（微生物学专业论文）一株丙酮丁醇梭菌高产丁醇培养基条件优化.pdf

一株阳酎丁醇梭菌高产丁醇培养桀条件优化 摘要 丙酮丁醇发酵有着悠久的历史，曾经是仅次于酒精发酵的世界第二大发酵过程。 但是在上世纪五、六十年代以后，随着石化工业的迅速发展，丙酮丁醇发酵逐渐衰 退下来。近年来，由于石油等化石资源的逐渐枯竭，丙酮丁醇发酵作为一种转化生 物质为液体燃料( 丁醇) 和工业原料的重要手段又重新引起人们的重视。但丙酮一 丁醇发酵过程中产物丁醇会对细胞产生很强的毒害作用，当发酵液中丁醇的浓度达 到或超过1 1g l 时，发酵菌株生长受明显抑制，严重时会导致细胞内质子外漏，细 胞膜受损并导致死亡，最终降低生产效率，这一问题严重制约了该产业的发展。 本论文以工业微生物保藏中心提供的丙酮丁醇梭菌8 0 1 2 作为出发菌株，通过优化 以期使丁醇产量产量超过1lg l 。 首先研究了添加( n h 4 ) 2 s 0 4 、c a c 0 3 、k 2 h p 0 4 3 h 2 0 、k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 7 h 2 0 、 f e s 0 4 7 h 2 0 、氯霉素对丁醇浓度的影响，结果表明丁醇产量由原来的7 4 4g l 提高 到1 0 3 3g l 。 在单因素的基础上，采用p l a c k e t t b u r m a n 设计对影响丁醇产量的发酵培养基组分 进行了筛选，确定主要影响因子为m g s 0 4 7 h 2 0 和氯霉素。 然后用最陡爬坡实验逼近以上2 个因素的最大响应区域，最后采用中心组合设计 和响应面分析法确立主要影响因子的浓度。优化后的培养基组成为：玉米粉7 0g l 、 ( n h 4 ) 2 s 0 43 9 l 、c a c 0 36 9 l 、k 2 h p 0 4 。3 h 2 01 2 5 9 l 、k h 2 p 0 41 5g l 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 4 3 9 l 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 5 9 l 、氯霉素0 1 3 7g l 。最终丁醇浓度为1 1 5g l 比原始 产量提高了5 4 ，本实验也说明用此优化方法可有效提高丁醇产量。 关键词丙酮丁醇梭菌；p l a c k e t t b u r m a m 中心组合；响应面 华中农业人学2 0 0 9 届硕l j 学位论义 a b s t r a c t a c e t o n e - b u t a n o lf e r m e n t a t i o nh a sal o n gh i s t o r y , w a so n c es e c o n do n l yt oa l c o h o l f e r m e n t a t i o no ft h ew o r l d ss e c o n dl a r g e s tf e r m e n t a t i o np r o c e s s h o w e v e r ，s i n c et h e 19 6 0 , 7 0 ，b e c a u s eo ft h ef a s t e rd e v e l o p eo fp e t r o c h e m i c a li n d u s t r y , a c e t o n e b u t a n o l f e r m e n t a t i o nh a sd e c l i n e dc o n t i n u o u s l y c u r r e n t l yd u et ot h ee x h a u s t i o no fn a t u r a lg a s a n do i lr e s o u r c e s ，a c e t o n e - b u t a n o lf e r m e n t a t i o ni sb e c o m i n gm o r ea n dm o r ea t r r a c t i v ef o r p r o d u c i n gl i q u i df u e l s ( b u t a n 0 1 ) a n di n d u s t r i a lr a wm a t e r i a l s h o w e v e r , b u t a n o lh a sd e e p e rt o x i c i t yd u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s g r o w t ho fc e l lb e s t o p e dw h e n b u t a n o lc o n c e n t r a t i o nr e a c ho ro v e r11 g j l ，i tl e a d st ol e a k a g eo fi o n s ，w i t h e x c e s s i v ei o nl e a k a g et h ec e l lc a n