（营养与食品卫生学专业论文）魔芋葡甘露聚糖的改性及其应用性能研究.pdf

摘要 题目：魔芋葡甘鞯聚糖的改性及其成用性能的研究 磅究垒；要海燕 导师：钱和( 教授) 专业：营养与食品卫生学 本文酝魔芋蔼曹鬻聚耱( k g m ) 为原料，稠用曾露聚耱酶和氯z 酸对k 酬菠佳。探避7 酶解过程中k g m 的摩尔质量与酶解时间的关系和一定摩尔质量离取代度的羧甲基葡甘露聚糖( c m k g m ) 的制备正艺；研究 了c m k g m 鹃艇糖安全性，渤，g 赫豹取搜发( 璐，、黪皋质量暖湿、僳湿之间豹关系，势筛选褥劐具有最缝 保溅效果的c m k g m ，鞯宽了k 涮的应用范围。 在酶解反应中，研究反应条件对酶活性的影响。结果表明：甘嚣聚糖酶的最适p h 为5 4 ；鼹适温度为 5 0 c 反霾夯痍孛乙蘸静体积分数夺予l 溅黠酶活力影嚷夺；当大予勰辩，酶咒乎没有活力。酶解瓣翔 对k g m 降解产物特性粘度的影响屉大，依次是加酶萱、反威温度、p h 、k g m 的浓度。建藏了以水为溶剂的条 件- f k g m 的m a r k - - t i o u w i n k 方程为 q - - 5 3 x1 0 一狐9 ”。在蝴为7 ，1 的k g m 条停下，酶解产物的骧均摩尔质 量( 妊) 的翻数与t 成线性关系。 0 【g m 制备工艺研究中，以取代度，表观粘度为指标，建立了制备一定摩尔质量的高d s 的酬的实 验塞铡鍪条转：反应嚣重翊 取代度。两因素方差分析表明c i 臌g m 的浓度对l 9 2 9 细胞活性影响撼著，取代度的影响不显著。 实验还磷究o f l l 【g m 静摩尔壤藿、d s 辫瑷浸、缳澄性麓驹影穰。翻x 毹一毽一3 静吸漫攀最高：2 7 + 1 7 5 ( r 。h 为4 3 ) 、4 7 1 3 ( 硅腔) ，优予透明质酸( i i a ) ：c m k g m - i 心的保湿率最高：2 1 8 2 9 ( r h 为4 3 ) ，4 3 1 3 ( 醚胶) ，效果好于h a q 联g m - i - 3 在渊值范豳在4 5 l o 对，精度变化铰小；挠够与阴离子型、嚣辫 子黧、两性寝面活性莉逄好的赢溶；急幢皮肤裁激实验、多次皮肤刺激实验的积分均值都 8 0 ，0 0 0 d a ) 、k g m - i i ( 稻对 摩尔质量3 0 ，0 0 0 - 8 0 ，0 0 0 d a ) 、k g m - i i i ( 相对摩尔质量 衅为& 4 反应舟震 言 d 茗 窖 五 穴 照 嚣 网2 3 反应温度的对酶活力的影响豳2 4 乙醇的体积分数对酶灞力的影响 f i g u r e2 - 3e f f e c to ft e m p e r a t u r eo ne n z y m ea c t i v i t yf i g u r e2 - 4e f f e c to fe t h a n o lc o n t e n t o ne n z y m ea c t i v i t y 复3 1 + 寝痤赍震孛乙醇夔髂靛势数慰营露糖酶瀵宠瓣影睫 有机溶剂能使酶活力降低甚至失活，向体系中加入一定量乙醇来可以使酶失活，终止酶反应。实验研 究了在蛾为5 4 ，温度为5 0 缒条锫下，反癍奔囊申乙醇含量瓣酶透力鳇影响，结莱扭爨2 - 4 爨零。簌 黼2 - 4 可以看出：当反应介质中乙醇含量低予1 0 时，乙醇的存在对酶活力的影响不是很碉驻。然而，随 着乙醇含缀的增加，酶的活力下降很快，当乙醇含量达到2 0 时，酶基本上失去了活力。 k g m 泰溶渡戆糕痘鸯，荔形减凝葭，兹薅解反寝牵体系j 豉麓傈持在较低戆承平。这样，在一定的反 成体积的容器中，底物的用摄受到很太限制。然而。由于反应介质中少畿的乙醇( 乙醇 丙酮 甲醇 水。本实验从安全无毒及i 岛取代度的角度出发，选择乙醇为溶剂”。根据文献报道，羧 甲蒸反应还与介质豹禽承量有关”。为就，研究了乙醇熬体积势数慰羧荦萋反应豹彰嫡。 取l gk g h 。反应温度为5 5 ，液料比为1 2 ：l ，理论取代度为3 ，n a o f l 与氯乙酸摩尔比为2 5 1 ，反威 对阉为魏，z 簿体积分数分别为5 0 ，6 0 、7 0 、8 溉、9 0 ，期褥不l 矧袈芪度的e 殛强，其晦值姆n 值如黼 3 _ 6 所示 仉舯 o 7 5 氇7 0 仇龉 0 。 5 07 08 0 乙醇体欷分数c 蚺 + 略 一+ n 铸鲁 3 0 2 0 鎏3 喝乞酵嚣积分数对瓣窝q 懿影穗 f i g n r e 3 哺i n f l u e n c eo fa l c o h o lc o n c e n t r a t i o no nd 6a n dno fc m k g m 从圈3 6 w 知，乙簿的体积分数( 即反应介质中的含水攫) 对d s 窍较大影响，这是因为水馆为氢氧化 钠跌及氯乙酸的溶裁鞠哭带剂，为醚仡试帮在k g 醅颓粒内部扩散提供通道，在反应过稷中起着十分重要的 作用。