（动物学专业论文）中华绒螯蟹体内几种同工酶及在不同发育阶段的研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文 论文题目：中华绒螯蟹体内几种同工酶及在不同发育阶段的研究 学科专业：动物学 学位申请人杨洁 摘要 中华绒螯蟹( 西勋c 加驴s f 玎e 淞话) 俗称河蟹j 属甲壳纲、方蟹科、绒螯蟹属， 其味道鲜美、营养丰富，是我国重要的水产养殖品种之。为深入了解中华绒螯 蟹不同发育阶段的代谢及其食性特点j 本文分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、 酶活力的生化测定以及透射电镜技术，对幼蟹、未成熟蟹、成熟蟹三个阶段的肝 脏( l ) 、肌肉( m ) 、心脏( h ) 和鳃( g ) 等四种组织的酸性磷酸酶( a c p ) 、酯酶 ( e s t ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 、过氧化物酶( p o d ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 和碱性磷酸酶( a k p ) 、多酚氧化酶( p p o ) 等7 种同工酶进行比较分析，初步 探讨了中华绒螯蟹体内这几种与糖、脂等代谢相关的同工酶的理化性质和细胞酶 化学：靴及其在不同发育阶段的变化规律i 旨在为中华绒螯蟹发育生物学的研究 提前卜定的生化指标，为中华绒螯蟹养殖生产、疾病防治、生态环境的保护提 f 供参影 结果表明，a c p 最适p h 为4 5 ，最适温度为5 0 ，妯 的最适p h 9 5 ， 最适温度4 0 s o p 的最适p h 值为8 ，o ，最适反应温度为4 0 ，p o d 反应的 最适p h 值为6 5 ，最适反应温度为4 5 ，p p 0 最适p h 为6 o ，最适反应温度 为5 。在中华绒螯蟹不同发育阶段中，除l d h 同工酶在肝脏中没有表达外， 其涵同工酶( a c p 、a k p 、e s t 、p o d ) 在四种组织中均有不同程度的表达，但 酶谱和酶活性大小不同，存在明显的组织差异性，这种组织的特异性表达与各组 织的不同生理功能是密切相关的。另外，同工酶在同一组织的不同发育阶段也表 现出显著的差异。例如：在不同发育阶段，除肌肉和心脏中的a c p 酶谱基本不 变外，其余兰脚组织的a c p 酶谱均有变化，其中以肝脏中的变化最明显，a c p 一3 酶带只在末成熟蟹肝脏中观察到，而a c p 1 酶带只出现在幼蟹和成熟蟹中，且 三个发育阶段均有的a c p 4 成熟蟹肝脏中的a c p 酶活性 活性最强。鳃中的a c p 一2 、5 未 酶 降 低，即鳃中的a c p 酶活性也是在幼蟹期最强。细胞化学定位结果表明：a c p 和 a p 酶在四种组织中都有定位，主要定位在细胞核、线粒体周围以及肌质网( 内 质网) 上，肝脏中定位更广泛，在脂滴以及微绒毛周围也有阳性反应颗粒。在肝 上海师范大学硕士学位论文 脏中，s o d 阳性反应沉淀物主要定位在脂滴周围，在鳃、心脏和肌肉中，蒸翌：， 有大量s o d 铈沉淀定位在线粒体周围。除肌肉中未发现有p o d 阳性反应颗粒外， 其余三个组织的细胞质中都发现有p o d 阳性反应颗粒，在肝脏组织的脂滴周围 有弱 应颗 和微 发育阶段的中华绒螯蟹体内代谢发生了特殊的变化，导致其同工酶带的增加或减 弱，说明其体内脂类、碳水化合物代谢机制随发育有所改变，反映出随个体发育， 机体对营养物的需求也有所不同；而不同发育阶段各组织中不同同工酶的变化是 有差异的，这种差异与各组织和酶的生理功能直接有关。中华绒螯蟹发育过程中 这几种同工酶的复杂变化既反映了其不同组织器官细胞组成变化，又反映了不同 组织中不同同工酶的活性和出现顺序变化，可作为一种发育阶段特异性的生化指 标。 关键词：中华绒螯蟹不同发育阶段；同工酶；理化性质；聚零烯酰胺凝胶电迹： 组织特异性；酶细胞化学定位 a b s t r a c t d f d 如折s 加p 珊话i sm em o s tc o n n e r c i a ls 】弦c i e si nc 蛐m i tn 咖r a l l yi n h a ：b b m en o m le a s t e mc 1 1 i i l aa i l dk o r e 如a 1 1 d h a sb e c n i n 仃0 d u c e dt om es o 础e mp r o v m c e s o fc l 血1 a ，n o n l la m e r i c aa i l dw e s t e me u r 6 p c - m 也ec u l t u r eo fc m s t a c e a n ，g r o w c t l 蛐g l a a ld e v e l o p m e n to f b r a c 咖a i lc r a b sh 舶e e ns t u d i e da sa 觚t i o n o fd i e t ， t e m p e r a m r e ，s a l i n i t ) ，a 1 1 d o 也e r p a r 锄e t e r s s o m ei s o 妒n e s 啦w m ga c l