（分析化学专业论文）分子印迹聚合物的新单体及扩展应用领域的研究.pdf

中文摘要 分子印迹技术是一种制备对特定分子具有选择性识别功能的聚合物的技术。分子印 迹聚合物( m i p s ) 因为对模板分子的识别具有预定性、识别性和实用性等优点而被广泛应 用到分离提纯、痕量分析、生物传感器、模拟酶催化、固相萃取和高效液相色谱等领域。 本文绪论概述了分子印迹聚合物的基本理论、制备方法及应用研究进展。 本文研究工作第一部分研究了棒状分子印迹聚合物对底物的结合性能。首次尝试将 杯【4 芳烃衍生物作为新的功能单体，与常见功能单体丙烯酰胺联用，选用一些药物小分 子，合成了新型的含杯 4 】芳烃衍生物的双功能单体分子印迹聚合物，与单一功能单体的 聚合物作比较，平衡结合实验和s c a t c h a r d 分析结果显示含杯【4 芳烃衍生物的聚合物对 模板分子具有更强的识别行为和结合选择性，揭示了分子印迹聚合物的结合机理，将杯 芳烃衍生物和分子印迹技术相结合，为进一步开拓分子印迹技术的应用研究提供了实验 和理论基础。另外还制备了以甲基丙烯酸或4 乙烯吡啶为功能单体的农药棒状分子印迹 聚合物，研究结果表明4 乙烯吡啶为功能单体的聚合物对模板分子有较强的识$ 1 j 平h 吸附 选择性。 本文研究工作第二部分研究了分子印迹聚合物膜的制备和膜传输性能。以市售微孔 滤膜为支撑膜，选用一些药物分子或农药为模板分子，紫外光引发原位聚合的方法制备 了分子印迹聚合物膜。通过紫外光谱和核磁共振讨论了模板分子和功能单体之间的相互 作用，测定了配合物结合常数。用红外光谱、扫描电镜表征了膜的结构和表面形貌。通 过对混合底物的膜传输实验研究了分子印迹聚合物膜对模板分子的选择性结合性能，尤 其是有些膜传输实验是在混合底物的水溶液中进行的，有助于将分子印迹技术用于实际 的药物、环境分析和分离富集等方面。 关键词：分子印迹技术，分子印迹聚合物 r 苄基海因，青莠定，邻香草醛， 分子印迹聚合物膜，功能单体，乙酰苯胺 氟哌酸，羟甲基香豆素 a b s t r a c t m o l e c u l a r l yi m p r i n t i 酣t e c h n i q u e i st o p r e p a r es y n t h e t i cp o l y m e r s t h a tc o n t a i n t a i l o r - m a d er e c o g n i t i o ns i t e sf o rt e m p l a t em o l e c u l e s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r s ( m i p s ) h a v em a n y a d v a n t a g e so fp r e d e t e r m i n a t i o n ，r e c o g n i t i o na n dp r a c t i c a b i l i t y t h u sm i p sh a v e b e e nw i d e l yu s e di ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，t r a c ea n a l y s i s ，b i o s e n s o r s ，m i m i ce n z y m e c a t a l y s i s ，s o l i d p h a s ee x t r a c t i o na n d h p l c t h i st h e s i s si n t r o d u c t i o n g a v e ab r i e fo v e r v i e wo ft h eb a s i c t h e o r y , s y n t h e s i sa n d a p p l i c a t i o no f m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s t i f f st h e s i s sf i r s tp a r ts t u d i e dt h es e l e c t i v t 2 b i n d i n gp r o p e r t i e so f b u l km i p s t od i f f e r e n t s u b s t r a t e s w ef i r s t a t t e m p tt o u s ec a l i x 4 a r e n ed e r i v a t i v e sa sn o v e lf u n c t i o n a lm o n o m e r , c o m b i n e dw i t hn o r m a lf u n c t i o n a lm o n o m e ra c r y l a m i d e ，a n d s y n t h e s i z e d n e wd o u b l e f u n c t i o n a lm o n o m e r sm i p s c o n t a i n i n gc a l i x 【4 a r e n ed e r i v a t i v e su