（分析化学专业论文）纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用.pdf

t h ea p p l i c a t i o no fn a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l sa n de n z y m ef o rt h e c o n s t r u c t i o no fe l e c t r o c h e m i c a lb i s e n s o r s z h a n g l i b s ( i n n e rm o n g o l i au n i v e r s i t yf o rt h en a t i o n a l i t i e s ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i n t h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rz h a n g x i a o b i n g m a y , 2 0 1 1 研 集 已 留 阅 检 硕士学位论文 矗日 ：乏 在电化学生物传感器的研究中，纳米材料一直受到广大研究者的青睐。纳米 材料具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，因而具备 特殊的磁学、光学、电学和催化活性等特性，在纳米电子设备、纳米材料传感器 以及催化剂等方面得到了较广泛的应用。纳米材料巨大的比表面积能显著提高生 物活性酶的负载量，将纳米材料应用于生物传感器可以显著提高传感器的性能， 所以纳米复合材料因其自身优点及其协同效应而越来越得到人们的重视。具体研 究内容如下： ( 1 ) 以碳纳米管为载体，通过种子生长法制备了碳纳米管钯纳米颗粒复合物， 用于构建过氧化氢传感器。利用扫描电镜对碳纳米管钯纳米材料复合物的形貌进 行了表征，该纳米复合材料对过氧化氢具有良好的电化学选择性和催化特性，电 化学响应信号稳定，线性范围从l 1 0 7 m 5 1 0 之m ，检测下限为0 5 xl0 8m ( 第2 章) 。 ( 2 ) 利用微孔聚碳酸酯膜( p c ) 模板法，首次制成了具有高度有序，排列规则 的镍纳米线阵列。首先将聚碳酸酯膜( p c ) 模板固定在电极上，采用恒电位沉积法， 使镍的单体进入模板微孔中，从而制成了镍纳米线阵列电极并用于葡萄糖的检测。 利用透射电镜( t e m ) 和扫描电镜( s e m ) 对镍纳米线阵列的形貌进行了表征。镍纳米 线阵列电极具有较多的电化学活性反应位点，在+ 0 5 5v 下，0 1m 的n a o h 中 对葡萄糖具有较强的电催化能力，此外，电极具有较低的检测下限0 1g m ( s n = 3 ) ，较高的灵敏度1 0 4 3g am m 。1c m 也和较宽的线性范围，更重要的是，该电极对 葡萄糖具有很好的选择性，对共存的干扰物质如抗坏血酸和尿素无响应( 第3 章) 。 ( 3 ) 制备了一种基于羟基磷灰石壳聚糖复合体系的新型酪氨酸酶生物传感 器，并用于酚类化合物检测。利用扫描电镜( s e m ) 对羟基磷灰石的形貌进行了表 征。采用循环伏安法和电化学交流阻抗法对酪氨酸酶电化学生物传感器的性能进 行了表征。并对实验条件进行了优化，包括p h 值，电位和实验温度。该修饰电 极具有较宽的线性范围和高的灵敏度( 2 11 l0 3g am m _ 1e m - 2 ) ，响应快速，检测 下限( s i n = 3 ) 为5 1 0 母m ，该传感器对邻苯二酚、苯酚、间甲酚的米氏常数( k - 叩9 ) 分别为3 1 6 ，1 3 1 和3 5 2 。实验结果表明，该纳米材料复合膜作为酪氨酸酶良好 的载体，能够较好的保持其生物活性，表现出良好的重现性( 第4 章) 。 关键词：电化学传感器；碳纳米管；镍纳米线阵列；羟基磷灰石；酪氨酸酶 i l 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 a b s t r a c t r e s e a r c h e r sp a ym o r ea n dm o r ea t t e n t i o nt on a n o m a t e r i a l si nt h e s t u d yo f e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s w i t hu n i q u es m a l ls i z ee f f e c t ，s u r f a c ee f f e c t ，q u a n t u m s i z e e f f e c t ，m a c r o s c o p i cq u a n t u mt u n n e l i