n o tm a i n t a i ni t st r a n s m e m b r a n ei o ng r a d i e n t sb yi o n p u m p i n g ，a tl a s tt h ei n t e g r i t yo fc e l lm e m b r a n ep h o s p h o l i p i db i l a y e rd i s a p p e a r sa n dc e l l d i e s op r o d u c t i o ne f f i c i e n c yi sl o w , m a k e sa c e t o n e b u t a n o lf e r m e n t a t i o nu n e c o n o m i c a l a n dh a r dt op o p u l a r i z e i nt h i sp a p e r , c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m8 012 ( f r o mc h i n ac e n t e ro fi n d u s t r i a l c u l t u r ec o l l e c t i o n ) 8 012w a ss e l e c t e d w i t hav i e wt h r o u g he x p e r i m e n tt oo p t i m i z i n g b u t a n o lp r o d u c t i o ne x c e e d i n g1 1g l f i r s t ，( n h 4 ) 2 s 0 4 ，c a c 0 3 ，k 2 h p 0 4 。3 h 2 0 ，k h 2 p 0 4 ，m g s 0 4 7 h 2 0 ，f e s 0 4 。7 h 2 0 ， c h i o r a m p h e n i c o lw a sa d d e da td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ni no r d e rt os t u d yt h a ti ft h e s e f a c t o r sw e r ea b l et oi n c r e a s eb u t o n o lp r o d u c t i o n a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tb u t o n o l c o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e df r o m7 4 4g lt o10 33g l b a s e do nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t w ol e v e lf a c t o r i a ld e s i g no fp l a c k e t t - b u r m a n w a su s e dt oe v a l u a t et h em o s ti n f l u e n c i n gf a c t o r s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt w of a c t o r s p l a y e dt h ei m p o r t a n tr o l e ，i tw a sm g s 0 4 7 h 2 0a n dc h l o r a m p h e n i c 0 1 t h e nt h ep a t ho f s t e e p e s ta s c e n tw a su s e dt oa p p r o a c ht h eo p t i m a lr e g i o n a tl a s tt h ec o n c e n t r a t i o n so f t h o s et w om a i nf a c t o r sw e r ef u r t h e ro p t i m i z e db yu s i n gc e n t r a lc o m p o s i t ea n dr e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s 功eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so ft h ev a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e da s ：c o r n f l o u r7 0g l ，( n h 4 ) 2 8 0 43 9 l ，c a c 0 36 9 l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 01 2 5 9 l ，k h 2 p 0 41 5 l ， m g s 0 4 。