s i n gs o m ed r u g s 船t e m p l a t e m o l e c u l e s c o m p a r e dt og e n e r a l l ys m n ef u n c t i o n a lm o n o m e rm i p s ，t h e ye x h i b i t e db e t t e r r e c o g n i t i o nw o p e r t i e sb yt h ee q u i l i b r i u mb i n d i n ge x p e r i m e n t t h ea t t e m p t t o e m p l o y c a l i x a r e n e si nm o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u em a yg i v ee x p e r i m e n tf o u n d a t i o nt ob r o a d e n m i p sa p p l i c a t i o n s a r e a s f u r t h e rm o r et h eb u l kp e s t i c i d em i p sw e r es y n t h e s i z e dw i t h m e t h a c r y l i ca c i do r4 - v i n y l p y r i d i n ea sf u n c t i o n a lm o n o m e r s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tm i f s w i t h4 - v i n y l p y r i d i n es h o w e db e t t e rs e l e c t i v e r e c o g n i t i o na n db i n d i n gp r o p e r t i e st o t h e p e s t i c i d e t h i st h e s i s ss e c o n dp a r ts t u d i e dt h ep r e p a r a t i o na n dp e r m e a t i o np r o p e r t i e so fm i p m e m b r a n e t h e yw e r es y n t h e s i z e dv i au vp h o t o i n i t i a t e d i n s i t up o l y m e r i z a t i o nw i 也s o m e d r u g s o r p e s t i c i d e a s t e m p l a t e sa n dm i c r o f i l t r a l o nm e m b r a n e sa ss u p p o r t i n gm e m b r a n e s u v - s p e c t r u m a n d1 hn m rw e r eu s e dt o s t u d y t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt e m p l a t ea n d f u n c t i o n a lm o n o m e r s m e m b r a n e ss t r u c t u r ea n ds u r f a c em o r p h o l o g yw e r es t u d i e db yf t - i r a n ds e m t r a n s p o r te x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e dt oe v a l u a t et h em i pm e m b r a n e ss e l e c t i v e l y t r a n s p o r ta b i l i t i e st o t h es u b s t r a t e sm i x t u r e s e s p e c i a l l ys o m et r a n s p o r te x p e r i m e n t sw e r e c a r d e di n a q u e o u ss o l u t i o n ，w h i c h w i l l h e l p t h e a p p l i c a t i o n o fm i p st ot h e d r u g s ， c i r c u m s t a n c es a m p l e s a n a l y s i sa n d s e p a r a t i o n k e y w o r d s ：m o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m o l e c u l a r l y i m p r i n t e dm e m b r a n e ，f u n c t i o n a lm o n o m e r a c e t a n i l i d e ，5 , 5 d i p h e n y l - h y d n t o i n ， p i c l o r a m ，o - v a n i l l i n ，n o r f l o x a c i n ，c o u m a r i n 一4 i i 第一章羲言 第一章前言 第一节概述 在自然界的生物进化过程中，分子识别不仅普遍存在而且往往起着决定性的作用。 