（分析化学专业论文）银纳米粒子与生物大分子相互作用的研究及其分析应用.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 核酸和蛋白质是生命活动中最为重要的两类物质。核酸是遗传的物质基础， 在生物的生长、发育和繁殖等活动中具有十分重要的作用，核酸的结构直接影 响其功能，并与致癌、抗癌有关。而蛋白质几乎参与所有的生命活动，是生物 体含量最丰富的高分子物质，几乎所有的器官组织都含有蛋白质，生物体结构 越复杂其蛋白质种类和功能也越繁多。因此研究核酸和蛋自质与小分子相互作 用，建立高灵敏度、低检测限的核酸和蛋白质的定量测定方法，在新型的药物 设计、抗癌药物的药理和毒性的研究，以及临床检测等方面具有重要意义，是 当前生物分析化学研究的前沿和热点之一 本论文从寻找新的核酸和蛋白质探针，以建立灵敏的定量检测的方法出发， 以荧光和共振光散射技术为主要研究手段，同时应用吸收光谱技术，圆二色光 谱技术，表面张力测定技术，电势电泳技术，透射电子显微技术等手段进行了 机理研究和探讨。本文共四部分 论文的第一部分综述了核酸和蛋白质发光探针以及纳米粒子作为探针在生 物分析中的研究进展及分析应用。 在论文的第二部分，研究了桑色素、纳米银和核酸的相互作用采用柠檬 酸钠还原法合成了粒径大约为1 5 姗的银纳米粒子，利用新合成的银纳米粒子 与桑色素核酸体系相互作用。研究表明，桑色素纳米银能选择性的识别双螺 旋核酸中的鱼精子d n a ，当向桑色素中加入纳米银时，桑色素的荧光显著猝灭， 而核酸( f s d n a 和s h l d n a ) 的加入，又使得体系的荧光显著的增强，且荧光的增 强程度与核酸的浓度在一定范围内具有良好的线性关系，据此建立了选择性检 测鱼精予d n a 的新方法f d n a 和s m d n a 的线性范围分别为： 1 o 1 0 2 o l o 5 9 ，m l ，和4 o l o 。2 0 1 0 - 5 9 ，m l ，检出限分别为1 2 lo 1 0 9 ，m l 和1 7 1o 1 0 9 l ，并成功应用于合成样品中盎d n a 的定量测定。m o r i n - n a n o a g 与删a 的相互作用机理研究表明：m o 血1 n 粕o a g 与矗d n a 之间主要为沟槽 式结合，并存在着分子间作用力；三者相互作用形成了立方型的银纳米晶，同 时体系的微环境也发生了变化( 即极性的减小和微粘度的增大) 从而导致体系的 荧光大大增强 i i 山东大学硕士学位论文 论文的第三部分中，以阳离子表面活性剂c 俐a b 和c p b 为代表，研究了 核酸对纳米银- 阳离子表面活性剂体系的共振光散射的猝灭效应。研究发现，核 酸的加入可以使纳米银阳离子表面活性剂体系的共振光散射强度大大猝灭，由 此建立了一种测定核酸的简单、灵敏的共振光散射法。在最佳实验条件下，建 立了核酸浓度与猝灭的共振光散射强度之间的线性方程。在 n 肋0 a 脚n a c 四胜b 体系中，f d n a ，c 妇孙a 和y 砌叮a 的线性范围分别为： 4 o 1 0 t 2 0 1 0 g 陆l l ，7 0 l o 嘎1 8 x 1 0 巧咖l 和6 o 1 0 1 o 1 0 巧酌n l ，检出限 分别为2 7 1 0 枷g ，m l ，4 8 x 1o - 1 0 9 ，札和7 2 l o 1 0 9 ，m l ；在n a n o a g f d n a c p b 体系中，f d n a ，c t d n a 和y m 叮a 的线性范围分别为：1 o l o 。8 - 4 o 1 0 缶鲈n l ， 4 o x l o 。8 4 o 1 0 石g ，m l 和1 o 1 0 2 o l o 6 9 m l ，检出限分别为1 7 1 0 1 0 9 n l ， 4 8 l o 以og m l 和1 5 lo - 1 0g ，m l 。该法已应用于实际样品拟南芥中核酸的定量 测定，得到满意的结果。机理研究表明，阳离子表面活性剂可以通过静电引力 以及疏水作用与银纳米粒子和核酸发生相互作用，使得体系中纳米银的排列有 序或分散，导致了体系共振光散射强度的猝灭。另外还从表面活性剂表面张力、 紫外可见吸收光谱、圆二色光谱、体系微环境的变化等方面比较了c p b 与 c 弧似b 对体系共振光散射影响的不同。 论文的第四部分中，研究了银纳米粒子对血清蛋白质的表面荧光增强效应。 利用沉积法在石英片上制备了银岛膜，并将胶原蛋白作为银岛膜和血清蛋白质 的隔离介质，建立了灵敏的血清蛋白质的定量测定方法；研究了胶原蛋白和银 岛膜的最佳厚度、浓度和吸附时间对体系荧光强度的影响。在最佳实验条件下， 体系荧光增强的程度与血清蛋白质的浓度成线性关系，b s a 和h s a 的线性范 围分别为1 0 1 0 4 - 4 o x l 旷g m l 和1 0 1 0 7 7 0 10 5 9 ，m l ，它们的检出限( s n = 3 ) 分别为3 。6 1 0 - 9 咖l 和3 6 1 0 4 咖l 。我们认为，银岛膜通过等离子体共振增 强了入射光的能量，调整了附近荧光分子的辐射速率，增强了入射局域场，使 得附近的荧光体分子的荧光强度得到增强。 