7 h 2 00 4 3 9 l ，f e s 0 4 7 h 2 00 015 9 l ，c h l o r a m p h e n i c o l0 13 7 9 l f i n a lb u t a n o l c o n c e n t r a t i o nw a s1 1 5g l ，i n c r e a s e db y5 4 t h a nt h eo r i g i n a lp r o d u c t i o n ，s o l v e n tr a t e t l 一株肉酮丁醇梭菌高产丁醇培养幕条件优化 a l s oi n c r e a s e df o r m6 5 t o7 2 t h i se x p e r i m e ma l s os h o w st h a tu s i n gt h i so p t i m i z a t i o n m e t h o dc a r le f f e c t i v e l yi n c r e a s et h eb u t a n o ly i e l d k e yw o r d s c l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m ，p l a c k e t t b u r m a n ，c e n t r a lc o m p o s i t e ， r e s p o n s es u r f a c e i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文7 是否保密 | 如需保密，解密时间年月日 桫 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的班何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名瑰确、帆d wq 年e 月fq 日 j l 学位论文使用授权书。 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数 据股份有限公司将本人学位论文收录到( ( 中国学位论文全文数据库，并进行信 息服务( 包括但不限于汇编、复制，发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在 其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 密的论文) 在解密后适用于本授权书。 学位论文储豁诱摊、导懒：群乡坪 签名日期h 年( ) 月f 。日签名日期3 _ 年 ) 月卜旧 j 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 一株阳酎丁酡梭菌高产丁醇培养皋条件优化 1 前言 丙酮丁醇发酵工业有着悠久的历史，曾经是仅次于乙醇发酵工业的大规模生物 技术产业之一。其产生、发展与产丙酮丁醇菌的发现、产品用途的开发及原料的选 用有关，同时也受到经济和军事影响( j o n e sa n dw o o d s ，1 9 8 6 ) 。 1 8 5 2 年，首先由w u r t z 发现丁醇是杂醇油的一种常见成分。1 8 6 1 年p a s t e u r 用 乳酸及乳酸钙发酵丁酸时发现丁醇以副产物出现。1 9 5 0 年s c h a r d i n g e r 利用马铃薯分 离得到一种好氧性菌b a c i l l u sm a c e r a n s ，该菌发酵淀粉时可生成乙醇和丙酮等物质。 1 9 1 1 年，英国s t r a n g & g r a h a m 公司委托f e m b a t h 教授研究丙酮的合成过程，其在研 究中分离获得f i t z 型菌。该菌不仅能生成丙酮，还可生成丁醇。但是该菌有局限性， 只适用于发酵马铃薯淀粉，不适用于其他淀粉质原料，后来逐渐被淘汰。 1 9 1 4 年w e i z m a n 博士成功的从谷物中分离得到一种属于b y 型的丙酮丁醇菌。 它可以发酵多种淀粉质原料，而且发酵产物中丙酮含量比f i t z 型菌提高了4 倍，溶 剂生成比例为：丁醇丙酮乙醇= 6 ：3 ：l ( 即b ：a ：e = 6 ：3 ：1 ) ，后来该菌被命名为 c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mw e i z m a n 。此菌的发现奠定了丙酮丁醇发酵的工业化基 础，促进了丙酮丁醇发酵工业的迅速发展。 第一次世界大战爆发期间，丙酮需求量激增，英国人为了大量制造纸状炸药对 发酵法生产丙酮非常重视，于1 9 1 4 年在本土建立了世界上第一座丙酮发酵工厂，并 使用了w e i z m a n 的方法，生产获得了成功。但由于当时英国粮食紧缺，被迫在1 9 1 6 年将工厂移到盛产玉米的加拿大，在多伦多成立了英国丙酮公司，后来又在美国成 立了多家丙酮发酵工厂。在战争期间做为军火原料，丙酮的需求量大幅增加，所以 将丙酮丁醇发酵工业称为丙酮发酵工业。但是在生产过程中得到了大量的副产品一 丁醇，当时由于没有发现丁醇的利用价值而将其储存起来。