d p h 6 s p h 躺e ( a c p ) ，出a l 妇p 1 1 0 s p h a t a s e ( a k p ) ，e s t e 敝( e s d ，p o l h h e n o lo x i d a s e ( p p o ) ；p e r 0 x i 抵s 唧x i d ed i s m u l 【a s e ( s o d ) 趾dl a c 婶d 哪唧g e n 警e ( l d h ) l 丹o mf o u rd i l 3 6 亭r e n tt i s s _ n e ( 1 i v e r ，m 璐c l e ，h e a r ta i l d ：够1 1 ) q i fz f d c 矗9 谚s 即p 珊括m d i 虢r e n t d e v e l o p m 函p l 粥e s w e r e ，踟1 a l y z e 0 谢m p o l y a c r y l 锄i d e 。g e l e l e m o p h o r e s i s ，m e n s u l a t i o no nm ee 购，i n e s 枷v i t ya l l d 。e n z y m ec y t o c h 咖c a l i t e d 血q 岳o fe l e c t r o i l i ci i l i c r o s c o p e t h er e s u l t ss h o w e d t l l a tp h6 p 缸眦o fa c p 、 知四、s o d 、p o d 、p p o i s4 5 ，9 5 ，8 o 一6 5 ，6 o ，r e s p e c t i v e l y ，a n d 也et e n 掣咖e 0 p t i m u i ni s5 0 ，4 0 ，4 0 ，4 5 ，4 5 ，r e s p e c t 时e l y t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a t 也e ? i o z y m e sd i s t j 曲试e d 、7 l ：，i d e l y 血西l l i l e l d h i s o z v l n ew a sd e t e c t e dn oe x p r e s s i o ni nl i v e ra 1 1 da p p a r e n tt i s s u es p e c i f i c i t yw a s f o u n d b e 眦e n 廿1 ee i l z 舯eb 觚dn 啪b e ra n de n z y m ea c t i v 埘o f t h eo m e ri s o 驷e s a n d 恤 d i 虢r e n c e si i li s o z y m ep a t t e m sd e t e c t e d _ i l lf o u rt i s s u e sd u 睁n g t l l e d e v 9 1 9 p m ? 。1 协l p r o c e s s 赫r e l a t e qw 瓶t h e 砸6 n0 ft l l et i s s u e s ：t h ec o m p l e x i 够o “s o z 珊e c h a n g e si ne r i o c ：1 1 e i r i n e n s i sd e v e l o p m e n t a ls t a g e si sb o 也ar e n e c t i o no fc b 趾g e sm c e l l l i l a rc o 南p o s i t i o no fs p e c i 丘ct i s s u 西a i i dc h a l l g e s i 1 1m e 豫t ea n ds e q u e n c eo i o c c 嘶e n c eo ft h ei s o z 舯e si nd i 腧r e n tt i s s u e s f o r 譬x 锄p l e ，d 面n gm e m r e es 哆e & m ea c pi s o z 肿ep 砒e m sa r es i m i l a ri n m u s c l ea n dh e 狐埘n gd e v e l o p m e n t h o w e v e r ，i nl i v e r 觚dg i ut 1 1 e a c pi s o z y m ep a t t e m sa r es i 咖f i c 狃td i f f c r e n c e s ， e s p e c i a l l yi nl i v e f i n1 i v e r ，a c p 一3i so n l yp r e s e n ti nt h ei m m 籼i t ) ，c r a b w t l i c h1 s l a c k i n gi na c p 1 ，m e a n t i m ea c p - 4 i so b s e r v e di na l lt h r e es 协g e s ，b u tt h el s o z y m e a c t i v i t vb e c o m e sw e a l ( e to b