本论文的主要特点： 1 、研究发现桑色素纳米银能选择性的识别双螺旋核酸中的鱼精子d n a ， 从而建立了灵敏而简单的选择性检测鱼精子d n a 的荧光新方法，同时还通过 透射电镜、紫外吸收光谱、圆二色光谱、荧光寿命等手段探讨了体系的作用机 i i l 山东大学硕士学位论文 理，发现纳米银在桑色素和d n a 协同作用下，可以进行有序自组装成单分散 银纳米晶，且其体系的荧光增强和银纳米晶的晶型结构有关。 2 、研究发现，核酸对纳米银阳离子表面活性剂的共振光散射有明显的猝 灭作用，并已将该体系应用于实际样品拟南芥中核酸的定量测定。机理研究表 明，阳离子表面活性剂可以通过静电引力以及疏水作用与银纳米粒子和核酸发 生相互作用，使得体系中纳米银的排列有序或分散，导致了体系共振光散射强 度的猝灭本方法为核酸的定量测定提供了一个新的发光探针，本方法还具有 操作简便、快速、线性范围宽、灵敏度高等特点，成为核酸灵敏的发光测定方 法之一 3 、利用适宜厚度的胶原蛋白作为介体，研究了银纳米粒子表面荧光增强测 定血清蛋白质的新方法即在合适的入射角度下，与金属纳米粒子有一定距离 的荧光分子的荧光强度可以被明显的增强，研究了银纳米粒子对血清蛋白质体 系的荧光增强效应 关键词：银纳米粒子，核酸，蛋白质，阳离子表面活性剂，荧光，共振光 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t n u c l e i c i d s 锄dp r o t e i i 塔a 咒i n l p on a 日_ tb i o l o g ym a c r o m o l e c m 髂n u c l e i c i d sa r e t h e m a 钯r i a l b a s eo f l i f e ，m e y p l a y 姐i n l p o n a n t f o l e i n t h ea c t i o n o f g r o w c h u p g r o 毗，觚dr e l 舯d u c t i o no fo 增a n i s m t h e 托a c 0 如e c t i o nb e t 讹e nn 眦l e i c i d sc o 娟g 盯撕a n di t sf i l n 甜o n w h i c hi s 托1 8 t i o n a lt oc a r c i n o g e n i c 曲d 枷c 锄c 盯a c t i 、，i 吼p r o t e i i l s a r em o s td b u n d a n ti i io r g i s m ，锄dt h e y 撒a c h 也e 艘l v e sa l m o s tt 0a l ll 施t i o n ，t h e 咖豫c l p l e xo f o r g a n i 锄咖咖镌t b c m o r ev 砌。岫o fp r o t e i 地1 ( i n d sa n df l l i 硎。璐s oi ti so f s p e c i a lv a l 鹏t o 咖d y 吐峙 i n 把吼c 吐o no f 裁曲hm o l e c l l j 髂a n db j 咖o l e c l d e s ，小eq 咖6 枷v ea 1 1 a l y s i so f n u c l e i c i d sa n dp f o t e i 璐w i t l ll l i g hs e n s m “t ya n dl o wd e t e c t i o nl i m i ta r ei m p o r t a n ti nl i 岛 s c i e n c e ，b i o c h c m 触m 础c 锄吼d 雏a l y s i s 锄dc l i n i c a la i l a l y s i s ，砌c hi s h e i p f i l l t od e s 酒m en 州孵o f d n l g 雒d 蛐也e t 0 ) 【i c 蚵o fd n l g 砸s 州e c t i s t h cf o l 懈耐p o s i d 孤dh o tp o i n ti nb i o c h c m i c a l d b i o p h y s i c a lr e s e 甜c h e s t 1 l i st h e s i sf b c u s 也ed c v e l o p m e n to fn e wp r o b 髂f o r 删c i e i ca c i d s 缸d p r o t e i n 3 如dt 0e s t ；a b l i s hs e n s i 6 v em e i h o d sf o r 也cq u a m i t 瓶v cd 砷嘲删o no f t h 锄，1 1 s i n gm en l 丑o r e s c e n c c 锄d 托s a n c el i g h t a t 响g ( r l s ) 船t h ep r i l n a r y t c c h n i