这些序列 与靶序列结合后再通过连接酶将之连接为环状，像一把挂锁锁在检测基因的靶位上，这 气 河北大学理学硕十学位论文 个环形探针就可通过引物进行滚环复制。若靶序列上存在变异甚至不存在所要检测的靶 基因，探针无法被连接成环状，r c a 反应也就无法进行。尽管环形探针在特异性上有它 的优势，但若无进一步的支链放大反应，它的灵敏度还是达不到检测要求。而通过支链扩 增后，在原始序列为突变序列5 0 0 倍的混合核酸溶液中，可将检测突变分子的灵敏度提高 至1 0 个拷贝左右【汜】。 2 细胞原位检测 原位r c a 技术可以用来分析细胞中的染色体情况。分析细胞染色体情况的最初方 法是直接检测与靶核酸序列特异性互补结合的锁式探针，借助于一些报告分子如荧光分 子、生物素、地高辛等，显微镜下就可以看到和染色体结合的环式探针。而引入r c a 技 术则可以在很大程度上提高检测的灵敏度，只需要在锁式探针和靶核酸序列特异性地互 补结合后，采用i 坨a 进一步扩增己成环的探针，最后检测扩增信号结果。 原位r c a 技术是细胞内检测较理想的方法。通过锁式探针和模板链的杂交以及之 后的连接扩增反应，大量的扩增产物( 长度可大于8o o ob p ) 在细胞内靶目标上生成，克服 了原位p c r 中扩增产物会扩散出细胞的缺点。而且，由于r c a 技术是在一种等温条件 下进行的，因此能够完整地保持组织的形态学特征。此外，由于锁式探针的杂交只针对靶 目标上特定的序列( 5 0b p 左右) ，且不需要在靶目标上进行直接的引物延伸，因此靶目标 序列之间的交联及一些特殊结构对r c a 过程的影响非常小【1 3 】。采用这种技术，一个拷贝 数的基因，例如t p 5 3 ，能够在h l b 细胞中被检测到，而且信号集中在靶目标上。该方法 还被推广到了同一个细胞的多条i a 的分析检测( t p 5 3 ，p 7 2 ，v i m 既t i nk 训i n1 0 等) ，m r n a 的表达水平最终通过图像系统定量显示【1 4 】。 利用r c a 还能够对单个细胞进行基因点突变检测。c m s t i a l l 等【1 4 】利用滚环扩增对 固定的细胞在原位进行基因拷贝数目的检测和单碱基突变的检测，效率达到9 0 以上。 所以滚环扩增技术在细胞原位检测方面是一个强有力的分析方法。 3 全基因组d n a 检测 几乎所有的分子生物学研究都需要d n a 的扩增，来源于病人的d n a 标本量是有 限的，而高通量遗传分析需要大量模板用于实验，因此保证模板的质和量是非常关键的。 近年来，r c a 方法已被用于扩增大的环型d n a 模板，例如质粒和噬菌体d n a ，r c a 方法 也扩展到了应用核酸酶抗性引物和p h i 2 9d n a 聚合酶进行全基因组扩增( w h o l e 4 第l 章引言 g e i l o m e 锄p l i f i c a t i o n ，w g a ) 。 有报道提出一种多重替换扩增( m u i t i p l ed i s p l a c e m e n t 卸叩l i f i c a t i o n ，m d a ) 的方法f 吲， 该方法利用p h i 2 9 酶扩增全基因组d n a ，能够从小于1 0 个人类细胞里精确扩增d n a ， 平均产物长度超过1 0k b 。全基因组d n a 通过r c a 在3 0 扩增4 6h 达到平台期，尽管 其起始物差异大于5 个数量级( 1 0 0f g 1 0n 曲，但1 0 0 “l 反应液里扩增d n a 产量恒定范 围为2 啦3 0p g 。这就是说，不同浓度或量的标本可以为随后的遗传分析提供一致的产物， 而无须测量或调整d n a 浓度。此外，这种方法也能直接从全血中均匀地扩增人类基因组， 而无须纯化d n a 。 