（动物学专业论文）棘蛙族tribe+paini精子形态结构及精巢年周期研究.pdf

摘要 棘蛙族( t r i b ep a i n i ) 精子形态结构及精巢年周期研究 覃丽梅 指导老师：郑中华研究员 ( 中国科学院成都生物所，成都，6 1 0 0 4 1 ) ( 中国科学院研究生院，北京，1 0 0 0 4 9 ) 摘要 棘蛙族( t r i b ep a i n i ) 隶两栖纲( a m p h i b i a ) 、无尾目( a n u r a ) 、蛙科( r a n i d a e ) 、 叉舌蛙亚科( d i c r o g l o s s i n a e ) ，由棘蛙属( p a a ) 、倭蛙属( n a n o r a n a ) 和沙巴蛙属 ( c h a p a r a n a ) 构成( d u b o i s ，1 9 9 2 ) 。由于特殊的形态特征和染色体核型，棘蛙族受 到国内外学者的广泛重视和研究，但是到目前为止，棘蛙族的系统发育关系尚未 明晰，族下属种的分类和归属问题还有待进一步研究和新的证据出现。 本文通过光学显微镜、电子显微镜和石蜡切片对棘蛀族1 0 物种的精子和 精巢进行研究，旨在了解棘蛙族精子的形态、量度、超微结构特征及不同季节精 巢结构的变化规律，同时为棘蛙族的系统研究提供新的依据，也为棘蛙族濒危物 种的保护和经济物种的繁殖提供基础资料。研究结果表明： 棘蛙族各属物种精子的形态基本相似，精子整体呈线形，由头部、中片和 尾部构成。精子头部呈长条状，顶体呈锥状，位于头部顶端并向前伸出，中片较 长，尾部波动弯曲。 棘蛙族各属物种精子量度差异较大，将各属物种精子头部、中片、尾部、 头宽、尾宽的量度数据进行聚类分析，结果表明棘蛙族1 0 物种可分为三类：第 一类包括棘侧蛙、合江棘蛙、小棘蛙、棘腹蛙和棘胸蛙，特点是精子较短，全长 在7 2 6 - - 一1 0 3 3 5 i ，t m 之间；第二类包括倭蛙、高山倭蛙、腹斑倭蛙，特点是精子 较长，全长在1 0 7 7 4 - - - - 1 2 9 7 5 b m 之间：第三类包括隆肛蛙和双团棘胸蛙，特点 是精子最长，全长在1 4 5 8 9 - 一1 6 5 8 4 1 x m 之间。 棘蛙族各属精子超微结构基本相似：精子头部由顶体、细胞核构成；中片 学位论文：棘蛙族( t r i b ep a i n i ) 精子形态结构及精巢年周期研究 由中心粒、线粒体构成；尾部由单根轴丝构成。精子顶体横切呈圆环状，细胞核 电子密度高；线粒体为卵圆形，呈环状围绕轴丝排列，线粒体数目较多，约3 0 层；尾部轴丝为典型的9 + 2 结构，即由2 根中央微管和9 对外周微管组成。 不同季节的倭蛙精巢结构变化表明倭蛙精巢每年只有一个生精周期，生精周 期始于7 月，繁殖季节从5 月到6 月，生精高峰期为9 月；根据倭蛙不同季节精 巢结构的变化，可将生精周期分为3 个阶段：第一阶段从7 月到9 月，为精子形 成期；第二阶段从1 0 月到翌年4 月，为精子的贮存阶段，也即倭蛙的冬眠期； 第三阶段从5 月到6 月，为精子的排放阶段，即倭蛙的繁殖期。不同季节的隆肛 蛙精巢结构变化表明5 月为隆肛蛙的繁殖高峰期。 根据棘蛙族各属精子的形态、量度和超微结构特征，结合已有的棘蛙族形 态学、生态学、染色体核型及系统学研究成果，本文认为： 1 基于精子数据对棘蛙族的划分和基于形态学及分子系统学数据对棘蛙 族的划分均有相同之处，精子形态结构可为棘蛙族的系统研究提供新的证据。 2 棘蛙族各属精子的形态、量度及超微结构不仅与蛙科其他属种有明显 差异，而且在无尾类中也较为特殊，精子学研究结果支持将棘蛙族从蛙科中分离 出来，归隶于叉舌蛙科的叉舌蛙亚科的系统学修正。 3 精子的顶体、细胞核、中片的形态结构及量度可作为蛙科的分类指标。 关键词：棘蛙族；精子；形态；超微结构；精巢 i i a b s t r a c t s t u d yo ns p e r mm o r p h o l o g y , u l t r a s t r u c t u r ea n d s e a s o n a lc h a n g e si nt e s t i so ft r i b ep a i n i q i nl i m e i ( z o o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f z h e n gz h o n g h u a ( c h e n g d ui n s t i t u t eo fb i o l o g y , c h i n e s ea c a d e m yo fs c i e n c e s ，c h e n g d u6 10 0 41 ) ( g r a d u a t e ds c h o o lo fc h i n e s ea c a d e m y o fs c i e n c e s ，b e i j i n g10 0 0 4 9 ) a b s t r a c t o nt h eb a s eo fu n i q u em o r p h o l o g i c a la n dk y r o t y p ec h a r a c t e r s ，d u b o