n ge f f e c t ，n a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l sa r e a t t r a c t i v ei nt h ed e v e l o p e m e n to fb i o s e n s o r sd u et ot h e i rn o v e lo p t i c a l ，e l e c t r i c a l ， e l e c t r o c a t a l y t i ca n db i o c o m p a t i b l ep r o p e r t i e s t h ep e r f o r m a n c eo ft h e r e s u l t i n g b i o s e n s o r sc o u l db eg r e a t l yi m p r o v e dw i t ht h ea p p l i c a t i o no fn a n o m a t e r i a l s t h e d e t a i l sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： c n t sr e p r e s e n tan e wk i n do fp r o m i s i n gc a r b o nm a t e r i a lo v e rt h ep a s ty e a r so w i n g t ot h eu n i q u ee l e c t r i c a lp r o p e r t i e ss u c ha sh i g hs u r f a c e - t o - v o l u m er a t i o ，h i g hc h e m i c a l s t a b i l i t y a n daf a s te l e c t r o n - t r a n s f e r r a t e w i t ht h ei n t r o d u c t i o no fp a l l a d i u m n a n o 。p a r t i c l e s ，t h ec n t s p dp a r t i c l em u l t i l a y e rf i l ms y s t e ms h o w e ds y n e r g yb e t w e e n c n t sa n dp dp a r t i c l ew i t ht h es i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n to fr e d o x a c t i v i t yd u et ot h e e x c e l l e n te l e c t r o n - t r a n s f e ra b i l i t yo fc n t sa n dp dp a r t i c l e t h ec n t s p dp a r t i c l e m o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ea l l o w e dl o wp o t e n t i a ld e t e c t i o no fh y d r o g e n p e r o x i d ew i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n df a s tr e s p o n s et i m e t h eb i o s e n s o re x h i b i t e daw i d e l i n e a rr e s p o n s et oh y d r o g e np e r o x i d er a n g i n gf r o m1xl0 。7m t o5 x10 2m w i t hah i g h s e n s i t i v i t y ，t h el i m i to fd e t e c t i o nw a sd o w nt o0 5x10 唱m ( s n = 3 ) ( i nc h a p t e r2 ) an in a n o w i r ea r r a y sw h e r ef i r s ts y n t h e s i z e db y e l e c t r o d e p o s i t i o ni nn a n o p o r e p o l y c a r b o n a t e ( p c ) m e m b r a n eh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no fg l u c o s e t h