q u c t h ci 喇s i b l es p e 咖腑y c i r c l l l 缸d i c h r o i 锄( c d ) ，s l l r 缸et e n s i 呱 e l c c 们p h o r e s i sb yt v t r a n s m i s s i e l e c 呐nm i c r o s c o p yf r e m ) t c c 枷q sa r e a l 璐e dt 0s t u d yt l l em e r a c t i o nm e c l l a l l i s m t h em 如n c l u s i o n sa 船1 i s t e d 嬲 b e l o 骗c ht h e 向赋s e c t i o i i w e 鲫m m a r i z ct h e c e n td e v e l o p m e n to fl l l i n i n e s c e m p f o b e sf o r 曲c l e i c i da n dp r o t e i n 觚d 也ea i l a i y t i c a la p p l i c a t i o ，a n dc 0 姗e n t t h cb 越i c 也e o r y 缸dp r o g 糟s so f s i l v e rn 觚o p a r t i c l e si nb i o a n a l y s i s ht l l es c c o n d c t i o n s i l v 既啪o p a n i c l e sa m a d eb yc h e m i c a l 似i u c t i 、i t hs o d i 眦c i t r a t e a n dt l l e ya r em i l i 碣di n 也es n l d yo ft h ei n t e ：嘞c t i o nb e 佃，a m o r i n ，n 姐o a g 弛dn u c l e i c i d s f m mt h e 他s e 8 r c h ，w ef i n dt h a tm o r i n - m m o a g 啪 s c l e c 石v e l y 把c o 鲷i f i s hs p c n nd n a i nd o u b l e - s 缸a n d 肌c l e i c i d s w h c nn 柚o a g i sa d d e dt om o r i n t h ei n 妇s i cn u o 陀s c e n o fm o f i ni so b v i o l l s l yq 眦h e d ； h o w e v e r t h ef i u o r e s 咖c ei m e 璐i t yo fm o r i n n 柚o a gi sg 诧a t l ye n h 缸dw h e n 丘s h s p e 玎nd n a d n a ) o rs a l m o ns e n 瑚d n a ( s n l 【) n a ) 蛳a d d c dt 0t h es y s t e m b a s e do nt h j s an e wf l u o r i m e 砸cm e t h o d 白rt l l ed e t e f i l l i 船虹o no fn u c l e i ca c i d si s v 山东大学硕士学位论文 p r o p o 也u n d e ro 】m 啪mc 0 咀d i 吐。岱，也e 豇l h 蛆c e dn u o r e s c e n i n t e n s 时i s p r o p o r t i o nt ot h ec o n c e 劬眦i o f u c i e i c i 出i nt l 砖r 锄g eo f1 0 l o s 2 o 1 0 - 5 咖1 lf o rf d n 4 o x l o 2 0 l o 5g 血f o r 锄d n n 曲d e t e c d o nl i m 妇( s n = 3 ) a 糟1 2 lo 1 0 咖l ，1 7 lo 1 0 咖l ，r e s p e 曲e l y 1 k 咖d yi n d i c a 士e s 衄t h e r c 黜 掣v eb i n d i n g 雅dm o l i l l a rf o r c 髂b e 棚，e e nm o i i n ，n 姐o a g 觚df s d n 人1 ) l i ! b i c h i n d u t h ef o 咖撕o no f 小，c l j b e ，t l l es y s t c mm i c r 咖l l n l e n ti n c l u d i n gs m a u p o 枷t y 舳di a g 盯m i c r o 、，i s c o s 时i sa l c h a n g e d ，雒dt h a tl c a dt ot h ef i u o d e 警c n c e 既i h 缸吲i m to f s ，吼e m h 也e 