（高分子化学与物理专业论文）c60氨基酸衍生物的合成及生物活性研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文 i 摘 要 富勒烯是继石墨，金刚石后出现的碳的第三种同素异形体，其中 c60是最典型的 一种，由于其独特的结构和性能,使得它在生物，化学，材料，纳米科学等领域显示了 巨大的应用潜力。本文采用分子设计原理，利用亲核加成方法，合成和制备了三种生 物相容性的 c60氨基酸衍生物，并用 ft- ir、1h- nmr、13c- nmr 、rf 等手段对这 些物质进行表征。同时还测试了其溶解性，发现这些化合物均有很好的水溶性，可见 采用氨基酸分子加成后改变了 c60的溶解性。通过对它们抗氧化、自由基清除及细胞 保护等活性的研究，为寻找具有优良抗氧化活性的 c60衍生物提供基础性的数据。同 时，通过对这些生物学性质的研究及构效规律的探讨和分析，为具有神经细胞保护作 用的生物相容性 c60衍生物分子的设计和合成提供基本的信息。本文主要内容包括： 1 利用亲核加成机理在甲苯/乙醇混和溶剂中用 c60与相应氨基酸类物质的反应 得到水溶性的 c60l苯丙氨酸（c60- l- phenylalanine derivatives，flpd），c60l 蛋氨酸（c60- l- methionine derivatives，flmd），c60l缬氨酸（c60- l- valine derivatives，flvd）衍生物, 并采用 ft- ir、1h- nmr、13c- nmr 、rf 等手段对这 些物质进行了结构表征。 2 采用了邻苯三酚自氧化化学发光体系和邻菲罗啉化学发光体系，检测了生物 相容性 c60衍生物清除 o2- 和 oh 的活性。结果表明生物相容性 c60衍生物能明显清 除化学发光体系中产生的 o2- 和 oh 活性氧自由基。比较不同的生物相容性 c60衍生 物在相同浓度时清除 o2- 和 oh 活性，发现均为 flpd flmd flvd。研究显示： c60衍生物清除自由基的活性与母体 c60上剩余 p 键数目、加成基团位阻效应、加成基 团电子效应、加成基团与 ros 反应活性相关。 3 利用dcf- da为荧光探针， 流式细胞计为测试手段检测了flpd， flmd， flvd 对于细胞内活性氧自由基的清除效率；利用 mtt、pi 染色流式细胞技术等方法，检 测了 flpd，flmd，flvd 对于 h2o2诱导的 pc12 细胞凋亡的抑制作用，采用单细 胞凝胶电泳法检测 h2o2诱导pc12 细胞 dna损伤的情况。 结果显示， flpd， flmd， 华中科技大学硕士学位论文 ii flvd 生物相容性良好，且能有效的抑制由活性氧聚集引起的 pc12 细胞的损伤，保 护活性 flpdflmdflvd。 关键词：富勒烯; 有机官能化; 活性氧自由基; 氨基酸; 神经细胞; 神经保护活性 本课题得到国家自然科学基金 no.20474020 的资助。 本文中生物活性实验部分是与华中科技大学同济医学院徐顺清教授研究小组合 作下完成的。 华中科技大学硕士学位论文 iii abstract fullerene is the third allotropic form of carbon besides diamond and graphite, c60 is the representative in the fullerenes. because of the special structure and properties of c60, it shown great potential of prospective applications in fields of biology, chemistry, materials and nanoscience. according to the molecular design principle, three kinds of the biocompatible fullerene amino- acid derivatives were synthesized by the nucleophilic addition for the first time. they also characterized by ft- ir, 1hnmr, 13c- nmr rf. meanwhile, by studying the water- solubility of these products, we found these products could easily solve in h2o. we studied their antioxidative and radical scavenging properties, and their protective effects on culturing cells. the studies may provide basic data for finding better antioxidative c60 derivatives. meanwhile, we also discussed and analyzed influencing factors of these biological properties and structure- activity relationships in order to obtain basic information for designing and synthesizing biologically compatible c60 derivatives. 