目前，还有一种改进的全基因组r c a 方法，称为限制性环化r c a ( r e s t r i c t i o n 锄d c i r c u l 撕z a t i o n a i d e dr o l l i n gc i r c l e 帅p l i f i c a t i o n ，r c a r c a ) 【1 6 】。这种方法首先使用限制性 内切酶把d n a 消化成短片断，然后环化成坏状d n a 单链，最后进行h r c a 。从福尔马 林液浸泡的石蜡包埋组织中提取的d n a 常常会出现明显的降解和交联，传统的p c r 无 法扩增这样的模板d n a ，而通过采用r c a r c a ，已降解的d n a 可以成功地被扩增数千 倍，且扩增产物能进一步用于基于芯片的比较基因组杂交( a r r a y - c g h ) ，微卫星稳定性 ( m s i ) 以及定量p c r 等分析。 总之，滚环放大技术是一种简单且功能强大的核酸扩增方法，通过结合生物标记，可 以有效的放大信号，为核酸序列的检测分析提供通用模板。该技术由于在特异性、灵敏 度、拓展性等许多方面都明显优于传统的核酸扩增方法，未来有望成为实验室分析和临 床诊断分析的有效工具和手段，在医药领域有着广泛的应用前景。 1 2 纳米粒子探针在d n a 杂交分析中的应用 1 2 1 纳米粒子概述 近年来纳米材料发展迅速，尤其是纳米粒子以其独特的物理、化学性质受到科学界 的更多关注。纳米粒子( n 锄o p a n i c l e s ) 是指粒径在1 l o o 啪范围内的粒子，其尺寸介于 原子、分子与宏观体相之间。由有限个原子或分子组成，能保持物质原有化学性质，处于 热力学不稳定的亚稳态的原子或分子群，是一种新的物理状态。当物质的尺寸减小到纳 米范围时，就具有了一些特殊的性质，如表面效应，小尺寸效应，量子效应，宏观量子隧道 效应等【1 7 1 。 5 河北大学理学硕十学位论文 1 量子尺寸效应 当粒子尺寸达到纳米数量级时，金属费米能级附近的电子能级由准连续变为分立能 级的现象称为量子尺寸效应。能带理论表明：金属纳米粒子所包含的原子数有限，能级间 距发生分裂。当此能级间隔大于热能、磁能、静电能、静磁能、光子能量或超导态的凝 聚能时，纳米粒子的磁、光、声、热、电及超导电性与宏观物体有显著的不同。例如：纳 米粒子所含的电子数的奇偶性不同，低温下的比热容、磁化率有极大差别；纳米粒子的 光谱线频移、催化性质也与粒子所含电子数的奇偶性有关【1 8 】。 2 体积效应 由于粒子尺寸变小所引起的宏观物理性质的变化称为体积效应。当纳米粒子的尺寸 与德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等物理特征尺寸相当或更小时，晶体 周期性的边界条件将被破坏；非晶态纳米粒子的表面层附近原子密度减小，导致声、光、 电、磁、热力学等特性呈现新的体积效应。例如：磁有序态向磁无序态、超导相向正常 相的转变；光吸收显著增加；声子谱发生改变：强磁性纳米粒子( f e c o 合金，氧化铁等) 尺寸为单磁畴临界尺寸时具有很高的矫顽力；纳米粒子的熔点远远低于块状金属；等离 子体共振频率随颗粒尺寸改变【1 9 之0 1 。 3 表面效应 表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随着粒径减小而急剧增大后 引起的性质上改变。随着粒径减小，表面原子数迅速增加，粒子的表面张力和表面能增 加。原子配位不足以及高的表面能使原子表面有很高的化学活性，极不稳定，很容易与其 他原子结合。表面原子的活性引起了纳米粒子表面输运和构型的变化，也引起了表面原 子自旋构象和电子能谱的变化【2 i 】。例如：化学惰性的p t 制成纳米微粒p t 后成为活性极 好的催化剂。 