也i r d c t i o n t h er e s 伽衄l i g b t a 士【e 痂1 9 s ) q u e n c h i n ge 彘c to f 埘c l e i c i d 加n o a g - 谢o n i c 跚匝i c t a n li ss t l l d i e 正ni sf o 咖dt h a lm l c l e i c i d s 锄 q l l e n c ht h cr l si n t e 璐i 哆o fn a n o a g 铡o n i c 酬d h c t a n ts y s 蛐，u 妇o p t i m 枷咀 c o n d i t i o 珊， t h ec a l i b m t i o n g 豫p h n 锄o a g - c 籼f d n as y s 衄n 也e r e f o rf s d n aa o b t a i n c d i l l a 坞l i l 把孤北l 撕o m 衄p sb t 峨嘞也e 舢g c 】( t c n to fr l s 孤d 血ec o n o e n 缸撕o f n u c l e i c 捌d si n 恤瑚唱eo f 4 o l o 9 2 0 1 旷g m l if o r f i s h s p 咖d n a ( f s d n a ) ，7 o l 旷1 8 l 矿g m l - 1 f o r c a l f t l 聊n u sd n a d n a ) a n d6 0 1 矿1 o l 矿gm l f o ry e a s t 鼢认o 鼢队) 髓ed c t e c l i l i m i t s ( s 虚归3 ) o ff d n c t 】孙i a 纽dy r n aa 地2 ，7 lo - ”gm l ， 4 8 x 1 0 。1 0gm l 1 趾d7 2 lo 1 0gm l - l ，f e s p e c t i v e l y bn 柚o a 哥c p b 墙d n as y s t 锄， t 1 1 e 他a r e1 i n e 盯豫l a t i o n s h i p sk 舸旧吼t h eq l l c n c h i n g 能缸to fr l sa n dt h e c o n c e n 血a t i o no fn u c l c i c i d si n 也c 瑚g co f1 o 1 0 _ 4 o 1 铲gm l - f o r 丘s h 啄煳md n a d n 砷，4 o l 矿4 o x l o 啼gm l 1 缅c a i f t l l y r n 峭d n a ( c t d n a ) a n d 1 0 x 1 0 一2 0 l o 石gm l 1f o ry e a s t 鼢弧0 r n a ) 1 kd e t e c t i o nl i l i l i t s ( s 忙3 ) o f 矗d n 气c t d n aa n dy 鼢魄a 聘1 7 l o 1 0gm l 。4 8 1o 1 7gm l 1 锄d1 5 1o 1 0g m l 1 ，豫s p e c t i v c l y t h er c s l l l t s 蠡竹n 玲d e t e m 血a l i o fd n a i na 咖a l 鲫唧l e s i l a t e d 丘d m 且r 口6 脚括腩耐砌忸a 把s a t i s f 缸t o r y t h e 组c c 哪嘶o nm e c h a n 王锄 i n v c s t i g a t i o ni n d i 咖e st h a 土c 砸o i l i c 触t a n tc 腑麒i c tw i 也s i h 惯n 粕o p 硎c l 懿缸d 蛐c l e i c i d st h r o u g he l e m s t a t i ca n dh y 出o p h o b i cf 0 d c 鹳，州c h 弛s l i l t si nw e n d i s p e 档i o no f 咖o a g 趾da 姗墨蜘i er l sq u e n c h i n go f 咖o a g - 淞b ，c p b ha 础t 王0 呜w e m p a r e n 圮d i 位鹏n i n i 也sb e t w c a 脚觚d c p bb y t l 钯d 埘q 嘴o f i v i s i b l e 驴咖m e 略妇m 盯d i c 蛐( c d ) 蛆ds u 她t 咖i 吡 l nt h cf 如n h c t i o n i ti sf o 啪dt h a tt l l en u o 地s c c ei n t e n s i 臼o f h s a c 匝b e 山东大学硕士学位论文 曲h 髓c e d t h es l l 面c c “s i l v e rn 觚o p a n i c l e ，d l i c hi sm a d ef i r s c l yb yc h 啪i c a l d e p o s i t e d t h e 锄r f i c eo fa p s 讹a t c dq m r t zs l i d e s ，锄du 辩c o n a g e np r o t e i n 船 i l a t c ：dm c d i u mo fn a l l o a ga i l da l b u m hb a s 酣o nt l l i s ，as 吼s 城v em e t h o df o rt h e q l l a 蛹t yd e t e 蒯o no f 舶l l m i ni sd e v e i o p e d u n d 盱也eo p 缸岫c o n d 谢。