1. c60- l- phenylalanine derivatives(flpd), c60- l- methionine derivatives(flmd) and c60- l- methionine derivatives(flvd) were synthesized by the nucleophilic addition of c60 with amino- acids in toluene/ethanol. they also characterized by ft- ir, 1hnmr, 13c- nmr, rf. 2. the luminol chemiluminescent system for measuring o2- radical and the o- phenathroline chemiluminescent system for measuring oh radical were useed. the biocompatible c60 amino- acid derivatives have obvious scavenging activity against superoxide o2- generated in chemiluminescence systems and hydroxyl radicals oh generated in chemiluminescence systems. the experimentation also showed that the scavenging o2- and oh activity of the biocompatible c60 amino- acid derivatives were with the following sequence: flpd flmd flvd. the results showed that the scavenging activity against ros of biocompatible c60 amino- acid derivatives were associated primarily with the number of p bond of c60, the steric effect, electronic effect and the scavenging activity of the addition group of the biocompatible c60 amino- acid 华中科技大学硕士学位论文 iv derivatives. 3. the fluorescent probe 2, 7- dichlorofluorescein diacetate (dcf- da) was used to monitor the scavenging activity of flpd,flmd,flvd against intracellular ros by flow cytometry. the protective effect of flpd,flmd,flvd against apoptosis were assessed by mtt, pi stained flow cytometric method and so on. we also used the method of single- cell gel electrophoresis to detection the dna damage because of h2o2- induced.the results showed that the biocompatible amino acid c60 derivatives had excellent protective effect on pc12 cells injury caused by the accumulation of ros and the protective effect on pc12 were with the following sequence: flpd flmd flvd. key words: 60fullerene; organofunctionalizations; active oxygen free radicals; amino acid; neuronal; neuroprotective activity. this work was supported by national science foundation of china (no.20474020) and the experiments of biological performance were cooperated with prof. xu shunqing s study group of tongji medical college of huazhong university of science and technology. 