所谓分子识别就是指在复杂的混合体系中，依据分子特定的形状、大小及其化学官能团 的空间排列对该客体分子进行的区别和结合，其重要特征就是选择性。在生物体系中， 分子结构上的细微差别可以决定某个生物化学反应能否顺利进行，如酶、抗体和受体对 底物、抗原和激素展现了特效的分子识别功能，从而决定着生物体能否正常的生长。它 是从分子水平研究酶反应、信息传递以及在不同介质间的能量传递等生物现象的重要化 学概念，己成为人们研究的前言课题的热点之一i l 。l 。一些天然化合物虽然不具有酶的 活性，但在这些化合物中也有选择性的特点，如由糖链组成的环状分子恍惚经等。尽管 这些天然的化合物具有优异的分子识别性能，但这些生物分子却存在着制取复杂、稳定 性查、成本高且品种少、可设计性查等许多缺点，这大大限制了它们在实际中的广泛应 用。所以长期以来科学家们致力于研究具有类似于天然生物分子的活性和分子识别性能 的化合物。随着仿生化学的不断发展，人工合成的冠醚【3 】、穴醚 4 1 、杯芳烃5 1 和环糊精【6 】 等环状化合物相继出现，并形成了一个化学和生命科学交叉的超分子化学学科。 分子间相互作用( m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s ) 是一个非常古老的概念，早在古希腊和罗 马帝国开始就有人使用。到十九世纪后半叶，现代分子间相互作用的概念才开始出现。 例如，范德华( v a l ld e rw a a l s ) 提出处于蒸汽状态的原子之间存在着范德华相互作用力 f v a i ld e r w a a l s i n t e r a c t i o n f o t e e s ) 。又如，1 8 9 4 年菲歇尔( f i s c h e r ) 提出了他著名的“锁 匙”( 1 0 c k a n d k e y ) 比喻，用来形容酶( e n z y m e ) 和底物( s u b s t r a t e ) 之间的相互作用。 在这个假设中，他认为分予相对较大的酶与分子相对较小的底物之间的作用就好象锁和 钥匙的关系，底物就好象一把钥匙一样牢牢地镶嵌在酶这把锁上( 见图1 ) 。 在生物系统中，分子与分子之间常常以氢键、范德华力和离子间相互作用等非共价 键( n o n c o v a l e n tb o n d ) 的多重相互作用而形成分子复合物( m o l e c u l a rc o m p l e x ) 。与共 价键f c o v a l e n tb o n d ) 相比较而言，这些非共价键单独存在时是比较弱的；但由多个这 些弱键相互作用而形成的复合物则非常稳定。例如，生物素一抗生物素蛋白( b i o t i n a v i d i n ) 南开大学博士学位论文 的相互作用就是一个明显的例子，其在水溶液中的电离常数达到fm o l 级；而相反，在 2 5 。c 时，它在水里的结合能接近9 0 k jm o l 。1m 。由此可见，几种弱的非共价键的相互 作用可以产生非常稳定的复合物。 长期以来，许多科学家对自然界中分子间相互作用非常感兴趣，因为人类对这些自 然复合作用的研究，可以用来模拟识别分子，从而为人类服务。由此而产生了一个新的 研究领域仂生化学( b i o m i m e t i ec h e m i s t r y ) ，专门研究象酶和抗体之间的结合的特 性。“仿生”一词本身就包含了生物化学反应过程的化学模仿之意。随着人们对生物化 学系统的结构和机理的逐渐认识，科学家们正试图将这些已知的机理转入化学合成阶 段。通常，这些合成方法的目的在于将这些复杂的生物系统变得简单和微型化。例如， 酶模型虽然缺乏大分子肽的骨架，但确含有催化活性基团，而具有与酶同样的几何定位 功能。一个研究和模拟天然分子识别的最吸引人的生物模拟方法分子印迹技术便由 此而产生了。 图1 菲歇尔的酶( 锁) - 底物( 匙) 复合结构示意图 f i g u r e 1s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o no f f i s c h e r sl o c k - a n d k e yc o n c e p t i na ne n z y m e - s u b s t r a t ec o m p l e x 分子印迹技术的发展还起源于免疫学( i m m u n o l o g y ) 。十九世纪三十年代早期， b 佗i n l 、h a u r o w i t z 和后来的m u d d 的研究发现，抗体在遇到其异型生物质抗原 f x e n o b i o t i ca n t i g e n s ) 时会产生多变性的特点【7 】。