璐，也e a 山舡l a 耐n u o s c c ei n t 印s i t yi sp r o p o r t i o n 协t b ec o n c e m r a 虹o f a i b l 】m i n si nt b e 脚g eo f1 o 1 0 4 4 o x l o 5g 枷f o rb s 气1 0 l o 。7 - 7 o l o - 5g ，血f o rh s a ，n 睹 d 嗽吐o nl i m | 乜( 鲫忙3 ) 躺3 6 1 0 母咖l ，3 6 1 矿酌m ，托s p 。c t i v e l y 1 k m e c h a n i s ms t u d yi n d i c a t 嚣t h a ts i l v e ri s l 锄df i l ma 出a n c e s 也ee n e r g yo fi n c i d e n l i g h tb yp l a s mr e s o n a i l c e ，a n da 肖l l s t sm ec r a d i a t ev e l o c i 妙o f 饿村b yf l u o r e s c c n t m o l e c l l l e ，、j i ，：i l i c hl e a d st 0t b en u o r e s c e n c e 蜘| h 锄c e m e n to f s y s t e | n 1 1 ”c h i e f d i a r a c 钯r i s c i c so f t l l i st l l e s i sa r e 罄f o l l o w s ： 1 w e 缸dt h a tm o 血呦o a gc 粗船1 e c t i v c l yr e c o 咖丘s h 印e md n ai n d o u b l e - s 扛a n d 加c l e i c i 凼觚dp r o v i d eas i m p l ea l l ds e n s 始v en u 耐m e m cm e t l l o d 矗”t 1 ”s e l e c t i v cd e t e m d n a t i o no f f i s hs p 锄d n a 1 km e c h a i l i s mo f s y s t e mi sa l s o s n l d i c dl l s i i l gm er c s e 眦ht c c h n i q 嘲妣l u d i n gr l s ，i 、s i b l es p e c t r 锄e 略c d ， t e m ，n u o r e s c e n c el i f e 畦m ee t c 2 i ti sf o 衄dt 1 1 a tm 聆l e i ca c i d sc 眦0 _ b v i o 璐1 yq u e n c ht l l er l si 1 1 钯邙i t yo f 蛳o a g - c a d o i l i cs u 疏c t a ms y 蚰：i i l t h i ss y s i e mh 蹈b e 铋a p p l i e di n 血c d e t e n n i n a t i o no fd n ai l la c 删s 锄p l e si s o l a t e d 筋m4 砌地芦捃砌f 砌懈a n dt h e 化s t l l ti ss a t i s f a c t o 够c o m p a r e d 谢t l lo t h c rr l sm e 也o d ，t l l i s 肌t h o di s s i m p l e ， 啾b l e ，q u i c ka n d “h a sal a 唱c rl i n e a r 啪g ea n db e t i 默s e i l s i d v i 够 3 s i l v c rn a i l o p a n i c l e sh a v ea 鲫m e n h a i l c e m e n te 彘c tt 0f l u o r e ：；c e n c e ，岫 i s 诵t h 觚a p p r 叩r i a t ea i l 出eo fi n c i d e n c e ，t i l ef l u o r e s c e n c eo fn e a r b yf l u o r e s c e m m o l e c i l l ec 姐b ce 吐a n c e