e s i z e - c o n t r o l l e da n du n i f o i t nn i n a n o w i r e a r r a y sw e r ee x a m i n e db yt r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) a n d s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) t h en i n a n o w i r e a r r a y s e l e c t r o d ee x h i b i t e da h i g h l y e l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t y f o r e l e c t r o c a t a l y t i co x i d a t i o no fg l u c o s ea t + 0 5 5vi no 1mn a o hs o l u t i o n t h en i n a n o w i r e a r r a y sn o n e n z y m a t i c e l e c t r o d eh a dm o r e a d v a n t a g e st h a ne n z y m a t i c b i o s e n s o rs u c ha sl o n g t e r ms t a b i l i t y ah i g hs e n s i t i v i t yo f10 4 3p am m 一1c m ，al o w d e t e c t i o nl i m i to fo 1p m ( b a s e do ns n = 3 ) a n dr a p i dr e s p o n s et i m e ( 1 0 s ) t h e p r o p o s e dn i n w ae l e c t r o d ea l l o w e dh i g h l ys e n s i t i v e ，s t a b l e ，a n df a s ta m p e r o m e t r i c s e n s i n go fg l u c o s e i na d d i t i o n ，i n t e r f e r e n c ef r o mt h eo x i d a t i o no fc o m m o ni n t e r f e r i n g s p e c i e s ，s u c ha sa s c o r b i ca c i da n du r i ca c i d ，w e r ee f f e c t i v e l ya v o i d e d ( i nc h a p t e r3 ) an o v e l t y r o s i n a s e e l e c t r o c h e m i c a lb i s e n s o r b a s e do n h y d r o x y a p a t i t e n a n o p a r t i c l e s c h i t o s a nn a n o c o m p o s i t eh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no f i l l 硕士学位论文 p h e n o l i cc o m p o u n d s t h es i z e - c o n t r o l l e da n du n i f o r mh y d r o x y a p a t i t en a n o p a r t i c l e s w e r ec h a r a c t e r i z e d b ys c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) t y r o s i n a s ew a s i m m o b i l i z e do n t ot h e h y d r o x y a p a t i t en a n o p a g i c l e s c h i t o s a n n a n o c o m p o s i t e m a t r i x - m o d i f e da ue l e c t r o d e c y c l i cv o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p yw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h et y r o s i n a s ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s t h e p r e p a r e dt y r o s i n a s e e l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o rw a su s e dt od e t e r m i n e p h e n o l i c c o m p o u n d sb y t h e a m p e r o m e t r i cm e t h o d a t 一0 2 v m o r e o v e r t h ee f f e c t so f t e m p e r a t u r e ，a p p l i e dp o t e n t i a la n dp ho nt h et y r o s i n a s ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r p e r f o r m a n c eh a db e e ns t u d i e d ah i g hs e n s i t i v i t yo f2 11xl0 3 肛am m 一1 c m 一2a n da r a p i dr e s p o n s et i m e ( 8 s ) ，w i t ht h el i m i to fd e t e c t i o nd o w nt o5 x10 拶m ( s i n = 3 ) t h e m i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t so ft h e t y r o s i n a s e e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rw e r e e s t i m a t e dt ob e3 5 2 ，3 16a n d1 31p mf o rm - c r e s o l ，c a t e c h o la n dp h e n o lr e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dl o n g - t e r ms t a b i l i t y ，e x c e l l e n tr e p r o d u c i b i l i t ya n d t h er e c o v e r yo ft y r o s i n a s eb i o s e n s o rw a se v a l u a t e dw i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s ( i n c h a p t e r4 ) k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r ；c a r b o nn a n o t u b e ；n in a n o w i r ea r r a y ； h y d r o x y a p a t i t e ；t y r o s i n a s e 纳米材料及生物活r 丰酶确：生物传感器中的应用 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论l 1 1 生物传感器概述1 1 1 1 生物传感器的分类2 1 1 2 生物传感器的工作原理2 1 2 电化学酶生物传感器2 1 2 1 电化学酶传感器的分类3 1 2 2 电化学酶传感器的原理4 1 2 3 电化学酶传感器的构建方法4 1 2 4 电化学酶传感器的发展阶段与趋势5 1 3 纳米材料6 1 3 1 纳米材料的分类。6 1 3 2 一维纳米材料6 1 4 本论文构思及主要研究内容9 第2 章碳纳米管钯颗粒复合体系用于构建过氧化氢生物传感器1 1 2 1 前言1 1 2 2 实验部分1 2 2 2 1 试剂和仪器1 2 2 2 2 碳纳米管处理1 2 2 2 3 金种子的制备1 2 2 2 4 电极的修饰1 2 2 3 结果与讨论1 3 2 3 1 p d n p s a u ( s e e o ) c n t s c h i t g c e 的形貌特征1 3 2 3 2 碳纳米管钯纳米颗粒复合体系修饰电极的电化学特性1 3 2 3 3 实验条件的优化1 5 2 3 4 修饰电极对过氧化氢的电化学特性1 6 2 4 小结。