（蔬菜学专业论文）小麦酯酶农药速测卡的研制和应用.pdf

小麦酯酶农药速测卡的研制和应用 摘要 检测有机磷农药残留量的方法主要有：色谱法、光谱法、酶抑制法、 免疫法和化学发光法等。其中酶抑制法以其快速、简易、灵敏度高等优点， 在检测过程中发挥着越来越重要的作用。本试验根据酶抑制法原理，在底 物筛选和小麦酯酶纯化的基础上，对农药速测卡进行试探性的研制，并对 速测卡的使用方法、使用范围以及存在的问题进行分析，取得以下结果： 1 2 6 一二氯靛酚乙酸酯和固兰8 盐都可以作为酶抑制法的底物，因为 它们都可以在小麦酯酶的催化作用下直接或间接地发生显色反应。但是， 相比而言，2 6 一二氯靛酚乙酸酯作为底物更具有优越性，主要表现在：第 一、底物和生成物都具有良好的稳定性，不易分解而影响检测结果的准确 性；第二、酶促反应条件比较合理，最适酶促反应温度为3 5 c ，最适p h = 7 0 ，两者都在正常范围内，而不是太高或太低；第三、定量检测主要是利 用抑制率与农药浓度对数值的线性关系来检测残留量，相关系数越大，表 示检测值越接近实际值。2 6 一二氯靛酚乙酸酪为底物时，r 2 = 0 9 9 11 ，要 远远大于以固兰b 盐为底物时的r 2 ；最后，用添加农药法测定的回收率高， 表明2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯为底物时，检测限更小。 2 酶活性的高低是关系检测方法灵敏度和稳定性的关键因素之一。本 试验采用d e a e - - 5 2 离子交换层析法对小麦酯酶进行分离纯化。结果表明： 同样重的干纯化酶粉和干原酶粉相比，前者蛋白质含量较高，约是后者的 2 8 6 倍；并且纯化后酶活性与原酶活性相比提高了近1 倍。 3 本试验采用先浸泡，再真空低温干燥，最后粘贴的方法对农药速测 卡进行了试探性的研制，并对速测卡的灵敏度进行了鉴定。结果表明，此 速测卡的灵敏度并不高，其原因可能在于酶活性偏低，或研制过程中酶活 性丧失严重。因此，仍需探索更优良的酶纯化方法和更完善的速测卡研制 技术。 关键词：小麦酯酶农药速测卡 d e a e - - 5 2 离子交换层析法 酶抑制法2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯 分离纯化抑制率检测灵敏度 d e v eio p m e n ta n da p plic a tio no faw h e a t e s t e r a s ep a p e rf o r d e t e r m i n i n gp e s t i c i d er e s i d u e s a b s t r a c t m a n yb i o l o g i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d sa r eu s e dt od e t e r m i n eo r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e sr e s i d u e s i nf r u i t sa n dv e g e t a b l e s s u c ha sc h r o m a t o g r a p y , s p e c t r o m e t r y , e n 巧m ei n h i b i t i o n ，i m m u n o a s s a ya n dc h e m i c a ll u m i n a r ya n ds o o n b u te n z y m e i n h i b i t i o ni sp l a y i n gv e r yi m p o r t a n tr o l ei nd e t e r m i n i n gp r o c e s s ，b e c a u s eo fa d v a n t a g e s o fr a p i d n e s s ，s i m p l i c i t ya n dh i g h e rs e n s i t i v i t y a c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l eo fe n z y m e i n h i b i t i o n ，t h i se x p e r i m e n tc o m p a r e da d v a n t a g e sb e t w e e nt h e s et w os u b s t r a t e s ，a n d p u r i f i e dw h e a te s t e r a s ew i t ht h em e t h o do fi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , a n dt r i e dt o d e v e l o pr a p i dt e s tp a p e r b e s i d e s ，i ta l s oe x p l a i n e da n dd i s c u s s e dm a n yq u e s t i o n sw h i c h