手性识别d 一和l - t a r t r a n i l i ca c i d 是一个 抗体抗原形成复合物的典型例子，其形成复合物的过程完全归结于在抗体生物合成过 程中初生抗体与抗原之间的化学官能团的相互作用。抗体的每一个结构单元在合成时都 必须被选择和定位，以适应抗原表面该处的构型及外部特征。这些理论后来由p a u l i n g 2 第一章裁言 总结，并把抗体形成的多变性归结为是由于抗原的作用而诱导抗体多肽链的三维构型发 生变化造成的 8 1 。根据这些理论，抗体必须改变他的三维结构以便有尽可能多的结合位 点与抗原肽链相互作用。从而使抗体的结合位点象模板一样以铸模方式被“镶嵌”在抗 原表面，也就是说，它们在分子水平上被印迹在抗原的表面。后来的研究发现这些“有 益的”模型是不完善的，逐渐被抛弃。取而代之的是更合理的“克隆选择”( e l o n a l s e l e c t i v i t y ) 理论的解释。但不管怎样，他们的理论模型为现代分子印迹技术奠定了基础。 作为p a u l i n g 有关抗体理论的演绎，人们开始想到用这种理念来合成分离基质。在 后来的几十年中。s c a t t e r d 在这方面作了一些尝试。但直到二十世纪七十和八十年代， 现代分子印迹技术( m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d t e c h n o l o g y , m i t ) 才有了真正的突破。特别是 w u l f f 等人在共价型分子印迹技术和m o s b a c h 等人在非共价型分子印迹技术上的开拓 性工作的开展，分子印迹技术领域才得到了蓬勃的发展。自从m o s b a e h 等人 3 1 在 ( ( n a t u r e ) ) 上发表有关茶碱分子印迹聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r ，m i p ) 的 报道后，每年公开发表的论文几乎直线上升。1 9 9 7 年，分子印述协会( g o e i e v o f m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ，s m i ) 正式成立。目前主要从事分子印迹聚合物研究工作的主要国 家有美国、英国、瑞典、日本、德国、中国、西班牙、加拿大、意大利、法国、荷兰、 印度、韩国、澳大利亚、新西兰、爱尔兰和以色列等四十多个国家和地区，公开发表的 论文数近千篇，相关的专利也不少。2 0 0 0 年国际性的关于分子印迹技术的专题讨论会首 次召开，这标志着分子印迹技术已经成为新世纪最为热门的技术之一。m i p 之所以发展 如此迅速，主要是因为它有三大特点：即预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、识别陛( r e c o g n i t i o n ) 和实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。预定性决定了人们可以根据不同的目的制备不同的m i p ，以满 足各种不同的需要；识别性是因为m i p 是根据印迹分子( i m p r i n t e dm o l e c u l e ) 定做 的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子：其实用性表现在它与 天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比，具有抗恶劣环境 的能力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命，且制备过程简单。由于m i p 具有如上这 些优点，它在许多领域，如色谱中对映体和异构体的分离、固相萃取、化学仿生传感器、 模拟酶催化、临床药物分析、膜分离技术等领域展现了良好的应用前景【4 - 2 。 3 南开大学鞲士学位论文 第二节分子印迹技术的基本理论和原理 2 1 分子印迹聚合物( m i p s ) 的制备过程 分子印迹聚合物的制各通常包括以下几步：( 1 ) 使印迹分子与功能单体( m o n o m e r ) 之间通过共价键( c o v a l e n t ) 或和非共价键( n o n e o v a l e n t ) 结合产生功能团和空间结构 互补的相互作用，形成配合物( c o m p l e x ) ；( 2 ) 在配合物中加入交联剂( c r o s s l i n k e r ) 和引 发剂( i n i t i a t o r ) ，使印迹分子一单体配合物周围发生聚合反应，产生高交联的具有一定 机械性能的高分子聚合物；( 3 ) 将聚合物中的印迹分子通过适当的方法洗脱( e x t r a c t i o n ) 或解离( d i s s o c i a t i o n ) 出来，形成具有识别印迹分子的识别位点( r e c o g n i t i o ns i t e s ) 和空 隙f c a v i t i e s ) 。分子印迹的三个过程可用图2 来描述。 