v i o u s l yi n 也ei 删【i l 抓艘a l l d m a h 】r ec r a b ，e s p e c l a l l ym t h e i m m a t u r e s o ，i ny o u n gc r a ba c pi s o z y m ea c t i v i 妙i st h es 仃o n g e s ti nl i v e r i n 舀l l ，t 1 1 e b a l l d sa c p 2 、5a r ep r e s e n ti na l l t l l r e es t a g e s ，w i t ha c p 2i s o z ) 幡ea c t i v l t ) rr e d u c e s 掣a d u a l l y m a t ，sm o r e t h ea c pa n da k p a c t i v i t i e sw e r em a i n l yd e p o s i t e di ni m c e l l a rc e l l ， e n d o d l a s m i cr e t i c u l u ma n dm i t o c h o n d r i u m ，t h e yw e r es h o w e di nm i c r o v i l l i ，a r o u n d l i p i dd m p l e t ，m i t o c h o n d r i u ma n dc e l l u l a re n d o m e m b r a n e e s p e c i a l l yi n1 i v e r t h es o d 气 上海师范大学硕士学位论文 a c t i v i t ) ，w a ss i t e di nm i t o c h o n “啪，c y t o p l a s mi nc e n s 锄da r o u n dl i p i dd r o p l e t a n d l ep o da 1 1 dp p oa c t i v i t i e sw e r es i t e di ns p e c i f i co r g a n e l l er e s p e c t i v e l y ：p e r o x i s o m e a n dp r o p h e n o l o x i d a s e ，b u tt h ep o d 母a n u l ed i dn o td e t e c ti i l 也em u s c l e n e d i f f e r e n c e so fm ee n z y m eb a l l d sa i l da c t i v i t i e si nd i f j | b r e n td e v e l o p m e n t a lp h a s e s s h o w e dt h ec h a l l g e so ft l l em e t a b o l i cm e c h a l l i s mf o rt 1 1 ec a l c i u m ，l i p i da i l d c a r b o h y d r a t e sd u r i n gt h ed e v e l o p m e n tp r o c e s s o fe r i o c h e i rs i n e n s i s a n dt 1 1 e d i 能r e n c e si ni s o z 皿9p a t t e m sd e t e c t e “nf o u rt i s s u e sd 嘶n gt 1 1 ed e v e l o p m 洲 p r o c e s sa r er e la _ t e d 谢t 1 1 也e 如n c t i o no ft h et i s s u e s t h ec o 如【p ! e x i t ) ro f ，i s o 巧m e s c h a n g e si i ld f d c 加护s 胁p 雕括d e v e l 叩m e n t a l 渤g e si sb o t ha 诧n e 鲥o no fc h 鲫g e s 洫 c e l 舢a rc o m p o s i t i o no fs p e c i f i ct i s s u e s 锄dc h a l l g e s 啦也e ，a t ea n d + s e 郇啦0 f o c c 硼汜n c eo f 廿1 ei s o z y m e si nd i 腩r e n t 廿s s u e s ，s ot l l ec h a n g e so fi s o 巧m ep 籼c a i l b e 蕊i n d i c a t o rf o rd i 虢r e n t i a t i o no ft i s s u e s 谢mt 1 1 eg r o 训ho f m o c h e i rs i n e n s i s k e yw o r d s ：j d 砌p 护s f 胛p 瑚括；d e v e l o p m e n t ；a c p ；e s t ；l d h 6 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均己在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：锕日期 砂弘。