4 宏观量子隧道效应 微观粒子具有穿越势垒的能力称为隧道效应。人们发现一些宏观量，例如微粒的磁 化强度、量子相干器件中的磁通量也具有隧道效应，称为宏观量子隧道效应。量子隧道 效应是未来微电子器件的基础，它确定了现存微电子器件进一步微型化的极刚2 2 1 。 正因具有这些特殊的基本效应，才使纳米粒子表现出一些特殊的物理化学性质【2 3 之4 】： ( 1 ) 特殊的化学反应活性：纳米粒子与常规物质比较，表面原子数多，表面配位不足，存在 许多悬键和不饱和键，使其具有较高的反应活性；( 2 ) 催化性能：纳米粒子表面积大，表 6 第1 章引言 面原子数多，表面活性高；( 3 ) 光学性质：纳米粒子由于具有一些特殊效应使其光吸收出 现蓝移，荧光光谱也出现蓝移，而且出现许多常规物质所不具有的发光现象；( 4 ) 热学性 质：纳米材料界面原子分布比较混乱，界面原子体积百分数较大，所以它的比热比常规材 料高；( 5 ) 磁学性质：纳米粒子的量子尺寸效应、表面效应等使它具有常规材料不具备 的磁特性；( 6 ) 力学性能：纳米材料有很大的表面积体积比，杂质在界面的浓度大大降 低，从而提高了材料的力学性能；( 7 ) 热导性能：超微粒子在低温或超低温条件下，几乎， 没有热阻。如a g 超微粒子在超低温下具有较佳的热传导性；( 8 ) 超导性：高温超导铍、 铜、钇等材料随着粒子的细微变化，超导临界温度逐渐提高。 纳米粒子不仅在材料科学方面备受关注，而且在生命科学及其分析领域引起广泛的 兴趣。纳米粒子特有的量子尺寸效应使纳米粒子的光学性质具有随粒子直径大小变化的 特性，而且纳米粒子具有独特的生物兼容性，蛋白质、核酸等生物大分子吸附在纳米粒子 上不会失去活性。纳米粒子探针，充分的利用了纳米粒子的这两个特性，显著提升现有分 析方法的灵敏度，在生命分析科学中发挥着突出的作用。 1 2 2纳米粒子探针在d n a 杂交分析中的应用 探针( p r o b e ) 通常是指针对某种特定目标物的探测器，在化学及生物领域所说的探 针，是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可通过一定的检测手段对其 进行分析。例如抗体一抗原，生物素一抗生物素蛋白，生长因子一受体等的相互作用以及 互补核酸之间的杂交都可以看作是探针与靶分子的相互作用。其中发展最早、应用最多 的是基于核酸分子杂交原理的核酸探针。 迄今核苷酸特殊顺序的测定大多利用一个固定的目标聚核苷酸与连有标记物的寡 聚核苷酸探针杂交的方法，目前常用的标记物有放射性同位素( 3 2 p 或3 5 s ) 、有机染料 【2 5 之9 1 、酶或底物【3 0 1 、化学或生物发光体系【3 1 3 3 1 和荧光物质3 4 3 6 1 等。放射性同位素的使用 不仅有可能损害操作人员的健康，而且半衰期较短，难以获得长期稳定的检测标准：酶标 记分析法虽克服了放射性污染的弊病，但酶本身容易失活；化学发光和生物发光分析法 的灵敏度很高，但其影响因素多，稳定性差，结果的重现性差；虽然荧光标记的检测体系 克服了以上缺点，而且近年来在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断 等领域得到了广泛应用【3 7 瑚】，但是它们对测定的仪器设备要求较高【3 9 】，荧光标记物也 比较昂贵。目前，应用最为普遍的荧光探针是有机染料，在大多数情况下，由于它们的激 7 河北大学理学硕士学位论文 发光谱都较窄，所以很难同时激发多种组分，而其荧光特征谱又较宽，并且分布不对称， 这又给区分不同探针分子的荧光带来困难，因此要同时检测多种组分较为困难。有机染 料最严重的缺陷还是光化学稳定性差，光漂白与光解使每个染料探针能够发出的荧光光 子平均数量不可能太多，光解产物又往往会对生物体产生杀伤作用。