图2 分子印迹过程示意图 f i g u r e2s c h e m a t i cd e p i c t i o no f t h ep r e p a r a t i o no f m o l e c u l a ri m p r i n t l n g 2 2 分子印迹聚合物和模板分子的结合作用 根据印迹分子与功能单体之间形成复合物时作用力的性质不同，分子印迹过程可分 为共价键型和非共价键型两种( 如图3 所示) 。前者是先将印迹分子和单体之间以牢固、 可逆的共价键结合在一起，再进行聚合反应。而共价键型是在制各m i p 过程中用非共价 键包括氢键、静电引力、范德华力、n n 相互作用、疏水性相互作用、( 过渡) 金属 配基结合作用、离子键等的作用，将单体和印迹分子形成复合物，然后再进行聚合反应。 也有人将共价作用与非共价作用相结合，应用于制备m i p 【2 。 4 第一章裁富 图3 共价键型和非共价键型分子印迹聚合物的制各 f i g u r e3t h ep r e p a r a t i o no f n o n - c o v a l e n ta n dc o v a l e n tm i p s 2 2 1 共价键结合作用 目前，已使用共价结合作用制备了对糖类及其衍生物、芳香化合物、腺嘌呤等具有 分离作用的分子印迹聚合物。迄今为止，人们使用的共价结合作用的物质包括硼酸酯、 西佛碱、缩醛酮、酯和螯合键合作用。其中最具代表性的是硼酸酯。其优点是能够生成 相当稳定的三角形的硼酸酯，而在碱性水溶液中或在有氮原子( n h 3 、哌啶) 存在下则 生成四角形的硼酸酯【3 0 1 。许多二醇类化合物用作印迹分子，与4 乙烯苯硼酸通过酯化后 聚合生成聚合物。以甘油酸酯【3 0 q 2 1 或丙二醇【3 3 1 为印迹分子，制各含有一个结合基团的 分子印迹聚合物，对外消旋体呈明显的分离能力。而在空穴中若含有两个硼酸基团的印 迹聚合物，用于拆分印迹分子的外消旋体时呈现出很高的选择性【2 9 3 4 , 3 5 。但是，并不是 结合位点( b i n d i n gs i t e s ) 越多，其选择性越高。研究结果表明，三个硼酸基团 3 3 , 3 6 】、 三种不同的共价键结合作用【3 7 1 或三种以上的非共价键结合作用( 3 8 _ 4 q 均导致较低的分离 能力，其主要原因是这类m i p 的结合位点与印迹分子之间的结合速度很慢之故。w u l f f 等人 3 2 , 3 4 , 4 1 就硼酸基团的柔性对m i p 的分离特性的影响进行了研究，结果表明，空穴 南开大学搏士学位论文 中硼酸基团越多，其对光学异构体的选择性越低【4 1 l 。 采用西佛碱的共价键作用也进行了广泛的研究1 4 2 4 4 1 。原则上，西佛碱适用于印迹 分子和后续的底物结合，因为对平衡位置有利，但对于要求快速的色谱来说，平衡速度 太慢了即1 。使用适当的分子内的邻近基团活化可使平衡速度有相当大的增加【4 2 1 。s h e a 等人【4 ”4 崎0 用缩酮引入结合基团，羰基基团之间不同距离的二酮用可聚合的二醇处理， 然后除去印迹分子所得的m i p 当用二酮重新处理时对其原来的印迹分子有很高的选择 性。这种m i p 重新结合时键的生成速度很慢，因此，这一过程似乎是由动力学所控制的。 2 2 2 非共价键结合作用 把能发生非共价键作用的单体和印迹分子与交联剂混合在一起，印迹分子与可聚合 的功能单体通过一种或几种非共价键作用形成有确定关系的主客体复合物，这种复合物 能够和溶液中的单体迅速地达到平衡。m o s b a c h 经过一系列的优化工作，结果表明单体 与印迹分子的摩尔比至少应该为4 ：1 时，m i p 完全能达到与共价键作用制得的产物同样 性能【4 8 4 叭。利用最多的非共价作用是氢键，但如果在印迹分子和后续的分离过程中只有 氢键一种作用时，其拆分外消旋体的n 值只有1 1 - - 2 5 【5 0 】，分离效果不佳；而如果在印 迹过程中既有氢键，又有其他选择性很高的结合位点时，其拆分外消旋体的分离系数a 值可达到3 8 。若将氢键作用和共价键结合起来使用，所得的m i p 的选择性比用单个共 价键作用的m i p 高得多。s e l l e r g r e n 就静电作用对选择性的影响作了详细的研究 4 8 , 5 1 , 5 2 ， 发现这种作用的强度与甲基丙烯酸( 单体) 和苯丙氨基酰替苯胺( 模板分子) 的p k a 、溶 液的p h 值接近时，色谱分离模板分子的理论板高达到最大【5 2 1 。分离因子q 在低p h 值 时较高，当p h 值超过p k a 时。q 随p h 值增高而降低。该系统中溶质的保留是由一个 简单的静电作用控制的。当只有一种静电作用时，同样导致获得的m i p 的选择性降低 53 1 。而将静电作用与共价作用结合起来，其选择性比单个共价作用的选择性好得多 3 0 , 4 3 。最近，有人使用强度小且无方向性的范德华力来形成复合物【5 4 1 ，其分子识别过 程接近天然的分子识别系统。f u j i i 等人 5 5 , 5 6 1 首次使用金属配基结合作用制得金属配位 m i p 。他们使用( 1 r , 2 r ) 1 ，2 二氨基环己烷和4 ( 4 - 乙烯苄氧基) 水杨醛形成西佛碱配基， 通过c 0 2 + 离子把氨基酸结合到配基上，在光学拆分n 一苄基d ，l 缬氨酸获得了非常高的 选择性。其m i p 拆分外消旋体的q 高达6 8 2 。更详细的研究表明【5 6 1 ，其主要分离能力 来自孔穴效应f 5 7 】，所得到的选择性比许多酶的选择性还高。