叟弓， 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名僦新躲叩亟嗽 7dv 皇、弓j 上海师范大学硕士学位论文 第一章综述 1 1中华绒螯蟹的水产养殖 中华绒螯蟹( 西f d 如p 护j 加p 瑚括) 俗称河蟹、毛蟹，属甲壳纲、方蟹科、绒螯 蟹属，其味道鲜美、营养丰富，是我国重要的水产养殖品种之_ 。河蟹的生长 向其他甲壳动物一样，也不是持续的，而是间歇性的。因为体外坚硬的甲壳不能 随着身体的生长而扩大，所以相隔。段时间后，必需蜕皮，身体方可生长。生长 与蜕皮这样交换进行，生长也就有间歇性j 1 1 1 中华绒螯蟹的习性 蟹种是成蟹养殖的基础，要提高养蟹的规格、质量和产量，必须先保证有优 质的蟹种。 幼蟹喜欢光线暗些，白天呆在水体阴暗或有隐蔽的地方，很少活动，傍晚才 开始活动、觅食。幼蟹期的活动方式也发生改变，由直线速游转为水底匍匐爬行， 在水层2 0 c m 处活动。 大眼幼体蜕壳为i 期幼蟹后，幼蟹会经常把身体浅埋在泥土中而不打洞，直 到i 期幼蟹时才开始打洞，育蟹种水池水位不稳定、高低不平时更容易打洞，在 洞中穴居的幼蟹会被动摄食，形成“懒蟹 。 早期幼蟹有较强的趋流习性，其趋流性有正负之分，当水流流速小于一定数 7 值时，表现为正向趋流；反之，流速超过一定数值时，幼蟹就逆流而上。 在幼蟹的i 期有很强的逃逸能力，尤其是培育池水质恶化后，此时幼蟹 的逃逸能力就更加显著，另外，培育池池壁潮湿时，也会显现出较强的逃逸性， 再加上河蟹趋流的习性，就容易出现幼蟹成群结队大批逃跑的现象n 1 。 1 1 2 中华绒螯蟹发育周期及营养需求 河蟹受精卵必需在海水中才能孵化，在各种不同盐度( 9 3 3 ) 的海水中均 可孵出潘状幼体，涵状幼体不能离开海水，一旦进入淡水就会死亡。在我国长江 等河口每年的4 月一7 月间，都可以见到河蟹的潘状幼体，尤其在5 、6 月最为常 见。它们借助颚足的划拨而游动，属于杂食性，但以动物性饵料为主。身体分头 胸部与腹部两部分，头胸部近乎球形，有一块头胸甲，体长在1 6 5 2 毫米之间 n 1 。陈立侨和周忠刚2 3 研究发现，河蟹蟹种饲料中豆饼含量超过4 3 时，会引起 上海师范大学硕士学位论文 蛋氨酸的缺乏，而当豆饼含量低于2 9 ，鱼粉超过4 0 时，会引起精氨酸和组 氨酸缺乏。在蛋白质含量降低3 一4 时，添加氨基酸可以获得较高的成活率。 中华绒螯蟹对蛋白质的需求实质上就是对氨基酸的需求，只有当河蟹从饲料中吸 收的蛋白质被消化分解成短肽和氨基酸等小分子化合物，才能被蟹体组织吸收并 转化为机体的组成部分。一般认为d 1 ，蟹类的必需氨基酸共有1 0 种，这与鱼虾 类相同，分别是：组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨 酸、色氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。 。 潘状幼体蜕皮3 次就成为后涵状幼体，生活习性与涵状幼体一样，但形态结 构有所不同。后涵状幼体蜕皮2 次，就变为十足幼体，也就是大眼幼体，通称蟹 苗。由l 龄潘状幼体变成大眼幼体共蜕皮5 次，每隔4 5 天蜕皮1 次，共需2 0 之5 天。如果水温升高，虽仍蜕皮5 次，但3 4 天即可蜕皮一次，因此一共只需要 1 5 2 0 天。大眼幼体在水中既能爬行，又能游泳，仍保持杂食性，捕食枝角类i 死鱼及水生植物。在半咸水与淡水中均可生活，有很强的溯水性，在长江口，大 眼幼体般出现于5 7 月n 1 。艾春香等h 3 以增重率、存活率和蜕皮频率为指标， 认为淡化5 天的大眼幼体饵料中维生素e 的适宜含量为2 0 0 4 0 0m g k g - 1 ，而 当维生素e 含量过高( 8 0 0m g k 9 1 ) 时，反而抑制会仔蟹的生长、存活和蜕皮。 徐新章哺1 以成活率为指标，得出在大眼幼体阶段河蟹对蛋白质的需求量为4 5 ； 韩小莲口3 以成活率和增长率为指标，得出大眼幼体至i 期幼蟹阶段对蛋白质的需 求量也是4 5 ；而张家国等埘以成活率为指标，却认为大眼幼体至期幼蟹阶段 ? ： ， 对蛋白质的需求量为4 5 。温小波等n 2 1 对仔蟹进行正交试验，表明e i ) a i 和d 姒 对仔蟹的营养生理作用最大，亚麻酸次之，最后是亚油酸，适宜需求量分别为 0 2 8 、o 5 3 、0 9 5 和2 7 9 。成永旭等n 3 1 的研究结果表明，饲料中添加 p u f a 可以显著提高大眼幼体到i 期仔蟹的成活率，但对提高大眼幼体到i 期仔 蟹的成活率效果并不显著，因此，认为p u f a 对仔蟹的早期发育作用显著。在河 蟹性早熟前后，d h a 可能主要参与卵巢的发育和卵黄的发生，而e p a 有可能参与 成熟、蜕壳和膜的构建。 大眼幼体生活数天以后，蜕皮1 次，就变成1 龄幼蟹。腹肢两性已显得不同， 雌蟹4 对，双枝型；雄蟹只有2 对，变成生殖肢。在水温约2 3 下，从1 龄溢 状幼体直到发育成为1 龄幼蟹，约需3 5 4 0 天。