18 v 硕上学位论文 第3 章基于镍纳米线阵列构建的超灵敏葡萄糖生物传感器的研究1 9 3 1 前言19 3 2 实验部分2 0 3 2 1 试剂和仪器一2 0 3 2 2 镍纳米线阵列电极的制备2 0 3 3 结果与讨论2 0 3 3 1 镍纳米线阵列的形貌特征2 0 3 3 2 镍纳米线阵列修饰电极的电化学性质2 2 3 3 3 葡萄糖生物传感器的电化学性质一2 4 3 3 4 干扰研究2 6 3 3 5 重现性和稳定性2 7 3 4 小结2 7 第4 章基于羟基磷灰石纳米材料的新型酪氨酸酶传感器的研究2 8 4 1 前言2 9 4 2 实验部分2 9 4 2 1 试剂和仪器2 9 4 2 2 金电极的修饰2 9 4 3 结果与讨论3 0 4 3 1 酪氨酸酶h a p 粒子壳聚糖修饰的金电极的电化学特性3 0 4 3 2 实验条件的优化3 1 4 3 3 酚类生物传感器的电化学特性3 3 4 3 4 生物传感器的重复性、重现性和稳定性3 6 4 3 5 与其他基于酪氨酸酶的苯酚类生物传感器性能对比一3 6 4 3 6 酪氨酸酶生物传感器的回收率实验3 7 4 4 小结3 8 结论3 9 参考文献4 0 附录a 攻读学位期间所发表的学术论文目录一5 2 致谢5 3 v i 硕上学位论文 第1 章绪论 生物传感器是电化学、医学、热学、光学、生物学及电子技术等多门学科相 互交叉渗透的综合产物，具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低廉等特 点【，在工农业生产、环保、食品工业、医疗诊断等领域得到了广泛的应用【2 ，3 】。 目前生物传感器已经从化学传感器中分离出来，作为传感器的一个独立分支。成 为一种集现代生物技术与先进的电子技术于一体的高科技产物。生物传感器的研 制和开发已取得了显著的进展，在许多行业都具有潜在应用价值，并将使生物传 感器向着微型化、便携化和实用化方向发展f 4 5 】。 最近几年，生物传感器的研究工作迅速发展，而纳米技术与纳米材料的介入 为生物传感器的发展提供了无限的发展平台，为生物传感器的创新带来突破【6 】， 它们的有机结合使得更为简单、快速、准确、灵敏、低成本的检测分析成为可能。 生物传感器纳米复合材料费用成本低，利用纳米材料固定敏感膜或生物活性酶， 可重复多次使用【_ 。生物活性酶专一性好，只对特定的底物起反应，因此一般不 需要进行样品的预处理，干扰少，分析速度快，准确率高，相对误差小，操作系 统简单，容易实现自动化分析，而且纳米材料和生物活性酶的有效结合大大增强 了待测物质的信号响应值【8 】和稳定性。 i i 生物传感器概述 1 1 1 生物传感器的分类 生物传感器研究始于2 0 世纪6 0 年代初，生物传感器主要有两种分类法，即 分子识别元件分类法和转换器件分类法1 9 j 。根据分子识别元件的不同可以将生物 传感器分为七大类：免疫传感器、酶传感器、组织传感器、基因传感器、细胞传 感器、微生物传感器【l 叫( 图1 1 ) ；按转换器件分类，生物传感器则可分为：电化学 生物传感器、光化学生物传感器、热生物传感器、声生物传感器、半导体生物传 感器等【1 1 1 。电化学生物传感器【1 2 】( e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ) 是最早问世的生物 传感器，它以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，以电位、 电流或者电容为特征检测信号，在生物传感器中占有重要的位置。自从2 0 世纪 6 0 年代酶电极问世以来，生物传感器获得了巨大的发展，已成为酶分析法的一个 日益重要的组成部分。特别是最近几年来，电化学生物传感器的研究工作取得了 巨大的进步，其性能和类型也得到了很大的发展1 7 , 1 3 】。 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 酶传感器 固定化酶 固定化微生物r 三荔磊； 固定化惋体抗原! 磊互鬲磊磊磊f 一识别元件卜一免疫传感器 基因传感器 固定化寡 链核苷酸 生物组织切片 固定细胞、f 百五赢 图1 1 生物传感器分类 1 1 2 生物传感器的工作原理 生物传感器( b i o s e n s o r ) 是利用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器 ( 即信号传导器) 所构成的分析检测系统【l4 1 ，生物传感器由敏感元件和信号传导 器组成【l ”。生物敏感元件有：生物体、组织细胞器、细胞膜、微生物细胞、酶、 感受器、核酸、抗体、有机分子等【l6 1 。t u r n e r 教授将它简化定义为：生物传感器 是一种精致的分析器件，它将一种生物或生物衍生的敏感元件与理化换能器相结 合，从而产生连续或间断的数字电信号， 个生物传感器便是一个独立的集成器件， 信号响应强度与被分析物成比例17 1 。一 它能够通过与换能器元件保持有直接接 触的生物识别成分，产生特定的分析信息。生物传感器一般由敏感膜( 其微观环境 仍可以认为是膜形式，所以膜的含义在这里是广义的) 、换能器和信号处理器三部 分组成【l 引。