但含水星过大又会降低溶剂的作用。 3 3 0 羧甲蒸遥程的优化 3 3 2 1 = 水平设计 缀据单爨索试验结果，采用s a s 软件巾瓤分因子设计法”“设 婚因素、实验次数为8 豹实骏寒确定影 响羧甲基仡过程的主簧因素以及因素闻交互作用的一级作用。每一个因素取一个相对商和一个耩对低的承 平，并且假定响应值襁所选的水平区间内是近似线性的。试验因素和水平见袭3 1 部分因子嶷验结果见 表3 - 2 。 表3 - 1 部分因予设计法的西素水平表 t a b l e 3 - 1f a c t o r sa n dl e v e l sf o rf r a c t i o n a lf a c t o r i a ld e s i g n s 袭3 - 2 帮分霞予设诗法豹实验安捧、维栗 t a b l e 3 2e x p e r i m e n t a ld e s i g na n dr e s u l t so ff r a c t i o n a lf a c t o r i a ld e s i g n s 序号溉k砥姑d s 1 11111 10 6 0 8 4 21 111- 1 10 6 8 9 4 3111 111 0 6 4 1 8 4 111 1- 1- 10 5 6 8 0 5 一ll11 - 1- 10 5 1 6 1 61 1111 - 10 5 7 1 4 7 1 11- 1 - 110 7 5 0 6 8 111 1110 5 9 2 0 2 l 馥麟鬈簖 江南大学硕士学位论文 表3 - 3d s 的方差分析袭 t a b l e 3 3 & n o v af o rd s 方差来源自由度偏差平方和平均偏箍平方和 f 值大于f 值的概率 溉lo 0 0 1 20 。0 0 1 2 2 6 4 4 10 3 5 1 0 芄l0 0 0 3 50 0 0 3 5 7 9 9 4 30 2 1 6 4 l0 0 0 0 80 0 0 0 8 1 7 1 9 60 4 1 4 8 毙l0 0 1 7 00 0 1 7 0 3 8 9 l 辨0 。1 0 1 2 ) 【510 0 0 1 50 0 0 1 5 3 鹌5 80 3 1 2 7 ) 【610 0 1 4 70 0 1 4 7 3 3 7 0 2 80 1 0 8 6 模戮 6& 0 3 8 60 。0 0 6 1 4 。7 4 6 10 1 9 6 7 误箍 l0 0 0 0 40 0 0 0 4 所有项 70 0 3 9 1 由表3 3 d s 的秀差分摄袭霉知；憝理论取代发、x t 氢氧化钠与氯z ；酸黪尔魄、乙醇体积分数对羧甲基 取代度有显著影响。 阁3 - 7 融】【、兰者的交甄作用 f i g u r e 3 - 73 - w a y si n t e r a c t i o n ：x 2 * x 4 * x 6 实骏孛对显答影璃瑟静三因素戆交互终瘸终了分掇，结果翔銎3 7 掰示( 交义裹示毒交曩俸囊，平行 袭示没有交互作用) 3 3 2 。2 响应颇分析 报猫b o x - - b e h n k e n i 戆孛心组合设计藏理，瓣3 3 色l 二承乎设计确定静主要影蟾因素律避一步豹分析， 设计了3 因素3 水平拱1 5 个实验点的响庞面分析实验，在中心值重复3 次实骏，用以估计试验误差。 表3 qb o x - b e h n k e n 实骏设计的蹰素水平 t a b l e 3 - 1l e v e l sf o rm a i nf a c t o r si nt h eb o x - b e h n k e nd e s i g n 因素编码值 x l理论取代度 22 53 k氢氧化镳与氯乙黢摩尔比 2 2 5 3 兰圣壁堡罄坌鳌!竖 ：苎! 塑 第三章、魔芋葡甘瓣聚糖羧甲熬化的改 生研究 表3 5 x - b e h r & e n 实验安捧，缀粟 t a b l e 3 5e x p e r i m e n t a ld e s i g na n dr e s u l t so fb o x - b e h n k e nd e s i g n s 表3 - 6 阐归分析结果 t a b l e 3 - 6r e s u l t so fr e g r e s s i o na n a l y s i s 由表3 _ 6 可见，三因素对羧甲基的过程的影响并非简单的一次线性关系。而是呈二次抛物丽关系。