随后每隔约5 天，蜕皮1 次，大 约蜕皮5 6 次后，才完全具备成蟹的外形，每蜕壳一次，幼蟹的体形和体重都会 上海师范大学硕士学位论文 有显著的变化和增长d 1 。中国科学院植物研究所口3 以生长发育为指标，经过两年 生产实验得出幼蟹阶段对蛋白质的需求量为3 9 7 8 ；钱国英婚1 以成活率和增长 率为指标，认为在幼蟹至成蟹阶段，河蟹对蛋白质的需求量为4 0 一4 4 。徐新 章等阳认为二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) 是幼蟹的必需脂肪 酸，当它们的相对含量分别低于0 0 3 和5 时，会不利于幼蟹的生长。汪留全 等n 钔以初始体重为( 1 2 3 0 3 6 ) g 的幼蟹为实验对象，在饲料中添加不同水平 的大豆磷脂，喂养6 0 天，得出以下结论：幼蟹饲料中适宜磷脂水平为2 一4 。 _ _ 在饲料中添加适量磷脂不但有利于幼蟹摄食，而且有利于幼蟹的饲料转化，：而且 ， ， ： 能有效提高幼蟹的蜕壳质量，促进幼蟹生长。另外，他们还认为在基础饲料中添 加0 2 的胆固醇可以促进幼蟹的生长，还能显著提高幼蟹对饲料的利甩率。脂 类是河蟹生长发育过程中主要的能量物质，它可以作为脂溶性维生素的溶质，帮 助河蟹对脂溶性维生素的吸收，另外，还是构成生物膜结构的主要成分，其中多 不饱和脂肪酸、胆固醇和磷脂还与河蟹蜕壳、生殖等密切相关，与其成活和生长 紧密相连。但是，这些物质在河蟹体内不能合成或合成量很少，不能满足河蟹生 长发育对脂类的需要，因此必须依赖于从外界饵料中摄取。已有大量学者睁坞3 对 河蟹生长所需的脂肪含量进行了研究，但结果差别很大，最低为3 ，最高为 1 7 9 3 ，出现这种差异一方面是因为研究条件、方法等不同，另一方面是因为 7 河蟹生长阶段不同。河蟹在不同生理时期对饲料中脂类需求量不同，即使在同一 一 生理时期，在_ 定范围，对饲料中的脂肪含量也没有特定的要求。 碳水化合物是河蟹生命活动最直接的能源：在河蟹生长的初期阶段，饲料中 的糖分含量是是决定成活率的第一限制因素。徐新章等隋1 以成活率为指标，结果 表明，体重0 1 9 以上的河蟹饵料中糖类和纤维素的适宜含量均明显高于潘状幼体 和大眼幼体的需要量。虽然过量的纤维素不利于养殖，它会对河蟹的摄食、生长 和颗粒饵料的黏结性能不利，但在饵料中加入少量的q 一纤维素，会促进肠的蠕动、 蛋白质的利用，而当饲料中a 一纤维素被完全除去后，蛋白质的利用率会降低。 有研究口盯认为，河蟹饲料中纤维素的适宜含量为6 5 。 河蟹在开始脱壳前，老壳撑起，不再贴附在身体上，身体以及附肢此时得以 生长扩大，等老壳脱去以后，新壳虽还柔软，但身体已经不再生长。脱壳时，动 物血压急增，首先在身体的一定部位，因为钙质溶解老壳破裂，脱下的老壳绝大 多数种类都完整无缺地留在脱壳个体的近旁。此时新壳尚未硬化，动物身体因此 9 上海师范大学硕士学位论文 柔软，被称为“软壳蟹”( b u 仕e rc r a b ) 。通常经过2 4h ，钙盐沉积，新壳也就变 硬。使新壳变硬的钙质来自血液，因此河蟹所摄取的食物必需含有足够的钙质， 尤其在刚脱壳以后，特别需要钙质n 1 。矿物质对河蟹等甲壳类动物是非常重要的， 因为，河蟹在生长期内需要经历多次蜕皮，而钙和磷对河蟹脱壳生长、营养物质 代谢和生长发育有着重要的作用。陈立桥等n 玎和钱国英等口1 的研究结果中，河蟹 饵料中适宜的钙磷比例明显不同，分别为1 ：1 9 和1 7 ；1 ，出现这种情况的原 因j 可能是由于养殖水体中钙、磷含量和饵料原料不同；另外，在河蟹不同生长 阶段、不同养殖模式对钙磷的需求量也不同乜。如在大眼幼体和幼蟹体内磷含量 大大高于1 l o 1 5 0g 的蟹，分别为。0 5 6 1 5 、0 2 5 0 2 7 。+ 但他们 都认为，当饵料中钙磷比例过高时，河蟹的生长率和蛋白质利用率等显著下降， 影响河蟹的生长发育。 河蟹不仅在未成熟阶段，即使成熟以后也仍能继续生长与脱壳，不过成熟以 后，生长较慢，脱壳次数减少而已。河蟹第一年( 体长约达1 0 毫米) 脱壳1 0 2 ： 次，第二年( 体长约1 8 _ 4 0 毫米) 约5 次，第三年( 体长约2 8 5 4 毫米) 2 3 次， 随后每年只一次。脱壳只在温度季节进行雌雄体交配以后以及正在抱卵的雌体都 不脱壳。 1 一同工酶与甲壳动物 1 2 1 j 同工酶应用于在个体发育方面 发育是指在一个稳定的遗传信息库中基因经过选择性表达，由单细胞受精卵 一 产生出一个复杂成体的过程啪1 。这个过程的主要特征就是细胞分化，由此产生多 类细胞，即特定时间的优势激活与调节的结果。但是；每类细胞都具有特异的功 能和代谢性，从而使成年机体既具有分工又兼具统一的整体功能。因此，特异的 基因表达最后产生了成体组织特异的同工酶谱，而且这些同工酶谱都是由单细胞 阶段的同一个前体酶谱产生的，所以，在个体发育过程中就必然会发生一系列复 杂的同工酶变化。 同工酶作为特异基因的产物，其最后的组织分布可作为代谢变化的特征，另 外在发育早期可以分辨出容易消失的同工酶谱0 1 ，因此在发育早期的同工酶检测 可以为甲壳动物的发育生物学、在幼体发育变态过程中的营养生理学以及水产养 殖技术提供某些理论参考。而在个体发育过程中，酶谱的变化也反映了细胞组成 和生理代谢发生的变化，因此利用同工酶谱的变化解释发育过程中某些阶段特有 上海师范大学硕士学位论文 的代谢方式，就促进了发育同工酶学的产生。