利用纳米粒子作为 生物探针就能较好的解决这些问题。 近年来，有关纳米材料的合成和应用方面的研究工作进展迅速，特别是纳米金，在分 子生物学领域的研究和应用已成为目前科学研究的热点。鉴于金纳米粒子与巯基之问能 共价键合【加】，这使得胶体金与巯基修饰的生物活性分子结合后形成的探针可用于生物体 系的检测中。这种复合探针较早被人们用在免疫学检测中，通过抗原抗体的相互作用可 以得到清晰的光学或电子显微镜图像【4 1 4 2 】。人们对胶体金在功能化固体表面的化学组装 行为也做了大量的研究【4 3 4 5 1 ，但对d n a 片段作为程序化组装元件并未受到材料化学家足 够的注意甚至还有一些争测4 6 1 。 1 9 9 5 年，n a t a n 研究组首次利用金属粒子( a u ，a g ) 组装到膜表面，并研究了其作为 s e r s ( 表面增强拉曼散射) 基底等方面的应用。该研究组还报道了纳米粒子放大s p r ( 表面等离子体共振) 超灵敏检测d n a 杂交新方法 4 7 】。相应的检测灵敏度与未经放大相 比提高了1 0 0 0 倍以上。用肉眼可见的4 4 的阵列，用2 4 m e r 寡聚核苷酸可达到1 0 衄o l l 的定量检测限。即使没有更深入的优化，这种方法的灵敏度也开始接近传统的荧光检测 d n a 杂交的方法。这些结果显示了纳米粒子增强的s p r 在阵列d n a 分析和寡聚核苷酸超 灵敏检测中的应用前景。 1 9 9 6 年以来，美国西北大学纳米技术研究所纳米装配和分子自组装中心c h a da m i 出n 教授领导的研究小组在纳米金与d n a 片段之间的相互作用方面做了大量深入 细致的创造性的工作。利用纳米金在d n a 片段作为组装分子的引导下可形成超分子结 构的特点，建立了用巯基化寡聚核苷酸探针标记纳米金并检测特定寡聚核苷酸序列的新 方法【4 8 5 2 1 。该小组在纳米金寡聚核苷酸探针的制备、纳米金及其组装态的等离子体共 振吸收，以及用纳米金寡聚核苷酸探针比色检测寡聚核苷酸的方法等方面为特定寡聚 核苷酸序列检测的研究和应用开辟了一个新领域。 m i r k i n 等在研究中创造了一种巧妙的方法【5 3 1 ，用于检测溶液中是否存在某种特定序 列的d n a 靶分子。他们的方法使用了两组不同序列的d n a 探针标记的1 3 啪大小的金纳 8 第1 章引言 米粒子。第一组金纳米粒子所带的d n a 同靶序列的一半结合，第二组所带的d n a 同靶序 列的另一半结合。有着完整靶序列的d n a 迅速地杂交在两种类型的金粒子上而使它们连 接在一起。由于每个金粒子都有许多d n a 探针，d n a 靶分子通过与d n a 探针杂交，将金 纳米粒子组装在一起。当这些金纳米粒子结合在一起形成多聚网状结构，其光学性质便 发生了显著的变化，使溶液由红色变成蓝色，产生寡聚核苷酸的杂交信号。由于实验结果 无需任何检测仪器就很容易看出来，这种方法有广阔的实际应用前景。1 9 9 7 年m i r k i n 研 究小组报道了用比色法检测靶序列的d n a ，灵敏度达到了1 0 觚l 寡聚核苷酸的水平 【5 4 1 。同时该研究组还利用核一壳a g a u 进行d n a 检测【5 5 1 。先用文献方法制备a g 纳米粒子， 粒径约1 2n m 。然后加入h a u c l 4 和n a b h 4 等，便在a g 核表面形成单层金膜，膜厚近似一个 金原子的厚度。这样就形成了a g 核a u 壳的结构。这样做的好处是：a g 粒的光学性质优 于a u 粒，金膜不会掩盖a g 核的光学性质。与金相比，a g 粒易聚集，稳定性差。包上金膜后， 由于金的稳定性及与巯基的强亲和性，为比色检测d n a 增添了一种新方法。 