一 次项x n 交叉莱积项x ，x nx z 、x s x x s 对y 显著影响。嚣因素经嬲归拟台厨，得回归方程： y = o 7 6 1 9 3 3 + 0 0 5 2 0 1 3 xx j + o 。4 6 7 5 鹣+ o 0 0 7 2 6 3 x r 援0 3 8 6 9 2 x i x x ，一氇6 0 7 5 x l x 妊 - 0 0 0 7 8 5 x 。x ) ( 3 - 0 1 3 0 0 6 7 x ) 【2 k + o 0 0 2 2 2 5 x x 2 x s - o 0 1 9 3 9 2 x ) 【3 摸型可荣凌分辑豹绞诗检验缝果觅袭3 - 7 袭3 7 模型的可储度分析的统计检骏结果 t a b l e 3 7f i ts t a t i s t i c sf o ry mean(均德)0。661587 r - s q u a r e ( 复相关系数的平方) 9 9 4 6 a d 土r - s q u a r e ( 复耀关系数) 9 8 5 0 脯se ( 模型误差的平方搬) o 0 0 9 8 c 、r ( 变异系数)1 4 7 5 8 笈相关系数嚣平方为9 9 4 6 ，说朝蠢这三个潮素及萁二次项能躺释￥变纯豹9 9 4 6 ，模垄误差貔平方 根0 0 0 9 7 6 3 ，模型拟食程度很好。对羧甲基化的响应因子水平的优化见图3 - 8 、3 - 9 、3 - 1 0 。 江南大学硕士学位论文 图3 - 8x l 、的响应面立体图和等高图 f i g u r e 3 8s u r f a c ep l o t sa n dc o n t o u ro p t i m i z e ro fx i 、如 图3 _ 9x - 、) 【3 的响应面立体图和等高图 f i g u r e 3 - 9s u r f a c ep l o t sa n dc o n t o u ro p t i m i z e ro fx h 图3 1 0x 2 、】( 3 的响应面立体图和等高图 f i g u r e 3 1 0s u r f a c ep l o t sa n dc o n t o u ro p t i m i z e ro fx 2 ，) 【3 利用s a s 分析可知，回归模型存在稳定点( x l ，) ( 2 ，) 【3 ) 为( 0 6 5 6 6 ，0 0 1 0 1 ，0 0 5 0 5 ) ，y 的最大 值为0 7 7 9 5 。根据表3 5 n 素水平，考虑实际操作，理论取代度取2 8 ，氢氧化钠与氯乙酸摩尔比取2 5 ：1 ， 乙醇的体积分数取7 0 ，得到取代度为o 7 7 2 9 甲基葡甘露聚糖，证实了回归方程对羧甲基化过程的提供 了可靠的模型。 3 3 3c m k g m 的红外光谱表征 k g m 、c m k g m 的红外光谱图见图3 1 1 、图3 - 1 2 2 4 第三章，魔芋葡甘藉聚糖羧甲纂化的改性研究 釜 m _ ”b - 0 f 忙” 图3 _ l l 葡翎红矫光谱圈 f i g u r e 3 1 1i n f r a r e ds p e c t r ao fk g m 围3 1 2e 搬强红势光谱图 f i g u r e 3 1 2i n f r a r e ds p e c t r ao fc g 鞋 由图3 1 1 、3 - 1 2 可知：在3 3 6 0 3 4 5 0 c m 1 处为多糖h 的特征缔合峰，2 8 5 0 2 9 2 5 c m 1 是碳氛( 臼k ) 伸 缩掇动暖浚蟪，嚣1 7 2 7 c m 1 兔羧蒸闺； 枣绽振动皲寝，我袭了k g 鼙分擎链上特蔹性戆乙魏基霍，瓣羰基嚷 收蜂c 帐g m 图谱上的消失反映了羧甲基过程中发生了脱乙酰基反应。8 8 6c m - 1 藏右处表征的b - v 糖苷键构溅 的吸收峰和8 0 7c m - 1 的毗喃环吸收振动峰在所有红外光谱图上的反映，说明了羧甲基反虑前后k g m 的主链一 缀结构没有改变。勇一方面代表羧酸盐f e o o i ) 特征性的强吸收晦1 6 0 1 c m 和1 4 0 3 c m 鹣出现在c m k g m 的灏 谱上，说明了发生了羧甲基的取代反应。 3 4 本章小结 1 、遴遘s a s 软 孛中熬= 东平设计实验，褥翻羧甲基取葭菠瘦中静变簧影嚷戮豢：理论瑕我发，整氧耽钠 与氯乙酸的摩尔比、乙醇的体积分数。 2 、利用三因豢三水平的晌应露分据实验，确定了羧甲基反旋酌最佳羔艺。在理论取代魔为2 8 、氢氧化钠 岛氯乙酸的摩尔眈为2 5 1 、乙醇的体积分数为7 0 9 6 对，可戳制得取代庶为0 7 7 2 9 的c b 潞m 3 、c m k g m 的红外光谱阁表明：羧甲基化反应过程中，分子童链的一级结构没有发生改变；羧甲藻化反应的 邂薅发生了聪乙酸罄反应。 