di ft l l e r ei s 勰a p p r o p r i a t cd e f i n i t ed i s t a i l c eb e t w e e na g i s l a n df i l m 锄dn u o r c s c e n tm o l e c u l e b 邪e do nm i s t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e m e 丘e c to f i l a n o a 争a l b m n i n s y s t e mi ss t i l d i e d 盖咖，出? i t r e rn a n o p a r t i c l e 5 ；n u c i e i c _ c i m ；p m t e m ；m o r i n ；c a 娃o n i c l u r f h c t a 矗t ；n u o i e s c e n c e ；i e s o n a c eh g h ts c a “e 血g v n 山东大学硕士学位论文 符号说明 m n o a g ：银纳米粒子 匈) n a ：鲱鱼精子脱氧核糖核酸 c t l ) n a ：小牛胸腺脱氧核糖核酸 b s a ：牛血清蛋白 c 弧t a b ：十六烷基三甲基溴化铵 d ( 1 0 0 ：曲拉通x - l o o s l s ：十二烷基硫酸钠 t e m ：透射电子显微镜 c d ：圆二色光谱 i i o ：加入样品后体系荧光强度的比值 m o 血：桑色素 s m d n a ：鲑鱼精子脱氧核糖核酸 y m q a ：酵母核糖核酸 h s a ：人血清蛋白 c p b ：十六烷基溴化吡啶 s d b s ：十二烷基苯磺酸钠 t r i s ：三羟甲基胺基甲烷 s e m ：扫描电子显微镜 ( ：电动电势 i r l s ：加入样品后体系共振光散 射光强度的增强值 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：粹 日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了鳃山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：兰6 螳导师签名： 萎：翟日期：兰! z 量：? 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 蛋白质和核酸是生命的基本物质，是生命科学的主要研究对象核酸是遗 传信息的载体，在生物的生长发育、物种繁衍等生命活动中具有重要的作用 近年来，现代分子生物学的发展以及分子生物学在临床诊断中的应用，已证明 许多疾病的发生( 诸如遗传病、艾滋病、癌症等) ，都与体内的遗传物质核酸的 变化紧密相关【l 】蛋白质是基因表达的产物，参与生命体内的每一步反应和 活动。人类绝大多数疾病都是由蛋白质异常引起的【2 蛔蛋白质由不同种类的 氨基酸通过肽键缩合组成，具有较稳定的构象和生物功能，是生物体的结构和 功能物质，生命运动是通过蛋白质来实现的核酸和蛋白质的存在与配合，是 诸如生长，繁殖，运动，遗传，物质代谢等生命现象的基础，因此研究机体的 分子结构与功能必须先深入了解这两类生物大分子，而探针技术是研究核酸和 蛋白质结构、功能以及定性和定量的重要手段特别是核酸和蛋白质光谱探针 的研究已成为生命科学领域的前沿课题之一 第一节核酸荧光和共振光散射探针的研究进展 核酸是重要的生物大分子。它们不仅起着储存，复制和传递遗传信息的作 用，而且还决定着细胞的种类及其功能，是分子生物学研究的重要内容核酸 分为脱氧核糖核酸( 简称d n a ) 和核糖核酸( 简称r n 舢两大类，它的基本单位是 核苷酸d n a 主要集中在细胞核内，r n a 主要分布在细胞质中，所有生物细 胞都含有这两类核酸1 9 5 3 年w a t n 和c r i c k 提出了著名的d n a 双螺旋结构模 型，从此揭开了分子生物学的序幕，为分子遗传学的研究奠定了基础；1 9 6 0 年，c r i c k 提出了遗传信息传递的中心法则，核酸的研究进入了突飞猛进的发 展时期；7 0 年代初，d n a 体外重组技术获得成功，以核酸研究为基本内容的 基因工程高新技术，已成为当前科技领域中发展最快的学科之一，并大大推动 了其他生物学科的发展 从生物分析化学的角度研究核酸的结构、定性、定量检测方法及其与探针 作用机理是人们关注的重要课题之一，特别是核酸的定量测定方法的研究，将 会对疾病诊断、新型抗癌药物的筛选等有重要的意义【7 ，8 】。核酸定量分析的方 山东大学硕士学位论文 法有很多，有化学发光法、光度分析法、荧光分析法、共振光散射分析法以及 电化学分析法等。荧光分析法和共振光散射法方法简单、灵敏度较高，在这 里，我佃对核酸的荧光探针和共振光散射探针进行了综述 1 核酸荧光探针 由于核酸的内源荧光很弱，直接用其天然荧光来研究核酸受到限制 【9 ，1 0 】，因此人们一直在探索利用一些荧光探针来研究核酸。