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许 论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保 密 ，在_年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在以上方框内打“ v” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华中科技大学硕士学位论文 1 1 绪 论 1.1 引言 富勒烯(fu11erene)是单质碳继石墨、金刚石之后的第3种碳的同素异形体。c60是 富勒烯家族成员中的典型代表，它具有中空的笼形结构。1985年kroto，curl和smalley 等1报道了富勒烯的发现，1990年krabtschmer和hufman等2 用电弧法制备制备克量 级c60获得成功此后，对c60的系统研究得到飞速发展。美国science杂志评选c60 为“ 91年年度分子” ， 并说“ 还没有哪一种分子如此迅速地打开通向科学新领域的大门” 。 它对现在、将来，对物理、化学、材料及生命科学等领域都将产生重大深远的影响。 c60独特的三维空间结构赋予了它特殊的物理及化学性质， 并使它隐含了许多有待 发现的新性质、新功能，这些为富勒烯科学的发展提供了广阔的空间。由于c60特殊的 结构及其衍生物潜在的应用前景，已经引起了越来越多的化学家们的关注。目前，有 关富勒烯的研究目前已涉及到有机化学、无机化学、生命科学、材料科学、高分子科 学、催化科学、电化学、超导体与铁磁体等3- 7众多学科及应用研究领域, 并日益展示 出重要的研究价值和巨大的应用潜力。 富勒烯化学是富勒烯科学中的一个重要研究领域8,9， c60有低能量的lumo 轨道, 电子亲合势为2.65 ev, 循环伏安法测定它最多可以接受6 个电子, 反应中表现出缺电 子烯烃的性质, 六元环间6，6 双键为反应活性部位, 可以发生2n环加成反应, 亲 核、亲电加成, 自由基加成, 聚合反应, 光化学反应, 氧化还原反应等。富勒烯化学的 核心是富勒烯参与的化学反应，包括研究它的反应活性、反应机理、反应的区域或立 体选择性等。c60化学修饰可以简单地分为两大类：球内修饰和球外修饰，球外修饰是 目前富勒烯化学的主体。c60多样化的化学修饰及官能化方法为c60的功能化及其各种 衍生物的制备提供了良好的基础，借助这一基础，几乎可以将所有的各种基团、分子 键接到富勒烯上，因此，富勒烯衍生物的制备有着无限的空间，进一步研究这些富勒 烯衍生物的各种功能特性是制备它们的目的所在，同时也丰富了富勒烯科学。 由于 c60多加成物质有不同于一般的物理化学性质，关于 c60多加成物的区域选 择性和立体选择性的合成也引起研究者极大的兴趣。利用富勒烯所特有的三维空间结 构设计合成出一些结构性能新颖化合物的研究也正在逐渐深入。 华中科技大学硕士学位论文 2 图1.1 c60 结构示意图图1.1 c60 结构示意图 1.2 c60的结构特点及主要物理特性 富勒烯是单质碳的第三种同素异形体，具有中空的笼形结 构，经典的富勒烯（fullerenes）cn就是一类由 n(偶数)个碳原子组 成的封闭的中空的碳原子簇，它的特征是由五元环和六元环构成 的三连接的多面体。 所有富勒烯分子cn包含12个五元环和n/2- 10 个六元环。c60富勒烯是这种分子的典型代表，其英文名称是 buckminster- fullerenes ，故又称之为巴基球(如图 1.1)。它的模型 是截去棱角正二十面体，由十二个五边形面和二十个六边形面组成(如图 1.1),具有 5 次对称轴，因此又称为“ 足球烯” 。c60分子中的 c- c 键有单键和双键两种，c60的五边 形环仅有单键，而六边形环中单、双键交替排列。c60的五边形环与六边形环的公共 棱边为单键，两个六边形环的公共棱边为双键（30 个） ，单键、双键的平均键长分别 为 1.45和 1.38。单、双键仅在 0k 时才有明显区别；温度在 350k 以上时，单、双 键的区别很小，c60分子中的 60 个碳原子是等效的，具有 ih对称性，c60分子具有很 好的高温稳定性，其笼形结构在 1800k 时仍保持不变，因此 c60能在高温碳电弧区或 激光烧蚀区自发形成。 