生物传感器工作原理是：生物敏感膜内含有能与目标物进行选择性作 用的生物活性组分，通过信息转化器，并将其转化为可检测的物理电信号，经过 信号处理器获得相关信息( 图1 2 ) 。 1 2 电化学酶生物传感器 生物活性酶是一类具有生物催化活性的蛋白质，对特定的底物具有高效的催 化转化能力。酶不仅具有催化反应、加快反应速度的作用，而且还具有高度的专 一性( 特异性选择) 。正是由于这些特点和性能，使其被非常广泛的应用于各类 化学分析上【19 1 。在1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s t 2 0 1 首次提出了葡萄糖生物传感器的原 硕上学位论文 生物敏感元件 电脑 图1 2 电化学生物传感器的原理图 理，他们预示了用一薄层葡萄糖氧化酶覆盖在氧电极表面，可以实现检测葡萄糖 的目的；1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 利用该原理，成功的将含有葡萄糖氧化酶的聚 丙烯酰胺凝胶膜固定到氧电极上制备了第一支葡萄糖传感器，开创了电化学酶生 物传感器的历史【2 1 1 。此后，酶传感器越来越引起广大科研工作者的重视，得到了 迅速发展。目前，因为酶传感器具有高度的专一性( 特异性选择) ，能够对待测 物质做出快速、准确的响应，而得到临床的广泛应用【2 2 1 。 1 2 1 电化学酶传感器的分类 按照经典的分类方式，电化学酶生物传感器可分为电位型酶传感器、电流型 酶传感器和电导型酶传感器三种。电流型酶传感器是利用修饰在电极表面的生物 活性酶对待测底物进行专一性的催化氧化或还原作用，从而记录电极上酶促反应 产生的电流信号，建立输出电流大小与待测物浓度之间的关系，利用能获得电流 信号转换的检测装置获取相应的电信号【2 3 , 2 4 j 。电位型传感器是指酶电极与参比电 极间输出的电位信号，固定到电极表面的酶对待测底物催化氧化或还原，产生离 子型物质，能引起指示电极电位改变( 即酶电极与参比电极间输出的电位信号) ， 电位变化关系遵循n e r n s t 方程【2 纠。电导型传感器是利用在酶促反应中，体系反应 前后电荷的改变引起的电导的改变。根据电导的改变值与生物活性酶的关系，即 可测定待测底物的浓度。电流型传感器与电位型传感器相比较具有更简单、直观 的优点1 26 。电流型酶传感器是生物传感器领域中研究较多，且灵敏度较高的一类 电化学生物传感器，它基于酶化学反应和异相电子转移反应，在恒定电位的条件 下，电流型酶传感器的反应过程是按照相应的反应机理进行的【2 。7 1 。 咽一；l 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 1 2 2 电化学酶传感器的原理 电化学酶传感器由信号转换器和生物敏感分子两部分组成【2 引。固定化生物活 性酶具有高度的专一性( 特异性选择) ，可以选择性识别被待测物质，从而发生 酶促反应，产生化学响应信号；信号转换器将化学信号转变为电信号，从而达到 检测的目的。信号转换器即基础电极可采用金属电极( 金电极、铂电极等) 、碳质 电极( 玻碳电极、碳糊电极等) 及自制的修饰电极【2 9 1 。当修饰了敏感酶膜的电极 浸入到含有待测底物的被测溶液中，待测底物进入酶膜内部参与化学反应，大部 分酶反应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性 物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定1 3 0 。优秀的酶传感器具有选择性 好、灵敏、分析速度快等特点，此外重现性和稳定性也尤其重要。在酶固定化技 术上首先要满足保持生物酶的良好生物活性，进而才可以获得较高的灵敏度及保 持酶的高度选择性，以达到良好的抗干扰能力【3 1 1 。 1 2 3 电化学酶传感器的构建方法 科研工作者针对生物传感器的界面固定方法展开了大量的研究，如何简单， 有效的固定生物活性酶在电极表面，形成稳定的、高活性的生物活性敏感膜，对 电化学酶传感器的发展至关重要。目前，常用的活性酶的固定化方法主要有以下 硕1 ：学位论文 其他化学试剂，也不需要采取活化、清洗等步骤，因而能最大限度地保持酶的生 物活性。吸附法主要包括静电吸附法【4 6 】和物理吸附法【4 7 】等。即将含有酶的溶液修 饰在电极表面，溶剂自然挥发、室温干燥。该方法简单，操作条件温和，但由于 生物分子与固体界面结合能力弱，易渗漏，从而导致稳定性差1 4 引。 1 2 4 电化学酶传感器的发展阶段与趋势 电流型酶传感器的构建主要经历了三个发展阶段，第一代酶生物传感器1 4 9 j 是以酶的天然介体氧作为媒介体的，第二代酶生物传感器是基于二茂铁等人工合 成的媒介体，第三代酶生物传感器= l 5 0 , 5 1 】利用酶与电极间的直接电子转移。 第一代生物传感器是利用天然存在的氧作为媒介体，从而实现生物活性酶与 电极之间的电子传递。