w e r ef o u n di nt h ep r o c e s so fu s i n gr a p i dt e s tp a p e lt h er e s u l t sw e r ed e s c r i b e da s b e l l o w ： 1 2 , 6 d i c h i o r o b e n z e n n o n e i n d o p h e n y l a c e t a t ea n d f a s tb l u ebs a l ta r et w ok i n d so f c o m m o ns u b s t r a t e si ne n z y m ei n h i b i t i o n ，b o t ho fw h i c hc o u l dp r o d u c tc o l o r i n gr e a c t i o n a tt h ef u n c t i o no fw h e a te s t e r a s e b u t ，t h e r e s u l tc o n f i r m e d t h a t 2 6 - d i c h l o r o b e n z e n o n e - i n d o p h e n y - l a c e t a t ei sb e t t e ru s e da ss u b s t r a t e st h a nf a s tb l u eb s a l t ，t h em a i na d v a n t a g e si n c l u d e ：f i r s t l y , s u b s t r a t ea n dp r o d u c th a v ef i n e rs t a b i l i t y ； s e c o n d l y ，t h er e a c t i o nc o n d i t i o no fw h e a te s t e r a s ei sm o r eo p t i o n a la n dr e a s o n a b l e ，t h e m o s to p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp ha r e3 5 ca n d7 0r e s p e c t i v e l y , s oi ti se a s yt oc o n t r o l r e a c t i o nc o n d i t i o n t h i r d l y , c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tf r o mr e g r e s s i o ne q u a t i o n sr e f l e c t st h e a c c u r a c yo ft h em e t h o d f i n a l l y , h i g h e rr e c o v e r y r a t ew i t ht h em e t h o do fa d d i n g p e s t i c i d e ，i tr e f l e c t e dt h a tt h em e t h o dw i t h2 , 6 - d i c h l o r o - b e n z e n n o n e - i n d o p h e n y - l a c e r a t e a si t ss n b s t r a t eh a sl o w e rl i m i to fd e t e c t i o n 2 e n z y m ea c t i v i t yi so n eo ft h em o s tk e yf a c t o r sw h i c ha r er e l a t e dw i t hs e n s i t i v i t y a n ds t a b i l i t yo fm e t h o d s t h ea r t i c l ep u r i f i e dw h e a te s t e r a s ew i t ht h em e t h o do f d e a e 一5 2i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l ts h o w e dt h ep r o t e i nc o n t e n to f p u r i f i e de s t e r a s ew a s2 8 6m o r et h a np r i m a r ye s t e r a s e m o r e o v e bt h ea c t i v i t yo f e s t e r a s e w a si m p m v e db yp u r i f i c a t i o n 3 t h i se x p e r i m e n tu s e dt h em e t h o do fi m m e r s i n ga n dv a c u u m d e h y d r a t i n ga tl o w e r t e m p e r a