i s ( 1 9 9 2 ) r e c o g n i z e dt h r e eg e n e r ap a a , n a r n o r a n a ，c h a p a r a n aa st r i b ep a i n i ，w h i c hi s a m e m b e ro fd i c r o g l o s s i n a e ，r a n i d a e i np r e s e n ts t u d y , t h es p e r ms h a p e ，s i z ea n d u l t r a s t r u c t u r eo f10p a i n is p e c i e sw e r ei n v e s t i g a t e dt h r o u g ht h el i g h ta n de l e c t r o n m i c r o s c o p e ，a n dt e s t i ss t r u c t u r eo fn p l e s k e ia n deq u a d r a n aw a sa l s os t u d i e d w e s u p p o s et h i ss t u d yc o u l do f f e rs o m es p e r m a t o l o g i c a le v i d e n c et op h y l o g e n ya n d r e p r o d u c t i o ns t u d yo f t d b ep a i n i t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h es p e r ms h a p eo ft r i b ep a i n ii sh o m o l o g i c a u ys i m i l a r , t h es p e r m a t o z o aa r e f i l i f o r m ，c o m p o s e do fe l o n g a t eh e a d ，l o n gm i d - p i e c ea n dw a v e dt a i l t h ea c r o s o m ei s a p i c a u ya s s o c i a t e d 、析t ht h en u c l e u sa n de x t e n da n t e r i o r l y t h es p e r ml e n g t ho ft f i b ep a i n id i f f e rr e m a r k a b l ya m o n gg e n e r a c l u s t e rf o rt h e l e n g t ho fs p e r mh e a d ，m i d - p i e c e ，t a i l ，t o t a ll e n g t h ，h e a d w i d t h ，t a i l w i d t ho ft e np a i n i f r o g si n d i c a t e dt h e10s p e c i e sc o u l db es e p a r a t e di n t ot h r e eg r o u p s ：g r o u pic o n t a i n s ps h i m pr o b e r t i n g e r i ，p s p i n o s a ，pe x i l i s p i n o s a ，pb o u l e n g e r i ，t h es p e r m a t o z o ai s c h a r a c t e r i z e d 、析ms h o r ti n t o t a ll e n g t h , r a n g i n gf r o m 7 2 6 9 mt o 10 3 3 51 a m ； g r o u pi ic o n t a i n sn p l e s 留i ，n p a r k e r i ，n v e n t r i p u n c t a t a , t h es p e r m a t o z o ai s c h a r a c t e r i z e dw i t l l r e l a t i v e l yl o n gi n t o t a l l e n g t h ，r a n g i n gf r o m 10 7 7 4 9 mt o 1 2 9 7 5 9 m ；g r o u p1 i ic o n t a i n seq u a d r a n aa n d 户y u n n a n e n s i s ，t h es p e r m a t o z o ai s i i i 学位论文：棘蛙族( t r i b ep a i n i ) 精子形态结构及精巢年周期研究 c h a r a c t e r i z e dw i t hl o n g e s ti nt o t a ll e n g t h , r a n g i n gf r o m1 4 5 8 9 p mt o1 6 5 