响应信号与氧的分压或溶氧关系很大，利用的是生成的过 氧化氢在电极上的电氧化的输出信号来检测底物浓度，过氧化氢的测试电位比较 高，过高的电位，使得电极的选择性很差，很难排除有关物质的干扰。将酶固定 在铁氰酸盐修饰电极上制备酶传感器1 5 2 1 ，利用它对双氧水的电还原催化在较低的 电位下进行，可排除其他物质的干扰。 第二代生物传感器就是人为的加入电子媒介体来解决电子传递的问题。最初 是将电子媒介体加入到底物溶液中，目的是降低工作电位，减少干扰；目前大多 是将其修饰于电极上【5 引。固定生物活性酶方法有多种，一类是将电子媒介体吸附 【5 4 1 、电聚合于电极上【5 5 1 ，然后再固定酶上去；一类是将电子媒介体、酶同基质或 聚合物共同固定在电极上。目前用于生物传感器研究的电子媒介体可分为小分子 媒介体和高分子媒介体。小分子媒介体包括：二茂铁及其衍生物，染料类等。高 分子媒介体主要包括金属离子螯合物型高分子等1 5 引。小分子媒介体如二茂铁、铁 氰酸盐等易扩散进入溶液而流失造成传感器稳定性差，高分子媒介体则经常是将 小分子媒介体嵌入或键合到高分子载体上，进而造成慢的电子转移速率，使响应 时间延长。m u g u r u m a 等报道了将二甲基二茂铁以等离子体膜的形式沉积到修饰有 葡萄糖氧化酶的玻璃片上制备了灵敏的传感器，这种方法简单，具有较好的重现 性，能用于生物电子器件的大量制备1 5 。7 。j u 等将羧基二茂铁交联到牛血清白蛋白 上，然后同碳纳米管以及葡萄糖氧化酶一起包埋在溶胶凝胶溶液中，得到稳定的 复合膜，制备的传感器有较好的响应性能1 5 引。 第三代生物传感器为无介体传感器。利用酶与电极之间直接的电子传递，而 无需加入任何电子媒介体，操作简单，是比较理想的生物传感器，因而这一发展 方向的传感器也得到了众多科研工作者的青睐。 电化学生物传感器的三个发展阶段，体现了传感器发展的进步，尤其是第三 代生物传感器，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低等特点，能在复 杂体系中进行在线连续监测等优点，具有良好的抗干扰能力。 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 1 3 纳米材料 如何有效的将敏感膜固定在电极表面，是电化学生物传感器发展的关键，电 极表面固定化方法种类很多，在考虑生物酶活性的前提下，包埋法和物理吸附等 方法相对于共价键键合和交联法在保持生物分子活性方面有显著的优势，此外此 类方法简单易于操作，但是也存在一些问题，包埋法和物理吸附法的稳定性差， 存在生物活性分子易溶解、渗漏等缺点。因此，固定材料的研制开发就显得尤为 的重要。 纳米级结构材料简称为纳米材料( n a n o m a t e r i a l ) ，是指其结构单元的尺寸 介于1n m lo o n m 范围之间。由于它的尺寸已经接近电子的相干长度，它的 性质因为强相干所带来的自组织使得性质发生很大变化。并且，其尺度已接 近光的波长，加上其具有大表面的特殊效应，使其具有优异的磁性、光学、 导热、导电等特性，往往不同于该物质在整体状态时所表现的性质。纳米结 构是以纳米尺度的物质单元为基础按一定规律构筑或营造的一种新体系。它 。包括纳米阵列体系、介孔组装体系、薄膜嵌镶体系。纳米材料在电化学生物 传感器方面的应用越来越得到科研工作者的关注【5 9 1 。纳米材料因其具有大的 表面积、光学、磁学、催化、吸附等特性，可广泛的应用于电化学生物传感 器方面的研制。同时利用纳米材料作为生物活性酶载体，可大大提高生物活 性酶的负载量，保持活性酶的生物活性。 1 3 1 纳米材料的分类 纳米材料是纳米技术发展的一个重要组成部分，它是指三维空间尺度至少有 一维处于纳米量级( 1 1 0 0n m ) 的材料，它是由尺寸介于原子、分子和宏观体系 之间的纳米粒子所构成的新一代材料。纳米材料的分类方法繁多，按照维数可以 分为以下四类【6 0 1 ： ( 1 ) 三维材料，指的是由二维、一维和零维材料为基本单元构成的块状材料， 其空间尺寸均不在纳米尺度。 ( 2 ) 二维材料，指的是在空间尺度有一维是纳米尺度的材料，如多层膜，超 薄膜等； ( 3 ) 一维材料，指的是在空间尺度有两维处于纳米尺度的材料，如纳米线， 纳米管； ( 4 ) 零维材料，指的是指在空间三维尺度上均属于纳米尺度的材料，如原子 团簇，纳米颗粒等【6 1 1 。 1 3 2 一维纳米材料 一维纳米材料的种类众多，包括纳米带、纳米线、纳米管等。作为一维纳米 硕上学位论文 材料的成员之一，纳米线因其优异的电学、磁学、光学及力学等性能，在选择性 催化等新功能材料的开发中显示出良好的应用前景，近年来成为纳米材料研究的 孰占【6 2 1 。 j 、 v 1 9 9 1 年，日本n e c 公司的专家饭岛首次发现多壁碳纳米管【6 3 1 。