但由于其在色谱分离中的传 6 薰一章前言 质速度非常慢，故很难将其用于色谱分离。a r n o l d 等) k t s 7 , 5 8 1 详细研究了含咪唑的化合物 与c u 2 + 的结合作用，他们把咪唑基之间不同距离的双咪唑化合物作模板把可聚合的亚氨 基二乙酸基团放置在聚合物的印迹空穴中的固定位置上。由此肯4 得的m i p 优先结合它的 模板化合物分子。这些实验是为了开发出一种新方法使之能通过聚合物上一些结合基团 的准确空问排列而有效地识别蛋白质。k e m p e 等人在研究手性分离是用非共价和非离子 作用的m i p 时，考察了水对分子识别的影响，并研究了氢键和疏水性在手性分离中所起 的作用 5 9 】。而d a u w e 等人在研究三嗪类( t r i a z i n e ) 农药的m i p 时1 6 0 】，以五个结构相 似但碱性、疏水性有差别的化合物作为印迹分子，发现在水含量较少的流动相中，m i p 的选择性随印迹分子的碱性增加而增加，与印迹分子的疏水性无关。而在水含量较多的 流动相中，m i p 的选择性同印迹分子的疏水性有关。总之，非共价作用的种类较多，在 制备m 口及其后续过程中，一般来讲使用单一的一种作用制得的m i p 的选择性较低， 因此大多使用多种作用相互结合才使制得的m i p 具有较高的选择性和分离能力。不仅如 此，w h i t e o m b e 甚至巧妙地将共价作用和非共价作用结合起来【州，用4 乙烯基苯基碳酸 醣作单体，通过共价作用同印迹分予形成复合物，用碱水解时随着c 0 2 的失去打开了单 体和印迹分子间的共价键，此时m i p 上便产生了一个非共价型的分子识别位点，识别位 点上的酚羟基可以通过氢键识别分子。h o s o y a 等人则首次采用了外消旋体印迹分子， 而采用手性单体，合成所得的m i p 的手性选择性较用纯的对映体作印迹分子时还要高。 他们还从热力学的角度对此作了解释【6 ”。 2 3 分子印迹技术的理论探讨 分子印迹技术的理论及定量描述，文献报道不多。其原因主要有两方面：一方面是 因为m i t 是刚刚发展起来的一门新兴边缘学科分支，它的发展还处于萌芽阶段，其理论 研究不成熟，还处在探索阶段：另一方面是因为m i t 所涉及的学科领域比较多，要想在 短时间内将各种理论问题和相关参数都搞清楚是比较困难的。但也有不少人在这方面作 了一些有益的尝试。n i c h o l l s 认为【6 2 】，m i p s 与模板( 配体) 分子之间的识别受热力学 定律控制的，配体( 1 i g a n d ) 与受体( r e c e p t o r ) 之间形成复合物的自由能改变由下式计算： g b i 。d = g ”，+ g 。+ g h + g v i b + g d + g 。f + g ，d 。 式中g b | n d 是形成复合物时g i b b s 自由能的改变；g t + r 是分子位移自由转动时损失的自由 能：g ，是分子内旋被“冻结”( f r o z e n ) 时损失的自由能；g h 是疏水性相互作用获得的自 7 南开大学博士学位论文 由能；g 。i b 是基团振动方式自由能：g 。是偶极基团相互作用总的自由能的贡献；g 。n f 是 由构型变化引起的自由能改变；g v d w 是由非范德华力相互作用损失的自由能。由此可见， m i p s 是一个如此庞杂而不协调的复合物体系，以至于我们很难定量估计某一单个因素 对结合能的贡献，也很难从理论上去预测。但从总体上可以得出一些结论：( 1 ) 带有较多 刚性结构的分子，产生较好的识别位点，即是较好的印迹分子；( 2 ) 在印迹分子与聚合物 中，互补的功能基团相互作用的强度越强，数量越多，m i p 的亲和力越强：( 3 ) m i p s 的 聚合和评价应该在热力学控制下进行，避免反范德华力作用和构象扭曲；( 聚合物应当 具有较高的交联度以保持最好的和最完整的孔穴，但同时也必须有一定的柔性以便能重 新结合印迹分子；( 5 ) 聚合和评价应该在同一种溶剂中进行以减小印迹分子一聚合物分子 之间构象发生改变的能量损失；( 6 ) 印迹分子与聚合物功能团之间的键应当是较强的但必 须是可逆的。库仑力、疏水性、离子键、电荷转移、偶极矩、氢键、范德华力以及共价 键均可利用。l i n 等人将m 口用于填充毛细管电色谱 6 3 - 6 7 l ，并计算了手性分离过程的 h o 和s o 。s e l l e r g r e n 等人【6 8 1 的研究发现印迹分子色谱峰的不对称因子与进样量 有很大关系而与流速基本无关，并由此推断，非线性的等温吸附曲线是该系统谱带展宽 的主要原因。他们还进一步研究了对映体在m i p 上质量传递的热力学和动力学性质 6 9 1 。 c h e n 等人 7 0 1 探讨了将m i p 进行热处理后对其热力学和传质动力学性质的影响。他们以 l 一苯基丙氨酸酰替苯氨f l p a ) 为模板分子，制各了用于色谱固定相的m i p ，并在5 0 、1 2 0 、 1 4 0 、1 6 0 c 进行热处理( 退火2 4h ) ，发现在1 2 0 和1 4 0 进行处理后的m i p 对l - p a 的保 留时间比对d p a 的保留时间缩短要多一些。