8 4 p m t h e t h r e eg r o u p sb a s e do ns p e r m a t o l o g i c a ld a t ai sp a r t i a l l ym a t c ht h ec l a s s i f i c a t i o nb a s e d o nm o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a rd a t a t h eu l t t a s t r u c t u r eo fs p e r m a t o z o ai nt r i b ep a i n ii sa l s ob a s i cs i m i l a r , i n c l u d i n g a c r o s o m ev e s c i l e ，n u l e u so ft h eh e a dp r o p e r , c e n t r i o l e ，m i t o c h o n d r i o lo ft h e m i d - p i e c e s ，a x o n e m eo ft h et a i l t h ea c r o s o m ev e s e l ei sc i r c l ei nt e m t r a n s v e r s e s e c t i o n , t h ed e n s i t yo fn u c l e u si sh i g h ；t h em i t o c h o n d r i o n si so v a l ，s u r r o u n d i n gt h e a x i a lf i l a m e n tw i t ha b o u t3 0l a y e r so fm i t o c h o n d r i a ；t h ea x o n e m eh a st h et y p i c a l9 + 2 p a t t e mo fm i c r o t u b u l e s t h es e a s o n a lc h a n g e si nt e s t i so f n p l e s k e ii n d i c a t e si th a so n l yo n e s p e r m a t o g e n e s i sc i r c l e ，w h i c hb e g i ni nj u l y , t h er e p r o d u c t i o ns e a s o ni sf r o mm a y t o j u n e ，t h es p e r m a t o g e n e s i si sa c t i v ei ns e p t e m b e r o nt h eb a s eo fs e a s o n a lc h a n g e si n t e s t i s ，t h es p e r m a t o g e n e s i sc i r c l ec a nb es e p a r a t e di n t ot h r e es t a g e s ：i ns t a g eif r o m j u l yt os e p t e m b e r , s p e r m a t i d sa r ef o r m e d ；i ns t a g ei i f r o mo c t o b e rt oa p r i ln e x ty e a r , t h es p e r m a t o z o aa r es t o r e di nt e s t i s ，w h i c hi st h eh i b e m a t e dp e r i o d ；i ns t a g e f r o m m a y t oj u n e ，m a t u r es p e r m a t o z o aw e r er e l e a s e df r o mt h et e s t i s ，w h i c hi st h e r e p r o d u c t i o ns e a s o no f n p l e s k e i a st oeq u a d r a n a , r e p r o d u c t i o n i sa c t i v ei nm a y w i t ht h ep r e v i o u ss t u d yo fm o r p h o l o g y , e c o l o g y , k a r y o t y p e sa n dp h y l o g e n y r e s e a r c ho ft r i b ep a i n i ，t h es p e r m a t o l o g i c a ld a t ai np r e s e n ts t u d ys u g g e s t s ： 1 t h es p e r m a t o l o g i c a lc l a s s i f i c a t i o no ft r i b ep a i n ii sp a r t i a l l yc o