在个体发育过程中，不同的同工酶 在同一组织中可能发生不同的变化，而在不同组织中的同一种同工酶的变化也会 不同。 有关水产甲壳动物发育过程中同工酶变化的研究已有很多，张志峰等口妇以中 国对虾各期幼体为材料，进行了8 种同工酶谱的研究，结果显示同工酶的表达具 有时间特异性，在不同生理阶段同工酶的表达具有显著差异；m 6 r g a n 等口2 1 曾对 哈氏扇蟹发育过程中的e s t 、l d h 、p g i 、a l p 和a c p 等同工酶进行了分析， 得出6 种同工酶的数量及其表达随发育表现出不同的变化，在不同发育阶段同工 酶谱明显不同；李广丽和朱春华口3 1 对罗氏沼虾个体发育过程中早期阶段9 个时期 ： 的8 种同工酶系统进行了研究，结果表明，除m e 、s o d 表现相对稳定外，a m y 、 a l p 、e s t 、l d h 等同工酶随发育其酶谱逐渐复杂；王桂忠和李少菁泓3 对锯缘 青蟹三个时期( 体重分别约为5 9 ，5 0 9 ，5 0 0 9 ) 为代表，研究了醛氧化酶、乳酸 脱氢酶、q 淀粉酶、酯酶的变化，除肝胰腺中酯酶表型稳定外，其它三个酶都 随不同的发育时期有明显的变化；饶小珍等口司分析了日本对虾成体5 个不同的发 育阶段肌肉中l d h 、g d h 、a d h 、e s t 、s o d 、m d h 等6 种同工酶的变化，除 a d h 的表型稳定外，l d h 等均随着个体生长而有所不同，而同工酶谱发生变化 的主要时期集中在体长3 5 c m 6 5 c m 阶段；李纯厚等3 研究了斑节对虾早期发 育中酯酶的变化，从无节幼体n 期到仔虾期斑节对虾体内的酯酶酶谱特征表现出 明显的发育差异性；贾守菊等叩和雷焕宗等啪3 分别对中华绒螯蟹不同发育阶段 j ( 幼蟹、未成熟蟹、成熟蟹和抱卵蟹) 腹肢粘液腺和肌肉中的乳酸脱氢酶醇脱氢 酶、苹果酸脱氢酶、过氧化物酶等同工酶进行研究分析，。除l d h 只有1 条酶带， 酶谱表达稳定外，其它酶在不同生理阶段的表达上都具有一定的特异性，酶带数 以及酶活性均有改变。 以上研究都表明了，在个体生长阶段，不同生理时期，同工酶会表现出明显 的差异性，这不仅表现在同工酶谱的表达上，而且，同工酶的活力也会不同，显 示出明显的发育差异性，同工酶的这些变化与个体生长发育过程中不同时期的营 养、代谢以及生理状况的不同相适应。 1 2 2 同工酶在组织特异性方面的研究 同工酶作为基因表达的产物，它的合成与分布受到基因的严格控制。生物在 不同的生理阶段，同一发育阶段盼不同器官间，同一器官的不同组织间以及同 上海师范大学硕士学位论文 一组织的不同细胞中甚至在同一细胞内的不同空间位置，都要求不同的同工酶来 发生作用，以保证各代谢过程有条不紊地进行d 引。同工酶的这种组织差异性与各 组织的代谢功能密切相关，不同同工酶在专一的进化控制系统中承担不同的作用 4 0 】 o 王国良等h 妇对三疣梭子蟹体内鳃、肝胰腺、心脏、血淋巴和肌肉等5 种组织 的c a t 、l d h 、a c p 、f d h 酶等进行了研究，结果表明同工酶在表型、迁移率、 一 酶活性上表现出明显的组织特异性，其中肝胰腺和鳃活性相对较强，酶谱差异较 大；而心脏与肌肉组织中的酶谱表达很相似，但心脏中酶谱特征相对复杂些，并 且肌肉中缺乏a d h 酶表达。余红卫等研究了三疣梭子蟹雌性成体心脏、。鳃、 肌肉等6 种组织中的1 0 种同工酶的分化表达模式，结果表明同工酶的分布及活性 强弱具有明显的组织特异性，如g d h 只在心脏和肌肉中表达，m s o d 只在眼睛 中表达，s m d h 只在鳃中表达，q 淀粉酶只在肝胰腺和卵巢中表达，肝胰腺中 的山梨醇脱氢酶( s d h ) 活性较强，而且a d h 、m d h 、s o d 、m e 和e s t 同工酶 ： 在卵巢中活性较强。王春琳等h 3 1 对口虾蛄眼球、。肌肉、腹鳃、肝胰腺和心脏等5 种组织中a d h 、s d h 、m y 、g d h 、s c d 、s o d 等共1 2 种同工酶进行了研究 分析，结果p o d 和s o d 的表达比较稳定，腹鳃中l d h 的活性很低，而心脏中l d h 同工酶活力较高，肌肉中的l d h 表达出两条酶带，而且酶活力比在肝胰腺中强， 一+ 在肌肉与心脏中a d h 活性较强：m d h 同工酶在肌肉和心脏中表达最强，肌肉中 g l d h 的活性也较强，另外，肝胰腺中e s t 同工酶表达最强，各组织间酶谱表达的 - 、 差异比较显著。郑曙明等h 钔采甩聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对中华绒螯蟹的 酯酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶和苹果酸脱氢酶三种同工酶进行了分析，发现中华 绒螯蟹体内这三种同工酶都具有明显的组织特异性。王桂忠等h 胡研究了锯缘青蟹 个体发育中肌肉和肝胰腺的同工酶谱，电泳结果显示，肌肉中酯酶表达有三个酶 带，比肝胰腺多了两个酶带；肌肉中醛氧化酶活力低于肝胰腺中的，但比肝胰 腺多了一个酶带；在肌肉中乳酸脱氢酶的活力明显高于肝胰腺中，而且酶谱也相 差很大。