等到战争结束后，首先 由杜邦公司发现：丁醇不仅可以用来来制造乙酸丁酯，而且可用作硝酸纤维喷漆的 优良溶剂。因此，积压的废物丁醇一跃成为有用的溶剂，丙酮丁醇发酵工业又改称 为丁醇发酵工业( 陈陶声和陆祖祺，1 9 9 1 ) 。1 9 4 2 年1 2 月第二次世界大战爆发，r 本的丁醇来源被封锁。由于丁醇的作用非常重要，它不仅可以做飞机翼涂料的溶剂， 而且又可用作高辛烷值的航空燃料的原料，所以日本便积极研究丙酮丁醇发酵技 术，由日本科研工作者分离得到一种可利用糖蜜发酵的菌种，在中国台湾省利用糖 1 华中农业人学2 0 0 9 届坝l ：学位论艾 蜜发酵生产丁醇，年产总溶剂2 5 万吨。 1 9 4 5 年美国改用以糖蜜等廉价原料进行生产，此法使得丙酮丁醇发酵工业取得 长足发展。与此同时，丁醇的其他用途被人们发现，逐渐将其应用到邻苯二甲酸二 丁酯( d b p ) 、增塑剂等方面，丙酮在有机玻璃、醋酸纤维素、维生素c 及等方面的 应用也引起人们的重视。 虽然在上世纪3 0 年代末期以石油化工合成丁醇技术己告成功，但是发酵法仍占 主要地位。但到了上世纪6 0 年代，伴随着石油工业的迅速发展，美国、日本等发达 国家丌始以石油为原料人工合成丙酮、丁醇，使得发酵法生产丙酮丁醇逐渐被淘汰。 只有南非、中国、和前苏联由于特殊的历史和政治原因，继续维持丙酮丁醇的发酵 生产。至7 0 年代以来，由于世界经济的快速发展，石油消耗量不断增长，石油价格 持续上涨，丁醇、丙酮价格长期高位徘徊，古老的丙酮丁醇发酵技术，作为一种有 效的、利用生物质资源生产重要平台化合物及燃料的生物转化技术，又重新开始被 人们重视。 1 1 研究背景 1 1 1 丙酮一丁醇梭菌的分类及代谢途径 长久以来对丙酮丁醇梭菌的分类人们比较模糊，没有形成统一的认识。后来随 着d n a 杂交技术的出现和对其进行1 6 sr r n a 测序( w o o d s ，1 9 9 5 ) ，将生产丙酮、 丁醇的梭菌分为2 大类：淀粉分解梭菌和糖化梭菌。 1 1 1 1 淀粉分解梭菌 此菌系最早发现的为乙酪酸梭状芽孢杆菌威斯曼种( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m w e i z m a n n ) 又简称乙酪酸梭菌威斯曼。是由威斯曼w e i z m a n n 氏于1 9 1 5 年从谷物 中分离而得，呈两端圆形短杆状，单一或双联。细胞大小为2 6 4 7 0 5 0 7 “m ， 由周围鞭毛进行运动。分裂生殖，革兰氏染色为阳性，后期变成阴性。培养3 天以 上游离出孢子，1 眦4 x 0 8 1 2l a m 大小，能休眠及抗不良环境能力保持其生命力。 在间歇培养后期出现介于营养体和孢子之间的梭状体，大小为4 6 1 - 2 9 m 。细胞 内积蓄淀粉颗粒，刘哥氏液染色呈蓝色，以后就形成孢予。 2 一株i q 酬丁醇梭菌高产丁醇培养皋条件优化 生理特性；厌气性，在好气的斜面培养基下不繁殖，培养温度以3 7 左右最合 适，2 0 - 4 7 下也能生育但很不好。孢子在6 5 下能耐4 0 天，1 0 0 下能耐几分钟， 故利于保藏。ph 值以6 7 为宜，发酵时ph 为4 5 5 。能液化明胶，凝固牛乳。可 以发酵淀粉、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、棉子糖、肝糖、 糊精、甘露糖、甘露醇等，不能发酵蜂蜜二糖、甘油、海藻糖、山梨糖、纤维素、 乳酸钙等。总溶剂产量约为淀粉的3 5 , - - 3 7 ，其丁醇比丙酮组成为2 ：1 ，气体容积 比c 0 2 ：h 2 = 6 0 ：4 0 ( 陈陶声和陆祖祺，1 9 9 1 ) 。 1 1 1 2 糖一丁基丙酮梭菌 此菌系适合糖蜜发酵的菌种，也是梭状属菌株，与乙酪酸梭状芽孢杆菌很相似。 一般培养温度低些，以3 0 3 4 为佳，它不能液化明胶，能充分利用无机氮源。菌体 比淀粉质原料用的菌种稍微大一些。在糖浓度为6 左右的糖蜜中加入硫酸铵、碳酸 钙，可得到糖的3 0 以上的溶剂。 营养细胞多为短杆状或长杆状，单个或连接存在，大小多为6 1 7l a m 。由周围 鞭毛进行运动，革兰氏染色为阳性，但宜变，3 天后就不规则了。产孢子，形状为 圆头的圆锥形或卵形，大小为2 7 1 4 9 m 。在马铃薯培养基中生长3 6 h 后会形成 梭状和鼓状的梭状提细胞，用碘化钾检验，呈淀粉粒反应。 生理特性；厌气性，用洋菜培养基3 0 下培养4 8 h 后，好气性培养时没有生殖， 厌气培养时生殖显著。但接种到新配置的葡萄糖马铃薯液体培养基中，即使是好气 培养，在3 0 下经过2 4 h 后也能生育发酵。2 9 3 1 最适合发酵，ph 以5 6 “2 最 宜。可以发酵玉米淀粉、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子 糖、肝糖、糊精等，不能发酵鼠李糖、甘油、松三糖、甘露醇、山梨醇等( 陈陶声 和陆祖祺，1 9 9 1 ) 。 