它的主要物理特性如下10: c60的主要物理性质 分子量 720.66 分子结构 平截二十面体（ih） ，即由 12 个五边形和 20 个六边 形三十二面体族构成 13c nmr（c6d6） d=143.27 红外吸收光谱（kbr压片） /cm- 1 527.4,576.4,1182.4,1428.6 红外发射光谱 (气相,850 100)/cm - 1 527.1,570.3,1169.1,1406.9 拉曼光谱（薄膜）cm- 1 273 (s), 437 (m), 496 (s), 710 (m), 774 (m) 1099 (w), 1250 (w), 1428 (w), 1470 (vs), 1575 (m) 华中科技大学硕士学位论文 3 紫外可见吸收光谱 （己烷溶液，括号内为 loge） 211 (5.17), 227 (sh, 4.91), 256 (5.24), 328 (4.71), 390 (3.52), 403 (3.48), 492(sh, 2.72), 540 (2.85), 568 (2.78), 590 (2.87), 620 (2.60) 荧光光谱 （甲苯溶液，室温）nm：未观测到 （薄膜，20k） 706.7（主） 787.4，877（尖峰） 三重态能（甲苯溶液） 37.54.5kcal/mol 离子化势 7.610.02ev 电子亲合力 2.560.02ev 晶体结构 单纯立方晶系（249k 以下） 面心立方晶系（249k 以上） 对称性 ih点群 密度 1.729g/cm- 3 (5k 计算值),1.682g/cm- 3 (300k 计算值) 压缩率 （0.20gpa） ， （5.50.5）10gpa 熔点 700 转化热 （249k）- 4.83kj/mol 升华热 9.580.31kj/mol 导电率 （室温）8.5 基本稳定(图 2.9(a)。根据我们的实验和有关文献，本实验选择了 ph 为 9.24 的体系。鉴于 ph 对发光强度影响较大，在每次测定前校准溶液 ph 值是必要的。 2. 邻菲罗啉对发光强度的影响：固定 ph 9.24、0.1 mol/l h2o2时，加不同浓度邻 菲罗啉所对应的发光强度见图 2.9(b)。由图 2.9(b)可见随邻菲罗啉浓度的增加，发光 强度增加，加量为 5 mmol/l 即达饱和,维持平稳状态时间可达 6084 s ，加量达 10 mmol/l时，维持平稳状态时间可延长至 180 s，根据有关文献，本实验选择邻菲罗啉 华中科技大学硕士学位论文 26 为 5 mmol/l。 3. h2o2量对发光强度的影响：当邻菲罗啉 5 mmol/l固定，所加 h2o2溶液的量不 同时对应的发光强度见图 2.9(c)。由图 2.9(c)可见 h2o2启动发光反应，h2o2溶液量达 0.1 mol/l时即达到饱和并且很平稳，平稳状态维持时间为 90 s，加量为 0.2 mol/l时 平稳状态可延长 132 s，根据有关文献，本实验 h2o2为 0.1 mol/l。 以发光的稳定性、重现性以及化学发光的强度为依据，并结合我们的实验，我们 最终选择 ph 为 9.24，邻菲罗啉为 5 mmol/l，h2o2为 0.1 mol/l 为体系。 2.3.3 超氧阴离子自由基的产生与检测 2.3.3.1 试剂与仪器 邻苯三酚，鲁米诺由国药集团化学试剂有限公司提供；碳酸氢钠，碳酸钠，盐酸 由上海虹光化工厂提供；德国 bruke 公司 lb9507 微弱化学发光仪；上海联胜实验仪 器厂 50250l 微量移液枪 2.3.3.2 溶液配制 nahco3naco3 缓冲溶液 ，ph 值 =10.2；0.1mmol/l盐酸；0.6mmol/l鲁米诺 溶液，用碳酸盐缓冲溶液配制；0.625mmol/l 邻苯三酚，用 0.1mmol/l 盐酸配制；不 同浓度的 c60氨基酸衍生物水溶液。 2.3.3.3 实验步骤 将50 l 的重蒸水100 l 0.6mmol/l的鲁米诺置于发光管内混匀, 上机测定本底. 原位注入 50 l 0.625 mmol/l的邻苯三酚, 启动发光反应, 测量该体系的发光动力学 曲线, 以 200 s 内发光积分值来表示体系中的 o2- 的相对含量。在上述体系中 50 l 的重蒸水换成一定浓度的生物相容性 c60衍生物溶液, 使发光体系总体积保持为 200 l. 鲁米诺及生物相容性 c60衍生物溶液由 0.5 mmol/l 碳酸盐缓冲溶液(ph= 10.2) 配 制, 邻苯三酚用 0.1 mmol/l 的盐酸配制。生物相容性 c60衍生物对超氧阴离子自由基 o2- 的清除效率 s 由下式计算： s=（rlu0- rlun）/rlun100%。 式中, rlu0，rlun分别为加入生物相容性 c60衍生物前后体系的化学发光值。 华中科技大学硕士学位论文 27 2.3.4 羟自由基的产生与检测 2.3.4.1 试剂与仪器 硫酸铜购自河南焦作市化工三厂；抗坏血酸，邻菲罗啉，硼砂，双氧水由国药集 团化学试剂有限公司提供；德国 bruke 公司 lb9507 微弱化学发光仪；上海联胜实验 仪器厂 50250l 微量移液枪。 2.3.4.2 溶液配制 不同浓度的 c60氨基酸衍生物；0.05mol/l硼砂缓冲溶液；6mmol/lcuso4用水配 制；5mmol/l 抗坏血酸，用 0.05mol/l 硼砂缓冲溶液配制；5mmol/l 邻菲罗啉，用 0.05mol/l 硼砂缓冲溶液配制；100mmol/lh2o2用 0.05mol/l 硼砂缓冲溶液配制。 2.3.4.3 实验步骤： 将 25 l 的重蒸水，20 l 6 mmol/l cuso4溶液, 10 l 5 mmol/l抗坏血酸溶液， 25 l 5 mmol/l 邻菲罗啉溶液，100 l 0.05 mol/l硼砂缓冲溶液，混匀置于发光管内, 上机测定本底。