瓶南大学碗士论文 如0 引言 第四章羧甲基葡甘露聚糖静细胞毒悭的初步研究 羧甲基葡甘嚣聚糖( c 非g m ) 是氯乙酸与葡甘露聚糖醚化反应的产物。由于氯乙酸具有强腐蚀性，人 嬲普遍关心c 瓢锚是否会对樵体造成按害或 l 起毒性反癍。因此，对e 挞捌避孬安全鼓评价是l # 誊有必疆豹e 体内试验和体外试验怒目前评价材料生物安全性的主要手段。体内试验由于w 能遭到许多混杂因素 的影响和干扰，加上动物个体之间的差异难以定量考察材料对机体的影响，因而难以获得客观、准确的 窦验资瓣。馋努试验易于控铡实验条锌，其鸯糖准纯、定量帮霹重复毪等统轰8 “。i s 0 1 0 9 9 3 5 ：1 9 9 9 帮 g b t 1 6 8 8 6 5 - 2 0 0 3 标准中对材料的安全性评价制定了严格的标准，细胞毒性试验被列为首选的评价方法 帆“。目髓国内外已有多种谨价细胞毒性的方法，如琼脂覆盖法、分子滤过法、细臌增殖法、间位素标记法 等。1 9 8 3 年，m o s m a n t * 次掖邋了一种快速评定细胞增殖和细胞毒性的毙色分析法，静砌汀眈色法。它的基本 原理是滔细胞中处于细胞色素的线粒体脱氢酶能将淡黄色可溶性的砌广r 还原成紫色结晶状物质，经有机溶 裁二甲基驻碾( d m s o ) 静俸翅，续藏滚鳃显色，援色熬深浅霹爱获活细藏数量鳇多少。嚣魏，靼唑撬魄色 法( 啪广ra s s a y ) 能够十分灵敏地反映材料对细胞的毒性稷度，戳被广泛成用生物相容性评价，进行细胞毒 性试验。 嚣蘸溷内癸瓣予羧甲基住产臻静安全性详徐主要嶷审在j l 垂羧泽基壳聚耱豹安全往译徐，c h e n 等8 证实 羧甲基壳浆糖对正常皮肤成纤维细胞的增值有促进作用。有较好的生物相容性。陈浩凡认为羧甲篡壳聚 糖的细臌毒性与羧擎基取代基匪的位嚣有关，黔c 醒，n o - c m c - 2 和n ，o - c m c - 5 在一定的浓度范嗣具有不屑程 度的细胞毒往。o - - c i l c 各浓度组和备辩闻组的细胞相对增殖率( r g r ) ，介予8 7 9 溉之间，毒性评分均为1 级，均属凭毒性，与阴性对照组比较笼统计学差异( p o 0 5 ) ，而与阳性组比较差异显藩( p 0 0 1 ) 。表明o - c m c 笼纲斑毒挂，具有薤好静缨藏摇容谯+ 旁云”等对硫酸聚托豹麓警多耱缒镪貔毒黢霹究表明，硫酸黪纯静 魔芋多糖毒性为o l 级，与阴性对照组比较滗显著性差异；与阳性对照组比较有显著性差异，无细胞毒 性。在本实验中，我们参照羧甲基壳聚糖的评价方法，通过体终培养小鼠成纤维l 9 2 9 ，应用不同d s 、不 瓣翘量的e 强丽，梭测1 9 2 9 静m 簸，裙步磷究了c i l k g l 4 的细胞毒性。 4 1 实验材料与设备 4 1 1 实验材料 r p m l l 6 4 0g 1 8 e 注公霉 小牛肌清 中国科学院上海实生细胞生物技术有限公司 胰蛋白酶 g i b c o 公司进口分装 青霉素( 8 0 万u ) 华j e 制药殷份有限公司 链霉索( 1 0 0 万u ) 华北制药股份脊限公司 c m k g l实验寒鑫翩 f l i t s i g m a 进口分装 二甲基亚碱( d k s o ) 重庆求方试剂厂( 分析纯) 透拆袋( 羲嚣摩象震鬟3 5 0 0 0 a ) 上海绿鸟释技发震畜聚凳司 i 1 2 主隳仪器殿设备 9 6 孔细胞培养板 电热恒温水浴锅 骧密龌诗 精密电子天平 超低温冰箱( - 8 0 ) 低速离心撬 涮e 公司 北京长安科学仪器厂 p i i s - 3 b s a r t o r i u s ，德国 f o r m as c i e n t i f i c ，德豳 上海葶术器藏厂 2 6 第四章、羧甲基葡甘辩聚糖的细胞毒性的初步研究 超净工臻台 o 嘎培养箱 荧光显微镜 全自动酶标读数役 s z - 9 7 自幼双重纯水蒸馏器 耪密电予天平 紫外分光光度计 l s - b 5 0 l 盘式压力蒸汽灭菌器 芬媸安泰空气技零鸯隈公司 t c 2 3 2 3 型，美国 e - - c l i p s ee 6 0 ，荚国 b i o - r a d 3 5 5 0 壅，瓣本 上海亚荣缴化仪器厂 s a r t o r i u s ，德国 岛津i n - 2 6 5 ，日本 上海医用拨子仪器_ r 4 1 3 实验细胞 小鼠成纤维细胞系l 9 2 9 ，上海生命科学院细胞所 4 2 实验方法 4 2 1 试剂鲍憩期 4 2 1 1 细胞培养液的配制 r p 鼙1 1 6 4 0 培养萋；耨一袭绪券基耪寒甥入琵文烧杯牵，翱入l | ，藏蒸拳，并嚣醣翔入n a h c o t 3 。? g b 青襟索8 0 u m l ，链霉索1 0 0 u j l ，用玻璃棒搅拌使之充分溶解。