t u r et od e v e l o pr a p i dt e s tp a p e r t h er e s u l tr e f l e c t e dt h a tt h es e n s i t i v i t yo fp a p e r w a s l o w , m a y b eb e c a u s et h ea c t i v i t yo fe n z y m ei st o ol o w , o rl o t so fe n z y m ew a sl o s s i n t h ep r o c e s so fm a l i n g t h e r e f o r e ，i ti sn e e dt os e a r c hf o rn e w e rw a y st oi m p r o v ee n z y m e a c t i v i t ya n db e t t e rs c h e m et od e v e l o pr a p i dt e s tp a p e r k e yw o r d s ：w h e a te s t e r a s e r a p i dt e s tp a p e re n z y m ei n h i b i t i o n 2 , 6 d i c h l o r o - b e n z e n o n e - i n d o p h e n y l a c e t a t e p u r i f i c a t i o n d e a e - 5 2i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yi n h i b i t i o nr a t e s e n s i t i v i t y 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 0 m 加沙一7 年6 月 f 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 囱即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：l ，袅另导师 6 a | f i 广冒失尊嘎士馨位嚷r 文小麦i l 农苟遗潮卡的司喇和矗【用 前言 1 有机磷农药的特性 有机磷农药( 0 r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ，o p s ) 是含c p 、c o p 、c s p 或c n p 键的有机化合物，正式商品有几十种，如对硫磷、氧乐果、敌敌畏、马拉硫 磷、辛硫磷、甲拌磷、久效磷、甲胺磷、敌百虫、乐果、甲基1 6 0 5 、谷硫磷等。它从 4 0 年代到7 0 年代得到飞速发展，目前在世界各地被广泛使用，有1 4 0 多种化合物正在 或曾被用作农药，其突出优点在于，它可以通过改变磷原子上的取代基和基团之间的相 互搭配，来找寻具有各种可贵生物活性的化合物。它作为杀虫剂的特性可概括为如下 几个方面“3 ： ( 1 ) 化学性质不稳定。易水解，在碱性条件下易分解，因而不宜和碱性物质混合； 易氧化，热分解，易于在自然环境中或动植物体内降解，在高等动物体内无累积毒性。 正确使用时残留问题小，不致污染环境。 ( 2 ) 对害虫高效( 毒力高于有机氯杀虫剂) ，广谱。作用方式多样，如触杀、胃毒、 熏蒸，不少品种为内吸杀虫剂。许多品种同时又是杀螨剂。 ( 3 ) 化学结构变化无穷，品种多，适用范围广。如敌敌畏、辛硫磷持效期短，适 用于随时收获的蔬菜、茶叶、桑叶等；甲拌磷、二嗪磷持效期长，适合作种子处理或防 治地下害虫。 ( 4 ) 毒性差异大。辛硫磷、马拉硫磷、敌百虫等毒性很低，而对硫磷、甲拌磷为 剧毒。总的来说，有机磷杀虫剂的毒性偏高。但高毒品种在逐步淘汰，低毒品种不断涌 现。此外，对有机磷杀虫剂引起的急性中毒有特效的解毒药( 如解磷定和阿托品) 。 ( 5 ) 除少数品种外( 如敌百虫，敌敌畏对高梁、瓜类敏感) ，一般对作物安全，在 推荐剂量百不致发生药害。 ( 6 ) 和有机氧，特别是和拟除虫菊酯类杀虫剂相比，害虫对有机磷杀虫剂的抗药 性发展缓慢。 2 有机磷农药的作用机理 有机磷农药是种神经毒剂，它能够与神经系统内乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 或胆碱酯 酶c c h e ) 的活性中心丝氨酸残基结合，不可逆地抑制酶的活性( 式i ) ，当昆虫接 触农药后在神经末梢突触处产生的乙酰胆碱不得分解( 式2 ) 使神经传导一直处于过渡 ，1 可，o 曾渑士掌位截废小麦旨，农药建潮卡的习h 两和应用 兴奋和紊乱状态，以至麻痹衰竭失去知觉而死亡。氨基甲酸酯类农药作用机理和有机磷 农药的作用机理相似，不同的是有机磷农药产生的是不可逆的抑制，而氨基甲酸酯类农 药的抑制作用是可逆的。长期使用这两种农药，不仅对哺乳动物、蚕、蜜蜂、水生生物、 害虫天敌等多种益虫有影响，而且对人神经系统亦有影响，轻则可引起头痛、恶心、呕 吐；重则导致肌肉乏力、呼吸困难、接触过多甚至会引起死亡啪。 