其中ca c e t 0 2 b u t y l i c u md s m l7 3 2 和ca c e t o b u t y l i c u ma t c c 8 2 4 是淀粉分解梭 菌的代表菌株，糖化梭菌则分为3 个不同的种：ca c t o b u t y l i c u mn c pp 2 6 2 、c b e i j e r i n c k i in c i m b 8 0 5 2 和ca c t o b u t y l i c u mn 1 4 。丙酮丁醇梭菌的代谢途径如下图 所示： 3 。产中农业人学2 0 0 9 届倾i ：学位论文 撼曼髓髑纛燮内孽黢趟垡箩然弼毒慧辚一舅影纤维鬃 z 。艨麓静转 l ：t 。 己黪艘麓确 3 一黟擎麓麓 脱瓴镌 l 幡躐东台麓 鞴雠a 转移翰 1 1 2 丁醇的生成方法 兰，墼墨丝iz 菇 t_ ” 。麟，。黢 艨糍蘸r 一；幽燃 i： 3 隈辅瞒a 脱瓴黪 m a 篙鬻黯然勰 叵：i 工业上比较成熟的丁醇生产方法有3 种：醇醛缩合法、羰基合成法和发酵法， 其中醇醛缩合法和羰基合成法均属于化学合成法，二者都以石油为原材料，投资相 对较大，而且对技术设备要求较高。微生物发酵法一般以糖蜜、野生植物、淀粉质 和纸浆废液为原料，利用丙酮丁醇梭菌在严格厌氧条件下所分泌的相关酶来将淀粉 分解为糖，然后经过复杂的生物化学转化，生成产物。其原料来源较广泛、价格低 廉，而且工艺设备简单，投资较小。发酵法生产条件温和，一般常温操作，不需贵 重金属催化剂：安全性高、选择性好、副产物少，易于分离纯化( 孙晓红等，2 0 0 8 ) 1 1 3 发酵条件对产物的影响 1 1 3 1 温度 一般说来，丙酮、丁醇菌的培养温度以3 5 3 7 为好。发酵温度以3 7 3 9 为宜。 有人对不同温度做过实验，得到的结果是：从总溶剂转化率和发酵时间俩个因素来 讲，最好的的温度是3 5 * ( 2 上下。温度太低，发酵时间延长，生产效率降低。温度太 高，发酵虽然快一些但丙酮、丁醇产量减少。工厂实践表明：从培菌室到种母罐温 4 一株阳酎丁醇梭菌赢产丁醇培养皋条件优化 度应严格控制在3 7 3 8 c ，而用发酵罐大生产时温度可略高1 2 c 。尤其在夏天，醪 液要冷却到3 7 c 比较困难，所以发酵罐醪温取3 7 - 3 9 c ( 冬天3 7 4 0 ) ( 陈陶声和陆 祖祺，1 9 9 1 ) 。 1 1 3 2 酸度 酸度指1 0 m l 醪液需用0 1 mn a o h 中和的毫升数。发酵开始时的酸度叫原始酸 度一般为0 8 1 2 ，不得超过1 4 ，否则要影响发酵。从发酵开始到1 2 h 左右，酸度 先上升到顶峰( 通常为4 5 “o ) ，然后急速下降到1 5 3 0 ，以后较长的中期、后期 的发酵时间内酸度稍微上升一点，这就是标准的酸度变化曲线。否则就发酵异常。 如果高峰酸度大于7 5 就可能染菌或酸败。p h 值与酸度有关，酸度越高，p h 值越 低。科研表明丙酮、丁醇发酵的最适p h 值为4 3 ，此时有利于生成丙酮和丁醇。p h 值低于4 0 、高于6 8 都顾利于发酵( 陈陶声和陆祖祺，1 9 9 1 ) 。 1 1 3 3 浓度 醪液的浓度，在培菌和种母阶段一般取5 6 的淀粉质原料为宜。而在发酵罐 大生产中希望尽可能用较高浓度来发酵，以求得高产量低能耗的生产，所以通常用 7 浓度的蒸煮醪为好。如果过高，恐怕残余淀粉浓度增高，发酵不彻底造成原料浪 费，单耗升高的弊病。这主要是代谢物溶剂浓度太高会抑制丙酮、丁醇的正常发酵。 根据实验表明：丁醇毒性最剧，若按6 0 丁醇比计算，欲使发酵最终的总溶剂浓度 超过2 1 7 是不行的。因此一般丙酮、丁醇发酵完毕时发酵醪中的溶剂最高浓度只 有2 0 5 。要突破2 1 7 溶剂浓度，就必须解决耐高丁醇浓度的菌种，或者在发酵 过程中移去代谢物。 1 1 4 丁醇的理化性质 j 下丁醇俗称l 一丁醇，英文简写为n b u t a n o l 。它是无色液体，有酒精味，相对 密度0 8 1 0 9 ，熔点- - 9 0 2 c ，沸点1 1 7 7 。c ，闪点3 5 - 3 5 5 c ，自燃点3 6 5 ，折射 率n d ( 2 0 * c ) i 3 9 9 3 ，2 04 c 时在水中的溶解度7 7 ( 重量) ，水在正丁醇中的溶解度 2 0 1 ( 重量) 。毒性大体与乙醇相同，但刺激性强，有使人难忍的恶臭。食入有害， 对皮肤和呼吸道有刺激性，可致眼睛严重损伤，蒸汽可导致瞌睡及头晕。根据国内 5 f 仁中农业人学2 0 0 9 届颂l ? 学位论义 化学皮品安全管理法规常用危险化学品的分类及标志( g b l 3 6 9 0 1 9 9 2 ) ，将其划 为第3 3 类高闪电易燃液体。工作场所空气中最高容许浓度3 0 0 m e f l m 3 。与乙醇、乙 醚及其他多种有机溶剂混溶。蒸气与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限1 4 5 - - 1 1 2 5 ( 体积) 。 1 2 丁醇的主要作用及优势 1 2 1 在切片中的应用 在病理组织制片过程中，组织的脱水和透明是极为关键的步骤，也是病理诊断过 程中的重要步骤( 李海等，2 0 0 8 ) 。目前在病理常规制片中多采用酒精脱水、二甲苯 透明的制片方法，此法在使用中有利有弊：纯酒精脱水力强，但很容易使组织产生 较大收缩，且不为石蜡溶剂，妨碍石蜡分子进入组织。