配殿完毕，用大滤器过滤除菌分装，放鬣 - 2 0 y ：冰箱保存。用前在1 h 删1 1 6 4 0 中加入l 鹦的小牛血清，用滴管轻轻吹打，使小牛斑涛混合均匀。 毒2 1 2 瓴o l 麓p b s 精确称取n a c l9 0 9 ，n a d 4 p 0 4 1 2 h 2 04 o g ，n a h 2 l v o , 2 h 力0 4 9 ，加双蒸水至1 0 0 0 m l ，高温灭菌备用 4 。2 1 3 胰蚤自酶酶琵髓 称取0 2 5 m s 胰蛋自酶，加入到1 0 0 m l 的p b s 液中，充分搅拌混匀，使其完全溶解，过滤除菌，分装 备耀。 4 2 ，1 4 样品溶液的配涮 毅去踩寨纯耪懿c 糕g m 2 9 ，溶于l 越不含小牛盘涛瓣r p 鬟1 1 6 4 0 培养滚孛，配或然瓣溶滚，势装， 封口，1 2 1 ，1 5 m i n ，蒸汽灭菌后备用。 4 。2 。2 零鬣裁纾维绷貔系礴2 9 豹簧鼗壤莠 在长满小鼠成纤维细胞l 9 2 9 的培养瓶中，加入i 2 m l 0 2 5 胰缀白酶，轻轻晃动培养瓶。使消化液流 速爨有蛔貔裘蘑。置予翦培粪耱，l 3 分铮鑫甓培葬糕放置在搦鬟显微镜下褒察，发现纲骢逐澎变黢， 细胞问隙增大时，用禽有血清的培养液终止消化并用吸管轻轻吹打成细胞悬液，用血球计数板计数，调羰 细胞密度为2 1 0 个札魄”。 4 2 3m t t 玩色法测定c m k g m 的细胞毒谯 l 9 2 9 缨腿复苏抟代居，缨腿计数，羯r p n l l 6 4 0 培葬渡调整细胞浓度2 xl o 曩 w l 、以1 0 0pl 孔鬟 于9 6 孔培养板中，每个试样复斡4 孔，在5 c 0 2 , 3 7 2 2 标楼环境下，瑙含1 0 小牛盘清翁1 6 4 0 培养液孵育， 2 4 小时后进行实验。实验细胞分为4 组，阴性对照组用新鲜1 6 4 0 培养液交换，阳性对照组用禽6 4 m l l 苯酚戆缕莠渡交换，其余3 组分剿翔a 致戴度力0 1 8 ( 璐，) 、0 4 1 ( d s d 、o 、6 4 ( 游s ) 豹c 撼g m , 髑r t 磋1 1 6 4 0 培养液调整不同取代度的c m k 酬的浓度梯度分别为：2m g m l ，i m g m l ，0 5m g m l 置细胞恒温培养箱中继 续培养。2 4 h 后，取出培养板，每孔加入2 0 ul 的m t t 液，4 小时聪，倒出原渡，用p s s 清洗两遍后加入 璃s 9 ( i p l 琵) ，室滋1 5 2 0 分锋，振荡结养袄均匀染色，用酶联硷溅便在4 9 0 m 波长检测光吸收值羽蛰， 取4 孔平均，按式4 1 计算细胞相对增髓百分率i i g r ( r e l a t i v egr o w t hr a t e ) 。 r g r = ( 试撵缌擅熙性对照缀o d 值) x 1 0 0 4 1 ) 江南大学硕士论文 根据每种材料组的细胞增殖百分率，按表4 1 转化为o - 5 级毒性评价。 表4 - 1 美国药典中细胞相对增值率与细胞毒性分级的关系 t a b l e4 1t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc e l lr e l a t i v ep r o l i f e r a t i o nr a t ea n dc y t o t o x i c i t yg r a d eo fu s p s c o r e ( g r a d e ) r e l a t i v eg r o w t hr a t e ( ) 1 0 0 7 5 9 9 5 0 一7 4 2 5 4 9 1 2 4 0 所有数据均采用s p s s 统计软件包进行描述统计，所有数据用均数标准差表示；并进行单因素及两 因素的方差分析。 4 3m t t 实验结果 表4 2 给出了在不同取代度、不同浓度的c 皿叫条件下，l 9 2 9 培养2 4 小时后的m t t 实验0 d 值。 表4 2 不同d s 的c m k g m 毒性测试结果 t a b l e 4 - 2e v a l u a t i o no nt h ee y t o t o x i e i t yo fa g mw i t hd i f f e r e n td s p o 0 5 与阴性对照，p o 0 5 与阳性对照，p o 0 1 与阳性对照 由表4 2 可知：阴性对照组细胞增殖率( r g r ) 最高，阳性对照组的r g r 最低，利用s p s s 软件分析， 阴性对照组的o d 值与阳性对照组的o d 值有统计学差异( p 彀芪度。 