根据发光机理及 发光类型的不同，核酸的荧光探针可分为：有机染料探针、金属离子探针、金 属配合物探针、光化学探针等。 1 1 有机染料探针 有机染料作为核酸荧光探针研究最早，发展最快。有机染料与核酸是非共 价结合，其作用方式主要包括静电式、插入式和沟槽式三种结合方式。此外还 有氢键、离子键、范德华力、疏水键等相互作用。 吖啶类的荧光反应体系简单，不需外加催化剂，只要在适当的酸碱体系中。就 可以发荧光，且发光效率高，背景小，可在中性或碱性条件下测定d n 已成为很 有发展前景的荧光分析试剂。吖啶橙( a o ) 可用于活细胞染色，将其用于细胞 内核酸的定量测定已有报道【1 l ，1 2 】，a 0 与核酸的结合方式有二种【1 3 ，1 4 】：一 种是嵌入核酸双链的碱基对之间形成a 0 d n a 复合物，另一种是与核酸骨架上 的磷酸基团发生静电作用，形成a o 核酸复合物。吖啶黄( a y ) 在预胶束聚集体 阴离子表面活性剂( s d s ) 的诱导下，可以形成非荧光二聚体。d n a 的加入能调 节s d s 中吖啶黄( a 的单体和二聚体之间的平衡，由于单体与d n a 的插入作用 而使二聚体解离，导致该体系的荧光增强。基于上述原理，许金钩等【1 5 】建立了 检测d n a 的灵敏方法。 溴化乙锭【1 6 ，1 7 1 是一种菲啶染料。在水溶液中荧光很弱，当插入到d n a 的碱基对之间后，荧光效率大大提高，且激发波长产生较大的位移。它是应用 最早，也是应用最广的荧光染料探针，不仅可用于核酸的定性定量分析，也可 用于研究核酸杂交动力学特性 1 8 】若将其它核酸探针( 如某些药物分子) 与溴 化乙锭同时键合到d n a 上，会导致溴化乙锭的荧光猝灭，因此，溴化乙锭可 被用作抗癌药物的筛选和药物分子与d 小帆作用方式研究的灵敏探针【1 9 】吖 2 山东大学硕士学位论文 啶、菲啶类的染料虽然与核酸结合稳定，但是具有很大的毒性因此，寻找无 毒、高效、简便的核酸荧光染料探针越来越受重视 花菁染料又称多次甲基染料，在多次甲基的两端带有吸电子基团和给电子 基团花菁染料的摩尔吸收系数大，荧光发射波长范围宽，一般在6 0 0 1 0 0 0 n m 的近红外区，可大大避免生物自身的荧光背景干扰，与d n a 有很大的 结合常数，且与d n a 结合后荧光强度大大提高( 约1 0 0 0 倍) ，是一类很有价值的 荧光染料【2 0 】 甲苯胺蓝属于吩噻嗪类染料，已用于共振散射法、分光光度法和荧光法厕 定d n a ，郭良洽等【2 1 】利用荧光法研究了甲苯胺蓝c i b ) 与核酸相互作用的荧光 体系，在p h8 5 的吲s - h c l 缓冲溶液中，体系的荧光随着核酸的加入而被猝灭，其 猝灭的程度与册媳的浓度在一定范围内有良好的线性关系。据此，建立了一种 操作简单、灵敏度高，干扰少的测定核酸的荧光分析体系已用于实际样品樟 树嫩叶中的d n a 含量的测定 荧光素的荧光强度较大，大量的荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试 剂，如5 ( 眵羧基荧光素、5 ( 6 ) 羧基荧光素琥珀酰亚胺脂、5 碘乙酰胺荧光素等 是应用最广泛的荧光衍生试剂，用于病毒学、细胞学及免疫组织化学将荧光 素共价的连接到核酸、寡核苷酸、药物及其它分子来合成探针，用于基因病毒 的检测及表达【2 2 】。，荧光素在水溶液中以离子形式存在，其吸收及荧光性质易 受p h 值影响，与标记物共轭连接后，易发生猝灭卞伟 2 3 】等用荧光光谱和磷 光光谱法研究了四溴荧光素f ) 与d 1 q a 的相互作用探讨了盐效应和乙醇在 d n a 存在和不存在条件下对t b f 体系荧光强度的影响，以及不同p h 在有无d 套i a 存在下对体系磷光强度的影响。并通过荧光猝灭实验和磷光偏振实验得出了 t b f 和d n a 的可能作用方式。罗丹明染料分子呈刚性平面，有较高的荧光量子 产率，荧光较强常用作核酸荧光探针的有罗丹明b 、罗丹明6 0 、罗丹明l o l 等【2 2 】 二苯并咪唑染料口c h s t3 3 2 5 8 ) 是一类d n a 小沟结合剂，具有一定的电 化学活性，可以插入到双链d n a 中，并对5 i - c a a a m g 3 片段具有识别特 性，它与d n a 结合后自身的荧光量子效率可提高4 0 0 倍。慈云祥等【1 l 】研究 指出，这种染料可望在研究d n a 的结构及其药物的生物功能等方面得到应 用 3 山东大学硕士学位论文 p i c o ( h e n 是一种新型的荧光染料试剂，该试剂与双链d n a 具有强的亲 和力，结合后荧光强度可增强1 0 0 0 倍以上，可以检测出少至2 5 p 咖l 的双链 d n a 分子【2 4 】。 药物也是常用的有机染料探针。研究药物小分子与脱氧核糖核酸( d n a ) 的 相互作用有助于从分子水平上了解药物的作用机理，为药物设计提供更为有效 的理论指导。 核黄素属于维生索类药品，常用于防治口角炎等炎症，它有可能成为肿瘤 的光敏治疗药物之一倪永年【2 5 】等研究发现核黄素本身具有较强的荧光，但 会随着d n a 的加入而猝灭，这是由于核黄素嵌插进d n a 的双螺旋结构，导致 电荷转移，并由此改变了自身激发态的电子态，导致荧光降低。 