原位注入 20 l 0.1 mol/l h2o2启动发光反应，测量该体系的发光动力 学曲线， 以 200 s 内发光积分值来表示体系中的 oh 的相对含量. 在上述体系中 25 l 的重蒸水换成一定浓度的生物相容性 c60衍生物溶液，使发光体系总体积保持为 200 l。cuso4溶液以重蒸水配制，其他溶液以 0.5 mmol/l硼砂缓冲溶液(ph= 9.24)配制。 生物相容性 c60衍生物对羟自由基 oh 的清除效率 s 由下式计算： s=（rlu0- rlun）/rlu0100%。 式中, rlu0，rlun分别为加入生物相容性 c60衍生物前后体系的化学发光值。 2.3.5 结果与讨论 flpd对超氧阴离子 o2- 和羟基自由基 oh 的清除率与其相应的质量浓度关系见 图 2.10，由图 2.10 可见，flpd具有清除 o2- 和 oh 的能力，其清除效率随着加入浓 度的提高而逐渐升高，显示了明显的剂量效应。flpd在 1 mg/ml 时对超氧阴离子和 羟基自由基 oh 的清除效率分别为 87.7%和 91.9%。对超氧阴离子和羟基自由基的半 抑制浓度分别为0.228 mg/ml 和0.198 mg/ml(半抑制浓度为达到总抑制浓度一半时的 浓度)。 c60衍生物清除自由基 ros 的活性受各种因素的影响，是比较复杂的综合效应。 首先，它与母体 c60上剩余 p 键数目有关，加成基团增加，c60分子的 p 键数目减少， 华中科技大学硕士学位论文 28 c60衍生物与 ros 反应活性会降低。同时，加成基团也影响着c60衍生物与 ros 反应 活性，具体表现为：通过空间位阻影响 ros 对 c60上 p 键的进攻，这将降低 c60衍生 物与 ros 反应活性；通过电子效应影响 c60上 p 键电荷密度并影响 c60的亲电性，这 将提高 c60衍生物与 ros 反应活性。其次，如加成基团本身含有能与活性氧自由基反 应的基团，也将提高 c60衍生物与 ros 反应活性。c60衍生物清除自由基 ros 活性的 规律和特点则由以上因素综合作用所决定。本实验中所用 flpd 的 c60上的 p 键除了 部分发生反应外。仍有大量的未反应的 p 键，同时通过粒径分析得知，在 1mg/ml 时， flpd的平均粒径只有 14.4nm，且分散均匀，因此，对活性氧自由基的吸收有利。 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 02 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0 f l p d ( g / m l ) r o s 清除率 ( % ) 超氧阴离子 羟自由基 图 2.10 flpd 对超氧阴离子和羟自由基的清除作用 2.4 c60l苯丙氨酸衍生物的神经保护活性 现代生物医学研究表明，活性氧类与多种神经退行性疾病密切相关。活性氧类自 由基对脑组织的氧化损伤作用是导致多种神经退行性疾病的主要原因。氧化应激产生 了大量的活性氧类，活性氧类对脂质、蛋白质的过氧化或氧化等损伤作用导致了神经 细胞的死亡。鉴于活性氧类对中枢神经系统的氧化损伤作用，发展具有抗氧化活性的 化学药物是神经保护的一条有效途径。 近十多年来，水溶性 c60及其衍生物的生物活性的研究已广泛展开，研究表明， 富勒烯类化合物具有抑制细胞凋亡，神经细胞的保护，抑制酶活性，抗菌、抗病毒， 切割 dna，光动力治疗等生物活性。在各种生物活性中，c60及其衍生物的抗氧化及 神经保护活性的研究引人注目。 华中科技大学硕士学位论文 29 由于 c60衍生物在产生自由基的化学体系中表现出良好的抗氧化及自由基清除活 性，许多学者对 c60衍生物在体外神经细胞培养及中枢神经系统损伤或疾病的动物模 型中所表现出的抗氧化及神经细胞的保护活性也展开了深入的研究。 2.4.1 仪器与试剂 pc12 细胞购于武汉大学细胞典藏中心；c60l苯丙氨酸衍生物由课题组合成； dmem 高糖培养基购自美国 gibco 公司； 胎牛血清购自美国 hyclone 公司 胰蛋白酶； 低熔点琼脂糖(lmpa)，二甲基亚砜(dmso)，triton x- 100，三羟甲基氨基甲烷 (tris- base)，碘化丙啶(pi)二氯荧光素（dcf- da）由美国 amresco 公司分装；正常熔 点琼脂糖(nmpa)购自美国 biowest 公司；噻唑蓝(mtt)购自美国 sigma 公司；乙二胺 四乙酸二钠(edtana2)，乙二胺四乙酸(edta)购自华美生物工程公司；氢氧化钠，0% 过氧化氢(h2o2)购自天津市化学试剂三厂丙；丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod) 检测试剂盒均购自南京建成生物公司；其它试剂均为国产分析纯。 苏州安泰空气技术有限公司 sw- cj- zf 型超净工作台； heares 公司 mco- 15ac 二氧化碳细胞培养箱； 日本 olympus 公司 ck- 40 倒置显微镜及 ckx41- f32fl荧光 显微镜日本； jasco 公司 fp- 6500 荧光光谱仪； 德国 eg emission wave: 525nm),用cellquest软件分析。 