n s i s t a n tw i t ht h e m o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a rc l a s s i f i c a t i o nr e s p e c t i v e l y 2 t h es p e r mm o r p h o l o g ya n du l t r u s t m c t u r eo ft r i b ep a i n ii su n i q u en o to n l yi n t h ef a m i l yr a n i d ab u ta l s oi na n u r a ，w h i c hs u g g e s tt h et r i b ep a i n ii sm o n o p h y l e t i ca n d m i g h tb et r a n s f e r e df r o mt h ef a m i l yr a n i d at ot h ef a m i l yd i c r o g l o s s i d a eb a s e do n ，m o l e c u l a re v i d e n c e 3 t h ea c r o s o m e ，n u l e u s ，s h a p e ，l e n g t ha n du l t r a s t r u c t u r eo fm i d - p i e c ec a nb e u s e da sa na l t e r n a t i v et a x o n o m i cc h a r a c t e ri na n u r a k e y w o r d s ：t r i b ep a i n i ；m o r p h o l o g y ；s p e r m a t o z o a ；u l t r a s t m c t u r e ；t e s t i s 引言 引言 1 棘蛙族的研究现状 1 1 棘蛙族分类和系统学研究历史 早在2 0 世纪中期，棘蛙族就引起学者们的研究兴趣， 1 9 6 1 刘承钊在中 国无尾两栖类一书中提到中国棘蛙群，他认为中国的棘蛙群为五种：分布在华 中、华东南、华南地区的棘胸蛙；分布在西南地区的双团棘胸蛙、眼斑棘蛙、花 棘蛙；分布在华西地区的棘腹蛙，这是有关棘蛙族的较早的记录。棘蛙族( t r i b e p a i n i ) 这一分类阶元是法国学者d u b o i s ( 1 9 9 2 ) 首次提出，包括棘蛙属( p a a ) ， 倭蛙属( n a n o r a n a ) 和沙巴蛙属( c h a p a r a n a ) ，归隶于蛙科( r a n i d a e ) 的蛙亚科 ( r a n i n a e ) ，这一结论得到d u e l l m a n ( 1 9 9 3 ) 的支持。江建平( 1 9 9 9 ) 、江建平 等( 2 0 0 1 ) 、j i a n ga n dz h o u ( 2 0 0 5 ) 、j i a n ge ta 1 ( 2 0 0 5 ) 根据形态和分子证据认 为棘蛙族应该归隶蛙科的叉舌蛙亚科( d i c r o g l o s s i n a e ) ，这一结论得到d u b o i s ( 2 0 0 3 ) 的支持，并修正了棘蛙族的亚科级归属问题，把棘蛙族从蛙亚科移入叉 舌蛙亚科。此后，r o e l a n t se ta 1 ( 2 0 0 4 ) 的研究结果印证了前述江建平( 1 9 9 9 ) 、 江建平等( 2 0 0 1 ) 、j i a n ga n dz h o u ( 2 0 0 5 ) 、j i a n ge ta 1 ( 2 0 0 5 ) 、d u b o i s ( 2 0 0 3 ) 等 的观点。c h e ne ta l ( 2 0 0 5 ) 认为棘蛙属、倭蛙属和沙巴蛙属在系统发育上是并列的 姐妹群，这一结论得到f r o s te ta 1 ( 2 0 0 6 ) 的支持。根据形态学特征和分子数据，f r o s t e ta l ( 2 0 0 7 ) 将棘蛙族物种划归以下4 属，即倭蛙属、a l l o p a a 属、q u a s i p a a 属和 o m b r a n a 属，并将叉舌蛙亚科( d i c m g l o s s i n a e ) 提升为科级，即叉舌蛙科 ( d i c r o g l o s s i d a e ) ，包括叉舌蛙亚科( d i c r o g l o s s i n a e ) 和浮蛙亚科( o c c i d o z y g i n a e ) 。 目前，棘蛙族共有3 8 种( f r o s te ta l ，2 0 0 7 ) ，在中国约2 0 余种，占全世界 棘蛙总数的5 0 ，其中1 2 种为中国特有种，如隆肛蛙、棘腹蛙、倭蛙、腹斑倭 蛙等。 1 2 棘蛙族的相关研究 近年来国内外学者对棘蛙族开展了较多研究，主要包括形态学、生态学、染 色体核型和分子系统学等方面的研究。 1 2 1 形态和生态学方面 棘蛙族物种的共同特点是身体各处有锥状黑刺或疣粒分布，包括头侧、胸部、 腹部、胸腹部、前臂、体背、体侧、腋部和肛部等部位，棘蛙族由此得名。