产卢 ( 白砖o ) 厂r f韵e 一 ( q h 7 0 ) 广p o e ( 有机磷农劫( 劲楗e r r a t a )( 磷酰化的乙酰胆碱醑酶，无活性) ( 式1 ) 产。 喝b 篡需筹硎5 + 珏。嫂蛳3 嚣啦咖+ m 啦。h 演2 ( 乙酰胆碱) + 强o ( 胆碱) + 。埔。地u n 3 国内外检测有机磷农药残留的方法 农药残留指一部分农药由于其很强的化学稳定性，施用后不易分解，仍有部分或大 部分残留在土壤中、作物上以及其它环境中。这些残留农药在食物上达到一定浓度( 郎 最低残留量) ，人或其它高等动物长期迸食这些食物，就会使农药在体内积累起来，引 起慢性中毒，这就是农药的残留毒性，亦称残毒。农药残毒所造成的污染包括对环境， 对自然界各类动物，对食品和对人体的污染。 施用农药后药剂对作物的直接污染，作物对污染环境中农药的吸收以及农药通过生 物富集与食物链转移到生物体内，这些是农药残毒的三个主要来源。它与环境的安全、 自然界的正常循环和人体的健康密切相关。因此，开展对农药残毒的检测自农药广泛应 用以来从未中止过，而且各种各样的检测方法应运而生。目前，根据有机磷农药的物理 化学性质和生物学特性，对其检测的方法主要有：色谱法、光谱法、酶抑制法、免疫学 法、化学放光技术等方法“。 ( 1 ) 色谱法( c h r o m a t o g r a p y ) 美、日、欧洲等发达国家大多采用色谱法对蔬菜中农药残留进行多组份同时测定， 因为在这些国家蔬菜生产主要以大规模的集约化生产为主，生产过程管理严格，违禁使 用农药现象较少，而且果蔬流通模式是先经储藏、加工后再分销各地，其间有充裕的时 间进行抽样检测，因而多采用色谱法。色谱法具有精密度高、检测限低等优点。但是在 我国色谱法很难广泛推广，一方面是因为色谱法通常需要昂贵的仪器和专业技术人员， 而且检测成本高；另一方面，我国属于小农经济，生产规模小，分散经营，市场小而散， 难以规范管理，蔬菜产销方式多为即采即售，所以应该根据实际情况建立健全与之相适 2 小童碡审满追涮卡的习p 劓和矗用 应的农药残留检测方法。 色谱法是一类分离分析方法，它根据分析物质在固定相和流动相之间的分配系数的 不同达到分离目的，并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号( 电压、电流等) ， 然后送到记录仪记录下来的方法。目前应用于检测有机磷农药残留的色谱法主要有薄层 色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。 薄层色谱法( t h i nl a y e rc h r 鲫a t o g r a p h y ，t l c ) 薄层色谱法是一种较成熟的、应用也较广的微量快速检测方法，先用适宜的溶剂提 取有机磷农药，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，显色后与标准有机磷农药进 行比较来定性测定，用薄层扫描仪进行定量测定，检出限达0 1 o 0 1ug 。由于样品中 农残成份复杂，有机磷农药含量较低，为此，国内外针对该方法的不同实验步骤，如提 取方法、纯化、浓缩方法、薄层板的吸附剂种类、展开剂的配制、展丌方式( 如单向和 双向展开) 以及显色方法都作了深入的研究和改进。s h e r m a j “”用c 。柱固相萃取水中 的有机磷农药。v a h k e v i c h0 v ”3 用酶抑制显色的高效薄层色谱法( i t l c ) 来检测马铃 薯中的有机磷农药残留量，检测限提高到0 o l 5 n g 。薄层色谱法与荧光显色技术结合， 对有机磷农药的检出限为o o lpg ；与酶抑制技术结合，检出限可达0 0 0 1pg 。 气帽色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 气相色谱法是检测有机磷农药的国家标准方法，该方法是利用经提取、纯化、浓缩 后的有机磷农药注入气柏色谱柱，程序升温气化后，不同的有机磷农药在固定相中分离， 经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时恻来定性，通过峰或峰面积与标 准曲线对照来定量，故具有既定性又定量、准确、灵敏度商，并且一次可以测定多种成 分的优点。a o a c 对大部份有机磷农药，如乙拌磷、丰索磷、马拉硫磷、对硫磷，在八 十年代就建立了气相色谱检测方法。我国食品理化检验国家标准方法也采用了气相色谱 检测有机磷农药残留，检出限为i n g 。郑丽丽”1 等应用氮磷检测器和毛细管气相色谱柱 测定了环境中五种痕量有机磷农药，混合样品中各组分以谱峰分辨较好，互不干扰，测 得甲胺磷最低检出浓度可达0 o l m g m l ，在保证分辨效果的前提下将分析时间缩短了 9 m i n 。张曙明”1 等以丙酮一石油醚混合溶剂提取残留农药，选用氮磷检测器和s p b 一1 7 0 1 毛细管柱，建立了同时测定中药中8 种有机磷农药残留量的前处理及其毛细管色谱测定 法，结果表明：敌百虫、敌敌畏等8 种在2 5 m i n 内有良好的分离；3 个不同浓度的标准添 加，其回收率为7 4 9 6 1 1 6 8 ，相对标准偏差为0 7 1 1 6 9 1 。其他研究“”还报道了 用凝胶渗透色谱法净化谷物、饲料中的有机磷农药残留，检出限达0 0 1 o 0 5 n g 。 