3 、两因素方差分析结果表明c m k g m 的浓度对1 9 2 9 细胞活性作用显著，取代度对细胞活性的影响不显著。 江南大学确士论文 5 0 弓i 畜 第五耄羧甲基蔫嚣露聚糖的废用悭髭的研究 透明质酸分子在溶液中高度伸展与随机卷曲构型使其占有很大区域，分子链之间互相缠绕形成连续的 嚼状结构，水分子通过极性键和氢键与其直接作用。陈浩凡认为透明质酸有良好的保湿性能是由予糖链 主有许多棠承缝豹嫠团缳、- c o o h ；有学者认为逶孵凌酸静像湿桎能勰其瘴尔菔量密留籀关，鼙尔震 照越大，其保湿效果越好“” 国内夕 研究表噢，羧甲基壳聚耱的吸湿缝、保湿馊与其摩零矮量、羧甲基取代的位置、羧甲基的取代 度有关。陈浩凡研究发现羧甲基壳聚糖的吸滋性能远近丈于未改性的壳聚糖，羧甲基取代位置和取代度对 c i c 吸湿性能有一定的影响；羧甲基取代位置不同，产物的保湿性能不同，羧甲基壳聚糖的保湿性能随着 取代度的增热逐澈增强。薮凌云磷究发瑷羧甲基麦募糖瓣吸瀑性爱夔薄零震量静增大覆增强，保澎性藐 随取代度的增加而增强 可见，多糖的瘴尔质堂和取代基团的取代度会影响多糖吸瀑、保湿性能，因此，本帮研究了c m k g w 豹瘴尔震爱、取霞度对吸溅、裸涅瞧缆的影璃，并探究羧甲基葡曾露聚蕤在纯毅晶中应用酌可行往删 5 1 实骏材料与设备 5 1 1 实验材料 c i l k 6 1 实验室自剑 透掰质酸镳( 孙用缓，痒尔痪蛩为5 x1 0 5 )出券福瑞达釜物记工脊限公司 丙三酵 国药集团化学试剂有限公司 藏酸铵 国药鼹霾纯学试裁有袋公雹 碳酸钠国药集团化学试剂有限公司 硅胶国药集团化学试剂有瞻公司 柠檬貔国药集罄纯学试裁有戳公司 氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司 十二烷基硫酸钠上海嘉辰化王有限公司 十六靛基三甲蒺氯化镀上海嘉辰化工有限公蠲 椰油脂肪酰二己醇胺上海舆科化学品有限公司 十二烧墓二甲蒺嚣菜碱上海经纬纯工骞骧公霸 以上试剂均为化学纯 曼1 2 圭疆仪器及设冬 z k - 8 2 j 电热恒温真空干燥箱上海实验仪器总厂 搀特勃p b 3 0 3 - n 电子天平梅特赣一托多利上海) 仪器有袋公霹 隔水式电热恒温培养箱p y x d h s 一4 0 5 0 - b s上海医疗器械厂 n d j l 型旋转粘度计上海晶吉地质仪器有限公司 d e l t a3 2 0 蹒计 臻士梅特羲纹器公司 5 2 实验方法 参照2 3 4 3 方法制备不同摩尔质量的k g m ，摩尔质量分踟为l o x l 0 5 左右( 1 ) ，8 x 1 0 5 左右( 弧) ， 5 1 0 5 左右( ) # 以3 种不同摩尔质量的葡惯露聚糖为原料，参照3 2 2 方法制备不同取代度的o t k g m ， 鼗鼗度分期戈0 。2 4 左右( 瓣1 ) ，筑艟左右( d s t ) 、0 。6 2 左右( d s s ) ， 5 2 1 吸湿性实验 将c m k g m 群熬在真空簸耱孛干璨嚣燕重备餍，在群干臻器中分霜露硫酸铵及碳酸铜饱和承溶液制成相 3 0 兰蔓堂：鍪旦董塑笪墨鍪燕塑壁旦堡塞 黠瀑度( r 1 ，) 秀8 l 器秘4 鼹静环境，莠掇予爨器纛予2 0 c 蠖渥麓中翅于吸瀑瞧魏溅试。壤确称取0 。5 9 试 样予3 c m 直径的表面胍中，置于干燥器中吸湿。每隔一定时间称黛一次，由公式5 - 1 计算吸澎率： 碾淀搴( 蒜) = 塑魁篙莪蔫产 5 2 2 保湿性实验 x 1 0 0( & 1 ) 在两干燥器中分掰用饱和碳酸钠制成酶r 。k 为4 3 嘘度环境和磋胶介质制成的环境，并将：f 燥器置予 2 0 c 恒温箱中用于保溅性的测试。将含水1 0 9 6 的试样置于3 c m 直径的表面皿中，置予千燥器中，经过一 定瓣翔后鞲确称取试梯静矮量，出公式一2 算缳滋事： 保湿率( ) = 篆茎霈勰x ， ( 5 2 ) 5 2 3p h 傲的稳定性测定 鬈型2 9 6 瓣e 瓣饿豹承溶渡强掺，分别耀0 。l m o l l 的拧攮酸和o 1 m o l l 瓣n 胡珏 骞渡调节硝篷，参照 3 2 4 测定其袭观粘廉，整个襄验在2 5 下进行” 5 2 。4c m k g m 与表嚣活性剂的鬈伍饿试验法 配制5 的c m k g m 水溶液与阴离予、阳离子、非离子及两性表面活性荆进行复配，在室温下用简单机 械搅拌混芒已不调节删绪况下进行观察”1 。 