碳纳米管作为 一维纳米材料，其重量轻，六边形结构连接完美，具有许多优异的力学、电学及 化学性能。近些年随着碳纳米管及纳米材料研究的深入其广阔的应用前景也不断 地展现出来。碳纳米管具有典型的层状中空结构特征，构成碳纳米管的层片之 间存在一定的夹角，碳纳米管的管身是准圆管结构，并且大多数由呈五边形 的截面所构成。管身则由六边形碳环微结构为基本单元构成，端帽部分由含 五边形的碳环组成的多边形结构，或者称为多边锥形多壁结构。是一种具有 特殊结构( 轴向尺寸为微米量级，径向尺寸为纳米量级) 的一维量子材料。 它主要由呈六边形排列的碳原子构成数层到数十层不等的同轴圆管。而且层 与层之间保持了特定的距离，约为0 3 4 n m ，其直径一般为2 2 0 n m 。由于其 独特的结构，碳纳米管的研究具有重大的理论意义和潜在的应用价值。通常 采用纳米微粒与纳米微粒复合，纳米微粒与常规块体复合及发展复合纳米薄膜， 国际上通常把这类材料称为纳米复合材料。目前，纳米组装体系和人工组装合成 的纳米结构材料越来越受到人们的关注1 6 引。 利用一维纳米材料碳纳米管和其他纳米微粒结合，利用两者有效的协同作用， 固定于电极表面，可以有效地增强复合材料的机械强度，改善电化学生物传感器 的性能。j o s h i 等报道了将单壁碳纳米管包埋在氧化还原聚合膜中用于制备电化学 生物传感器【65 1 。作者研究了两种不同的制备方法，发现将葡萄糖氧化酶同碳纳米 管一起交联在聚合膜中传感器有较好的响应性能。z h a n g 等将c n t 和甲苯胺蓝结 合起来，将碳纳米管分散在壳聚糖溶液中然后利用壳聚糖的氨基交联甲苯胺蓝， 所得复合膜明显优越于没有碳纳米管的膜【6 们。一维结构的碳纳米管和其他纳米微 粒结合，使得复合材料的性能得到了大大的改善。 羟基磷灰石( h a p ，c a 5 ( p 0 4 ) 3 ( 0 h ) ) ，是骨骼当中主要的无机成分，广泛的应 用于生物医学、骨骼再生、分娩麻醉、免疫传感器等。羟基磷灰石( h a p ) 具有优 良生物相容性和独特吸附性，生物活性，较多的吸附位点【6 7 击9 1 ，纳米结构的h a p 粒子比块状的h a p 粒子具有更高的比表面积，应用于更多的领域，例如，已有研 究证明了纳米结构的h a p 粒子已被用于制备气相传感器【7 啦7 2 j 和固定生物活性酶 【7 引，然而，单纯的h a p 粒子结构材料的易聚合性，极大的影响了它的进一步的 应用，因此如何在适宜的矩阵中分散该纳米材料具有重要的研究价值。壳聚糖是 一种天然的来自几丁质的多糖，具有良好的生物兼容性，生物降解性，低毒性， 抗感染性【7 4 】和极好的成膜性，此外，由于壳聚糖的亲水性的氨基官能团使得它能 够兼容生物大分子，能够为生物活性酶提供良好的生物相容性环境1 7 引。壳聚糖这 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 些优异的特性使其能够结合金属纳米粒子【76 1 ，碳纳米管【7 7 , 7 8 1 和离子液7 9 , 8 0 1 等用于 电化学生物传感器方面的研究。h a p 纳米粒子由水热制备法获得，构建h a p 酪 氨酸酶复合体系用于制备检测酚类的电化学生物传感器，此类型电化学生物传感 器不需要任何电子媒介，对酚类化合物具有高的灵敏度和快的响应速度。纳米材 料作为酶的固定材料，同时也作为基础电极的修饰材料，有以下优点：( 1 ) 羟基 磷灰石( h a p ) 的电学性质使得它作为一种修饰材料，在电化学反应中能够有效地 促进电子传递，提高电化学酶传感器的检测能力，降低过电位，提高电极的灵敏 度；( 2 ) 羟基磷灰石( h a p ) 大的比表面积能够提高酶的负载量，从而对传感器的性 能有所改善；( 3 ) 羟基磷灰石( h a p ) 良好的生物相容性，有利于保持酶的活性，因 而有利于提高电化学酶传感器的稳定性和延长使用寿命。 纳米线是一维纳米材料的重要组成部分。其中有序排列的纳米线阵列尤其得 到了科研工作者的重视。纳米金属材料镍【8 卜8 3 】在碱性溶液的环境下，已被用于构 建葡萄糖传感器，且其电化学性质已得到了深入全面的研究，并已提出了电极表 面的镍氧化机制涉及到n i 计坩十两种价态。最近几年，纳米线因其具有较高的比表 面积，独特的物理和化学性质而倍备受研究者的关注。镍的纳米线阵列结构以其 独特的电化学特性【8 4 , 8 5 】和三维立体空间阵列【86 】使得电化学的性能大大提高。规则 有序的纳米阵列的制备主要有两种方法：自组装法和模板法。 ( 1 ) 自组装法：是指不借助外部作用力，通过分子间作用力( 如氢键、静电 作用) 的协同作用使纳米粒子或大分子结合在一起，从而在基底表面形成纳米结 构薄膜。a s t 等人哺7 j 报道了将聚苯乙烯溶于甲苯溶液中，然后加入银纳米粒子， 超声使之分散，再取出其中部分溶液置于水面上，等甲苯蒸发后，得到有序规则 的纳米结构薄膜。t a l e b 等哺副通过自组装法得到了致密、规