鉴于金纳米粒子标记的d n a 探针与寡聚核苷酸杂交后金纳米粒子所形成的聚合网 络结构具有特殊光学性质，m i r k i n 等人又将体系推广至d n a 芯片的检测中。传统的基 因芯片检测技术基于对杂交在探针阵列上目标d n a 的量的检测，靶序列与不同探针杂交 量的比值决定了检测的效率。用金纳米粒子标记的d n a 探针检测的方法中，被固定的寡 核苷酸探针与靶序列结合，再结合与靶序列互补的金纳米粒子标记的d n a 探针，产生粉 红色斑点。此反应可以通过加入银显影液放大。通过特定温度及特定盐浓度缓冲液洗涤， 检测产生信号的灰度，可以定量研究靶序列的杂交。该方法具有单碱基错配的选择性及 超过荧光检测1 0 0 倍的敏感性【5 6 】。m i r k i n 等设计了特定位点碱基分别为a 、t 、g 、c 的 四条探针并把它们固定在玻片上，一条与靶序列完全互补，三条单碱基错配。检测了不同 浓度的靶序列与芯片的杂交并与相应c y 3 标记探针的杂交作了比较。结果检测到的最低 靶浓度为5 06 n o l l ，比荧光检测的灵敏度( 5p m o l l ) 提高了1 0 0 倍。洗涤后各个点上杂交 信号出现区别，金纳米粒子标记的d n a 探针检测到的完全互补序列的信号大大高于荧光 探针，完全互补与单碱基错配序列间的信号比( 1 0 ：1 ) 也明显高于荧光检测( 2 6 ：1 ) ，在 适宜温度下洗涤，该比值更高。 m i r k i n 等将此方法推广到微电极芯片中【，7 1 ，用手工点样法将探针固定在一对微电 极之间2 0h m 的空隙中，杂交后纳米金聚集在空隙中，导致电传导率的变化，用银显影液 9 河北大学理学硕十学何论文 处理后信号进一步放大。实验中在一定温度下用o 3m o l lp b s 洗涤芯片，再用银显影液 处理3 2 0m i n ，完全配对探针相应电极间的电阻下降到5 0 0 欧，与单碱基错配的信号比 值为1 0 5 ：1 ，检测的最低样品浓度为5 0 0 缅。扎。利用不同粒径的纳米金具有不同颜色的 特点，t a t o n 等还发展了多色标记检测d n a 的方法【5 8 1 。他们用5 0 姗( k 瞰= 5 4 2m ，红色) 和1 0 0n m ( k = 5 8 3 姗，橙色) 标记的两种探针和s n p 芯片同时检测两种靶序列，同样具 有很高的选择性和灵敏度，完全互补与单碱基错配序列间的信号比为5 ：1 。因此这些方 法有望应用于单核苷酸多态性分析、突变分析等领域，由于其灵敏度均很高，还可能不需 p c r 扩增直接检测d n a 。 电化学分析技术具有仪器简单、测定快速等特点，所以电化学d n a 传感器发展迅速， 该类传感器在d n a 分子识别和测定中的应用研究已有不少报道【5 9 也】。j o s 印h 等蚓报道了 一种基于纳米粒子电化学检测d n a 杂交的方法。他们用抗生蛋白链霉素包被的磁珠，固 定上生物素修饰的d n a 探针，与生物素修饰的靶基因互补配对，生物素再捕获包有抗生 蛋白链霉素的金纳米粒子，经洗涤，最后溶解这些被捕获的金粒子，用电位分析法测出金 的量，从而算出杂交量。a u t h i 一删等也报道了用电化学方法定量检测4 0 6 碱基对人类细 胞巨型病毒d n a 序列( h c m vd n a b u m a i lc y t o m e g a l o v i l l l sd n a ) 。这种检测方法基于： 1 单链的h c m vd n a 与寡核苷酸修饰的金纳米粒子探针的杂交；2 固定在杂交物上的 金粒子的溶解：3 在夹心式的丝网印刷微条纹电极( s p m b e ) 上用阳极溶出伏安法检测可 溶性a u ( i i i ) 离子，从而间接得出d n a 检测结果。