按照 学位论文：棘蛙族( t r i b ep a i n i ) 精子形态结构及精巢年周期研究 胸部的刺的特征可将棘蛙属分为两类，第一类，胸部的刺不分为左右2 团，为棘 腹蛙种组，包括棘侧蛙、棘腹蛙、合江棘蛙；第二类，雄性胸部的刺分为左右2 团，为双团棘胸蛙种组，包括布兰福棘蛙、波留宁棘蛙、棘臂蛙、错那棘蛙、花 棘蛙、墨脱棘蛙等( 费梁，2 0 0 5 ) 。 棘蛙族一般生活在山溪间水旁、小瀑布下或水中石隙内，它们后肢粗壮，趾 全蹼，能跳跃于山间卵石之间或游于急流内。雄蛙前肢特别粗肥，鸣声宏大，产 卵季节颇长，从4 月底一直持续到到9 月；卵大，外胶质层厚，粘性强，不易被 流水冲散。棘蛙族物种分布区域广，从印度和巴基斯坦北部的喜马拉雅山区，阿 富汗、尼泊尔、缅甸、泰国、越南北部的山脉地区到西藏南部和东部地区，华西、 华南、华中、华东及华北南部都有分布；不仅如此，棘蛙族分布的海拔跨度也较 大，如倭蛙生活在海拔4 2 0 0 米以上的高山上，而棘胸蛙生活在海拔只有1 - 2 0 0 米的华东、华南地区，海拔相差4 0 0 0 米左右。 1 2 2 染色体核型方面 棘蛙族的染色体核型在常规核型、带型方面与一般蛙科物种有很大的差异。 通常蛙科的染色体核型模式为2 n = 2 6 、n f = 5 2 、5 + 8 ，而棘蛙族的无声囊棘蛙、 双团棘胸蛙的染色体数却为2 n - 6 4 ；云南产的棘肛蛙染色体为2 n - 4 0 、n f = 7 8 ( 李 树深，1 9 9 4 ) ；寨隅棘蛙的着丝点c 带浅染，但有较多的端部和居间型c 带；隆 肛蛙的a g - n o r s 在1 2 p p e r ，除了较浅的垒部着丝点c 带外，在少数染色体上有 很浓的端部和居间型c 带( 李树深，1 9 9 6 ) 。可见棘蛙族的染色体核型与蛙科其 他物种有显著差异。 1 2 3 分子系统学方面 j i a n ge ta l ( 2 0 0 5 ) 研究了棘蛙族1 9 物种部分线粒体1 2 s 和1 6 s r r n a 基因序 列，通过最大简约标准( m a x i m u mp a r s i m o n y ，简称m p ) ，最大似然( m a x i m u m l i k e l i h o o d ，简称m l ) 和邻接法( n e i g h b o rj o i n i n g ，n j ) 分析，发现可将1 9 个棘 蛙族物种分成两支：第一个分支主要分布在喜马拉雅山脉的西部，在棘蛙族中属 于高海拔种群，特点是胸部有两个刺团，如双团棘胸蛙、棘臂蛙、倭蛙、高山倭 蛙、太行隆肛蛙和隆肛蛙等；第二支主要分布在喜马拉雅山脉的东部，属低海拔 种群，特点是在身体某一区域有棘刺分布，如叶氏隆肛蛙胸部无刺但肛部有刺； 棘侧蛙胸部和体侧有刺；棘腹蛙和合江棘蛙整个腹部有刺；小棘蛙和棘胸蛙胸部 2 引言 和腹部上部分有刺，这一分支是q u a s i p a a 属成立的重要分子系统学依据。 1 3 棘蛙族系统学研究存在的问题 自1 9 9 2 年d u b o i s 提出棘蛙族这一分类阶元的十多年来，通过形态学、生态 学、染色体核型学、分子系统学等研究，人们对棘蛙族的系统发育关系有了一定 的了解，在棘蛙族的分类问题上也达成一定共识，但棘蛙族的分类和系统发育关 系研究中仍然存在很多问题，首先，棘蛙族属种的划分至今还没有定论，如棘蛙 族最初成立的时候为3 属，即棘蛙属、倭蛙属、沙巴蛙属( d u b o i s ，1 9 9 2 ) ；费 梁( 2 0 0 5 ) 根据形态学特征认为棘蛙族应分为4 属，即棘蛙属、倭蛙属、隆肛蛙 属( f e i r a n a ) 、棘肛蛙属( u n c u l u a n a ) ；f r o s te ta l ( 2 0 0 7 ) 重新分析已有的分子 数据将棘蛙族分为新的4 属，即倭蛙属、a l l o p a a 属、q u a s i p a a 属、o m b r a n a 属， 可见棘蛙族的分类还比较混乱；其次，棘蛙族科的归属问题存在争议，棘蛙族最 初归隶于蛙科( d u b o i s , 1 9 9 2 ；江建平，1 9 9 9 ；江建平等，2 0 0 1 ；d u b o i s ，2 0 0 3 ；r o e l a n t s e ta l ，2 0 0 4 ；j i a n ga n d z h o u ，2 0 0 5 ；j i a n ge ta l ，2 0 0 5 ) ，f r o s te ta l ( 2 0 0 7 ) 根据已有报道 的分子系统学数据，认为应该将棘蛙族从蛙科中分出来，转归为叉舌蛙科的叉舌 蛙亚科，又引发了新的讨论。可见棘蛙族的分类和系统关系需进一步研究，有待 新的证据出现。 2 无尾两栖类精子形态结构研究现状及对分类和系统学研究的意义 早在1 8 9 6 年，b o u l e n g e rg a 就对无尾两栖类的精子形态进行初步研究，他 对铃蟾科的b o m b i n a t o rp a c h y p u s ，锄足蟾科的p e l o b a t e sf u s c u s ，蟾蜍科的b u f o v u l g a r i s ，雨蛙科的h y l aa r b o r e a 以及蛙科的r a n ae s c u l e n t a , 尼w m p o r a r i a 的精子 形态进行了初步描述，这是迄今为止最早的有关无尾两栖类精子形态的记录。