博来霉素【2 6 】与d n a 以沟槽式结合为主，优先识别含a t 碱基的d n a 片 段，从而实现对核酸的定位识别与断裂。北醌类衍生物如竹红菌素姒，是一 种新型的光疗药物，可用于皮肤病及癌症的治疗【2 刀。h a 具有与稀土离子类 似的长波长荧光发射特性 。积。= 4 7 0 6 0 0 n m ) ，以沟槽式与d n a 结合，增强 其荧光，该方法测定d n a 和r n a 的检测限低，灵敏度高。胡敏等用荧光光 谱和吸收光谱研究了抗癌新药吡柔比星n 诤与d 咐a 的作用【2 8 】，研究结果表 明，n 口的葸环结构可嵌入d n a 的碱基对中，其含糖侧链则可能键合在 d n a 的小沟槽中。已报道的药物荧光探针还有利凡诺o n ) 【2 9 】、苯并喹嗪 【3 0 】、亚甲蓝 3 l 】、小檗碱【3 2 】等。 双插入剂是指插入剂的两个嵌插环被不同长度的链共价连接起来并分别插 入d n a 的碱基对之间，该插入荆具有很高的灵敏度。喹喔啉、三骨菌素a 和 棘霉素是天然双插入剂的代表【3 3 】。 1 2 金属离子荧光探针 目前，核酸分析中常用的金属离子荧光探针主要是稀土离子，这是由于稀 土离子与生物大分子问的亲和力大，当核酸三线态与镧系离子( 如1 分+ ，酣+ ) 激发态能量匹配时可发生从核酸到镧系离子的能量转移。从而发射稀土离子的 特征荧光，且其光谱窄、激发态寿命长、s t o c k s 位移大等优点，已成为核酸分 析中常用的金属离子荧光探针 3 4 3 6 】o 4 山东大学硕士学位论文 慈云祥小组【3 7 】研究了n 尹与d n a 和r n a 的反应，发现n 尹可以直接与 r n a 作用产生n r 的特征荧光，且变性前后荧光差别不大，而对于d n a ，则 要变性后才可有明显的荧光增强，由此可选择性测定d n a 与r n a 1 9 8 6 年，杨景和小组发现在稀土离子( 如e i l 扣，付+ ) 配合物体系中加入某 些其它稀土离子( 如l a “、g d 3 + 、t 妒+ 、h 一、y 3 + 等) 时，体系的荧光强度明显 增强，命名为“稀土共发光效应”或“稀土共荧光效应”或“稀土协同增强效 应”【3 8 】，近年来又将稀土共发光效应应用到核酸的研究中【3 9 】，使核酸测量的 灵敏度提高了一个数量级。 p a t l y 等用n 一作探针【4 0 】，研究了双链e i n a 中的单链错配情况。研究表 明，c 碱基对1 妒+ 的荧光增强幅度大于d c m p ：d g m p 对n 尹荧光增强幅度 大于g 碱基。双链研叮a 错配中g g 错配的增强幅度最大；其次是c a ，g a 和 c c 错配。利用n 一荧光的增强可成功地检测d 小4 a 双链中的单链错配。 此外，c e d 也是一种较好的金属离子探针，由于c e 具有其独特的荧 光性质，在弱酸性的n a c l 介质中，c e o i d 的荧光为多种核酸所猝灭利用核酸 对c e o i i ) 的这种荧光猝灭特性可以灵敏的测定不同核酸【4 1 】。吴霞等【4 2 利用 在h 2 s 0 4 介质中，核酸的加入可使c e ( ) 被还原为c e ( ) 而发射三价铈的 特征荧光，三磷酸盐对体系荧光有明显的增强作用，建立了灵敏的核酸测定方 法该方法的检测限达到n g 级。 1 3 金属配合物荧光探针 核酸与金属配合物作用的研究是核酸研究的一个重要领域，其研究对药物 作用的生理机制研究、某些疾病的诊断和治疗、合成和设计新的药物都有重要 意义根据其发光类型可将金属离子配合物荧光探针分为金属离子发光的金属 配合物荧光探针和配体发光的金属配合物荧光探针。 1 3 1 金属离子发光的荧光探针 如果络合物中金属离子的发光电子能级在配体t i 能级之下，则可能发生 电子从配体三重态向金属离子激发态的非辐射跃迁口l m ) ，然后发生m 哼m + h u 的辐射跃迁，发射金属离子的敏化荧光。金属离子发光的配合物荧光 探针主要是稀土离子配合物，其中最常用的稀土离子主要有t b 弘和e u 3 + 稀 5 山东大学硕士学位论文 土离子共振能级和核酸的共振能级相匹配时，与核酸作用后能提高从配体向中 心离子的能量转移效率，从而提高核酸测定的灵敏度。 环丙沙星( c i p r o f l o x a c i l l ，c 婵) 为氟喹诺酮类药物，在中性条件下，铽( ) 与环 丙沙星反应极易形成络合物。何华【4 3 】等以环丙沙星一铽络合物作为荧光探针， 研究了d n a 对此络合物的荧光增强作用，以此建立了简单、快速、灵敏的 d n a 测定新方法。此方法具有较高的灵敏度和选择性，用于临床近2 0 例全血 d n a 提取样本的检测 一 广谱抗菌素四环素及其衍生物是一种亲癌化合物，近年来已成为诊断、治 疗肿瘤的一种常用的荧光探针，并用于临床检查和治疗中【4 4 】。慈云祥【4 5 ，4 6 】 等对e u ( ) 四环素类络合物作为d n a 荧光探针进行了研究，并应用时间分辨 荧光技术来检测核酸，其检出限达到5 o n 咖l ，且当有心魄存在时，不干