王琦等“6 1 利用高p h 不连续系统聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳方法对河蟹的 肌肉、心脏、鳃、肝胰腺、血清等组织进行了l d h 同工酶的酶谱分析，结果显 示河蟹l d h 同工酶具有明显的组织特异性。 以上实验结果都表明，同工酶的表达具有空间特异性，在不同组织中有明显 的差异性，这种差异性使我们能够更好地了解各组织的生理功能。 上海师范大学硕士学位论文 1 2 3 同工酶在种群遗传多样性方面的研究 同工酶的群体遗传多样性研究主要是利用同工酶技术对处于不同地理居群 或养殖种群的种内、种间的生化遗传差异以及群体的遗传结构进行分析。王国良 等h 对浙江舟山朱家尖养殖区的三疣梭子蟹进行生化遗传分析，在所检测的1 0 种同工酶中，多态座位比例为2 4 ，低于脊椎动物多态座位比例的平均值4 6 9 和绒螯蟹群体平均值，反映出三疣梭子蟹的遗传变异水平已出现偏低的趋势。 d e l l i s e 等h 钔研究发现南美对虾两个家系的3 0 个同工酶基因座位没有明显分化j 多 态性分别为6 6 7 和3 3 3 ，而w a n g w 色i - j i 等嘞1 对4 个种群的中国对虾同工 - ， 酶遗传变异进行了研究，结果表明在分析的1 2 种同工酶编码的2 0 个基因位点中， 只有4 个是多态位点。王春琳等n 3 1 对口虾蛄的1 2 种同工酶进行了生化遗传分析， 共记录了3 5 个基因座位，其中l d l l 2 3 、a d h 2 1 、s d l l 2 2 、e s t 2 1 、e 蛇2 、e s t 2 3 、 s c d 2 1 、m e p 2 7 、g l d l l 2 l 、g l ( 1 1 1 2 2 和m d l i 共1 1 个基因座位是多态，多态座位比 i _ 例为3 1 4 3 ，高于对虾，而接近绒螯蟹和方蟹科，同时也低于脊椎动物的平均值 4 6 驴，与整个甲壳动物低水平遗传变异相一致。 1 2 4 同工酶应用于在病理诊断 同工酶作为生物机体中的天然标记，能够反映出机体里的各种变化，甚至包 括染病后机体内部发生的变化。另外，同工酶技术具有更高的特异性和灵敏度， 重复性好：因此，同工酶的含量、组成以及所具有的组织器官特异性都可以作为 疾病检测及诊断的一种辅助指标。 王金星等2 3 研究了中国对虾成体中肌肉、鳃、中肠和肝胰脏四种组织中的蛋 白质、酯酶、乳酸脱氢酶和超氧化物歧化酶等同工酶在健康虾和病虾中的变化， 结果显示，蛋白质表型、e s t 、s o d 的表型在健康虾和病虾中的肝胰腺和肌肉问 存在明显的差异，而且在肝胰脏中同工酶表型变化规律稳定，重复性又好，因此 可以将同工酶的这种变化作为一个辅助指标应用于虾病的早期诊断。薛俊增哺 对正常的和患“抖抖病”的中华绒螯蟹心脏、肝脏、肌肉、鳃、血淋巴等5 种组 织中的可溶性蛋白质及乳酸脱氢酶、酯酶和过氧化物酶等同工酶进行了分折，结 果，在健康蟹和病蟹中蛋白质和这三种同工酶谱存在显著差异，比如，可溶性蛋 白质在病蟹体内酶带增多，尤其是心脏中酶带增加最多，而病蟹组织中的过氧化 物酶谱带却减少，活性变弱，肝脏中表现最为显著。孙静秋等采用聚丙烯酰胺 凝胶垂直平板电泳法，对凡纳滨对虾健康成钵和感染桃拉综合症病毒( t s v ) 病虾 上海师范大学硕士学位论文 的复眼、肝脏、心脏、鳃和肌肉等5 种组织中的a c p 、a k p 、e s t 、p o d 等4 种同 工酶进行比较研究。结果，这4 种同工酶的表型在健康虾和病虾之间存在着明显 的差异，由于病原体的入侵，直接干扰了虾体正常的物质代谢，产生一系列免疫 反应，使得与代谢和免疫相关的酶类发生变化，这也说明这4 种同工酶在肝脏中 的特异性变化可作为研究凡纳滨对虾桃拉综合症的生理生化指标。黄灿华和陈棣 华泓3 应用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳研究健康中国对虾和患白斑病虾体内4 种同 工酶( 酯酶、苹果酸脱氢酶、谷草转氨酶、超氧化物歧化酶) 的表型变化，结果 病虾中e s t 、m d h 、g o t 的某些酶带丢失，酶活性下降，这样就会直接影响或 干扰虾体内正常的生理代谢j 而这种生理代谢功能的紊乱，又会导致营养与能量 的供给受阻，并可能导致组织细胞大量死亡。病虾体内s o d 同工酶活性的下降， 又反映出机体的免疫防御机能衰退，而这又导致了对虾至发病晚期会出现多种病 原混合感染。 同工酶是由生物体细胞内基因编码的，当病毒侵入宿主细胞后，病毒的核酸 1 同时也侵入宿主的细胞核，参与宿主细胞基因组的转录与翻译，其转录产物也会 抑制或激活宿主细胞的部分功能，包括宿主细胞的各种参与代谢和免疫反应的同 工酶类的表达及活力强弱5 1 。 1 2 5 同工酶应用于形态分类学 不同种的生物具有不同的基因，并且基因的表达与调控也不相同? 而同工酶 是基因表达的产物，也必然存在明显的物种特异性。利用同= e 酶的这种物种差异 性，采用同工酶电泳技术，以同工酶表型作为种内遗传多样性的标志来研究物种 的差异和分类关系，可以为物种的鉴定提供生化遗传依据。 程家烨等畴6 3 研究了苏北南部沿海中华绒螯蟹、天津厚蟹、红螯相手蟹和日本 大眼蟹四种蟹的眼、肝脏等组织的蛋白和l d h 、a n e a 同工酶。