到 本世纪初，已有精子形态结构报道的无尾类两栖类共有2 1 科，包括尾蟾科 ( a s c a p h i d a e ) 、铃蟾科( b o m b i n a t o r i d a e ) 蟾蜍科( b u f o n i d a e ) 、小跗蛙科 ( c e n t r o l e n i d a e ) 、盘舌蟾科( d i s c o g l o s s i d a e ) 、雨蛙科( h y l i d a e ) 、非洲树蛙科 ( h y p e r o l i i d a e ) 、滑踱蟾科( l e i o p e l m a t i d a e ) 、细趾蟾科( l e p t o d a e t y l i d a e ) 、曼 蛙科( m a n t e l l i d a e ) 、角蟾科( m e g o p h r y i d a e ) 、姬蛙科( m i c r o h y l i d a e ) 、龟蟾科 ( m y o b a t r a c h i d a e ) 、锄足蟾科( p e l o b a t i d a e ) 、合跗蟾科( p e l o d y t i d a e ) 、石蛙科 ( p e t r o p e d e t i d a e ) 、负子蟾科( p i p i d a e ) 、树蛙科( r h a c o p h o r i d a e ) 、蛙科( r a n i d a e ) 、 剑毒蛙科( d e n d r o b a t i d a e ) 和尖吻达蛙科( r h i n o d e r m a t i d a e ) ( j a m i e s o n , 2 0 0 2 ； b u r g o s ，19 5 5 ，19 5 6 ；c a r n p a n e l l a ，19 7 9 ；d e l a h o u s s a y e ，19 6 6 ；a s a , 19 9 8 ；f e m a n d e s ， 3 学位论文：棘蛙族( t r i b ep a i n i ) 精子形态结构及精巢年周期研究 1 9 9 8 ；h e n m a n n ，1 9 8 7 ；j a m e s ，1 9 7 0 ；j e m i e s o n ，1 9 8 9 ；m a i n o y a , 1 9 8 1 ；m o r r i s e t t ，1 9 7 4 ； p u g i n - r i o s ，1 9 8 0 ；r e t z i u s ，1 9 0 6 ；s c h e l t i n g a , 2 0 0 1 ，2 0 0 2 a ，2 0 0 2 b ；w i l s o n , 1 9 9 4 ) ，其中 研究较多的有铃蟾科、角蟾科、雨蛙科、树蛙科、姬蛙科、剑毒蛙科及蛙科。 2 1 铃蟾科( b o m b i n a t o r i d a e ) r e t z i u s ( 1 9 0 6 ) ，l e e & k w o n ( 1 9 9 6 ) ，k u r o m a t o ( 1 9 9 6 ，2 0 0 0 ) 对红腹铃蟾( 丑 b o m b i n a ) 、东方铃蟾( 丑o r i n t a l i s ) 、多彩铃蟾( 丑v a r i e g a t a ) 精子进行光学显微 镜和电子显微镜的观察；郑中华等( 2 0 0 0 ) 对铃蟾属5 种精子的形态进行了研究， 发现铃蟾属精子形态不仅异于盘舌蟾科另外两属精子形态，而且也异于无尾两栖 类其他科属的精子形态，这为铃蟾科的成立提供新的证据。 2 2 角蟾科( m e g o p h r y i d a e ) 郑中华等( 2 0 0 0 ，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ，2 0 0 5 ) 对角蟾科4 属，即角蟾属m e g o p h r y s 1 6 种，短腿蟾属b r a c h y t a r s o p h r y s2 种，拟角蟾属o p h r y o p h r y n e1 种，髭蟾属 v i b r i s s a p h o r a5 种，拟髭蟾属l e p t o b r a c h i u1 种的精子形态进行了观察比较，发 现角蟾科精子形态和大小的差别可为该科属、种的划分和亲缘关系的研究提供新 的依据；蛾眉髭蟾( 矿b o r i n g i i ) 与东南亚拟髭蟾( lh a s s e i t i i ) 在精子的超微结 构上存在明显的差异，这为髭蟾属的有效性提供了新的证据。 