2.4.2.5 mtt 法评价细胞活力 细胞接种：细胞接种于96孔板。培养板四周的孔不种细胞，而是注入200l无菌 d- hanks液，以防止板中培养基蒸发。 实验分组：阴性对照组（加无血清dmem） ，h2o2损伤组（100 m h2o2） ，含c60 衍生物保护组（0.5、1、5、10、25、50、100g/mlflpd+ 500m h2o2） ， 阳性对 照组（0.1mm vite+500m h2o2） 实验方法： 将处于对数生长期的pc12细胞接种于96孔培养板。 待细胞稳定2448h 后，弃去培养基，加入含25、50、100、200 m h2o2的无血清dmem作用24 h，观察 不同浓度的h2o2对细胞存活率的影响；加入500m h2o2作用6、12、24及48 h，观察 pc12细胞存活率随h2o2作用时间的变化规律；不同浓度flpd(0.5、1、5、10、25、 50、100g/ml)和终浓度为0.1mm的vit e的dmem分别与pc12细胞共孵育1h，然后加 入500m h2o2作用24 h，检测细胞存活率，观察flpd对h2o2引起pc12细胞氧化损伤 的保护作用。各实验组处理后，弃去培养基，将细胞用无血清dmem洗一次，然后加 入含0.5mg/ml mtt的无血清dmem，置于37孵育4h后，小心吸弃上清，再加入 150ldmso， 于37恒温摇床中孵育10min，使甲瓒颗粒完全溶解，酶标仪波长490nm 处测定吸光度值。用酶联免疫检测仪测定570 nm/630 nm处的光密度值(optical density, od)根据下式计算药物对h2o2引起的pc12细胞损伤的存活率： 华中科技大学硕士学位论文 33 存活率(%)=(oddrug- odblank)/(odcontrol- odblank) 100%90 2.4.2.6 流式细胞仪检测 h2o2诱导的 pc12 细胞凋亡率 细胞接种：将细胞接种于6孔板中。 实验分组：阴性对照组（无血清dmem） ，h2o2损伤组（500mh2o2） ，含c60衍 生物保护组（0.5、5、50g/ml flpd+500mh2o2） ，阳性对照组（0.1mm vite+500m h2o2） 实验方法：待细胞稳定2448h后，弃去培养基，无血清的dmem洗2次，加入含 终浓度为0、0.5、5、50g/ml flpd和终浓度为0.1mm的vit e的dmem分别与pc12细 胞共孵育1h，再加入含终浓度为500m h2o2 dmem继续培养24小时；收集处理后的 细胞培养液至流式专用管；加1ml pbs缓冲液清洗一次，清洗液加入管中；胰酶消化 收集细胞于上述管中； 1ml pbs缓冲液清洗剩余细胞一次， 清洗液加入离心管； 1500rpm 离心5min；加1 ml pbs缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清；用1ml预冷的70%乙醇中， 4避光固定40min；1500rpm离心5min；pbs 清洗两次；加入500l终浓度为100ug/ml 的pi染色液，4避光30min；以pi 荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞 仪上计数细胞周期各期的细胞数目。 2.4.2.7 彗星实验 彗星实验（comet assay） ，又称单细胞凝胶电泳scge（single cell gel electrophoresis）是一种在单细胞水平检测dna 微损伤的方法。它是在载玻片上用少 量琼脂糖凝胶包埋单个细胞，细胞经裂解、解旋和电泳后，断裂的dna 在电场力作 用下向阳极移动，经荧光染料染色，在荧光显微镜下可观察彗星样图像 明亮的头 部和弥散的彗尾，之后进行图形分析即可在单细胞水平判断dna 损伤程度91。 细胞接种：细胞接种于6孔板。 实验分组：阴性对照组（无血清dmem）,h2o2损伤组（500mh2o2）,含c60衍生 物保护组 （0.5、 5、 50g/ml flpd+500mh2o2） ,阳性对照组 （0.1mm vite+500m h2o2） 实验方法： 制备第一层胶：100ml 0.8正常熔点胶，加盖盖玻片，4固化 10min； 制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含110000个 细胞的0.6低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5） ，加盖盖玻片，4固化10min； 裂 解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10 dmao，1triton x- 100） ，4裂解1h； 取出玻片，用pbs缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入 华中科技大学硕士学位论文 34 ph13的电泳缓冲液 （没过玻片2- 3min） ， 放置20min （黑闭） 。 