5 2 5c m k g m 的皮肤刺激性试验法 c 黼m 皮获潮激性怒其毙否寂薅于纯羧品的翦掇条饽，为她，我搬参爨翌生帮诬壤熬望生援藩( 2 0 0 7 ) 对其作皮肤刺激性实验。将c m k g m 研磨成糟末状，配制成1 0 9 6 的水溶液，以保渊g m 与皮肤充分接触嘲。 实验动物选择白色容兔( 2 k g 左右) ，试验前约2 4 h ，将熊子背部脊柱两侧绝剪掉，不可损伤表皮，去 毛藏豳左、毒备绣3 c m x 3 c m 。 5 2 5 1 急性皮肤刺激性试验 1 、联溶液约0 5 m l 蹇接涂簌瘦获上，然磊用：层纱毒( 2 。5 c r u x 2 。5 c m ) 耧一层玻壤纸覆羲，荐趸秃 刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用4 h 后清洗去除c m k g t l 。 2 、在清除c 默g m 后的1 、2 4 ，4 8 _ 靼7 2 h 藏察涂抹部位皮肤反应，按袭5 - 1 进行评分，以受试动物积分的平 均值进行综合评价，撮据1 、2 4 、4 8 和7 2h 蠢观察对点最高积分均僮，按袭5 - 2 判定皮肤刺激强度。 5 2 5 2 多次皮肤刺激性试验 敬e 巍涮溶液约氇s m l 涂抹磁一侧皮获上，另一铡涂承律为对照，每天涂拣1 次，连续涂抹1 4 d 。获第 二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水清除残留受试物。- - 4 时后观察结果，接表5 - 1 进行评分。 按公式5 3 来计算每天每只动物平均积分，以袭5 2 判定皮默蒯激强度。 每天每只动物平均积分2 驾瓣石 慨3 ) 袭5 - l 覆默裁激爱瘴谔势 t a b l e 5 1t h er a n k e ds c a l eo fr e s p o n s et os k i ni r r i r a t i o n 红斑和焦癫形成 评分水肿形成评分 凭红斑0无水肿0 轻微红斑( 勉强可见)l 轻微水肿( 勉强可见) l 孵显红褒 2 轻痊承辨( 疫歉隆起轮臻瀵楚) 2 中度- 重度红斑 3 中度水肿( 皮肤隆起l m m ) 3 严重红斑( 紫红色) 至轻微焦癞的形成4重度水肿( 皮肤隆起超过l m m 范蹦扩大) 4 3 l 江南大学硕士论文 表5 - 2 皮肤刺激强度分级 t a b l e 5 2t h es t a n d a r do fs k i ni r r i t a t i o ni n t e n s i t y 积分均德 强度 争一 0 5 0 5 - 取代发，表明摩尔质量对吸湿率魄影响较羧甲 纂豹取代皮显著，可能最好靛吸湿率的因素水平为c m k g m i i i - 3 。 5 3 2 保湿性实验 不同的o i k 6 m 试样及与对照物透明成酸、甘油在4 3 的湿度环境下，保湿曲线如潮5 - 5 所示。 圈5 - 5 羧甲基葡曹露聚糖及对照物的像湿曲线( 4 3 9 6 ) f i g u r e5 5m o i s t u r e r e t e n t i o nc a p a c i t yo fc 溉g m 。h aa n dg l y c e r o la t 髓4 3 ，2 0 由爨5 5 可知：在4 3 篝戆滠度嚣壤中，莒演瓣保瘩囊夔霹闯懿增热藤减少：纛融秘c 疆g m 鹣保拳塞夔畦 问的增加水分不仅没有失去，水分残存率反而增加，在3 6 4 8 h 艏达到平衡。c 砥g m 试样保温方式与商分子 保湿剂1 1 a 相同，保湿效果优予甘油。 整5 峭绘出了僳逶到达平衡雾雩( 4 8 h ) ，苓鞫摩尔袋囊、不阉敬代度懿e 掘涮对僳遵率静影臻趋势。 第五举、羧甲蒸葡甘露聚糖的应用研究 2 2 0 2 1 0 2 0 0 喜；9 s o o 蛹1 7 0 雀1 6 0 1 5 0 1 4 0 1 3 0 l23 取代度的水平 一l 睡_ l 一k g * 一2 一k g 舻3 图5 喵e 孤罐箍傈涅搴嗣摩尔爱囊、取健发懿关系鍪线( 4 瓣，4 8 h ) f i g u r e5 - 6t h er e l a t i o n s h i po fm o i s t u r e - r e t e n t i o nc a p a c i t yo fc 觚叫，m o l e c u l a rw e i g h ta n dd s a tl l l l4 3 ，2 0 i n4 8h o u r s 由闺5 - 6 w 躺，随潜摩尔质麓的增搬，傈温率也增加。这是因为搿摩尔质燧有翻予湖络结构的形成。 能够阻止所吸收的水分释放；随着取代魔的增加，保湿率也增加，遮是因为羧甲基的暇亲水性，能与水分 子形残氢键，结会能力强，水分子不瑟蒜去。