2 3 雨蛙科( h y l i d a e ) c o s t ae ta 1 ( 2 0 0 4 ) 研究了雨蛙科2 属( h y l a 和s c i n a x ) 3 种( 月= p s e u d o p s e u d i s ， r o s t r a t u s , s q u a l i r o s t r & ) 精子的超微结构，发现雨蛙科精子的结构存在多态性； 此外且p s e u d o p s e u d i s 精子尾部缺乏轴棒及轴鞘( a x i a ls h e a t h ) ，这一特点很容易将 其与蟾蜍科( b u f o n i d a e ) 区分；根据两属精子结构的差异可将毋舷属和s c i n a x 属区分开，精子学研究结果和形态学的分类结果相吻合。f o u q u e t t e ( 1 9 7 7 ) 根据 精子形态对雨蛙的分类提出修正意见。林丹军( 1 9 9 9 ) 认为中国雨蛙精子尾部波 动膜消失，附属纤维数量减少，比已报道的雨蛙科其他种的精子结构更为简单。 根据蟾蜍科、雨蛙科、蛙科精子的结构由复杂趋于简单的趋势，作者认为中国雨 蛙的精子更为特化。 2 4 树蛙科( r h a c o p h o r i d a e ) k u r a m o t o ( 1 9 9 6 ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 研究了溪树蛙属( b u e r g e r i a ) 2 种、小树蛙属 ( p h i l a u t u s ) 7 种、跳树蛙属( c h i r i x a l u s ) 2 种和树蛙属( r h a c o p h o r u s ) 3 种精 4 引言 子的形态和结构，他认为树蛙科精子存在明显的差别，并认为无尾两栖动物的精 子在量度和结构上都存在很大差异，不同分类单元精子的形态结构不同。q i ne t a 1 ( 2 0 0 7 ，i np r e s s ) 比较和分析了斑腿树蛙( r m e g a c e p h a l u s ) ，无声囊树蛙( r m u t u s ) ，峨嵋树蛙( 尺o m e i m o n t i s ) ，宝兴树蛙( r d u g r i t e i ) ，经甫树蛙( 尺c h e n f u i ) 精子形态和量度的差异，认为这5 种树蛙的精子学形态量度特征支持将斑腿树 蛙，无声囊树蛙从树蛙属分开，并归隶于泛树蛙属的系统学修正，这与f r o s te ta l ( 2 0 0 7 ) 的分类结果相吻合。 2 5 姬蛙科( m i c r o h y l i d a e ) s c h e l t i n g ae ta l ( 2 0 0 2 a ) 对星蛙亚科( a s t e r o p h r y i n a e ) 1 种，暴蛙亚科 ( d y s c o p h i n a e ) ，g e n y o p h r y n i n a e 亚科5 种，姬蛙亚科( m i c r o h y l i n a e ) 4 种精子 进行光学显微镜和电子显微镜观察，认为姬蛙科精子在中片、核内沟、轴状穿孔 器和轴丝等结构上都属于变形，在两栖动物精子中属于特化现象。 2 6 箭毒蛙科( d e n d r o b a t i d a e ) a g u i a r - j r ( 2 0 0 3 ) 观察了箭毒蛙科2 属2 种( e p i p e d o b a t e sf e m o r a l i s 和 c o l o s t e t h u ss p ) 精子的双尾结构，他认为二者精子的形态结构的差异建议它们 应该归于不同的两个分支，这两个分支虽然关系较近但依然是彼此独立的，而且 均非单源性。a g u i a r - j r ( 2 0 0 4 ) 研究了箭毒蛙科e p i p e d o b a t e s 属的et r i v i t t a t u s 和 eh a h n e l i 精子的形态结构，作者认为两者在系统发育上是同源的，因此e t r i v i t t a t u s 应该继续保留在e p i p e d o b a t e s 属中，而不应当划分到p h o b o b a t e s 属中， 这一结论与z i m m e r m a n n ( 19 8 8 ) 的结论相反，但支持v e n c e se ta 1 ( 2 0 0 0 ) 通过 m ir r n a 基因序列分析得出的分子系统学结论。g a r d ae ta l ( 2 0 0 2 ) 通过观察箭 毒蛙科( e p i p e d o b a t e s f l a v o p i c t u s ) 精子的超微结构，发现其结构非常独特，如轴 棒弯曲、无近轴丝纤维( j u x t a a x o n e m a lf i b e r ) 、线粒体分布于波动膜，这在其他 无尾类精子中是没有的。作者认为e f l a v o p i c t u s 精子缺少穿孔器，应该归为蟾蜍 类支系( b u f o n o i dl i n e a g e ) 而不应该归为蛙类支系( r a n o i dl i n e a g e ) 。 