而在1 6 0 处理后的m d 已不能溶解 d ，l p a 的外消旋体。 2 4 分子印迹的表征方法 m i p s 性质的表征到目前还没有一个统一的理论描述，主要原因是因为m i p s 的应用 范围很广泛，在不同的应用领域，可以有不同的表征方法。例如在色谱固定相、手性分 离和固相萃取应用中，一般用分离系数a 、分离度黜、保留时间t r 、结合常数k a 、富 集系数等来表征m i p 的选择性的好坏，采用的仪器方法有高效液相色谱( h p l c ) 、质谱 f m s ) 、核磁共振波谱( n m r ) 、傅立叶变换一红外光谱( f t - - i r ) 和紫外光谱( u v ) 等；而在 化学传感器的应用中，则需要借用各种电化学参数如电流、电容、电导、电压以及各种 光学参数和质量参数如光强度和质量等来表征。其转换装置有化学修饰场效应晶体管 第一章裁言 ( c h e m i c a l l y m o d i f i e d f i e l de f f e c t t r a n s i s t o r ，c m f e t s ) 引1 、光学积分仪 ( i n t e g r a t e do p t i c a l ) 7 2 1 、质量敏感装置( m a s s s e n s i t i v ed e v i c e s ) 【7 3 】如石英晶体微量天 平( q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e s ，q c m s ) 7 4 - 7 7 和表面声波传感器( s u r f a c ea c o u s t i c w a v e s ，s a w s ) 【嘲，在催化应用领域中则以催化效率、反应速度、结合量等参数来描述 m i p s 的催化活性。 分离度r s 是色谱中用来描述将a 与b 两种物质分开的程度，其定义为：r s = ( t m 3 - - t r a ) o 5 ( y a + y a ) ，式中r s 表示分离度；t r b ，t r a 分别表示a 、b 物质在色谱柱上的保 留时间；y a 、y b 分别表示a 、b 物质的色谱峰宽。m i p s 作为色谱固定相广泛应用于拆 分外消旋体，w u l f f 做了开创性的工作，将m i p s 作为h p l c 固定相广泛用于拆分d 甘露吡哺糖苯苷的外消旋体，分离度r s = 2 1 ，改用梯度洗脱时分离度r s 达到4 - 3 【4 ”。 s e l l e r g r e n 等人【4 目用l 苯丙氨基酰替苯胺为模板分子，通过与甲基丙烯酸的氢键和静电 作用制得m i p ，对d l 苯丙氨基酰替苯胺获得了完全拆分( r s - - - - 1 2 ) 。他们进一步在p h - - - - 4 的缓冲溶液内，把底物质子化，其中聚合物空穴内的羧基部分去质子化，而空穴外 的羧基则一点也不去质子化，这样只能在孔穴内通过离子交换机理进行选择性的结合。 使r s 提高到2 2 【观】。有人用( 一) 一s t i m o l o l 为模板的甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯共 聚物用于色谱系统，使模板分子的外消旋体达到了基线分离( r s = 2 o ) 【79 1 。表征m i p s 分离选择性的另两个参数是分配系数k d 和分离因子a1 8 0 1 ，静态吸附分配系数k d 的定 义为 k d = c p c s 式中c p 表示印迹分子在聚合物上的浓度( m gg 。1 ) ，c s 表示印迹分子在溶液中的浓度( m g m l 。) ，分离因子( 系数) a 定义为a = k d i ，k d j ，i 和j 表示模板分子和底物，规定i _ j 时，= 1 0 。k e m p e 等人1 5 9 】用s - n a p r o x e n 为模板，4 乙烯基吡啶和乙二醇二甲基丙烯 酸酯共聚制得的分子模板聚合物作为h p l c 固定相，成功地从外消旋体中分离出 s - n a p r o x e n ，其d = 1 6 5 ，r s - - - - 0 8 3 。g l a d 等人以表面含双键的t r i m 小球( 5 1 0 m ) 为 载体，将m i p 连接到这些小球的表面，制得了适用于h p l c 的分离介质，其a 值达1 7 4 。m o s b a c h 通过悬浮聚合法剑得了粒径在5 5 0 岬的球形m i p1 5 2 , s 3 1 ，全氟取代的有 机物被用作分散相，通过改变表面活性剂的用量来控制半径。即使采用5i t m 的填料， 柱压也很小，溶质扩散很快，高流速下也能获得较好的分离效果，q 高达3 0 8 。s h e a 等人【州使用9 乙基腺嘌呤为模板制得的m i p 与印迹分子的结合常数k d = 7 6 0 0l m o l ， 9 南开大学博士学位论文 用于h p l c 固定相，对印迹分子选择性极高。周杰等人【8 5 l 以利凡诺为印迹分子制得的 m i p 对利凡诺、丫啶黄、罗丹明b 进行吸附性实验，发现对印迹分子的吸附性明显比其 他两种非印迹分子的吸附性要大得多，对利凡诺的k o 值为1 1 2 1 2 ，d 值为1 5 9 。