二甲苯为石蜡溶剂，透明力 强，作用快，但在对组织的媒介透明过程中，很容易对组织产生剧烈的弥散作用而 使样品扭曲、变硬变脆；同时它所挥发的有毒气体不但污染环境而且损害人体健康 ( 丁伟星，1 9 9 8 ) ( 石雪君和孙宏夫，1 9 8 2 ) ，会对对病理技术工作者的呼吸道及造 血功能带来一定的损害，有人甚至认为长期接触此种物质，能诱发上皮性恶性肿瘤 ( 骆利康，1 9 8 3 ) 。 正丁醇与二甲苯相比具有许多优点。它既能与水和乙醇混和，又能作为石蜡溶 剂，所以它对组织起了脱水、透明双重作用。它性质较柔和，适用于任何性质组织 的脱水、透明。大多数情况下，不同的组织的性质不同，厚度不同，在用酒精脱水 的时候就要区别对待。而正丁醇无此特殊要求，即使组织完全脱水，并在正丁醇中 长久放置也不会引起变硬变脆。组织在其浸渗过程中也不产生剧烈的收缩，避免了 因二甲苯对组织造成的明显收缩造成的质量问题。医学研究表明，正丁醇小鼠经口 给药的l d 5 0 为4 3 6g k g ，未列入职业中毒化学试剂范围之内。许多学者认为只有 当环境中正丁醇浓度超过2 0 0p p m 时，才会引起人体不良反应，如角膜水肿及眼结 膜等，但数天后即可消失，不会留后遗症。在对2 0 0p p m 环境中工作的工人进行体 检时发现，其肝功能、血液、尿液等均无异常。许多职业医生在多年常规工作中， 也未发现有任何副作用( 李海等，2 0 0 8 ) 。 6 一株i q 酎丁醇梭菌高产丁醇培养綦条件优化 1 2 2 用于合成醋酸丁酯 对于醋酸丁酯的生产，传统生产方法是以浓硫酸为催化剂，由醋酸和丁醇直接 进行酯化。浓硫酸所起的作用是催化和脱水，即吸收由醋酸与正丁醇酯化时所生成 的水，使平衡向右移动，促进反应向右进行。这是一个非常成熟的工艺路线，其催 化剂来源容易，价格低廉，因此吸引着人们。 1 2 3 合成d b p d b p 又简称二丁酯，是早被应用的增塑剂，目前主要用于制鞋业和农业灌溉塑 料制品的加工过程，也可用于聚氯乙烯p v c 、硝化纤维、油漆润滑剂和乳化剂等。 用正丁醇和苯酐为原料，用硫酸做催化剂，经酯化反应生成二甲苯二丁酯。此方法 酸性催化剂活性高，而且价廉易得、能源消耗低。且丁醇可回收循环，从而有效的 降低了生产成本( 张木存等，2 0 0 3 ) ( 乞少红，2 0 0 4 ) 。 1 2 4 合成丙烯酸丁酯 丙烯酸丁酯是一种通用丙烯酸酯，用丙烯酸酯是重要的聚合单体，以其为主体 聚合或与其他乙烯基单体共聚制备的聚合物、共聚物被广泛应用于涂料、油墨、纺 织、皮革、造纸、胶粘剂、橡胶、塑料等领域。丙烯酸丁酯化学反应式如下： c h 3 c h 2 c h 2 c h 2 0 h + c h 2 = c h c o o h ( 丁醇) ( 丙烯酸)c h 2 = c h c o o c 4 h 9 + h 2 0 ( 丙烯酸丁酯) 1 2 5 在冶金中的应用 t m k 是测定金的良好显色剂，其反应灵敏度高，选择性好( 吴伟明等，2 0 0 6 ) 。 显色剂t m k 不溶于水，微溶于乙醚、乙醇、丁醇，易溶于苯。由于乙醇极易溶于 水，不利于萃取络合物于有机相。而正丁醇水溶性小，还能溶解t m k 与金的络合 物，所以正丁醇视为t m k 的理想溶解剂( 吴伟明，1 9 9 8 ) 。 7 华中农业人学2 0 0 9 届坝l j 学位论文 1 2 6 作为可循环生物燃料 生物燃料是指通过微生物生产的适用于汽油或柴油发动机的燃料，包括燃料生 物柴油、乙醇、生物丁醇、生物甲醇、生物气体、生物二甲醚等。目前市场上以燃 料乙醇和生物柴油最为常见( 刘娅等，2 0 0 8 ) 。作为生物燃料，丁醇与其同系物及其 他燃料不但在物化和燃烧特性方面都显示出优势，同时还具有以下不可取代优势：1 ) 能量含量高，与乙醇相比可多走3 0 的路程，与传统燃料相比可支持汽车多走1 0 路程( 周京波，2 0 0 6 ) ；2 ) 丁醇的挥发性小是乙醇的1 6 ，汽油的l 1 3 1 5 ，与汽油 混合对水的宽容度大，对低水蒸气压力和潮湿有更好的适应能力；3 ) 腐蚀性比其他 生物燃料小，比乙醇、汽油更安全；4 ) 与现有的生物燃料相比，生物丁醇与汽油、 柴油( 孙晓红，2 0 0 8 ) 的混合比更高，不需要对车辆进行改造( s c h w a r za n dg a p e s ， 2 0 0 6 ) ，就可以使用几乎1 0 0 浓度的丁醇，而且混合燃料的经济性更高；5 ) 发酵 法生产生物燃料丁醇会减少温室气体的排放量，与乙醇一样，燃烧时不产生s o x 或 n o x ，不会对环境产生危害；6 ) 丁醇可在现有燃料供应和分销系统中使用，可在 炼油厂混合( 王风芹等，2 0 0 9 ) ，而乙醇则需要通过铁路、船舶或货车运输；丁醇作 燃料会降低国内对石油进口的依赖性，体现燃料类型的多元化，有利于缓解国家之 间因石油引发的关系紧张问题。因此生物丁醇发酵己成为仅次于燃料乙醇发酵的第 二大可再生能源开发研究的热点。 1 3 国内外丁醇相关情况 1 3 1 我国丁醇生产装置发展情况 我国丁醇工业化生产始于2 0 世纪6 0 年代中期，生产规模一般偏小，发展缓漫 ( 张志新，2 0 0 6 ) 。