2 7 蛙科( r a n i d a e l j a m i e s o n ( 2 0 0 3 ) 、k u r a m o t o ( 19 9 8 ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 、s c h e l t i n g a ( 2 0 0 2 ) 、 k w o n & l e e ( 19 9 5 ) 、w i l s o n ( 19 9 5 ) 、y o s h i z a k i ( 19 8 7 ) 、v e nd e rh o r s t ( 19 7 9 ) 分别对 水栖蛙属( e u p h l y c t i s ) 、水游蛙属( l i m n o n e c t e s ) 、昏蛙属( m e r i s t o g e n y s ) 、扁 5 学位论文：棘蛙族( t d b ep a i n i ) 精子形态结构及精巢年周期研究 手蛙属( p l a t y m a n t i s ) 、蟾蛙属( p h r y n o b a t r a c h u s ) 、皱蛙属( p t y c h a d e n a ) 、蛙属 ( r a n a ) 精子的形态和结构进行研究，结果表明蛙科精子有科的共同特征，如 精子由头部、中片、尾部构成，精子头部呈棒状，较直，中片短，尾长；顶体呈 囊状，无穿孔器；尾部由轴丝构成；线粒体一般出现在精子的中片或在近中片的 轴丝上；无轴棒、近轴丝纤维( j u x t a - t a x o n e m a lf i b e r ) 和波动膜，与其他无尾两 两栖类精子的结构相比大为简化。 3 研究目的和意义 鉴于棘蛙族的系统学研究还存在许多争议，同时精子形态和超微结构在无 尾两栖类的分类和系统学研究具有的重要作用，而目前缺乏对棘蛙族精子形态结 构的系统研究，此外，也鉴于繁殖季节在两栖动物保护和繁殖中具有的重要作用， 本研究通过光学显微镜、电子显微镜和石蜡切片对棘蛙族1 0 物种精子和精巢进 行比较研究，旨在了解棘蛙族精子的形态、量度、超微结构特征和不同季节精巢 结构的变化规律，同时结合已有的棘蛙族形态学、生态学、细胞学、分子系统学 等研究结果，为棘蛙族的系统研究提供精子学依据，也为棘蛙族濒危物种的保护 和经济物种的繁殖提供基础资料。 6 第一章棘蛙族精子形态研究 第一草棘蛙族精于彤忑饼冤 1 材料和方法 1 1 标本的采集 在繁殖季节采集1 0 种性成熟的个体，每物种2 个标本，具体标本名称和采 集地点见表1 。 表11 0 种棘蛙的采集地点和采集时间 t a b l e1c o l l e c t i v es p o t sa n dt i m eo ft e np a i n i f r o g s 种采集地采集时间 s p e c i e s c o l l e c t i v es p o t s c o l l e c t i v et i m e p 合r o 江b e r 棘t i n 蛙g e r is i c h u 四a n 川! 合h 江e i i a n g 1 9 9 8 5 p 棘胸蛙甘肃文县 1 9 9 9 5 ps p i n o s a g a n s u ，w e n x i a n 翌团棘胸蛙 四川凉山 2 0 0 0 4 9 尸y u n n a n e n s i ss i c h u a n l i a n g s h a n 蝥侧蛙 广西龙胜 2 0 0 2 3 ps h i n i g u a n g x i ，l o n g s h e n g 一 ” 。棘腹蛙四川，些嵋 2 0 0 5 5 pb o u l e n g e r i s i c h u a n e 、m e i 一 小棘蛙 香港岛 2 0 0 2 8 只e x i l i s p i n o s ah o n g k o n g 倭p l e 蛙s k e is i 四c h 川u a n 石s h 渠i q u 2 0 0 5 6 烹山p a 倭r k e 蛙r i t 西i b 藏e t l 拉h a 萨s a 1 9 9 9 7 n 。 v 腹e n 斑t r i p 倭u n 蛙c t a t ay u n n 云a n 嘉z h 中o n 甸g d i a n 2 0 0 5 。5 。 。隆肛蛙 甘肃，文县 1 9 9 9 5 fq u a d r a n ag a n s u 。w e n x i a n 1 2 光学显微镜样品的制备和观察 将标本用双毁髓法处死，剖开腹部摘取精巢，用蒸馏水清洗干净后置于装 有福尔马林固定液的e p 管中，并用针尖捅入精巢以便固定液渗入，约2 小时后 取精子悬浊液涂片，室温干燥后用0 5 酸洋红染色1 分钟，再用双蒸水缓慢冲 洗载玻片，直至流出的水无色，晾干后在z e i s sa x i o p l a n2i m a g i n g 光学显微镜 下观察、拍照，精子头长、中片长、尾长、总长、头宽、尾宽等部位通过a r c v i e w g i s3 2 软件测量，数据用s p s s1 1 5 软件进行统计分析。 1 3 扫描电镜样品的制备与观察 7 学他连史韩l e 旗( f t l b ep m n l 懈了形态特构辅塑午月m q f 咒 标本处，e 后，将精巢取小后越入福尔，j 林迎液中商定2 小时，低速离心 ( 8 0 0 转分) ，使固定液与精于分开，弃上清， l f 用o2 m 磷酸缓冲液漂沈，重 新离心弃上清，n 用浓度逐级1 升的丙酮脱水，每级1 0 m i n ，用滴管将含有精 于的丙酮液滴在