3 ，1 f ，叫攀习b b 掌位论文小麦荫 翻i 农定r 追测卡的习h 哪和矗l 用 s a n n i n o “用b i o - - b e a d ss x 3 的净化方法，分析了7 个脂质性食品中3 9 种o p s 及其代谢 产物，并迸一步进行g c m s s i m 确证和定量。h o p p e r “”用g p c 净化，测定了谷物中o p s 、 o c s 及拟除虫菊酯；h o l s t e g e “”采用g p c 净化，进行4 3 种o p s 、1 7 种o c s 及1 1 种n m c s 多残 留分析。近年来毛细管气相色谱法( c g c ) 得到了不断发展和完善，使毛细管桂基本替 代了原来的填充柱，不仅提高了灵敏度、分辨率和检测速度，而且稳定性、使用寿命都 比填充柱优良。 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 高效液相色谱法是在液相柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改进而发展起 来的色谱分析方法。与g c 法相比，不仅分离效能好，灵敏度高，检测速度快，而且应用 面广。对气相色谱不能测定的如沸点太高不能气化以及对热不稳定，易裂解变质的有机 磷农药都可以用h p l c 来检测。h e n r yk r o t i c h “”等采用离线固相萃取( s p e ) 富集 高效液相色谱( h p l c ) 分离和紫外分光光度法检测，对环境水中甲基对硫磷、对硫磷和 辛硫磷3 种有机磷农药进行分析：黄聪“”等采用商效液相色谱法对克线磷检测，最低检 测限为l n g ，回收率为8 3 0 9 9 1 4 ，r s d 为2 2 6 4 3 7 。由于高效液相色谱仪价格不 菲，所以推广和普及该方法有一定的困难，但随着经济的发展，h p l c 将以其无可比拟的 优点必将在有机磷农药残留检测领域占据重要地位。 ( 2 ) 光谱法( s p e c t r o m e t r y ) 光谱法是根据有机磷农药中的某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色刺在特定 的环境下发生氧化、磺酸化、酯化、络合等化学反应产生特定波长的颜色反应来进行 定性或定量( 限量) 测定。检出限在微克级，见表l 。表l 反映的是微量化学试验法。主要 用于商品农药的鉴别试验，灵敏度不高，试验干扰因素多，含不同基团的有机磷农药的 反应也不一样，易出现假阴性。为提高灵敏度，用分光光度计等来测定有机磷农药的方 法( 即波谱法) 逐渐代替了微量化学试验。a o a c 规定了用红外光谱法检测敌敌畏、保 棉磷、甲拌磷，用分光光度法检测马拉硫磷，对硫磷等。苟中坤“”利用氟磷酸酯和氰磷 酸酯在碱性过氧化氢溶液中使鲁米诺产生冷光的原理，建立了一种简便、快速的测定方 法，对敌敌畏的检测范围为o 2 5hg ，对敌百虫、对硫磷等的检测范围在0 1 0 01 tg 。 但是，光谱法只能检测一种或具有相同基团的一类有机磷农药，灵敏度不高，一般只能 作为定性方法。 4 ，冒大茸u 曩士掌位论文小麦翻 农皇阽t 铡1 啪习h 时和矗用 表l 各种显色反应类型及灵敏度 t a b l e 1t y p e so fd i f f e r e n tc o l o rr e a c t i o na n ds e n s i t i v i t y ( 3 ) 酶抑制法( e n z y m ei n h i b i t i o n ) 当前我国主要采用酶抑制法来测定蔬菜水果中有机磷农药的残留量。根据酶抑制法 研制的各种型号的速测仪，速测卡开始走向市场。目前使用的速测仪的主要型号“”有： r p 系列( 北京产) 、c l 系列( 上海产) 、t j 系列( 山东产) 、绿t 系列( 福建产) ；速测卡 也在深圳、杭州、上海、南宁等多个城市出售。这些速测仪和速测卡在农药残留的现场 检测及大批量样品的快速检测过程中起着十分重要的作用。 酶抑制法是在有机磷农药能够抑制酶活性的基础上，通过在酶反应的过程加入底物 和显色剂来观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化“” ，从而判断有机磷农药的残留情况。在用酶抑制法测定农药残留的过程中，酶是决定 检测方法灵敏度和可靠性的最关键的因子。酶对有机磷农药的敏感度决定了方法的敏感 度，而所用酶的种类则决定方法的可靠性。 检测所用的酶有：羧酸酯酶”( 主要来源于动物的肝脏、植物等) 、丁酰胆碱酯酶 ( 主要来源于动物的血清) “、乙酰胆碱酯酶( 主要来源于昆虫头部、动物血细胞等) 和小麦酯酶( 主要来源于小麦) 。现在普遍使用的是乙酰胆碱酯酶，因为据研究其灵 敏度要高于其它几种酶。 显色反应有：乙酰胆碱水解产物为胆碱和乙酸，通过酸碱指示剂溴百里酚蓝与 乙酸反应。农药残留高时显蓝色，无残留或残留低时显黄色“； 乙酸一a 一萘酯水解产物萘酚与固兰b 盐作用可生成紫红色的偶氮化合物“”； 乙酸羟基吲哚水解产物吲哚酚自身的氧化成靛蓝而显蓝色： 靛酚乙酸酯水解产物靛酚显蓝色1 。 