丙烯羰基合成丁醇生产技术是从2 0 世纪7 0 年代开始的( 沈佩 芝和任诚，2 0 0 5 ) 。1 9 7 6 年，吉林化工公司引进德国b a s f 公司5 0 0 0 0t a 的高压 钴法丁辛醇装置，并于1 9 8 2 年建成投产，2 0 0 0 年扩能至1 2 0k t a ，其中丁醇为 7 0k t a 。自8 0 年代我国的丁醇生产开始才有较大的发展( 玄恩峰，2 0 0 0 ) 。齐鲁石 化公司、大庆石化总厂分别引进英国d a v y 公司低压铑气相循环法丁辛醇装置，丁 醇生产能力均为5 0 0 0 0t a ，并分别于1 9 8 6 年、1 9 8 7 年相继投产。1 9 9 2 年北京化 8 一株l j 酮丁醇梭菌岛产丁酵培养皋条件优化 工四厂引进同本三菱化学公司低压铑液相循环法装置，生产能办5 0 0 0 0t a ，于1 9 9 6 年投产。1 9 9 6 年齐鲁石化公司将原来低压羰基合成气相循环法改为液相循环法，在 原有主反应器不变的情况下将产能由5 0 0 0 0t a 扩大到7 0 0 0 0t a ，并于2 0 0 0 年将 丁醇装置能力再扩大到1 3 5 0 0 0t a 。2 0 0 2 年，公司完成“7 改1 2 项目( 柴国梁， 2 0 0 6 ) ；2 0 0 3 年继续将丁醇总生产能力扩大到2 5 0 0 0 0t a ，并计划在2 0 0 4 年年底 投产。1 9 9 8 年吉化公司在对原有装置升级改造同时引进了u c c d a v y 第四代低压 液相循环羰基合成技术。在原有装置异构物分离、丁醛缩合、辛烯醛液相加氢、醇 的精馏分离等不变的基础上，另外扩建了一套气相加氢、丁醛缩合、液相加氢、醇 精馏分离系统，使丁醇生产能力扩大到1 2 0 0 0 0t a ，于2 0 0 0 年8 月投产。2 0 0 2 年 高压法改为低压法全部改装完成，增加丁醇年产能力4 万吨，总年产能力扩大到1 0 万吨( 柴国梁，2 0 0 6 ) ，2 0 0 3 年吉化公司继续改扩建，使丁辛醇总生产能力达2 4 0 0 0 0 t a ，于2 0 0 4 年9 月底投产，现装置在满负荷运行。 “十五”期间，中石化扬子石化公司与德国b a s f 公司合资在南京建设1 0 00 0 0 t a 丁醇生产装置，2 0 0 5 年6 正式投入商业运营，新建的丁醇装置推进我国丁醇生 产能力( 程佳，2 0 0 7 ) 。 1 3 2 国内外丁醇生产能力情况 9 0 年代全球丁醇生产主要集中在美国、欧洲、同本等地，主要生产商有美国塞 拉尼斯、伊士曼、陶氏化学，德国巴斯夫，日本三菱化学公司、协和油化学公司等。 1 9 9 0 年全世界丁醇生产能力约为2 1 0 万吨，1 9 9 8 为21 5 万吨，2 0 0 2 年达到24 9 万吨，年均增长4 左右。美国1 9 8 8 年正丁醇产量为5 4 2 万吨，比1 9 8 0 年增长5 2 ， 8 年间年平均增长速度为5 4 。比1 9 8 3 年增长3 0 6 ，5 年间年均增长速度分别为 5 5 。1 9 9 3 年消费量达到5 0 1 万吨。日本的丁醇产量增长较为缓慢，1 9 8 8 年为2 7 6 万吨，比1 9 8 0 年增长2 4 ，8 年间年平均增长速度只有2 8 。 近年，全球丁醇生产能力增长迅速，1 9 9 8 年全球生产能力为21 5 万t a ，2 0 0 2 年 为24 9 万t a ，年均增长4 左右。全球有5 家丁醇生产能力超过2 0 万t a ，有1 3 家工厂生产能力超过1 0 万t a ，位于美国路易斯安那州的陶氏化学是目前世界上丁 醇生产能力最大的企业，其生产能力为2 7 2k t a 。 2 0 0 5 年全球丁醇生产装置集中在美国、欧洲( 主要是德国) 、日本、韩国、东南 9 芦中农业人学2 0 0 9 届坝f j 学位论义 亚和中国。2 0 0 5 年，国外丁醇的总生产能力为3 2 3 7 万t a ，其中美国是最大的丁 醇生产国，其次是西欧和f 1 本，其生产能力分别为1 2 9 4 8 万t a 、1 0 6 8 2 万t a 和 2 9 1 3 万t a ( 程佳，2 0 0 7 ) 。 近年来我国丁醇生产基本保持稳定，石油化工路法丌工负荷很高，都在9 0 以 上。只有几家粮食发酵法在维持生产( 沈佩芝和任诚，2 0 0 5 ) 。随着我国丁醇生产能 力的不断扩大，产量也在相应的不断增加。近几年我国的生产情况为：1 9 9 4 年丁醇 产量仅为7 9 5 万t a ，1 9 9 9 年产量为8 7 7 万t a ，2 0 0 0 年增加到1 1 9 3 万t a ，2 0 0 2 年进一步增加到1 7 4 2 万t a 。2 0 0 3 年产量突破2 0 万吨大关，总共为2 0 0 4 万t a ； 2 0 0 4 年产量又增长了3 9 2 个百分点。1 9 9 8 2 0 0 4 年间国内丁醇产量年均增长率为 1 1 3 9 ，目前国内丁醇生产能力占全球总能力的5 2 ( 田凤和梁云龙，2 0 0 4 ) 。 1 3 3 国内外丁醇消费情况 我国丁醇最主要的消费领域为化学工业，约占丁醇总消费量的7 5 ，其中以增 塑剂为主，其次为醋酸丁酯、丙烯酸丁酯( f f l 风和梁云龙，2 0 0 4 ) 。