结果表明，这四 种蟹的蛋白和同工酶表达具有明显的物种特异性，酶带数量和迁移率都不同，这 种差异性既反映出生物体生命过程的多样性，同时又为物种的分类鉴定提供了依 据。乔新美等啼7 3 对我国长江、瓯江雌性中华绒螫蟹成蟹的酯酶、乳酸脱氢酶和苹 果酸脱氢酶等同工酶进行研究比较，结果表明在肌肉组织中，l d h 、m d h 、e s t 三种同工酶表达基本一致，而在心脏、卵巢和肝脏中存在明显的差异，证实了这 两个水系的中华绒螯蟹存在一定的差异。许加武和李思发睛8 1 采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳，对长江口中华绒螯蟹、天津厚蟹、无齿相手蟹、红螯相手蟹和字纹弓蟹等 上海师范大学硕士学位论文 5 种蟹的肌肉、肝的碱性磷酸酶、甘油一3 一磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱 氢酶、苹果酸脱氢酶、超氧化物歧化酶等6 种同工酶进行研究比较，结果，红螯 相手蟹、无齿相手蟹、天津厚蟹的a l p 、a ( 巾d h 、s o d 的酶带迁移率和分布基 本相似，认为它们属同一亚科。其中，红螯相手蟹和无齿相手蟹这6 种同工酶的电 泳图谱几乎一致，亲缘关系最近，属于同一属。字纹弓蟹和中华绒螯蟹的a l p 、 叶g p d h 、s o d 同工酶谱也大致相似，因此属于另一亚科，而这些结果与形态学 的分类结果相_ 一致。 上海师范大学硕士学位论文 第二章中华绒螯蟹几种同工酶理化性质的比较 生物的生命代谢离不开酶，酶的活性与物质代谢活动密切相关。开展对酶学 性质的研究，不仅在酶的结构与功能方面具有重要的科学理论意义，而且在水产 养殖中病害防治与环境污染预防方面也具有重要的实践意义。 已有大量实验研究对各种同工酶活力进行了研究n 卜7 8 3 ，其中马贵华等? 1 7 2 1 分 别以长江水系中华绒螯蟹的成蟹与大眼幼体( 俗称“蟹苗 ) 为研究对象，对其血 淋巴中酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性进行了初步研究，以期丰富河蟹的基础免 疫学，为衡量中华绒螫蟹的成蟹与大眼幼体的机体免疫功能提供科学依据，并为 将来使用一些免疫增强剂来提高河蟹自身免疫功能提供参考。杨志彪等仃研究了 水环境中的c u 2 + 对中华绒螯蟹代谢酶( c u z h s o d 、a c p 、舢o ) 活力的影响，初步 确定了c u 2 + 影响中华绒螯蟹代谢酶的机制，探讨c u 2 + 影响甲壳动物生长和毒性的 机理，并为建立水体过量c u 2 + 对经济甲壳动物生长发育的危险评价标准奠定基 _ ? ： 础。艾春香等口4 】通过分别给中华绒螯蟹投喂v 。含量不同的试验饲料后，检测其各 组织、器官中与非特异性免疫相关的酚氧化酶、抗菌力、溶菌酶等指标的变化， 探讨v 。与中华绒螯蟹非特异性免疫力的关系，以期为中华绒螯蟹无公害健康养殖 提供理论支持，同时为甲壳动物营养免疫学积累基础资料。王伟伟h 毋的研究中对 凡纳滨对虾、日本对虾和克氏原螯虾在不同生境中的虾类进行了比较分析j 可以 ? 为深入研究虾类s o d 的生物学理论及免疫学作用机帛i j 提供基础：同时也为虾类的 健康养殖、疾病防治以及新型药物的开发提供依据。因此，研究水生生物酸性磷 一 酸酶( a c p ) 、碱性磷酸酶( 舢o ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 和多酚氧化酶( p p o ) 对于水产动物的健康养殖、疾病防治、生态环境的保护等 都具有重要意义。 2 1 实验材料 2 1 1 材料 材料取自上海市奉贤水产养殖场。2 0 0 8 年6 月取当年的幼蟹。2 0 0 9 年6 月 再取一次。 2 1 2 主要试剂 磷酸苯二钠( p n p p ) ，焦性没食子酸，l 一多巴，愈创木酚，双氧水( 3 0 ) 。 上海师范大学硕士学位论文 2 1 2 主要仪器 玻璃匀浆器，台式冷冻高速离心机，m e t t l e rt o l e d o3 2 0 sp h 计，电 子天平f a l 0 0 4 ，电热恒温水浴锅，紫外分光光度计。 2 1 3 酶液制备 将中华绒螯蟹幼体雌蟹活体解剖，取肝脏组织，组织称重后按1 ：9 ( 咖1 ) 的比例加入生理盐水，于冰浴中匀浆， 1 2 0 0 0 r m i n ，4 条件下离心3 0 m i n 。取 上清液作为测定酶活性的粗酶液，置一2 0 冰箱中备甩。 2 2 实验方法 2 2 1 酶活力测定 a c p 酶活力测定：采用磷酸苯二钠法为底物的金氏法m 3 j 反应体系如下： 取0 9 m lo 1 m o 儿的醋酸缓冲液( p h 值为4 5 ) ，加入1 m lo 0 1 m o l ：l 对硝基苯磷 酸二钠( 砷旧p ) ，3 7 预热5 m i n ，然后加入o 1 n l l 酶液，混匀后于3 7 保温1 5 m i i i ， 用2 1 1 1 l0 1 m o 儿的n a o h 终止反应，以预先终止酶活性的测活体系为参比。以每 分钟产生1 啪o l 酚所需的酶量定义为一个活力单位( u ) 。 酶活力计算：己知波长4 0 5 1 1 i i l 条件下产物对硝基苯酚的消光系数毛为1 8 8 1 0 3m o l ( l