由于在电沉积过程中非线性扩散的a u ( i i i ) 质量转移的增加，s p m b e 电极能灵敏地检测静态溶液中小体积中的a u ( i i i ) ，每个探针释 放出的纳米金数量较大，在s p m b e 电极上灵敏的a u ( i i i ) 的检测结合起来，可使h c m v d n a 片段的检测限达到5i m o l l 的水平。 纳米金在该领域的应用研究在国内外非常活跃，目前已发展了多种技术，除了m i r k i n 研究组所建立的一系列方法及电化学方法之外，v e l l a n o w e t h 【6 5 】等报道了金纳米粒子增强 的a f m 成像及提高寡聚核苷酸检测灵敏度的方法。在金表面上形成d n a 探针靶d n a 金纳米粒子夹心式结构，用原子力显微镜检测寡聚核苷酸。赵红秋等惭】利用双硫醇分子 作连接剂，将金纳米粒子固定在金片上。在金片上便形成了l ，2 己二硫醇自组装成的单分 子膜。在修饰过双硫醇的金电极上加两滴制备好的金溶胶，l h 后用水冲洗并晾干。用石 英晶体微天平( q c m ) 技术研究d n a 探针在金片上的固定。并对d n a 识别能力进行了初步 l o 第1 章引言 探讨。在实验条件下，经过纳米颗粒修饰的金片对h s d n a 探针的吸附量比未经修饰的金 片可提高3 5 倍，并将传感器的灵敏度提高了3 倍。 本实验室在近两年来一直致力于共振光散射技术在以纳米粒子为探针的d n a 杂交 检测分析中的应用，也取得了一些初步的进展，本论文第二章的内容便是其中的部分工 作。 1 3 共振光散射在分析中的应用 1 3 1 光散射现象 光散射是指一束光线通过介质时，在入射光方向以外的各个方向都能观测到光强的 现象。光是一种电磁波，传播时其交变的电磁场与介质分子发生强烈的相互作用。如果 这些分子是可极化的，就会被诱导产生以电磁场的频率振荡着的电偶极子。根据电磁理 论，振动着的电偶极子是一个二次波源，向各个方向上发射的电磁波就是散射波。如果介 质是完全均匀的，各个粒子的散射光将因相互干扰而抵消；如果介质是光学上不均匀的， 分散项与分散介质折光指数相差较大，则产生的诱导偶极距不同，次级辐射波不能抵消， 这就出现光散射现象。 根据介质中粒子大小不同，散射可分为t y n d a l l 散射和分子散射。当粒子的尺寸大于 入射光波长( ) 时发生反射和折射并服从光的反射和折射定律。如果介质中粒子直径( d ) 与入射光波长相近，便产生t y i l d a l l 散射；如果介质中粒子很小，如d o 0 5 时便产生以 r a y l e i 曲散射为主的分子散射，分子散射一般要比t ”d a l l 散射弱得多。 根据入射光与散射光的能量间的关系，散射现象又可分为弹性散射和非弹性散射以 及准弹性散射( q u a s i - e l a s t i c1 i g h ts c a t t 耐n g ) 。弹性光散射( e l a s t i cl i g h ts c a t t 耐n g ) 在散射过 程中没有能量变化( 即没有频率位移) ，也常称为经典光散射( c l a s s i c a l l i 出s c a t t 甜n g ) 或静 态光散射；非弹性散射( i n e l a s t i cl i 曲ts c a t t 鲥n g ) 在散射过程中发生能量变化( 即产生频率 位移) ；准弹性散射是相对于弹性散射而言，指由于质点在不停地做布郎( b r o w n ) 运动，根 据多普勒效应质点辐射的次波频率与其运动速度有关，产生散射光以入射光频率为中心 而展宽的现象，又称为动态光散射( d y n a m i cl i 出s c a t t 嘶n 曲。 弹性散射又可分为瑞利( r a y l e i 曲) 散射，得拜( d e b y e ) 散射和大粒子散射( 或m i e 散 射) ；在非弹性散射中，最主要的