依据酶抑制法原理设计的农药残留的检测方法主要有试纸法( 速测卡、速测箱) 、 s 广西大肖嘲士掌位嘲： 小麦t 重i 农药追涮卡的习一和点l 帛 比色法和酶传感器法： 试纸法 将胆碱酯酶或小麦酯酶和乙酰胆碱的类似物2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯( 红 色) 分别经固定化处理后加载到滤纸上。靛酚乙酸酯在酶的作用下分解为靛酚( 蓝色) 和乙酸( 式3 ) ，反应前后有明显的颜色变化，然而当样品中存在有机磷农药时，就会抑 制酶的活性，因而反应不会进行下去。故可以通过观察反应前后颜色的变化及其变化程 度，来定性推测有机磷农药的残留情况。此法对常用有机磷农药的检测限为0 3 l o m g k g ”4 。“。 ac i 吣 鲫圳，三 o c 1 1 0 a i + h o 1 一c h ( 式3 ) 0 ( 式3 ) 0 2 ，6 一二氯靛粉乙酸酯( 红色) 靛酚( 蓝色)乙酸 比色法将蔬菜、水果提取液与胆碱酯酶或小麦酯酶作用，以碘化硫代乙酰胆 碱( a t c i ) 为底物，以二硫代二硝基苯甲酸( d t n b ) 为显色剂，经过一段时间反应后， 在4 1 0 h m 处测定其吸光值，通过吸光值的变化计算酶抑制率( 式4 ) ，从而判断有机磷农 药残留是否超标。比色法具有可靠性和灵敏度高及成本低等明显的优势，是目前使用 的主要方法。 抑制率c ，：兰警t 。 c 式。， a ，。显色前后空白溶液的吸光值的变化 a ，。显色前后样品溶液的吸光值的变化 酶传感器法生物传感器是用一种生物敏感部件( 如胆碱酯酶) 和转换器紧密配 合，对特定种类化学物质具有选择性和可逆效应的装置。生物敏感部件与特定的分析物 之间反应会产生一些物理化学信号的变化，再通过转换器转化放大、显示出来或记录下 来。研制酶传感器时，应选择活性高而其活性对农药敏感的酶作为生物传感器的酶源。 最近国外研制的胆碱酯酶生物传感器，能检测出浓度为2pg k g 的对氧磷。“。“1 。 ( 4 ) 免疫法( i m m u n o a s s a y ，i a ) 免疫就是机体接触“抗原性异物”或“异己分子”所发生的特异性生理反应。抗原 是引起机体发生免疫应答的最基本物质。但是有机磷属小分子化合物，只能作为半抗原。 如果让机体产生抗有机磷作用的抗体，就必须将有机磷分子与大分子蛋白质结合后制备 成具有抗原性的物质，再免疫动物，让动物机体产生具有特异性的抗体。抗体对相应的 小麦翻农药趣翊_ 卡的习删和应用 抗原具有识别和结合的双重功能，可与抗原选择性地结合，选择性强，灵敏度高，所以 免疫学方法是一种简便、快速、灵敏、特异的生物检测方法“1 。利用免疫学技术进行农 药残留分析自e r c e g o v i c h 和h a m m o c k 提出，国外近年来在此方向的研究较为活跃0 2 3 “， 该法测定水中的有机磷农药残留限可达0 1 l o m g l 。中国农业大学从美国引进的酶联 免疫测定技术，是通过酶联免疫吸附分析( e l i s a ) 及胶体金技术制备农药抗体，并生 产相应的农药残留现场快速检测试剂盒和试纸条1 。该方法可检钡 n g m l 级的农药残留， 检测时间一般为l o 1 5 m i n ，具有很高的特异性、敏感性与准确性。王刚垛1 等用醋酸 一锌粉一盐酸还原甲基对硫磷，制备氨基甲基对硫磷，重氮化法使氨基甲基对硫磷与牛 血清白蛋白及中国鲎血蓝蛋白偶合，合成人工抗原m 1 6 0 5 一b s a 、m 1 6 0 5 一t t hm 1 6 0 5 - b s a 免疫新西兰兔1 0 周后，双向琼脂扩散试验和间接e l i s a 检测，证明得到了高价且具有较 好特异性的多抗血清，成功地合成了甲基对硫磷人工抗原。张卫国啪1 等用同样的方法合 成了甲基对氧磷人工抗原。邓安平“”等应用阿特拉津( a t r a z i n e ) 半抗原衍生物共价交 联于载体蛋白分子上，制成免疫抗原，经免疫得到高质量的兔抗阿特拉津抗血清。并建 立了测定阿特拉津酶联吸附分析( e l i s a ) 竞争法，测定线性范围为0 0 5 5 0 0pg l ， 最低检出限仅为0 0 1 8 0 0 2 2 1 1g l ，且精密度高，特异性强。因为免疫法特异性强， 所以一种试荆盒只能检测一种有机磷，不能检测到有机磷的总量，且有机磷抗体制作过 程难度较大，所以免疫法在推广方面受到很大的限制。 ( 5 ) 化学发光技术( c h e m i c a ll u m i n a r y ，l c ) 通过化学发光( c l ) 技术进行有机磷农药残留的检测研究国内外均有报道，国内研 究者利用c l 技术和基于鲁米诺一也0 。体系与敌敌畏的反应，直接对敌敌畏进行检测，在 碱性条件下以0 0 5 m o l l c t a b 作为鲁米诺一也0 。体系检测敌敌畏的反应增强剂，选择 p h = 1 3 ，l m m o l l 鲁米诺为测定的最优条件，检测残留量低于0 1 m g k g “。r o d a “”应用流 动注射( v i a ) c l 法检测了对氧磷，三种酶( a c h e 等) 参与了反应，对氧磷的检测限为 0 7 5ug l 。与现今其它检测系统相比，该方法简单、快速，而且有更高的灵敏度和重 现性，为检测o p s 提供一种方便、可靠的分析方法。 ( 6 ) 生物传感器法( b i o s e n s o r ) 生物传感器是由分子识别元件( 酶、抗体、受体、细胞及组织器官等) 与信号转换 器( 电极，半导体、光导纤维、压电晶体及表面声波、热敏电阻等) 结合在一起的装置。 对测定有机磷农药具有灵敏、快速、一般不需对样品进行前处理，适合现场和在线监测 等优点。主要存在问题是选择性不高，虽然用抗体作分子识别元件有很高的选择性，但 7 ，1 盯大掣蛹受士掣啦能瞄 小麦翻i 农寓f 逭翱卡的訇h h 和矗e 用 制各选择性好的抗体难度较大，目前大部分工作限于以胆碱酯酶作生物活性材料，许多 有机磷农药对酶有同样的抑制作用，只能测出一类农药的总量：所用酶活性不稳定和存 在酶的失活现象，由于有机磷农药对酶的抑制是不可逆的，酶电极难以重复使用，成 本高。 ( 7 ) 其它检测方法 发展中检测有机磷农药的技术还有检测灵敏度高达n g l 级的光电比色法1 ，以及生 物芯片技术等也具有检测快速、灵敏度高的效果。 4 本论文研究的内容、目的及课题来源 ( 1 ) 研究内容 酶抑制法是在有机磷农药能够抑制酶活性的基础上，通过在酶反应过程中加入底物 和显色剂来观察颜色的变化以判断试样中有机磷农药残留是否超标。目前，酶抑制法常 用的底物有2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯和固兰8 盐与乙酸一a 一萘酯的混合物。本试验从反应 原理、底物和生成物的稳定性、不同底物时酶促反应条件、不同底物时敌敌畏对酶活性 的抑制效果，以及用添加法测定不同底物时对敌敌畏的回收率等方面分析了这两种底物 在酶抑制法应用过程中的优越性，最后选择最优越的底物作为农药速测卡研制时的底 物。 在用酶抑制法测定农药残留量的过程中，酶是决定检测灵敏度和可靠性的最关键因 子。本试验采用小麦酯酶作为研究对象，为了提高小麦酯酶的活性，采用d 队e 一纤维素 ( d e 一5 2 ) 离子交换层析对其进行部分纯化，通过比较纯化前后粗酶中蛋白质含量，以 及纯化前后酶活性的变化情况，来阐述离子交换层析对酶活性的影响。 利用动物酯酶研制的速测卡已经出现在市场中，但是较高的费用限制了农药速测卡 的使用范围。本试验采用小麦酯酶研制农药速测卡，并对其灵敏度、使用方法及存在的 问题进行分析。 ( 2 ) 研究目的 研制一种能够应用于现场检测或对大批量样品中有机磷农药或氨基甲酸酯类农药 残留量快速检测的方法。 ( 3 ) 课题来源 广西科学研究与技术开发计划课题( 桂科能：0 3 2 2 0 2 9 2 ) ；广西高校百名中青年学 科带头人资助计划项目。 8 广西，叫塾习n b 掌位髓乞 小麦曩r 农药建测卡的习喇和矗乙帛 第一章材料和方法 1 1 酶抑制法两种底物优越性的比较试验 1 1 1 材料和仪器设备 材料和试剂：2 ，6 一二氯靛酚钠盐( s i g m a 产品) ，固兰b 盐，小麦( 西农9 5 3 ) ， 乙酸一a 一萘酯，8 0 的敌敌畏乳油( d d v p ) 。 主要仪器：u v 1 7 0 0 分光光度计，冷冻离心机，| 1 1 一4 调速多用振荡器， 恒温水浴锅。 1 1 2 试验原理 固兰b 盐显色法( 方法i ) ：乙酸一a 一萘酯在小麦酯酶的催化作用下生成n 一萘 酚，它与显色剂固兰b 盐形成紫红色偶氮化合物。当样品中含有机磷农药时，酯酶活性 受到抑制，则影响乙酸一a 一萘酯水解，偶氮化合物量变少，使溶液颜色成浅红色或黄 色。 2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯法( 方法i i ) ：小麦酯酶可催化底物2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯分 解为蓝色的靛酚，反应前后颜色变化很大，容易鉴别。当样品中含有机磷农药时，酯酶 活性受到抑制，底物分解变慢或不分解，溶液为浅蓝色或不变色“”。 l i1 3 试剂的配制 1 1 3 1 小麦酯酶的提取 称取小麦粉l o g ，加入4 0 m l 的蒸馏水，先振荡3 0 m i n ，然后在4 c ，3 0 0 0 r m i n 条 件下离心l o m i n ，上清液过滤即得小麦酯酶液。”。 1 1 3 2 固兰b 盐显色基质液的配制 a 液：1 2 5 m g 固兰b 盐溶于8 0 m l 蒸馏水，振荡3 0 m i n ： b 液：l o o m g 乙酸一q 一萘酯溶于8 0 m l 无水乙醇。 使用前将a 液和b 液以9 ：l 的比例混合，即为固兰b 盐显色基质液“”。 1 1 3 32 ，6 一二氯靛酚乙酸酯的制备 取2 9 0 9 干燥的2 ，6 一二氯靛酚钠盐于锥形瓶中，加入i o m l 的乙酸酐，振荡器中振 荡2 h 。室温下静置l h 后加入6 0 9 碎冰块，1 5 h 后过滤，水洗，滤出物溶于乙醚中， 加无水硫酸钠干燥，在水浴上蒸发至约l m l ，然后加入4 倍体积的石油醚稀释。过滤， 滤液冰冻冷却后得晶体，再用乙醚石油醚重结晶一次。真空干燥，晶体避光保存。称 9 小麦荫t 嗣f 农药道翱i 卡的习p 触和应用 取所得晶体l o m g ，溶于l o m l l ，4 一二氧六环中即得l m g 札2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯显色基 质液，避光保存，备用。 