取我度豹增麴，亲承彀戆基囝数嚣麓增热，结台戆承分子黪 数目就增加，保湿率就提高。为了分析o i z g m 试样摩尔质量、取代度崔4 3 的漱度环境对保湿率的影响程度 大小，我们对其展开旋变分析，结果如袭5 - 5 。 袭5 - s 歪交实验辍差务辑 t a b i e 5 3r a n g ea n a l y s i so fo r t h o g o n a ld e s i g n 通过极差分析可知，嚣因素豹影螭摊痔为：取饯度 瘁尔质量，表明羧甲基的取代度对缳滠率鳇影响 较摩尔质量显著，可镌精好的僳湿率的因素水平为o i k g m - l 3 不同的c m k g m 试样及岛对照物遴明质酸、甘油在髓胶环境下。保湿曲线如图5 7 所示 图5 7 羧甲基葡甘露聚耱及对照物的保湿擞i 线( 硅胶) f i g u r e5 - 7m o i s t u r e - r e t e n t i o nc a p a c i t yo fe 辍g ，融a n dg l y c e r o lo v e rs i l i c a - g e l 。2 0 3 5 战南大学硕士论文 由图5 7 可知：在硅胶千燥器中，所以的样品在1 2 h t 赶失水都比较快，随后慢慢达到平德。苗油的失水 速率最快，在1 2 h 辩，其永分残存率仪在1 0 9 6 左右。而h a 和c 殛g m 的失永速率均小于暂油，最终的水分残存 率也大予甘油，说明在硅胶环境中， i a 和c 觚g m 的保湿性能优于甘油。 霪8 绘出7 保漫至选平舞畦( 4 8 h ) ，不褥摩尔震赣、不露驭鼗度黪潮晖￥对保浸率戆影睫趋势。 4 罅5 g3 5 篓篓 嚣 23 取黻嚣痰平 一k g 替* 1 一k g m 一2 p 竭g 一3 鼹5 8 删k 6 雎的保涩率同摩尔质量，取代度的关系睡线( 硅胶，4 8 h ) f i g u r e5 谓t h er e l a t i o n s h i po fm o i s t u r e - r e t e n t i o nc a p a c i t yo fc m k c 滏。m o l e c u l a rw e i g h ta n dd s o v e rs i l i c a - g e l 。2 0 i n4 8h o u r s 由围争8 可躲，在硅股环境中，隧着摩尔矮量斡增魉，承分残存率也耀搬。这是因为囊摩尔蕨鬣霉穗 于网络结构的形成，能够阻止所吸收的水分释放；随着墩代度的增加，僳湿率也增加，这越因为羧甲基的 强亲水性，能与水分子形成氯键，结合能力强，失水速率就减缓，水分残存率就增加。为了分析c 1 4 k g m 试 群痒皋缓繁，取我爱在硅茨强境对绦滠率静影蟾程度太夸，我学】对箕震嚣正交分橱，鳍栗魏表s 喝 表5 - 6 正交实验极差分析 t a b l e 5 - 4r a n g ea n a l y s i so fo r t h o g o n a ld e s i g n 通过极差分析可知，两阂素的影螭排守为；取代痍 痒尔餍最，表弱在硅驳环辘孛，羧甲基静取代度 对保湿率的影响较摩尔质量显著，可能最好的保湿率的因素水平为c m k g m - i - 3 。 本文选择吸溅搴与l l 是蝴当，傈滠率远大予珏盎的试撵c 溅g m - l 一3 ，逑一步磋究其痰瘸瞧能。 5 3 30 4 k g m 的p h 值稳定性 c 蜮g m - l - 3 的媸毽的稳定性如图鼬爨示。 3 5 勰 2 5 2 0 l s 1 8 5 o 44 。5578& 591 0 1 11 2 p h 值 鹫5 - 9p h 餐对c m k g m 承溶滚表瓣穗度静影瘸 f i g u r e5 - 9i n f l u e n c eo fp ho nno f 伽( g ms o l u t i o n 实验发现，蛾佳 4 时，翻k g m 的溶液均成透明状；p h 值 1 0 曩重，溶渡瓣蕤度秘骞降低，可糍是由于钠裹予黪妇入抑髑了分擎链在水孛 的舒展而导致其粘度降低“。p h 值 4 5 时，溶液的粘度迅速降低，这是因为商分子溶液的粘度岛分子闻的 相互作用力有关，c 揪g m 分子中麓甲基带负电荷，相互排斥，p h 值的降低，减少了这种相互作用力；同时， 删大分予是由耱营键连接熬来瓣，覆糖萤键对酸不稳定，在器酸性条舞下，逐溪发生瘩瓣，使大势予 链发生断裂，导致粘度下降“。 纯披品的娜擅的范固一般在4 5 8 5 ，所以在化妆品豹配方中，相应的翊范潮内c e c g m 是稳定。 5 3 4c m k g m 与表丽活性剂的配伍髋 蚴每非离子燮、夔褒予挺、靼离半型、褒性表露溪挂裁配缀揍嚣