电泳： 电压20v， 300ma， 30min。 取出玻片，用pbs或tris.cl，ph7.5漂洗3次，每次3min； 染色：胶上滴 加3uleb，加盖盖玻片，24h检测。 拍照：在荧光显微镜下观察、测定。每张玻片 随机观察计数100个细胞并拍照。未受损的细胞核表现为一圆形荧光核心，即彗星头 部，没有拖尾；而受损的细胞则有彗尾从核中伸向阳极，形成一个亮的荧光头部和尾 部。 实验分析：用casp彗星分析软件分析彗星图片，求出平均olive尾矩值。 2.4.3 实验结果与讨论 2.4.3.1 细胞培养液和细胞内 sod 和 mda 含量的测定 实验结果显示（表2.1），与阴性对照组相比，500m h2o2损伤组细胞培养液中 以及胞内sod减少，mda增加（p0.05）；给予flpd预处理后，与h2o2损伤组相比， 细胞培养液中以及胞内sod明显增加，而mda明显减少（p0.05）。 表2.1 flpd对h2o2诱导pc12细胞培养液和胞内sod活性和mda含量的影响 pc12 细胞培养液 pc12 细胞内 sod mda sod mda 组别 （u/ml） （nmol/ml） （u/ml） （nmol/ml） control 14.230.21 0.12370.016 219.510.52 19.835.486 h2o2(500m) 10.540.26* 0.73240.039* 83.3212.71* 157.9613.54* flpd(50g/ml) 14.020.13* 0.23330.025* 189.48.236* 43.439.853* flpd (5g/ml) 13.590.32* 0.34360.019* 144.78.96* 77.447.41* flpd(0.5g/ml) 12.670.44* 0.45850.073* 124.910.88* 88.2211.28* （与阴性对照相比，*p0.05；与h2o2相比，*p0.05） 2.4.3.2 c60l苯丙氨酸衍生物清除细胞内活性氧自由基 flpd对经 500m h2o2诱导后的 pc12 细胞内的 ros 清除能力见图 2.11。由该 图可以看出，单独用 500m h2o2诱导后，胞内 ros 的相对量高达 428.3(ros 的相对 量由二氯荧光素的荧光强度表示)，而当预先用 0.5、5、50g/ml flpd 处理，再经 500mh2o2诱导，胞内 ros 的相对量依次降到 180.2、129.4、110.3，由上说明 flpd 有较高水平的结细胞内活性氧自由基的清除能力。 华中科技大学硕士学位论文 35 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 阴性对照h 2 o 25 050 . 5f l p d ( 5 0 g / m l ) 荧光强度 f l p d ( g / m l ) h2o2 ( 5 0 0 m ) 图2.11 flpd对胞内ros的影响 2.4.3.3 flpd对 h2o2诱导 pc12 细胞存活率下降的影响 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 0481 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 6 时间( h ) 细胞存活率( % ) 图2.12(a) 500mh2o2作用不同时间对pc12细胞存活率影响 500mh2o2单独作用于细胞 4、8、12、16、20、24、28、32h 后，pc12 细胞的 存活率随时间的延长逐渐下降 （图 2.12 （a） ） ；预先将0.5、 1、 5、 10、 25、 50、 100g/ml flpd预孵育pc12细胞1h后， 再加入500mh2o2共孵育24h， flpd可明显拮抗 h2o2 的毒性作用， 500mh2o2单独作用时细胞存活率下降到对照组的32.8%， 而单独用0.5、 1、5、10、25、50、100g/ml flpd 孵育 pc12 细胞 24h后，与阴性对照组相比，细 胞存活率不受影响（p0.05）（图 2.12(b)）；先用不同浓度 flpd 预处理后再加入 华中科技大学硕士学位论文 36 500mh2o2共孵育，可明显增加细胞存活率，0.5g/ml flpd 预处理组可使细胞存活 率达到 64.1%，100g/ml flpd预处理组提高到 87.1%，差异具有显著性（p0.05）， 另外，vit e保护组细胞存活率为 71.6%（p0.05）（图 2.12(c)）。 0 5 0 1 0 0 阴性对照 0 . 5151 02 55 01 0 0 f l p d 浓度( g / m l ) 细胞存活率( % ) 图2.12(b) 不同浓度flpd处理24h后对细胞存活率影响 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 阴性对照h 2 o 21 0 0 5 0 2 5 1 0 51 0 . 5v i t . ef l p d ( 5 0 g / m l ) 细胞存活率( % ) f l p d （g / m l） h2o2 （5 0 0 m） 图2.12(c) flpd对h2o2诱导pc12细胞存活率下降的拮抗效应 2.4.3.4 flpd对 h2o2所致细胞凋亡的抑制作用 h2o2可以诱导 pc12 细胞凋亡。