l i 4 试验方法 1 1 4 1 底物的稳定性 将固兰b 盐显色基质液和2 ，6 一二氯靛酚乙酸酯显色基质液放置于4 冰箱中，观 察颜色的变化。 1 1 4 2 最大吸收波长的确定 取两支试管，均加入5 m ，p h = 7 0 的磷酸缓冲溶液和l m l 的小麦酪酶，混匀后置于 3 0 的水浴锅上保温l o m i n ，分别加入0 1 m l 固兰b 盐显色基质液和2 ，6 一二氯靛酚乙 酸酯溶液，先在5 2 0 n m 处观察吸光值的变化情况，待吸光值不发生变化时，再分别于 4 2 0 6 2 0 n m 闻进行波谱扫描。 1 1 4 3 反应温度对酶活性的影响 改变反应温度，设置梯度为2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 。小麦酯酶的用量改为0 1 m l ， 保温l o m i n 后，加入0 1 m l 的底物。方法l 于5 1 4 n m ，方法i i 于6 0 6 n m 进行时间扫描， 比较3 m i n 前后吸光值的变化情况。 1 1 4 4p h 对酶活性的影响 改变p h ，设置梯度为5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 。小麦酯酶的用 量0 1 m l ，保温时间l o m i n ，加入底物的量0 1 m l 。方法i 反应温度为3 0 ，方法i i 反 应温度为3 5 ，分别在5 1 4 n m 和6 0 6 n m 处比较3 r a i n 前后吸光值的变化情况。 1 i 4 5 酶促反应时间的确定 小麦酯酶的用量0 1 m l ，保温时间l o m i n ，加入底物的量0 1 m l 。方法i 的反应温度 3 0 ，p h = 5 5 ：方法i i 反应温度为3 5 ，p h = 7 0 。延长反应时间至lo i l l i n ，然后观察 每分钟吸光值的变化情况。 1 1 4 6d d v p 对小麦酯酶的抑制时间的确定 分别用p h = 5 5 ( 方法i ) 和7 0 ( 方法i i ) 的缓冲溶液对d d v p 进行稀释，使农药 浓度最终达0 1 豫m l 。取稀释后的d d v p 溶液5 m l ，加0 1 m l 的小麦酯酶，在o 2 5 m i n 的范围内改变d d v p 与酶作用的时间，然后加入0 1 m l 的底物进行反应。分别于5 1 4 n m 和6 0 6n l i l 处比较3 m i n 内的吸光值的变化情况。 1 1 4 7 不同浓度d d v p 对小麦酯酶活性的抑制效果 分别用p h = 5 5 ( 方法【) 和7 0 ( 方法i i ) 的磷酸缓冲溶液对d d v p 进行逐步稀释， 1 0 广西，叫鐾固仕掌位论文小麦啊 酮f 农莳追测卡的司嗍和应用 稀释倍数为1 0 3 、l o 、1 0 5 、1 0 6 、1 0 7 、1 0 8 。然后以此液代替缓冲溶液作为酶促反应的介 质，在各方法对应的条件下进行反应，比较3 m i n 前后吸光值的变化情况。同时，以缓 冲溶液作为空白。最后，以农药浓度的对数值为横坐标，以抑制率为纵坐标做线性关系 图。式5 为抑制率的计算公式1 ： 抑制率( ) = 垒警x 1 。( 式5 ) a a2 空白3 m i n 内的吸光度 a a 槔一样品3 m i n 内的吸光度 1 1 4 8 回收率( r e c o v e r yr a t e ) 的比较 以菜心为材料，于叶缘处剪成i c m 2 的小方块，取2 9 菜样两份，分别加入l o m lp h = 5 5 ( 方法i ) 和7 0 ( 方法i i ) 的磷酸缓冲溶液，静置1 5 m i n 后，取5 m l 浸提液，通 过计算抑制率测定菜样中的农药残留量( w ) 。然后以1 o p l g m l 和0 1 p g m l 的d d v p 代 替缓冲溶液浸泡菜样，用同样的方法测定浸提液中农药残留量( w i ) ，最后计算回收率。 式6 为回收率的计算公式。“： r ( ) = 警x l o 。c 删 w ，菜样中的农药残留量 w f 添加农药的浓度 w ，用d d v p 浸泡菜样后浸提液中残留量 1 2 小麦酯酶的纯化 1 2 1 材料和仪器 材料：小麦( 西农9 5 3 ) 、2 ，6 一二氯靛酚钠盐( s i g m a 产品) 、乙酸酐、聚乙二醇， 牛血清蛋白( s a n i a n d 产品) 、考马斯亮兰( s a n l a n d 产品) 、 d e a e 一纤维素5 2 ( w a d m a n 产品) 仪器：普通层析柱( 1 5 2 0 c m ) 、u v 一1 7 0 0 紫外分光光度计、冷冻干燥机 1 2 2 纯化方法及过程 1 2 2 1d e a e - 5 2 离子交换层析分离纯化小麦酯酶 离子交换层析( 1 ：o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a 曲y 简称为i e c ) 是以离子交换剂为固 定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的 】1 广西大掌习e 士掌位论文小j 衙i 玮明眵趣