s e l l e r g r e n 用治疗a i d s 病毒引起机能失调的药物p e n t a m i d i n e ( p f 蠊d 为模板制各了p a m 的m i p ， 用于固相萃取剂，从稀溶液中富集p a m 的富集系数达5 4 ，是苄脒( b a m ) 为模板制得 的组成相同的参比聚合物的4 倍 s 6 1 。有人用除草剂a t r a z i n e 为模板制得的m i p 对 a t r a z i n e 有很高的亲和性，其离解常数达到1 0i j m o ll 8 7 , 8 8 。s i e m a n 进一步用色谱检 验表明，这种m i p 对a t r a z i n e 的保留时间是有相同组成的非模板聚合物的6 0 倍【盼1 。 第三节分子印迹聚合物的制备方法 3 1 分子印迹聚合物原材料 3 1 1 模板分子 根据所要识别的化合物的结构和性质，模板分子可以是小分子化合物、低聚物、金 属离子或金属络合物，也可以是分子聚集体，习惯上统称为模板分子。应用较多的有糖 类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、蛋白质、核算、激素、杀虫剂、农药、食品、酶或 辅酶、药物、燃料和多肽。 3 1 2 溶剂或分散剂 聚合过程中所用的溶剂或分散剂对聚合物的聚合过程、后继处理以及实际应用都有 一定的影晌。选用溶剂时应既要考虑到模板分子、单体、交联剂和引发剂的溶解性，也 要尽可能的减小它对模板分子与聚合物的键合作用产生不利影响，使后继处理( 如洗脱) 尽可能的简单易行。目前，常把聚合环境分为水相和非水相两大类。 在非水相中，常用的溶剂主要有二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲苯、乙腈、甲醇、乙醇 等。近来，y e 等 9 0 】等采用全氟代碳化物也取得了很好的效果。 一般情况下，若模板分子和功能单体之间是氢键作用，则溶剂尽量采用非极性的。 因为极性溶剂( 尤其是水) 会大大削弱模板分子和聚合物之间的相互作用，导致聚合物 的选择性降低。目前，大部分的印迹过程都是在有机溶剂中完成的。，实际的应用环境， 1 0 第一章蘸毫 其中包括在药物拆分、仿生模拟和生物传感器等方面的应用中，需要在水环境中进行识 别。然而，在水性体系下进行印迹研究的工作却很少，虽然一些工作取得了一定的进展， 但依然不完善，急需进一步深入开展。 3 1 3 功能单体和交联剂 m i p s 可分为共价型和非共价型两种。制备前者的功能单体是含有乙烯基的硼酸、醛、 胺、酚和二醇以及含有硼酸酯的硅烷混合物等1 9 1 】。通常使用的单体有4 乙烯苯硼酸 ( 4 - v p b a ) 、4 - 乙烯苯甲醛( 4 v b d ) 、4 - 乙烯苯胺( 4 v a ) 、4 - 乙烯苯酚等。制备后者通常使 用的单体是甲基丙烯酸( m a a ) 。因为它的特殊结构决定了它既可以同胺类物质发生离 子作用，又可以与酰胺或羧基发生氢键作用，由于其与印迹分子之间有较多的结合位点， 因此由其制成的m i p 具有高的选择性和结合能力。若用2 - ( - - 氟甲基) 一丙烯酸( t f m a a ) 做单体时由于三氟甲基有强烈的吸电子效应，使得该单体的酸性更强，更适合于碱性化 合物的分子e 口迹 9 2 , 9 3 。非共价聚合物己使用的单体有丙烯酸( a a ) 、甲基丙烯酸( m a a ) 、 甲基丙烯酸酯( m a ) 、三氟甲基丙烯酸( t f m a a ) 、亚甲基丁二酸( m s a ) 、丙烯酰胺( a m ) 、 4 乙烯基苯甲酸( 4 v b a ) 、4 - 乙基苯乙烯( 4 v b ) 、2 - 丙烯酰胺基- 2 甲基1 丙磺酸( a m a s ) 、 1 乙烯基咪唑( 1 一v d a ) 、4 - 乙烯基吡啶( 4 一v v ) 、2 - 乙烯毗啶( 2 一v p ) 、2 , 6 一二丙烯酰胺吡啶 ( 2 ，6 b a p ) 9 4 】、n 丙烯酰基丙氨酸( n a l a ) 、n - ( 4 乙烯苄基) 亚氨基二乙酸铜( i i ) 1 9 5 】、b 一环糊精和含乙烯基的l - 缬氨酸的衍生物f 9 7 l 等。 制备m i p 目前最常用的交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 。除此之外，已经 使用的交联剂还有n n - 亚甲基二丙烯酰胺( n ，n 一m b a ) 、n ，n - 1 ，4 苯基二丙烯酰胺 ( p b a ) 、3 ，5 二丙烯酰胺基苯甲酸( b a b a ) 、- - 7 , 烯苯( d v p ) 、l - 2 - 二丙烯酰胺基苯丙醇丙 烯酸酯( b a p a ) 、季戊四醇三丙烯酸酯( p e t r a ) 、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 等。色谱研究结果表明，选用p e t r a 和t r i m 做交联剂制备的m i p 对印迹分子氨基酸 衍生物和肽的柱容量和选择性优于e g d m a l 9 , , 9 9 1 。 常见功能单体和交联剂的结构见图4 。 3 1 4 致孔荆 为了提高m i p s 的吸附能力，m i p s 的制备过程中除了模扳分子、功能单体、交联剂 和溶剂或