丁醇用于生产增 塑剂d b p 的量占其消费总量的3 0 以上，醋酸丁酯、丙烯酸丁酯分别占我国丁醇 消费总量的3 2 7 、1 5 3 ( 田凤和梁云龙，2 0 0 4 ) 。 医药工业也是消费丁醇较多的领域，主要用于生产维生素、抗生素、激素等药 物。近几年我国医药市场供大于求，市场竞争激烈。同时加上进口药品对国内市场 将造成一定的冲击，因此医药方面对对丁醇的需求量不会出现太大的增长。 国外与我国正丁醇消费构成有所不同，国外丁醇在丙烯酸酯类的消耗上所占比 重较大( 田凤和梁云龙，2 0 0 4 ) 。1 9 8 8 年全世界丁醇消费在2 1 0 万吨以上。其中， 美国丁醇的消费量为4 6 1 万吨；西欧4 0 0 万吨；同本1 3 4 万吨。1 9 8 8 年西欧地区 丁醇消费量比1 9 8 3 年增长3 3 ，5 年间平均增长速度为5 9 ，到1 9 9 3 年消费量达 到了4 3 o 万吨( 刑焱，1 9 9 5 ) 。美国j 下丁醇应用较为广泛。在美国的正丁醇消费中， 甲基丙烯酸丁酚和丙烯酸丁醋用占4 6 ，乙二醇醚类用占2 5 ，醋酸丁酷用占1 5 ， 直接溶剂用占7 ，增塑剂用占2 ，其他用占( 含氨基树脂和丁胺) 5 ( 何坤荣， 2 0 0 3 ) 。欧洲的丁醇消费主要集中在溶剂及丙烯酸酯两方面，分别占总消费总量的 3 2 8 和2 5 3 ；日本丁醇消费相对分散，其中丙烯酸酯占用3 9 2 、溶剂占用1 8 、醋酸酯占用1 7 1 、乙二醇醚占用1 4 7 ( 田凤和梁云龙，2 0 0 4 ) 。 l o 一株肉酮丁醇梭菌商产丁醇培养壮条件优化 1 3 4 我国丁醇进口情况 近年来虽然我国丁醇的产量有很大提高，但仍然不能满足国内实际生产的需求， 需要大量进口，且进口量已经占到国内总消费量的约6 0 ，在进口丁醇的同时，还 有不少丁醇的下游产品供应不足需要大量进口。近几年我国进口丁醇的情况为： 1 9 9 9 年的进口量为2 3 1 6 万t a ，2 0 0 0 年的为2 6 3 3 万t a ，2 0 0 1 年为3 0 8 2 万t a ， 2 0 0 2 年的为3 6 5 8 万t a ，到2 0 0 3 年丁醇净进口突破4 0 万吨大关，实为4 1 5 6 万 t a ；2 0 0 4 年进口量又增长了5 3 5 。1 9 9 4 2 0 0 0 年间丁醇进口量年均增长率为2 0 1 7 ；1 9 9 6 2 0 0 2 年间丁醇进口量年均增长率达1 9 2 0 。1 9 9 6 年丁醇净进口量年增 长率超过5 0 ，达5 3 8 1 ；1 9 9 9 年丁醇净进口量年增长率超过5 0 ，达5 2 2 0 。 1 9 9 7 2 0 0 3 年间丁醇净进口量年均增长率达2 3 1 3 。1 9 9 8 - 2 0 0 4 年间丁醇净进口 量年均增长率达1 9 5 3 ( 柴国梁，2 0 0 6 ) 。 2 0 0 5 年，全球丁醇的总生产能力为3 5 3 1 万t a ，我国丁醇总生产能力为2 9 4 0 万t a ，表观消费量为6 9 万吨，预计2 0 1 0 年国内丁醇需求量将达到9 7 2 万吨( 程 佳，2 0 0 7 ) 。上述资料表明我国丁醇自产率严重不足，国内市场供不应求，使得我国 成为世界上最大的丁醇进口国，因而丁醇工业在我国发展前景十分广阔。 1 3 5 国内外的研究情况 目前，国内外丁醇的生产主要通过石油化工合成获得，大多是采用丁辛醇联产 技术丙烯羰基合成法。近年来随着全球石油资源的逐步减少，导致原油价格的 持续上涨，通过石油化工方法生产丁醇、丙酮的成本大大提高，这就给生物发酵法 生产丙酮、丁醇带来了新的机遇。但由于丙酮丁醇发酵生产中还存有一些不利因素， 使得目前此法尚不能完全取代化工法。其中主要问题为：原料成本较高且转化率低， 溶剂产量低，生产强度不高，发酵后处理复杂等。为了解决上述问题，使得发酵法 在经济上能与石油化工法相竞争，自上世纪六十年代以来，世界各国研究工作者在 菌种改造、发酵原料、代谢途径、产物分离等方面进行了大量研究( e je ta 1 ，2 0 0 2 ) ， 我国工作者也对丙酮丁醇发酵进行了一系列探索。1 9 5 9 年中科院微生物研究所在 微生物学通讯中发表了我国关于丙酮丁醇发酵研究的第一篇学术论文，1 9 8 5 年孙志浩、焦瑞生发表了关于丙酮丁醇连续发酵研究和生产的学术论文，1 9 9 3 徐家 华中农业人学2 0 0 9 届硕i j 学位论文 芳、陆祖祺等发表了固定化细胞连续生产丙酮的研究( 范力敏，1 9 9 3 ) 。1 9 9 6 年中 科院上海植物生理研究所成功筛选出一株高丁醇比丙酮丁醇梭菌，总溶剂为2 0g l ， 其中丁醇稳定在7 1 9g l ( 张益桑等，1 9 9 6 ) 。1 9 9 8 年华中农业大学陈守文等人进 行了利用纤维质原料发酵生产丙酮丁醇的研究( 陈守文等，1 9 9 8 ) ，2 0 0 7 年李冬敏、 陈洪章研究了汽爆秸秆膜循环酶解耦合法丙酮丁醇发酵技术( 李冬敏和陈洪章， 2 0 0 7 ) 。虽然在一些方面取得了成果，但是总体来讲我国在这一领域的研究还是较少， 而且研究不够深入。随着基因工程技术和代谢工程的发展，国外一些科研工作者已 经在基因水平对丙酮丁醇发酵