由图 2.13 可以看出，500m h2o2诱导 pc12 细 胞 24h后， pc12 细胞的凋亡率达 47.1% （对照组为 2.3%） ， 而经过 0.5、 5、 50g/ml flpd 预处理后，细胞凋亡率降到 18.4%、7.2%、4.1%，vit e保护组的凋亡率为 11.2%，差 异具有显著性。flpd 在 dmem 培养基中化学性质稳定，能够在较长时间内抑制由 华中科技大学硕士学位论文 37 h2o2诱导所致的细胞凋亡。 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 阴性对照h2o2 50 50.5 vit.eflpd (50 g/ml) 凋亡率 ( % ) h2o2 ( 5 0 0 m ) f l p d ( g / m l ） 图2.13 flpd对h2o2诱导pc12细胞凋亡的影响 2.4.3.5 flpd对 h2o2诱导 pc12 细胞 dna损伤的影响 0 2 4 6 8 1 0 阴性对照h 2 o 25 050 . 5v i t e o l i v e 尾距 f l p d ( g / m l ） h2o2 ( 5 0 0 m ) * * * * * * * * * （与阴性对照相比，*p0.05；与h2o2损伤组相比，*p0.05） 图2.14(a) flpd对h2o2诱导pc12细胞dna损伤的影响 本试验采用单细胞凝胶电泳法检测dna损伤。由图14(a)、14(b)可以看出，经 500m h2o2处理后，pc12细胞明显出现dna损伤，其dna的olive尾矩达明显增加， 而当加入不同浓度的flpd预处理后，结果显示flpd能明显减轻dna的单链损伤（p 0.05），并呈剂量依赖关系。 华中科技大学硕士学位论文 38 图2.14(b) flpd对h2o2诱导pc12细胞dna损伤的影响(a.阴性对照 b.500 m h2o2 c .flpd(50g/ml)+ 500 m h2o2 d.0.1mm vite+500m h2o2) 2.5 本章小结 （1） 利用 c60与 l苯丙氨酸在甲苯/乙醇/水混和溶剂中的亲核加成反应制备了 水溶性的 flpd，采用 1h nmr, 13c nmr, ir, rf 等对其结构进行了表征。 （2） 采用邻苯三酚自氧化化学发光体系产生 o2- ，检测了 flpd清除超氧阴离 子的活性。在 40、160、240、320、400、1000g/ml时 flpd 对超氧阴离子 o2- 的清 除率分别为 11.9%、39.3% 、52.9% 、64.8% 、72.4%、 87.7% 实验结果表明 flpd 能明显清除化学发光体系中产生的超氧阴离子 o2- 活性氧自由基。flpd的清除 o2- 活性与其浓度有关，且量效规律明显。 （3） 采用邻菲罗啉化学发光体系产生 oh，检测了flpd清除羟自由基的活性。 在40、160、240、320、400、1000g/ml时flpd对超氧阴离子o2- 的清除率分别为11%、 42.5% 、 60.5% 、 71.1% 、 76.9%、 91.9%。结果表明， 跟flpd的清除o2- 相似， flpd 的清除 oh活性与其浓度有关，且量效规律明显。 （4）采用硫代巴比妥酸(tba)法和黄嘌呤氧化酶法分别检测了pc12细胞内外的 mda和sod的含量。 结果表明， 经过flpd处理后细胞培养液和细胞内mda含量降低， sod含量增加。 华中科技大学硕士学位论文 39 （5）利用dcf- da为荧光探针，为测试手段检测了flpd对于细胞内活性氧自由 基的清除效率，结果表明flpd能明显清除细胞内性氧自由基，且呈剂量效应； （6）利用mtt法，流式细胞计等，检测了flpd对于h2o2诱导的pc12细胞凋亡 的抑制作用，经过检测得知flpd在 50g/ml时细胞存活率和细胞凋亡率分别为 80.2%，4.1%，结果表明，在有flpd存在的情况下，细胞存活率要明显高于，细胞凋 亡率要明显高于单独用h2o2诱导时的情况。 （7）采用单细胞凝胶电泳法检测h2o2诱导pc12细胞dna损伤的情况，结果显示 flpd能明显减轻dna的单链损伤。 总之，通过实验结果显示flpd生物具有良好的生物相容性，且能有效的抑制由 活性氧聚集引起的pc12细胞的损伤。 华中科技大学硕士学位论文 40 3 水溶性 c60l蛋氨酸衍生物的制备、表征 及生物学性能研究 3.1 引言 l蛋氨酸是含硫必需氨基酸，与生物体内各种含硫化合物的代谢密切相关。当 缺乏蛋氨酸时，会引起食欲减退、生长减缓或不增加体重、肾脏肿大和肝脏铁堆积等 现象，最后导致肝坏死或纤维化。 蛋氨酸还可利用其所带的甲基，对有毒物或药物进行甲基化而起到解毒的作用。 因此，蛋氨酸可用于防治慢性或急性肝炎、肝硬化等肝脏疾病，也可用于缓解砷、三 氯甲烷、四氯化碳、苯、吡啶和喹啉等有害物质的毒性反应。 本章将 l蛋氨酸引入 c60上合成出具有较好水溶性和生物相容性的 c60l蛋 氨酸衍生物并用 ft- ir, 1h- nmr,